Metode Immunohistokimia

Metode ImmunohistokimiaMakhyan Jibril Al Farabi*

*Program Study Master Biomedik, FKUB

1. PENDAHULUAN1.1. Latar BelakangImunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untukmengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Pewarnaan sediaan jaringan menimbulkanikatan antibodi pada antigen di permukaan atau didalam sel yang selanjutnya dapat dideteksi dengan cara dilabel dengan enzim,isotop,fluoropore,atau coloidal gel. Untuk mempelajari morfologi sel, sel dalamjaringan difiksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan divisualisasikan denganmikroskop elektron atau mikroskop cahaya (Rantam, 2003) Teknik imunohistokimia dapat digunakan untukmempelajaridistribusienzimyangspesifikpadastrukturselintak(normal/lengkap),mendeteksikomponensel,biomakromolekulsepertiprotein, karbohidrat (Lehret al., 1999). Dengan demikian, maka sangat penting sekali untuk memahami teknik imunohistokimia guna penelitian yang berkaitan dengan pengukuran ekspresi protein, karbohidrat maupun antigen lain di permukaan maupun di dalam sel.

1.2. TujuanUntuk mengetahui proses pelaksanaan metode immunohistokimia

2. TINJAUAN PUSTAKAImunohistokimia merupakan proses untuk mendeteksi antigen (protein, karbohidrat, dsb) pada sel dari jaringan dengan prinsip reaksi antibody yang berikatan terhadap antigen pada jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari nama immune yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan antibody dan histo menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Imunohistokimia seringkali digunakan untuk mengukur dan mengidentifikasi karakteristik dari even seluler seperti proses proliferasi sel, apoptosis sel. Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. (Ramos-Vara, 2005). Untuk memvisualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibody dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, dimana cara yang paling sering digunakan ialah dengan konjugasi antibody dengan enzim seperti peroksidase. Selain itu juga bias digunakan fluorophore seperi fluorescin atau rhodamin. Untuk mempelajari morfologi sel, sel dalamjaringan difiksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan divisualisasikan dengan mikroskop elektron atau mikroskop cahaya (Rantam, 2003)

Secara garis besar, untuk metode imunohistokimia, dapat dilakukan dengan metode direct maupun indirect. Dimana keduanya ditentukan oleh prinsip reaksi antibody yang digunakan, yakni:Metode Direct

Metode imunohistokimia direct menggunakan antibody primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung

Metode Indirect

Metode imunohistokimia indirect menggunakan antibody primer yang tidak ada labelnya, namun digunakan juga antibody sekunder yang sudah memiliki label dan akan bereaksi dengan IgG dari antibody primer.3. METODERangkaian pemeriksaan Immunohistokimia dimaulai dengan pengambilan sampel lalu pembuatan paraffin block. Setelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. Berikut perinciannya :a. Pembuatan paraffin block1. Jaringan dicuci dengan PBS2. Difiksasi dengan formalin 10%3. Dilakukan dehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolute)4. Clearing menggunakan xilol 2 kali, masing-masing 60 menit.5. Infiltrasi menggunakan paraffin lunak selama 60 menit pada suhu 480C. 6. Block dalam paraffin keras pada cetakan dan diamkan selama sehari.7. Tempelkan. Pada holder dilakukan pemotongan setebal 4-6 mm dengan rotary microtome.8. Mounting pada objek dengan gelatin 5%b. Proses deparafinisasi1. Slide direndam xilol 2 kali, masing-masing selama 5 menit.2. Rehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolute) masing-masing 5 menit3. Bilas dengan dH2O selama 5 menitc. Proses imunohistokimia terhadap eNOS1. Slide preparat dicuci dengan PBS pH 7,4 2. Aplikasikan 3% h2o2 (daco, Inc) selama 10 menit.3. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali4. Blocking menggunakan serum 2% BSA (Sigma USA) selama 60 menit (1%)5. Inkubasi dengan antibody primer mouse monoclonal vcam-1 human absorbed semalam pada suhu 40C (1:100)6. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali7. Tetesi dengan anti body sekunder berlabel biotin (Santa Crus) dan inkubasi selama 1 jam (1:200)8. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali9. Tetesi dengan SA-HKP (Strep Avidin horse radis peroxidase) (Dako,Inc) selama 40 menit (1:500)10. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali11. Aplikasikan cromogen untuk HRP yaitu DAB (Diamono Benzidine) (Daco,Inc)12. Bilas dengan H2O 13. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali14. Counter straining dengan mayer Hematoxilen (lab Vision) selama 10 menit15. Cuci dengan tap Water16. Kering anginkan dan mounting menggunakan entelan serta cover Glass d. Pembuatan mediaLarutan PBS a. Na H2 PO4 2 H2O 2,4 gramb. Na2HPO4 1,2 gram c. KH2PO4 0,7 gramd. KCI 6,8 gramPembuatan- Dilarutkan ke 3 bahan tersebut dengan aquadest sampai 1 L- Diletakkan di atas magnetic stirrer agar homogen - Diukur pada pH 7,4. Distrilisasi- Simpan disuhu dingin- Jika ingin diencerkan, ambil 100 cc, tambahkan 900 mL Aquades 4. HASIL5. KESIMPULAN Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa imunohistokimia merupakan metode semi-kuantitatif yang bermanfaat untuk mempelajari distribusi enzim yang spesifik pada struktur sel intak (normal/lengkap), biomakromolekul seperti protein, karbohidrat dengan prinsip prinsip immunoassay.

