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7/26/2019 Mtodos de Histologia.pdf

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Mtodos de Histologiamaro 22, 2012

Embriologia e HistologiaHistologiahistologia,mtodos,MicroscopiaDeixe um

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Microscopia Na aula prtica , foi constado que o microscpio possui vrios componentes e que

cada um possui uma determinada funo. Entre os componentes podemos citar: lente

ocular (10x), tubo binocular, revlver, objetiva (4x,10x,40x,100x), prendedor de lmina,

diafragma do condensador, diafragma do campo, base, regulador da intensidade

luminosa, macromtrico e micromtrico. Todos esses componentes funcionam em

conjunto com o objetivo de aumentar a imagem a ser visualizada.

Durante a prtica foi aprendido a manusear o microscpio, entre os conceitos bsicos

esto, verificar se a voltagem do aparelho condiz com a da tomada, antes de ligarajustar a intensidade da luz e deixar o aparelho na objetiva de 4x.

Para o ajuste do foco necessrio o manuseio do macro e micromtrico sendo que o

macro serve apenas para a primeira aproximao e micro para o ajuste final, pois seu

movimento mais sensvel.

Histologia

Na primeira aula em laboratrio de histologia foi posto em prtica conceitos visto em

sala de aula, onde revisamos passo a passo o preparo de lminas atravs do mtodo

com parafina.

O primeiro passo a colheita que pode ser realizada atravs de necropsia.

O segundo passo a fixao, que pode ser usado formaldedo, lcool, acido actico

ou acido pcrico, que tem como objetivo interromper a morte programada da clula e

manter como proporo de 30/1 em pelo menos 24 horas.

O terceiro passo a desidratao, que tem como objetivo eliminar toda gua existente

na clula. Para isso se usa o etanol 70% at chegar ao 100%.

O quarto passo a diafanizao que tem como objetivo garantir que no existe mais

gua na clula. Nesse processo usado o xileno, que torna miscvel o tecido com a

parafina.

O quinto passo a incluso, em que se utiliza a parafina quente no seu ponto de fuso

(mais ou menos 45C).

O sexto passo o corte, realizado pelo micrmetro, esse corte deve ser extremamente

fino com aproximadamente 5m.
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O stimo passo o banho-maria em que a parafina derrete e cola na lmina de vidro,

que seria a montagem.

O oitavo passo a colorao. Nesse processo removido a parafina e hidratado o

tecido que seria corado e desidratado rapidamente em lcool 70% a 100%.

Para finalizar o processo realizada a montagem da lmina, e deixando a mesma em

blsamo do Canad para conservao do tecido.

Mtodos de estudos Histolgicosmaro 15, 2012

Embriologia e HistologiaHistologiaaula,embriologia,histologia,mtodos de estudo

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Vrios so os mtodos de estudos dos tecidos, variando do estudo dos tecidos invivo at aqueles que utilizam os tecidos mortos. O mtodo mais utilizado em Histologia

opreparado histolgico permanente (lmina histolgica) estudado em microscpio

ptico. A seguir descrevemos as etapas de produo de uma lmina histolgica:

1 Etapa: Coleta da Amostra

A primeira etapa de todo o processo de preparao de uma lmina histolgica consiste

em coletar a amostra, ou seja, obt-la e isto pode ser feito, por exemplo, por

necropsia.

As peas cirrgicas grandes ou de autpsia devem ser clivadas previamente para

reduzir sua espessura permitindo a penetrao fcil do fixador. O princpio

fundamental de clivagem que o fragmento possua em torno de 4 mm de espessura.

2 Etapa: Fixao

A base de uma boa preparao histolgica a fixao que deve ser completa e

adequada. Para tanto preciso tomar algumas precaues que so obrigatrias:

a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador;
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b) O volume de fixador deve ser em torno de 30 vezes maior que o volume da pea

coletada.

