metode lokasi dan waktu materi · agar (mrsa) untuk ... selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air...
TRANSCRIPT
17
METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Pengolahan Susu, Laboratorium
Mikrobiologi Hasil Ternak bagian Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan IPB
dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UI. Penelitian dilakukan pada
bulan Pebruari - September 2011.
Materi
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah susu sapi skim untuk
media pertumbuhan kultur starter. Susu kuda segar untuk adaptasi kultur campuran
dan pembuatan koumiss berasal dari peternakan kuda perah Cikampak. Kultur
bakteri asam laktat Lb. acidophilus Y-01, Lc. lactis ssp. lactis D-01 dan khamir Sc.
cereviceae merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi Teknologi Hasil Ternak
Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Kultur bakteri patogen S.
Typhimurium ATCC 14028 dan M. tuberculosis H37RV merupakan koleksi
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Media tumbuh yang digunakan adalah de Man’s Rogosa Sharpe Broth
(MRSB) untuk Lb. acidophilus, Lc. lactis ssp. lactis dan de Man’s Rogosa Sharpe
Agar (MRSA) untuk pengujian bakteri asam laktat; Nutrien Broth (NB) dan Potato
Dextrose Agar (PDA) sebagai media tumbuh Sc. cereviceae; Plate Count Agar
(PCA) untuk penghitungan jumlah mikroorganisme; Violet Red Bile Agar (VRBA)
untuk pengujian koliform; media tumbuh Lowenstein Jensen untuk M. tuberculosis
H37RV; media Nutrien Agar (NA) untuk S. Typhimurium ATCC 14028 dan Mueller
Hinton Agar (MHA) sebagai media konfrontasi produk koumiss terhadap
S. Typhimurium ATCC 14028. Bahan kimia yang digunakan adalah NaCl fisiologis
0,85%; alkohol 70%, safranin, kristal violet, asam alkohol, methylen blue, karbol
fuchsin dan spiritus.
Alat-alat yang digunakan untuk penumbuhan, perbanyakan dan pembuatan
media tumbuh kultur starter dan bakteri patogen adalah tabung reaksi, rak tabung
reaksi, inkubator, lemari es, mikroskop, cawan petri, pipet satu ml, heater-magnetic
stirrer, pembakar bunsen dan autoclave. Alat untuk pembuatan koumiss yaitu botol
steril, pengaduk kayu, termometer, gelas liter, gelas ukur, panci double plate dan
kompor gas; sedangkan untuk pengujian daya hambat antimikroba koumiss dengan
18
S. Typhimurium ATCC 14028 dan M. tuberculosis H37RV menggunakan alat pipet
volumetrik, pipet man, tabung ulir kecil, tabung reaksi kecil, cawan Petri, jarum Ose,
vortex-mixer, tabung berdiameter lima mm (corke borer), glass beed, nevlometer dan
jangka sorong.
Prosedur Penelitian
Penelitian terdiri atas beberapa tahap meliputi perbanyakan kultur, pembuatan
starter induk serta persiapan dan perbanyakan kultur uji bakteri patogen. Tahap
selanjutnya adalah pengujian kualitas mikrobiologi susu kuda, pembuatan koumiss
dan pengujian aktivitas daya hambat antimikroba koumiss pada bakteri S.
Typhimurium ATCC 14028 dan M. tuberculosis H37RV. Diagram alir penelitian
disajikan pada Gambar 6.
Persiapan Kultur Bakteri
Kultur bakteri koleksi yang digunakan adalah Lc. lactis D-01, Lb. acidophilus
Y-01, dan Sc. cereviceae, serta bakteri patogen S. Typhimurium ATCC 14028 dan
M. tuberculosis H37RV. Pemeriksaan morfologi dan sifat katalase untuk
mengetahui karakteristik kultur bakteri termasuk ke dalam persiapan kultur bakteri.