DAFTAR PUSTAKALehr S, Kotzka J, Herkner A, Klein E, Siethoff C, Knebel B, Noelle V, Brning JC, Klein HW, Meyer HE, Krone W, Mller-Wieland D. 1999. Identification of tyrosine phosphorylation sites in human Gab-1 protein by EGF receptor kinase in vitro. Biochemistry. Jan 5;38(1):151-9.Ramos-Vara, JA. 2005. "Technical Aspects of Immunohistochemistry". Vet Pathol 42 (4): 405426. doi:10.1354/vp.42-4-405. PMID 16006601.Rantam, Fedik A. 2003. Metode Immunologi. Airlangga University Press. Surabaya. 145-155imunohistokimia

IMUNOHISTOKIMIA (IHK)PendahuluanImunohistokimia adalah suatu metode kombinasi dari anatomi, imunologi dan biokimia untuk mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu dengan menggunakan interaksi antara antigen target dan antibodi spesifik yang diberi label. Dengan menggunakan imunohistokimia, kita dapat melihat distribusi dan lokalisasi dari komponen seluler spesifik diantara sel dan jaringan lain di sekitarnya dengan menggunakan mikroskop cahaya biasa. Komponen seluler tersebut dapat terlihat karena kompleks antigen-antibodi yang sudah dilabel akan memberikan warna yang berbeda dari sekitarnya.Imunohistokimia dibagi menjadi 2 metode, yaitu metode direct dan indirect. Pada metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan dimodifikasi dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut. molekul indikator tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau enzim peroksidase, sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan warna pada jaringan tersebut. Selanjutnya dalah metode indirect, pada metode ini antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak dilakukan modifikasi pada antibodi ini. Namun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan dengan antibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. Antibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Setiap 1 antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder, oleh karena itu, setelah diberikan substrat akan terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan tersebut.Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu preparasi sampel dan labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Sampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat. Sampel labeling terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya.Tujuan1. Melatih mahasiswa biomedik untuk dapat melakukan Imunohistokimia2. Melihat sel kanker pada preparat jaringan buli-buli dari hasil Imunohistokimia MetodeHari pertama1. Deparaffinisasia. Teteskan Xylol 2x10 menitb. Teteskan ethanol absolute 1x5 menitc. Teteskan ethanol 90% 1x5 menitd. Teteskan ethanol 80% 1x5 menite. Teteskan ethanol 70% 1x5 menitf. Teteskan Sterile aquades 3x5 menit

2. Slide siap untuk dilakukan Imunohistokimia :a. Dicuci PBS steril 3x5 menitb. Dikeringkan dengan tissuec. Ditambah H2O2 3% dalam methanol inkubasi 15 sampai dengan 20menit d. Dicuci PBS steril3x5 menit3. Blocking unspesifik protein :a. Ditambah 0,255 triton-x100 dalam blocking buffer BSA selama 1 jam pada suhu ruangb. Dicuci dengan PBS steril 3x5 menit

4. Inkubasi antibodi primer :a. Ditambah antibodi primer dalam blocking buffer BSAb. Inkubasi semalam pada 4Cc. Dicuci PBS steril 3x5 menit

Hari kedua1. Inkubasi antibodi sekunder :a. Ditambah antibodi sekunder kit, inkubasi 60 menit pada suhu kamar (walapun menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya)b. Dicuci PBS steril 3x5 menit

2. Inkubasi SAHRP :a. Ditambah SAHRP kit, inkubasi 40 menit pada suhu kamarb. Dicuci PBS steril 3x5 menitc. Dicuci akuades steril 3x5 menit

3. Aplikasi kromagen DAB (dipilih DAB karena lebih awet) :a. Ditambah (DAB :buffer DAB = 1:50), inkubasi 20 menit pada suhu kamarb. Dicuci PBS steril 3x5 menit diaminobenzidine

