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28/03/14 Métodos de laboratorio> BAM: Métodos microbiológicos para cosméticos

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BAM: Métodos microbiológicos para cosméticos08 2001

Bacteriológico Analítico Manual Capítulo 23 Métodos microbiológicos para cosméticosAutores: Anthony D. Hitchins Tony T. Tran, y James E. McCarron

Para obtener información adicional, póngase en contacto con Rebecca Campana

Historial de revisiones:

Agosto de 2001: Sección: Identificación de los microbios. Revisado de la Parte D y ha añadido 2breferencia.

Agosto de 2001: formulación M79 corregido.

La capacidad de los microorganismos para crecer y reproducirse en los productos cosméticos ha sidoconocido durante muchos años. Los microorganismos pueden causar deterioro o cambios químicos en losproductos cosméticos y los daños para el usuario (4,5,10,14-16,20,21). Métodos para el aislamiento demicroorganismos a partir de los productos cosméticos son los recuentos de colonias directos y cultivo deenriquecimiento. Los productos que no son solubles en agua se tratan inicialmente de que sean misciblesantes de que se llevaron a cabo los procedimientos de aislamiento. Medios de dilución y de las planchas quese utilizan sistemas conservantes parcialmente inactivate se encuentran comúnmente en los productoscosméticos. Los microorganismos aislados se identifican por métodos microbiológicos de rutina o mediantekits comerciales de identificación. El esquema para estos análisis se resume en la figura. 1.

A. Equipos y materiales

1. Pipetas, estéril, 1, 5 y 10 ml, se graduaron

2. Gasas, estéril, 4 x 4 pulgadas

3. Los instrumentos estériles: pinzas, tijeras, bisturí y cuchillas, espátulas y microspatulas

4. Tubos de ensayo, con tapón de rosca, 13 x 100, 16 x 125 y 20 x 150 mm

5. Botellas de dilución, con tapón de rosca

6. Equilibrio, sensibilidad de 0,01 g

7. Placas de Petri, estériles, de plástico, 15 x 100 mm

8. Varillas de vidrio doblado, estéril

9. Incubadoras, 30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C

10. Sobres generadores de atmósfera anaerobia, tiras indicadoras, y tarros (BBL o Oxoid), oincubador anaerobio, 35 ± 2 ° C, o en la guantera anaeróbica, 35 ± 2 ° C.

11. Tarros de la vela o de CO 2 incubadora, 35 ± 2 ° C.

12. Campana de flujo laminar con filtro HEPA, si está disponible

13. Vitek o sistema de identificación automatizado computarizado equivalente

B. Medios1 de enumeración e identificación de las bacterias Gram-positivas y hongos

1. Agar anaerobios ( M112 )

2. Agar bilis esculina ( M183 )

3. Infusión de cerebro y corazón (BHI) agar y caldo de ( M244 )

4. Agar extracto de malta (MEA) ( M935 )

5. Agar de dextrosa de patata (PDA) ( M1276 )

6. Agar sal manitol ( M977 )

Comida

CasaComidaCiencia e Investigación (Alimentación)Métodos de laboratorio

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7. Agar leten Modificado (MLA) ( M788 ) y el caldo (MLB) ( M799 )

8. (DE) medio de ensayo-oxidativo fermentativa ( M11710 )

9. Caldo de dextrosa de Sabouraud ( M13311 )

10. Base de agar sangre ( M20A12 )

11. Agar de almidón ( M14313 )

12. Tripticasa (tríptico) agar de soja (TSA) ( M15214 ) y el caldo (TSB) ( M15415 )

13. Baird-Parker (BP) agar ( M1716 )

14. Prueba de la catalasa ( R1217 )

15. Vogel-Johnson (VJ) agar (opcional) ( M17618 )

16. Kit de identificación bacteriana Comercial (API o equivalente)

La figura. 1: Esquema de la enumeración, el aislamiento e identificación de los microbioscosméticos

Preparación de la muestra.

Diluir las muestras preparadas en las Grandes Ligas.

Extender las muestras duplicadas en 0, l ml

(A) (B) (C) (D)MLA 48h, 30 ° C

PDA (o MEA) con clortetraciclina 7 días, 30 ° C

BP (o VJ) de agar 48h, 35 ° C (opcional)

Agar anaeróbico MLA días 2-4, 35 ° C

Enriquecer diluciones MLB durante 7 días, a 30 ° C. Se purifica el crecimiento sólo si no hay coloniasen MLA.

Recuento de las colonias y la subcultura diferentes tipos de colonias en agar MacConkey y MLA (y BPo VJ agares si se utiliza en c, arriba). Para aislados fúngicos, ver texto.

Determine la reacción de Gram, forma de la célula, y la producción de catalasa de los aislamientospurificados.

Procederá a la identificación de las cepas bacterianas que se describen en el texto o utilizar juegos deidentificación.

La figura. l. Abreviaturas: MLB, caldo leten modificado; MLA, agar leten modificado; PDA, agar papadextrosa; MEA, agar extracto de malta; BP, Baird-Parker, VJ, Vogel-Johnson.