Pengujian morfologi starter dengan bantuan pewarnaan Gram untuk bakteri asam
laktat Lc. lactis D-01, Lb. acidophilus Y-01, khamir Sc. cereviceae dan bakteri
patogen S. Typhimurium ATCC 14028 dan pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk
M. tuberculosis H37RV. Pengujian pewarnaan Gram mengacu pada Fitria (2009)
meliputi tahapan sebagai berikut: kultur bakteri dioleskan pada gelas obyek dengan
jarum Ose, kemudian kultur ditetesi kristal violet dan dibiarkan selama satu menit.
Preparat kemudian dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat yang
sudah kering ditetesi larutan lugol iodin dan didiamkan selama satu menit, kemudian
dibilas kembali dengan akuades. Preparat kemudian dikeringudarakan, selanjutnya
ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama sekitar lima detik.
Preparat dibilas kembali dengan akuades dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir
menggunakan safranin selama 30 detik dan dibilas kembali dengan akuades, lalu
preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diperiksa di bawah
mikroskop pada perbesaran 10 x 100.
Bakteri dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif, bila dapat
mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok
19
bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah, karena pada saat pencucian
dengan alkohol tidak dapat mempertahankan warna ungu yang berasal dari kristal
violet sehingga sewaktu pemberian pewarna tandingan dengan warna merah safranin,
bakteri akan menyerap warna tersebut dan mengakibatkan tampak berwarna merah.
Pewarnaan Ziehl-Neelsen diawali dengan pembuatan smear lonjong pada
gelas objek dengan diameter lebar dua cm dan panjang tiga cm, lalu difiksasi di atas
api bunsen hingga kering. Karbol fuchsin diteteskan, lalu dibakar dengan api bunsen
Persiapan kultur BAL dan khamir
Perbanyakan kultur
Pembuatan kultur starter
Lc. lactis D-01 Lb.acidophilus Y-01 Sc. cereviceae
Pewarnaan Gram
Pengujian sifat katalase
Persiapan media tumbuh dan inokulasi kultur
Kultur induk (mother starter) Feeder starter Kultur kerja (bulk starter)
Pemeriksaan viabilitas
Pembuatan starter koumiss
Susu skim
Susu kuda
Pembuatan koumiss Penyimpanan 0, 2, 4, 6, dan 8 hari
Pengujian karakteristik koumiss
Total Asam Tertitrasi (TAT)
TPC Koliform BAL Khamir
Pengujian daya hambat koumiss terhadap bakteri
patogen
S. Typhimurium ATCC 14028
M. tuberculosis H37RV
Gambar 6. Diagram Alir Penelitian
Persiapan kultur bakteri patogen
S. Typhimurium 14028 M. tuberculosis H37RV
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Ziehl Neelsen
20
dan didiamkan selama lima menit. Setelah itu dibilas dengan air, selanjutnya ditetesi
decolorizer berupa asam alkohol dan didiamkan selama 10-15 detik, kemudian
dibilas kembali. Larutan ketiga berupa methylen blue diteteskan dan didiamkan
selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air mengalir dan didiamkan hingga preparat
kering. Identifikasi menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x100 (WHO,
1998).
Pengujian sifat katalase dilakukan dengan pengambilan satu Ose bakteri,
kemudian dioleskan pada gelas objek, selanjutnya ditetesi dengan satu tetes H2O2.
Apabila dihasilkan gelembung-gelembung gas O2, maka bakteri yang diperiksa
diklasifikasikan ke dalam kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya apabila tidak
ditemukan gelembung gas, maka bakteri tersebut diklasifikasikan ke dalam
kelompok bakteri katalase negatif (Pelczar dan Chan, 2007).
Perbanyakan Kultur
Persiapan Media Tumbuh. Media tumbuh untuk masing-masing mikroflora
penyusun starter koumiss disiapkan sebelum melakukan perbanyakan kultur. Media
tumbuh untuk Lc. lactis ssp. lactis, Lb. acidophilus berupa de Man’s Rogosa Sharpe
Broth (MRSB) disiapkan, pada suhu inkubasi 37 oC. Media tumbuh untuk Sc.
cereviceae berupa Nutrien Broth pada suhu inkubasi 25 oC.
