TEMA: MÉTODO BRADFORD

Universidad Politécnica de Tlaxcala

Calidad del producto Biotecnológico

Profesor: Amado Israel Grandes Blanco

Integrantes:Elizabeth Maldonado Lima

Valeria Gracia Osorio

GRUPO: 3ro “B”

Ing. En Biotecnología9/agosto/2012

Proteínas

Son macromoléculas formadas por residuos de aminoácidos.

Pueden tener distintas funciones:DefensaTrasporteReservaEnzimasMovimientoEstructuralesRegulación

Es importante contar con una técnica que permita determinar la cantidad presente en una muestra biológica (orina, sangre, plasma, extracto vegetales, semillas, células, tejidos, etc.).

Purificación de proteínas.Actividad Enzimática.Diagnostico de enfermedades

MÉTODOS

Métodos de Absorción:Propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV.

Métodos Derivados Fluorimétricos:Formación de derivados químicos.

Métodos Colorimétricos La capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS

• Fue diseñado por Bradford en 1976.

• Técnica sensible, simple (1-15 μg), rápida (la reacción finaliza a los 5 min. y es estable hasta una 1 hr.), barata y pocas sustancias interfieren en su determinación.

• Consiste en la medición de la extinción provocada por el cambio en el espectro visible de un colorante.

MÉTODO BRADFORD

PREPARACIÓN DEL REACTIVO

Colorante Coomassie brilliant blue G-250 (también Serva Blue)  

En solución ácida

Azul rojo

Forman un complejo proteína-colorante

Se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína.

Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos.

Colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm.

La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de proteínas.

MÉTODO

Realizar una curva de calibración

• Se requiere contar con un solución testigo de proteína de concentración conocida (generalmente se utiliza albúmina sérica bovina o inmunoglobulina G).

• Se preparan por lo menos 4 tubos testigos con distintas cantidades de proteínas.

• Luego se agrega la misma cantidad del reactivo de Bradford a cada tubo

Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm)

y = 5.2361x + 0.0102

R2 = 0.998

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

Albúmina (mg)

Abs

(595

nm

)

Abs promedio ( Lineal)Abs promedio

y = Abs 595

m = pendiente

x= la concentración de proteínas

b = ordenada al origen

CURVA DE CALIBRACIÓN

ANÁLISIS DE LA MUESTRA PROBLEMA

Se preparan diluciones con la solución de NaCl 0.15 M:

1:10,1:20,1:50

• Se mide la absorbancia 595 nm , y los datos se interpolan en la ecuación de la recta y=mx +b

• Se toman 200 ul de cada una de las diluciones y se les agrega 2 ml de reactivo de coomassie.

INTERPRETACIÓNEn aplicaciones muy especificas el método de Bradford es muy útil para la determinación de proteínas tal es el caso, que Bradford (1976) menciona que valores fuera de un rango establecido no son confiables para la cuantificación de proteína en tejidos y fluidos. De esto nos pudimos dar cuenta en artículos como “Adaptación de métodos en microplacas para identificar mecanismos de resistencia en Tetranychus urticae Koch” en donde podemos darnos cuanta que al analizar profundamente el caso y estudiarlo se concluyen que las oxidasas, y las α y β esterasas estudiadas aportaron mayor presencia dentro de la población de campo, por lo que estas enzimas son las responsables de la resistencia a acaricidas de la población de T. urticae Koch en estudio.

Ya que se realizan comparaciones en la absorbancia para saber el factor que está determinando las condiciones para que los rangos tengan variación significante o no. La diferencia de lecturas (T10–T0) se usó para el análisis de los resultados. Pero para que se pueda llevar a cabo todo esto es importante establecer patrones, en este caso tomar en cuenta a otras proteínas como base para comparación en las futuras lecturas de absorbancia una de las proteínas más utilizada puede ser la albúmina sérica bovina (ASB)

REFERENCIA:

Agrociencia vol.44 no.6 México Ago./sept. 2010

versión impresa ISSN 1405-3195.

Biotecnología.

“Adaptación de métodos en microplacas para identificar mecanismos de resistencia en Tetranychus urticae Koch”

Ernesto Cerna, Yisa Ochoa, Mohammad Badii, Jerónimo Landeros.

 http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1405-31952010000600002&script=sci_arttext