Os principais objetivos da fixao so:

a) Inibir ou parar a autlise tecidual;

b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusveis as substncias insolveis;

c) Proteger, atravs do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e

procedimentos tcnicos posteriores;

d) Preservar os vrios componentes celulares e tissulares;

e) Melhorar a diferenciao ptica dos tecidos;

f) Facilitar a subseqente colorao.

3 Etapa: Desidratao

Antes que um material de incluso, tal como a parafina, possa penetrar no tecido seu

contedo em gua deve ser removido. A desidratao levada a efeito imergindo o

bloco de tecido em concentraes crescentes de lcool etlico. O lcool o agentemais comumente utilizado neste processo, sendo empregado numa srie crescente

(70%80%90%100%) para se evitar a retrao pronunciada do tecido

ocasionando leses estruturais da clula de carter irreversvel. O lcool tem a

vantagem de endurecer mais o tecido. O volume de lcool dever ser 10 a 20 vezes

maior que o volume da pea.

Vrias so as substncias utilizadas como agentes de desidratao: lcoois etlico,

butlico, metlico e isoproplico, a acetona, o ter, o clorofrmio e o xido propileno. O

lcool etlico o mais utilizado em tcnica de rotina.

4 Etapa: Diafanizao (Clarificao)

A impregnao do tecido com meio de incluso impossvel nesse estgio porque as

substncias semelhantes parafina usadas para a incluso no se misturam com o

lcool. O tecido deve, portanto, ser imerso em um produto qumico e que o lcool e a

parafina sejam solveis. Assim a diafanizao consiste na infiltrao do tecido por um

solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina no se

mistura com gua e nem com lcool. Ambos devem ser completamente removidos

para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. O xilol comumente

utilizado. Tal produto qumico muitas vezes chamado de agente clarificador porque

torna o tecido semi-translcido, quase transparente. Entre os reagentes mais utilizados


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na fase de diafanizao podemos citar ainda: toluol, clorofrmio, leo de cedro, benzol

e salicilato de metila.

A quantidade de xilol (substncia mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o

volume da pea. A durao da clarificao varia com as dimenses, a constituio do

material e a temperatura.

5 etapa: Incluso (Impregnao)

A finalidade da impregnao eliminar completamente o xilol contido no material e a

total penetrao da parafina nos vazios deixados pela gua e gordura, antes

existentes no tecido. Este processo serve tambm para preparar o material para os

cortes, removendo o clarificante e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a

consistncia adequada para que possa ser cortado.

O tecido passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituio de todo

o agente clarificador pela parafina. Emprega-se a parafina a uma temperatura emtorno de 45 C (parafina fundida). O bloco de tecido permanecer imerso na parafina

fundida (em estufa) durante o tempo necessrio para a completa impregnao.

Posteriormente sero retirados da estufa e deixados temperatura ambiente at que a

parafina endurea, aps isto o bloco de parafina com o tecido ser retirado da frma e

conduzido ao corte. Pode-se citar ainda como agentes de impregnao: celoidina,

goma arbica, parafina plstica, polietileno glicol e parafina esterificada.

6 etapa: Microtomia (corte)

Para se obter cortes de material includo em parafina ou por congelao necessrioum instrumento especial: o micrtomo. Os micrtomos variam de acordo com os

fabricantes e tem como fundamento duas peas principais: o suporte ou mandril (onde

fixada a pea a cortar) e a navalha. O suporte sempre encaixado a um parafuso

micromtrico ou a uma espiral metlica que o faz adiantar segundo seu eixo, em

medida conhecida e que pode ser regulada vontade. Esta medida tem como unidade

o micrmetro que corresponde milsima parte do milmetro. Normalmente um

micrtomo faz cortes cuja espessura varia de 1 a 50 micrmetros, mas a espessura

mais utilizada em microscopia ptica de 4 a 6 micrmetros. H vrios tipos de

micrtomos: rotativo, tipo Minot, de congelao e o destinado a trabalhos demicroscopia eletrnica.