Inokulasi Kultur. Perbanyakan kultur dilakukan dengan cara penyegaran kultur
bakteri sebanyak 5% di dalam media yang sesuai dan diinkubasi pada suhu optimal
yang sesuai untuk masing-masing pertumbuhan mikroflora.
Pembuatan Starter dan Pemeriksaan Viabilitas
Persiapan Media Tumbuh. Media tumbuh adalah susu skim yang telah disterilisasi
pada suhu 115 oC selama tiga menit. Susu didistribusikan dalam tabung reaksi
ukuran 10 ml untuk penumbuhan starter induk.
Penyegaran Kultur Starter. Sebesar 5% kultur perbanyakan diinokulasi ke dalam
susu steril yang telah dipanaskan pada suhu 115 oC selama tiga menit, lalu diinkubasi
pada suhu 37 oC untuk Lc. lactis D-01 dan Lb. acidophilus Y-01 dan pada suhu 25 oC
untuk Sc. cereviceae sampai terjadi koagulasi. Kultur tersebut adalah kultur induk
(mother starter). Tahapan selanjutnya yaitu membuat feeder starter dengan cara
menambahkan 5% kultur induk ke media tumbuh baru dan diinkubasikan pada suhu
21
37 oC. Bulk starter dibuat melalui penambahan 5% feeder starter ke dalam media
tumbuh baru dan diinkubasikan pada suhu 37 oC.
Pemeriksaan Viabilitas Kultur Starter Koumiss. Pemeriksaan viabilitas kultur
starter ini bertujuan untuk mengetahui jumlah koloni dalam starter kerja yang
ditentukan dengan memupukkan dan menumbuhkan kultur starter koumiss pada
media yang sesuai, untuk bakteri asam laktat (Lc. lactis D-01 dan Lb. acidophilus Y-
01) pada media MRSA dan khamir (Sc. cereviceae) pada media PDA.
Pembuatan Starter Koumiss. Bahan baku pembuatan media koumiss yaitu susu
segar yang dipanaskan pada suhu 65 oC selama 30 menit, lalu didinginkan hingga
suhu 28 oC. Koumiss dibuat dengan cara membagi tiga bagian yang sama, yaitu satu
bagian susu dinokulasi dengan Lc. lactis D-01, satu bagian susu diinokulasi dengan
Lb. acidophilus Y-01 lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama tujuh jam dan satu
bagian susu diinokulasi dengan Sc. cereviceae pada suhu 25 oC selama lima jam
(Gambar 7).
Gambar 7. Diagram Alir Pembuatan Starter Koumiss
Tambahkan satu bagian susu kuda yang telah dipasteurisasi 65 oC selama 30 menit dan telah didinginkan hingga suhu 28 oC
Dipanaskan 65 oC, 30 menit
Inkubasi 25 oC, 5 jam
Inkubasi 28 oC, 24 jam Starter koumiss terbentuk
Dicampur
Inkubasi 37 oC, tujuh jam
Satu bagian inokulasi Sc. cereviceae
Satu bagian inokulasi Lb. acidophilus
Satu bagian, inokulasi Lc. Lc. lactis ssp. lactis
Dinginkan suhu 28 oC
Susu sapi skim
22
Pembuatan starter koumiss diawali dengan pencampuran keseluruhan kultur,
baik Lc. lactis D-01, Lb. acidophilus Y-01 maupun Sc. cereviceae sebanyak 3%-5%
(v/v) ke dalam susu kuda yang telah dipanaskan 65 oC selama 30 menit, lalu
didinginkan hingga suhu 28 oC. Hasil campuran susu dan kultur starter diinkubasi
pada suhu 28 oC selama 24 jam sehingga terbentuk starter yang diinginkan
(modifikasi Rahman et al., 1992).
