metodiche molecolari applicate a campioni paraffinati di tumori della ewing family (eft) a....
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METODICHE MOLECOLARI APPLICATE A CAMPIONI PARAFFINATI DI
TUMORI DELLA EWING FAMILY (EFT)
A. Parafioriti(1), S. Del Bianco(1), E. Armiraglio(1), S.Mapelli(2)
(1) U.O. Anatomia Patologica; (2) Centro di Chirurgia Ortopedica Oncologica
Istituto Ortopedico Gaetano Pini - Milano
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Sarcoma di EwingTumore maligno dell’osso più comune in età pediatrica dopo l’osteosarcoma con prognosi legata a :• presentazione localizzata (70 % sopravvivenza)• metastatica (30% sopravvivenza)
FLI1 CD99
Descritto da J. Ewing nel 1920 e rimasto per decenni ad istogenesi incerta. Oggi sappiamo che ha origine neuroectodermica e che insieme al Tumore di Askin ed ai Tumori neuroectodermici primitivi (PNET) costituiscono un gruppo chiamato EFT con caratteristiche istologiche, immunofenotipiche, genetiche comuni.
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Caratteristiche citogeneticheIl sarcoma di Ewing presenta delle traslocazioni cromosomiche peculiari:t(11;22) nel 70% dei casit(21;22) nel 10% dei casit(7;22) nel 5% dei casit(17;22) ed altre…
La traslocazione più frequente t(11;22)(q24;q12) produce un gene chimerico EWS/FLI1 che codifica per una proteina espressa nel 90% dei EFT.
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Riscontro delle traslocazioni
L’identificazione delle traslocazioni è importante:
-per motivi diagnostici (diagnosi differenziale dei tumori a piccole cellule Ewing-like)-
- per motivi prognostici/predittivi (valutazione di malattia residua a livello midollare e plasmatico).
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Scopo dello studio
Abbiamo applicato routinariamente la metodica RT-PCR che permette di rilevare la presenza dei trascritti di fusione più comuni EWS/FLI1 e EWS/ERG in sezioni tumorali paraffinate di pazienti portatori di EFT dello scheletro.
L’accurata scelta dei primers ha reso possibile, con un’unica amplificazione, la discriminazione tra i due sottotipi del trascritto EWS/FLI1.
Alcuni casi sono stati tipizzati anche con metodica di Real-Time PCR (qRT-PCR).
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Metodi
L’analisi è stata condotta su 53 campioni di sarcoma EFT dell’osso.
• L’RNA è stato estratto da sezioni paraffinate con un kit commerciale
• Il risultato dell’estrazione è stato valutato allo spettrofotometro ottenendo valori di ratio e resa.
• Due microgrammi di RNA sono stati retrotrascritti in cDNA ed è stata effettuata una PCR sul gene housekeeping PGK per verificare la buona qualità del cDNA.
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Metodi
• La PCR standard è stata condotta amplificando circa 200 ng di cDNA ed utilizzando una coppia di primers in grado di discriminare i due sottotipi di trascritto di fusione.
• Su 5 campioni di cui 3 risultati negativi in PCR standard è stata condotta un’analisi di Real-Time PCR utilizzando il metodo del SYBR green con la stessa coppia di primers usata in PCR standard.
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Risultati
La tipizzazione dei pazienti per il trascritto di fusione EWS/FLI1 ha fornito i seguenti risultati:
EWS/FLI1 tipo 1 36
EWS/FLI1 tipo 2 6
Nessun trascritto 7
RNA degradato 4
Totale 53
Di 5 pazienti analizzati mediante q RT- PCR:
• 3 confermati negativi
• 2 positivi per EWS/FLI1
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A B C D E F G
Lane A e D = trascritto EWS/FLI1 tipo 1
Lane B e E = trascritto EWS/FLI1 tipo 2
Lane C = nessun trascritto
Lane F = marcatore 25bp
Lane G = marcatore 100bp
PCR standard
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Vantaggi della Real-Time PCR
La rilevazione dei trascritti di fusione tramite metodica di RT- PCR può essere utile come supporto alla diagnosi degli EFT• Accresce enormemente la sensibilità dell’analisi minimizzando il rischio di falsi positivi.
• Non richiede ulteriori indagini post-PCR per la visualizzazione dei risultati (elettroforesi su gel di agarosio) e la verifica della loro identità (sequenziamento).
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Conclusioni
La caratterizzazione citogenetica dei tumori appartenenti alla EFT integra i dati morfologici ed immunofenotipici della diagnosi istopatologica, al fine di una classificazione sempre più accurata, della possibilità di identificare sottogruppi di pazienti con prognosi diversa o riprese di malattia altrimenti non ancora “detectable”.