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Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Nachweis und Differenzierung potentiell humanpathogener Clostridium spp. in

unterschiedlichen Matrizes

U. Messelhäußer, R. Zucker, P. Kämpf, H. Schreiner, U. Pudich, H. Diepolder, C. Höller, U. Busch

Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 2

Humanpathogene Clostridium spp.

Lebensmittel

C. perfringens (Typ A und selten Typ C u. D)Botulinum-Toxin produzierende Clostridium spp. (Typ A, B, E und F)(C. difficile)

Wundinfektionen

C. botulinum (Typ A, B, E und F)C. perfringens (Typ A)u. a. C. tetani, Clostridium septicum u. C. chauvei

Krankenhausassoziierte Erkrankungen

C. difficileC. perfringens (Typ A)


Clostridium perfringens


Clostridium perfringens

gram-positive, sporenbildende anaerobe bzw. aerotolerant wachsende Stäbchenbakterien

Einteilung in fünf Toxintypen (Typ A bis E)

ubiquitäre Verbreitung in der Umwelt

lebensmittelassoziierte Toxi-Infektionen in der Mehrzahl durch C. perfringensTyp A-Stämme mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung (CpE)

Freisetzung des Enterotoxins im Darmlumen durch die Sporulation der aufgenommenen vegetativen Zellen


Enterotoxämie bei Kälbern

cpa, iap, ipb, (cpe)cpa, iap

xxE

Enterotoxämie bei Lämmern, Schafen, Kälbern und Ziegen

Gastroenteritiscpa, etx, (cpe)xxD

Nekrotisierende Enteritis bei Ferkeln, Lämmern,

Kälbern, FohlenEnterotoxämie bei

Schafen

Nekrotische Enteritis (Darmbrand)

cpa, cpb1, (cpe)cpa, cbp2, (cpe)cpa, cpb1, cpb2,

(cpe)

xxC

Dysenterie bei Lämmern,

HämorrhagischeEnteritis bei Kälbern und Fohlen, Enterotoxämie

bei Schafen

cpa, cpb1, etx, (cpe)xxxB

Durchfall (Fohlen, Ferkel usw.)

Nekrotisierende Enteritis (Geflügel)

Gangrän bei Wundinfektionen

Gastroenteritis(lebensmittelbedingt,antibiotoikaassoziiert)

cpa

cpa, cpecpa, cpb2, (cpe)

xA

ιεβα

Veterinärmedizi-nisch bedeutsame

Erkrankungen

Humanmedizi-nisch bedeutsame

Erkrankungen

GenotypHaupttoxineToxintypen

Petit et al., 1999


Angewandtes Nachweisverfahren

Probenmaterial

9 x TPGY-Bouillon

Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 37° C für 24 h

real-time-PCR nach DNA-Extraktion aus der Anreicherungsbouillon

Ausstrich aus der Anreicherungsbouillon auf Eigelb-

Lactose-Agar und Blutagar

Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 37° C für 24 h

real-time-PCR von verdächtigen Kolonien

Keimzahlbestimmung(Spiralplattenverfahren auf

Eigelb-Lactose-Agar)



C. perfringens in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs

Blattsalate (u. a. Rucola, Feldsalat), n = 49

Nachweis von C. perfringens in 31 von 49 Proben (63 %):

Trockenpilze u. Gewürze, n = 108


25

15

ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb2

27

41 3

ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb2cpa/iap


C. perfringens in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs

Tee und Teeerzeugnisse, n = 57


17

1

8

3 1

ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb2cpa/iapcpa/etx


C. perfringens in Lebensmitteln tierischen Ursprungs

Hackfleisch, n = 24


8

6

6

ausschließlich cpa

cpa/cpe

cpa/cpb2

Kesselkonserven (Direktvermarktung), n = 13

Nachweis von C. perfringens in 1 von 13 Proben (8 %)


C. perfringens in Proben mit Erkrankungshintergrund (01/2007-08/2009)

12

948

In keiner Probe lag die detektierte Keimzahl über 103 KbE/g.