Pembuatan Koumiss
Koumiss dibuat dari susu kuda yang dipanaskan pada suhu 65 oC selama 30
menit dan setelah suhu mencapai 28 oC inokulasi dengan 30% starter. Setelah itu
diinkubasi pada suhu 28 oC selama 24 jam (modifikasi Rahman et al., 1992).
Diagram pembuatan koumiss disajikan pada Gambar 8.
Dinginkan hingga 5 oC dan disimpan
Pematangan 20 oC selama dua jam
Dikemas dalam botol
Dinginkan hingga 20oC
Inkubasi 28 oC selama 24 jam
Dicampur dan diaduk
Gambar 8. Diagram Alir Pembuatan Koumiss
Inokulasi dengan 30 % starter
Dinginkan suhu 28 oC
Dipanaskan 70 oC, 30 menit
Susu kuda
23
Pengujian Karakteristik Mikrobiologis
Metode yang digunakan dalam penghitungan TPC, koliform, bakteri asam
laktat dan khamir yang terdapat dalam susu kuda adalah metode agar tuang (Fardiaz,
1992). Sebanyak satu ml susu kuda contoh dipipet ke dalam tabung reaksi berisi
sembilan ml larutan pengencer BPW steril yang selanjutnya merupakan faktor
pengenceran 10-1. Campuran dihomogenkan, kemudian diambil satu ml larutan dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi sembilan ml larutan pengencer NaCl
fisiologis steril sebagai pengenceran 10-2. Pengenceran 10-3, 10-4, dan seterusnya
diperoleh dengan cara yang sama.
Setiap pengenceran yang dikehendaki untuk dipupukkan, dipipet secara
aseptik sebanyak satu ml. Hasil pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri, yang
kemudian dituangi dengan 15-20 ml media steril dan dihomogenkan dengan cara
cawan digerakkan membentuk angka delapan. Khusus untuk koliform media dituang
sebanyak 15 ml, dihomogenkan, lalu dibiarkan membeku. Setelah itu dibuat over lay
dengan cara 5 ml media dituang kembali secara merata ke seluruh permukaan.
Penghitungan jumlah mikroorganisme dilakukan dalam media Plate Count
Agar (PCA) dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6, sedangkan penghitungan
bakteri asam laktat menggunakan media de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) pada
pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6.
Penghitungan koliform dilakukan dalam media Violet Red Bile Agar (VRBA)
dengan pengenceran 10-1, 10-2 dan 10-3 dan penghitungan khamir dilakukan dalam
media Potato Dextrose Agar (PDA) dengan pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6.
Penghitungan dilakukan secara duplo. Cawan petri diinkubasi dengan keadaan
terbalik dalam inkubator bersuhu 37 oC selama 24 jam. Koloni mikroba yang
terbentuk dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC) dengan rumus sebagai
berikut:
1 0,1 2
Keterangan :
N = Jumlah koloni yang berbeda dalam kisaran hitung (25-250 koloni) n1 = Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung n2 = Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung d = Pengenceran pertama yang dihitung
24
Setelah dilakukan tahapan persiapan kultur dan telah didapat jumlah total mikroba,
maka selanjutnya dihitung pengenceran yang diperlukan saat mengerjakan uji difusi
agar sumur.
Pengukuran Nilai pH (AOAC, 2005). Nilai pH diukur dengan alat pH meter
(Schott instrumen lab 850) yang telah dikalibrasi dengan larutan buffer pada pH 7
dan 4. Sampel susu fermentasi dimasukkan ke dalam gelas ukur, kemudian elektroda
dari pH meter dimasukkan ke dalam gelas ukur yang telah diisi dengan susu
fermentasi, nilai pH tertera pada layar pH meter.