4. Counterstain dengan mayer hematoxilen :a. Ditambah (mayer : tap water =1:10), inkubasi 5-10 menit pada suhu kamarb. Dicuci tap water steril 3x5 menit c. Dikeringkan anginkan5. Mounting dengan entellanDikeringkan anginkan6. Amati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskop

Hasil

Gambar hasi ImunohistokimiaDari Imunohistokimia pada preparat jaringan buli-buli yang diperkirakan terdapat sel kanker, sel kanker tersebut akan terwarnai dengan warna coklat. Dari preparat pertama didapatkan sedikit warna coklat, sehingga diperkirakan hanya ada sedikit jumlah sel kanker, sedangkan pada preparat kedua dan ketiga terdapat banyak warna coklat sehingga diperkirakan ada banyak sel kanker pada jaringan buli-buli tersebut.DiskusiPada pelatihan penelitian ini langkah-langkah Imunohistokimia sudah dilakukan dengan teratur dan semua peserta telah mengetahui dasar teori dan prosedur Imunohistokimia ini. Namun proses preparasi sampel tidak seluruhnya dilakukan oleh peserta. Preparasi sampel terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Peserta pelatihan memulai pada saat preparat sampel sudah dilakukan deparafinisasi, sehingga hanya proses bloking protein tidak spesifik dari proses preparasi sampel saja yang dilakukan oleh peserta. Namun telah dilakukan penjelasan secara rinci dari laboran biomedik tentang preparasi sampel. Proses antigen retrieval diperlukan setelah dilakukan deparafinisasi karena proses tersebut akan membuat epitop dari jaringan tersebut lebih terlihat atau lebih dominan dibandingkan dengan tidak dilakukan antigen retrieval sehingga nantinya antibodi primer yang diberikan akan dapat mengenali epitopnya dengan baik. Selanjutnya dilakukan bloking protein tidak spesifik, hal ini bertujuan untuk menutupi sisi protein lain, sehingga anti bodi tidak mengenali protein lain yang tidak dimaksud. Hal ini dapat mengurangi bias.Pelatihan penelitian ini menggunakan teknik Imunohistokimia secara indirect. Pada proses selanjutnya adalah sampel labeling yang terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. Antibodi primer yang digunakan adalah antibodi yang spesifik terhadap protein sel kanker buli-buli. Setelah diberikan antibodi primer, preparat dicuci, sehingga antibodi primer yang tidak berikatan akan terbuang. Berikutnya diberikan antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer, sehingga antibodi sekunder ini akan berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Pada pelatihan penelitian ini, molekul indikator yang digunakan adalah SAHRP yang berikatan dengan H2O2. Setiap 1 antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder yang memiliki SAHRP. Selanjutnya diberikan kromagen diaminobenzidine (DAB). DAB ini akan bereaksi dengan H2O2 yang terdapat pada SAHARP antibodi sekunder dan akan dihasilkan produk reaksi berwarna coklat yang dapat kita lihat. Oleh karena lebih dari 1 antibadi sekunder yang berikatan dengan antibidi primer, maka DAB yang bereaksi dengan H2O2 akan semakin banyak dan akan menghasilkan warna yang lebih jelas dibandingkan dengan metode direct yang tidak menggunakan antibodi sekunder. Proses terakhir adalah counterstaining, yaitu memberikan warna lain pada jaringan yang tidak terwarnai oleh proses Imunohistokimia. Pada pelatihan penelitian ini menggunakan mayer hematoxilen sebagai counterstaining yang nantinya akan memberikan warna kebiruan pada jaringan lainnya. Counterstaining bertujuan untuk memberikan warna kontras terhadap hasil Imunohistikimia, sehingga jaringan berwarna coklat dapat terlihat jelas dibandingkan dengan jaringan sekitarnya. Pada hasil Imunohistokimia dari pelatihan penelitian ini, terlihat adanya sel kanker yang terwarna coklat diantara jaringan lain yang berwarna kebiruan.Kesimpulan1. Mahasiswa biomedik dapat melakukan prosedur Imunohistokimia dengan baik sehingga diperoleh preparat jaringan buli-buli dengan adanya warna coklat pada pelatihan prosedur Imunohistokimia ini.2. Pada preparat jaringan buli-buli yang dilakukan Imunohistokimia menggunakan antibodi spesifik terhadap sel kanker buli-buli, terlihat adanya jaringan berwarna coklat yang menunjukkan sel kanker pada jaringan tersebut dengan menggunakan mikroskop cahaya.