73

1 1

ausschließlich cpacpa/cpecpa/cpb1cpa/etx

In insgesamt 12 von 960 auf C. pefringens untersuchten Proben wurde der Erreger nachgewiesen


Beispiel für einen lebensmittelbedingten Ausbruch (C. perfringens)

Erkrankung mehrerer Kinder in einem Kinderhort ca. 8 h nach dem Verzehr von Hühnerfrikassee (Reste vom Vortag) an Durchfall

ausschließlich qualitativer Nachweis von C. perfringens mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung in Resten des Mittagessen

qualitativer Nachweis von C. perfringens mit der Fähigkeit zur Enterotoxinbildung in den Stuhlproben der mehrerer Kinder

vier Wochen später bestätigen die Untersuchungen des humanmedizinischen Referenzlabors für Anaerobier den Verdacht: Die humanmedizinischen Isolate und die Isolate aus den Lebensmitteln sind identisch


Clostridium botulinum


Clostridium botulinum

gram-positive, sporenbildende strikt anaerob wachsende Stäbchenbakterien

ubiquitäre Verbreitung der Sporen in der Umwelt

derzeitig Einteilung in die Toxintypen A bis G:

Toxintypen A, B, E und F rufen lebensmittelassoziierte Intoxikationen / Toxi-Infektionen hervorübrige Toxintypen führen zu Erkrankungen bei unterschiedlichen Tierarten

zwei Erkrankungsmöglichkeiten (im Zusammenhang mit der Aufnahme von Lebensmitteln):

Aufnahme des Toxins („lebensmittelassoziierter Botulismus“)Aufnahme der C. botulinum-Sporen und Toxinbildung im Darm („infektiöser Botulismus“, vor allem bei Säuglingen von Bedeutung)


Nachweismethode

Probenmaterial

9 x TPGY-Bouillon

Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 30° C bzw. 37° C für 48 h

real-time-PCR nach DNA-Extraktion aus der Anreicherungsbouillon

Ausstrich aus der Anreicherungsbouillon auf Eigelb-Lactose-Agar und

Blutagar

Bebrütung unter anaeroben Bedingungen bei 30° C bzw. 37° C für bis zu 48 h


in Zusammenhang mit einem humanen Erkrankungsfall Direktextraktion aus dem

Lebensmittel


Nachweis von C. botulinum-Stämmen –Beispiel Proben im Rahmen von lebensmittelbedingten

Erkrankungsfällen (2007-2009)

gesamtC. botulinum

2007

2008

2009

20

3

27

3

17

10

5

10

15

20

25

30

200720082009


Probenmaterial, aus dem die Stämme isoliert wurden


Beispiel für einen lebensmittelbedingten Ausbruch (C. botulinum)

Erkrankung eines Familienvaters nach Verzehr von Leberwurst (Kesselkon-serve) mit neurologischen Ausfallserscheinungen (Intensivstation mit Beatmungspflicht)

Nachweis von C. botulinum Typ B Sporen und vegetative Zellen in zwei geöffneten Dosen

Beurteilung der Probe unter Berücksichtigung des Erkrankungsfalles (epidemiologischer Zusammenhang) als „gesundheitsschädlich“ und damit „nicht sicher“ gem. Art. 14 Abs. 1 i. V. m. Abs. 2a der VO (EG) Nr. 178/2002

Maus-Bioassay aus dem Patientenmaterial positiv, auf den Toxinnachweis aus dem Lebensmittel wurde verzichtet


Untersuchung von Proben im Rahmen des amtlichen Probenplans

58

3

43

0

Honig Kesselkonserven


Schlussbemerkungen

bei den beiden wichtigsten humanpathogenen Clostridium spp., im Lebensmittelbereich, C. perfringens und C. botulinum, ist eine ausschließlich kulturell-mikrobiologische Untersuchung nicht aussagekräftig

häufig können die in der Literatur angegebenen Infektionsdosen auch im Rahmen von lebensmittelbedingten Erkrankungsfällen in den Verdachts-proben nicht nachgewiesen werden

eine zuverlässige Risikobewertung für einzelne Produkte bzw. Produkt-gruppen ist nur beim Vorliegen belastbarer Daten über Vorkommen, Kontaminationsquellen und –wege möglich


Herzlichen Dank an….

…die Labore für

Lebensmittelmikrobiologie

LM 3.1 u. LM 3.3

und…

…Frau Zucker für eine stets

konstruktive Mitarbeit und die

vielen investierten Arbeitsstunden


…an Sie für Ihre Aufmerksamkeit!

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