Total Asam Tertitrasi (TAT) (Nielsen 2003). Sejumlah volume tertentu sampel
susu fermentasi ditambah tiga tetes Phenopthalein (PP) sebagai indikator, kemudian
campuran tersebut dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga terbentuk warna
merah muda pertama yang tidak hilang. Nilai derajat keasaman dapat dihitung
melalui konversi nilai keasaman menjadi persentase asam laktat sebagai berikut:
persen asam laktat .
100%
Keterangan:
N= normalitas titran (NaOH)
V1= Volume titran (ml)
V2= Volume sampel (ml)
Eq. Wt = Berat ekuivalen asam (asam laktat = 90,08)
Pengujian Aktivitas Daya Hambat Antimikroba Koumiss terhadap Salmonella Typhimurium
Pengujian aktivitas daya hambat antimikroba koumiss terhadap bakteri
Salmonella Typhimurium dilakukan dengan metode difusi agar sumur (modifikasi
Wiryawan et al., 2009). Perlakuan yang dilakukan berupa susu kuda pasteurisasi,
filtrat dan koumiss. Filtrat merupakan hasil sentrifugasi koumiss 6.000 rpm selama 20
menit. Filtrat koumiss digunakan sebagai perlakuan pembanding dan susu kuda
pasteurisasi sebagai kontrol.
Persiapan Bakteri S. Typhimurium ATCC 14028. Bakteri patogen yang
digunakan adalah bakteri yang berumur 24 jam. Bakteri patogen dengan populasi
awal minimal 108 cfu/ml (standar Mc Farland no. 0,5) untuk metode spread plate,
25
sedangkan untuk metode pour plate perlu diencerkan dalam media NaCl fisiologis
hingga populasi 106 cfu/ml.
Evaluasi Metode Konfrontasi Koumiss terhadap S. Typhimurium ATCC 14028
(Modifikasi Savadogo 2006 dan NCCLS). Pengujian aktivitas antimikroba koumiss
terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 dilakukan dengan metode difusi agar sumur
pour plate (Gambar 9) dan spread plate (Gambar 10).
Keterangan: 1= dimasukkan 50 µl koumiss
2= dimasukkan 50 µl filtrat koumiss
3= dimasukkan 50 µl susu kuda pasteurisasi
diencerkan hingga 106 cfu/ml
bakteri S. Typhimurium ATCC 14028 dipipet satu ml ke dalam cawan petri berdiameter 100 mm
dihomogenkan, dan dibiarkan hingga agar memadat
ditambahkan Muller Hinton Agar suhu 50 oC sebanyak 20 ml
dibuat 3 lubang atau sumur dengan corke borer pada media agar yang telah padat, kemudian ditambahkan Bacteriological Agar pada dasar lubang sumur
1
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam lalu diamati dan diukur diameter penghambatan setiap sumur
bakteri S. Typhimurium ATCC 14028 berumur 24 jam 108 cfu/ml (standar Mc. Farland no. 0,5)
1
2 2
3 3
Gambar 9. Diagram Alir Metode Difusi Agar Sumur Pour Plate
26
Metode pour plate dilakukan dengan cara sebanyak satu ml kultur bakteri S.
Typhimurium ATCC 14028 yang telah diencerkan dengan populasi 106 cfu/ml,
dipipet ke dalam cawan petri, lalu ditambahkan media Muller Hinton Agar (MHA)
pada suhu 50 oC sebanyak 20 ml/cawan dengan diameter 100 mm, kemudian
dihomogenkan dengan cara digerakkan membentuk angka delapan. Media MHA
berisi bakteri indikator dibiarkan memadat.
Metode spread plate dilakukan dengan menggores bakteri standar 0,5 Mc.
Farland tanpa perlu diencerkan secara merata, setelah media MHA dituang ke dalam
cawan dan memadat. Setelah itu dibuat sumur difusi berdiameter lima mm dengan
alat pelubang atau cork borer, lalu bagian bawah sumur dilapisi dengan media
Bacteriological Agar untuk menghindari koumiss merembes di dasar sumur.