7 etapa: Colagem do Corte Lmina

As fitas de cortes de parafina so estiradas cuidadosamente e os cortes individuais

so separados por um bisturi. Na superfcie de uma lmina de vidro feito um ponto

de aderncia (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina colocado

embanho-maria(gua morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no

tecido desapaream. Aps o que o corte pescado com a lmina, preparada com

albumina, na qual se adere.

8 etapa: Colorao


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a tcnica tintorial empregada para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia. A

colorao de importncia fundamental em histologia, pois os tecidos no tratados

tm pouca diferenciao ptica. As coloraes de um modo geral se efetuam por

processos fsico-qumicos ou puramente fsicos e podem ser consideradas, segundo a

modalidade, a ao, o carter, o grau de ao, o tempo, o nmero de corantes e acromatizao.

Quanto cromatizao, ou seja, de acordo com o nmero de cores conferidas s

estruturas pelas coloraes simples ou combinadas, estas tomam a denominao de

coloraes monocrmicas (uma cor), bicrmicas (duas cores), tricrmicas (trs

cores) e policrmicas (mais de trs cores).

Para se corar convenientemente a clula, deve-se recorrer a um mtodo de colorao

sucessiva do ncleo e do citoplasma.

A combinao mais comum de corantes usada em Histologia e Histopatologia aHematoxilina e Eosina (HE). A hematoxilina um corante natural obtido da casca

de pau campeche. Ela no realmente um corante e deve ser oxidada em hematena

a fim de tornar-se um corante. Ademais, o corante que resulta (hematoxilina-

hematena) no tem afinidade para os tecidos. Deve ser usado um mordente, como o

alumnio ou o ferro, juntamente com a mistura de hematoxilina antes que ela possa

corar os tecidos. A mistura cora em azul-prpura. A eosina um corante sinttico e

produz uma coloraovermelha.

Nas clulas coradas com HE os cidos nuclicos presentes no ncleo so corados

pela hematoxilina, dando ao ncleo um tom azul-prpura. A eosina atrada peloselementos bsicos da protena do citoplasma da clula, corando-o de rseo a

vermelho. Os componentes dos tecidos que se coram prontamente com os corantes

bsicos so chamados basfilos; os que tm afinidade pelos corantes cidos so

chamadosacidfilos. A hematoxilina comporta-se como um corante bsico e,

portanto, cora o ncleo de modo basfilo. A eosina um corante cido e cora os

elementos bsicos da protena do citoplasma de maneira acidfila.

Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi includo deve ser removida. O

corte, que j foi aderido lmina de vidro (pescagem em banho-maria), banhado no

xilol para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solveis emgua, torna-se necessrio remover o xilol do tecido e substitu-lo por gua

(hidratao). O corte imerso em uma srie de concentraes decrescentes de lcool

etlico at que esteja hidratado. Depois que o corte estiver hidratado procede-se

colorao propriamente dita. No caso da HE, o tecido imerso primeiramente em

hematoxilina, lavado com gua para retirada de excedente, depois imerso em eosina

e, aps isto tambm se faz lavagem do tecido.

9 etapa: Montagem


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Depois que o corte tiver sido corado com a soluo apropriada, ele passado atravs

de concentraes crescentes de lcool para remover, de novo, a gua (desidratao).

Objetiva-se com esta desidratao aumentar a sobrevida do preparado histolgico.

Finalmente, o corte banhado em xilol antes de ser montado em um meio solvel em

xilol, que o meio de montagem (para os cortes de parafina usado o Blsamo de

Canad). Uma gota do meio de montagem colocada sobre o corte e a lamnula

posicionada sobre o corte de forma

delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o corte.

Depois a lamnula comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se

espalha formando uma delgada pelcula entre a lmina e a lamnula que

posteriormente vo estar firmemente aderidas uma outra pela estabilizao do meio

de montagem.

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