Keterangan: 1= dimasukkan 50 µl koumiss
2= dimasukkan 50 µl filtrat koumiss
3= dimasukkan 50 µl susu kuda pasteurisasi
MHA dibiarkan hingga padat
bakteri S. Typhimurium ATCC 14028 berumur 24 jam 108 cfu/ml (standar Mc. Farland no. 0,5) dituang di atas MHA, kemudian dihomogenkan
dibuat 3 lubang atau sumur dengan corke borer pada media agar yang telah padat, kemudian ditambahkan Bacteriological Agar pada dasar lubang sumur
1
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam lalu diamati dan diukur diameter penghambatan setiap sumur
Muller Hinton Agar suhu 50 oC sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan berdiameter 100 mm
1
2 2
3 3
Gambar 10. Diagram Alir Metode Difusi Agar Sumur Spread Plate
27
Sebanyak 50 μl koumiss dipipet ke dalam sumur, lalu cawan beserta isi diletakkan
dalam refrigerator suhu empat derajat celcius selama 30 menit untuk memberi
kesempatan koumiss berdifusi ke dalam agar. Cawan selanjutnya diinkubasi pada
suhu 37 oC selama 24 jam. Diameter penghambatan berupa zona bening di sekeliling
sumur diukur dengan jangka sorong pada empat tempat yang berbeda, lalu hasil
pengukuran dirata-ratakan.
Penetapan Konsentrasi Koumiss untuk Penghambatan M. tuberculosis H37RV
Penetapan konsentrasi ini dilakukan untuk mengetahui persentase koumiss
yang tepat untuk ditambahkan ke dalam media Lowenstein Jensen dan dapat
menghambat pertumbuhan M. tuberculosis H37RV. Pembuatan Media Lowenstein
Jensen dilakukan dengan terlebih dahulu homogenisasi telur, penimbangan media
Lowenstein Jensen dan pembuatan media untuk pengujian penghambatan
(Sjahrurachman, 2008). Penanaman bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV
dilakukan setelah media penghambatan disiapkan. M. tuberculosis H37RV yang
telah ditanam, diinkubasi selama delapan minggu dengan pengamatan dilakukan
pada minggu keempat, keenam dan kedelapan.
Homogenisasi Telur. Telur bebek segar dibersihkan dengan cara digosok dengan
sikat dan sabun serta dicuci dengan air mengalir. Setelah itu telur dikeringkan dan
direndam dalam etanol 70% selama 15 menit. Telur dipecahkan dengan terlebih
dahulu membakar cangkang lalu ditampung di dalam gelas beker. Homogenisasi
telur dengan blender selama dua menit (jangan sampai terbentuk gelembung).
Larutan telur disaring dengan corong steril yang telah dilapisi dengan kasa steril.
Larutan telur diukur sehingga didapatkan satu l larutan.
Persiapan media Lowenstein Jensen. Media LJ (garam-garam, L-Asparagine)
dilarutkan dalam 600 ml. Gliserol sebanyak 12 ml dan 20 ml larutan malachite green
2% ditambahkan ke dalam larutan. Larutan dihomogenisasi hingga tercampur
sempurna kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 oC selama
15 menit. Media yang telah steril didinginkan sampai suhu 50 oC dan ditambahkan
telur homogen sebanyak satu l yang telah dipersiapkan secara steril dan perlahan-
lahan (pembentukan gelembung dihindari). Media yang telah siap dituang ke dalam
tabung ulir sebanyak 6-8 ml dan dimasukkan oven pada suhu 85 oC selama 45 menit
pada posisi miring 30o.
28
Media Lowenstein Jensen Resistensi. Pengujian aktivitas daya hambat dengan cara
menambahkan koumiss dengan persentase tertentu ke dalam media LJ. Persentase
yang diuji sebesar 5%;7%;10%;12%;14% dan 20%. Setelah itu baru dilakukan
inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV.
Inokulasi Bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV. Inokulasi diawali dengan
persiapan suspensi bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV dengan konsentrasi
standar 0,5 Mc. Farland lalu diencerkan hingga 103 cfu/ml. Pengenceran dilakukan
dengan menambahkan 1% bakteri (v/v) ke dalam lima ml NaCl fisiologis. Sebanyak
100 µl suspensi bakteri diinokulasi ke dalam media resistensi yang telah disiapkan
dengan menggunakan pipet man secara duplo. Setelah itu suspensi diratakan pada
seluruh permukaan media resistensi. Inkubasi tabung-tabung media dengan posisi
horizontal dengan sudut kemiringan 30o ke dalam inkubator suhu 37 oC selama satu
malam dengan tutup longgar. Setelah inkubasi, tutup tabung dieratkan dan tabung
ditegakkan menjadi posisi vertikal. Pembacaan pertumbuhan koloni dilakukan pada
hari ke 28 dan 42.
Pengujian Penghambatan M. tuberculosis H37RV
Pengujian untuk bakteri M. tuberculosis H37RV dilakukan dengan membuat
media penghambatan yaitu menambahkan koumiss yang telah mengalami perlakuan
penyimpanan dengan persentase sesuai hasil penetapan ke dalam media Lowenstein
Jensen. Penanaman dan pengujian penghambatan dilakukan sesuai dengan metode di
atas.
Pembacaan Uji Penghambatan M. tuberculosis H37RV
Hasil resistensi dibaca pertama kali pada hari ke-28. Jika pembacaan pada
hari ke-28 tersebut adalah resisten, maka tidak perlu diadakan pembacaan ulang,
sehingga produk dinyatakan resisten terhadap Mycobacterium tuberculosis. Jika hasil
pembacaan pada hari ke-28 adalah sensitif maka perlu dilakukan pembacaan ulang
pada hari ke-42 untuk meyakinkan hasil pembacaan pada hari ke-28.
Rancangan
Analisis Data
Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis deskriptif
dengan perlakuan pemberian antimikroba pada taraf kontrol (susu kuda pasteurisasi),
29
pemberian filtrat koumiss dan pemberian koumiss serta perlakuan penyimpanan
koumiss hari ke-0, 2, 4, 6 dan 8 untuk pengujian terhadap S. Typhimurium ATCC
14028. Perlakuan untuk Pengujian M. tuberculosis H37RV yaitu perlakuan
penyimpanan koumiss hari ke-0, 2, 4, 6 dan 8. Analisis data untuk M. tuberculosis
H37RV menggunakan rancangan non-parametrik uji Cohran. Model statistik yang
digunakan sebagai berikut:
M. tuberculosis H37RV
Uji Cohran (Daniel, 1990)
1 ∑ – 1∑
Keterangan:
Q = Statistik Cohran C = Jumlah ulangan N = Jumlah total perlakuan R = Jumlah total ulangan
Jika hasil zona penghambatan bakteri M. tuberculosis H37RV menunjukkan
perbedaan diantara taraf perlakuan yang diberikan, maka analisis akan dilanjutkan
dengan uji banding nilai tengah Cohran. Pengolahan data dibantu dengan software
statistik program MedCalc 11.5.0.0.
Peubah yang Diamati
Peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah karakteristik mikrobiologis
susu kuda dan koumiss berupa jumlah TPC, koliform, bakteri asam laktat dan khamir
serta aktivitas daya hambat antimikroba terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 dan
pengujian penghambatan koumiss terhadap M. tuberculosis H37RV. Aktivitas daya
hambat antimikroba dihitung berdasarkan diameter zona bening di sekeliling sumur
(mm), sedangkan pengujian penghambatan terhadap Mycobacterium tuberculosis
H37RV dilihat berdasarkan jumlah koloni yang masih tumbuh. Penilaian dengan
skor yaitu 0 (tidak tumbuh) dan 1 (tumbuh).