C. Medios19 para la identificación de Enterobacteriaceae

1. Caldo de hidratos de carbono de Andrade y el indicador ( M1320 ) para las pruebas demetabolismo de ramnosa, manitol, sorbitol, arabinosa

2. Agar hierro lisina ( M8921 )

3. Caldo de malonato de dietilo ( M9222 ) o fenilalanina caldo de malonato de dietilo (Difco)

4. Medio de ornitina-Motilidad indol ( M9923 )

5. Caldo MR-VP ( M10424 )

6. Agar citrato de Simmons ( M13825 )

7. Hierro triple azúcar (TSI) agar ( M14926 )

8. Agar urea de Christensen ( M4027 )

9. Agar MacConkey ( M9128 )

10. Medio lisina descarboxilasa para las bacterias Gram-negativos no fermentadores ( M8829 )

11. Agar desaminasa Fenilalanina ( M12330 ) ( véase también el C-3, más arriba)

12. API 20E, Roche Enterotube u otros kits de identificación equivalentes


























Incubar todas las pruebas bioquímicas utilizando medios de comunicación en B y C, por encima, a35-37 ° C durante 18-24 h, excepto el caldo malonato (48 h) y el caldo MR-VP (48 horas o más).

D. Medios31 y reactivos32 para la identificación de bacterias Gram-negativos no fermentadores (NF)bacilos

1. La acetamida medio ( M233 )

2. Flagelar mancha de Clark ( R1434 )

3. Agar esculina, modificado (CDC) ( M5335 )

4. Gelatina de nutrientes (CDC) ( M11536 )

5. Medio Indol ( M6437 ) y medio indol (CDC) ( M6538 )

6. Medio de King B ( M6939 )

7. De la lisina descarboxilasa (PMA) medio para las bacterias Gram-negativas NF ( M8840 )

8. Medio de nitrato Motilidad ( M10141 )

9. Caldo de nitrato, enriquecido (CDC) ( M10942 )

10. Rey de DE medio basal ( M7043 ) para las pruebas de metabolismo de la sacarosa, lactosa,fructosa, esculina, xilosa, glucosa (dextrosa), manitol, salicina, sorbitol, y maltosa

11. Tiras de prueba de oxidasa

12. Agar urea de Christensen ( M4044 )

13. Medio basal descarboxilasa (por arginina descarboxilasa) ( M4445 )

14. El extracto de levadura (YE) agar ( M18146 )

15. Pseudomonas agar F ( M12847 y P ( M12948 ) (Difco)

16. Agar cetrimida (Pseudosel TM , BBL, Difco), o equivalente ( M3749 )

17. Glicerol, estéril (Difco), o equivalente

18. API, NFT, u otro sistema de identificación comercial equivalente

19. Caldo citrato de Koser ( M7250 )

E. Otros medios de comunicación51 y los reactivos52

1. Solución acuosa de etanol al 70% y 1% de HCl (v / v) o 4% de yodo en solución de etanol al70% o solución de glutaraldehído al 2%

2. De Tween 80 (Polysorb 80)

3. Etanol, 95% (v / v)

4. Coagulasa plasma de conejo liofilizado con EDTA

5. 3% (v / v) Solución acuosa de peróxido de hidrógeno

6. La tinción de Gram ( R3253 ) y la mancha endospore ( R32A54 )

7. Medio de carne cocida ( M4255 )

F. Manipulación de las muestras de cosméticos para el análisis microbiológico

Analizar las muestras tan pronto como sea posible después de su llegada. Si es necesario, guarde lasmuestras a temperatura ambiente. No incubar, refrigerar o congelar las muestras antes o después desu análisis. Inspeccione las muestras cuidadosamente antes de abrir y tomar nota de lasirregularidades del recipiente de la muestra. Desinfectar la superficie de recipiente de la muestra con lamezcla acuosa de etanol al 70% (v / v) y 1% de HCl (v / v) u otro desinfectante ( ver El) antes deabrir y retirar contenidos. Utilice campana de flujo laminar, si es posible. Superficie seca con una gasaestéril antes de abrirlo. Utilice porción representativa de contenido para el análisis microbiano, porejemplo, 1 g (ml) porción de muestra.

Para los productos que pesen menos de 1 g (ml), analizar el contenido completo. Si sólo hay unaunidad de muestra está disponible y múltiples análisis que se desean (es decir, microbianos,toxicológicos y química), tomar la submuestra para análisis microbiológico antes de los de otrosanálisis. En esta situación, la cantidad de submuestra utilizada para el análisis microbiano dependeráde otros análisis a ser realizados. Por ejemplo, si el contenido total de la muestra es de 5 ml, utilizar 1




























o 2 porción ml para análisis microbiano.

G. Preparación preliminar muestra

Las cantidades de muestra y diluyente que aquí se pueden ajustar de acuerdo a la cantidad demuestra disponible. Si la muestra tiene muchas submuestras, cantidad de material de prueba puedeser aumentado y la carga de trabajo racionalizado por composición. Los analistas deben utilizar sumejor juicio para decidir cuándo y cuánto material compuesto.

1. Líquidos . Decimalmente diluir 1 ml de líquido directamente en 9 ml de caldo modificados leten

(MLB) en 20 x 150 mm tubo de ensayo con tapón de rosca para el 10 -1 dilución.

2. Los sólidos y polvos . Asépticamente separación y pesado de 1 g de muestra en tubo deensayo con tapón de rosca de 20 x 150 mm que contiene 1 ml de Tween 80 estéril. Dispersarproducto en Tween 80 con espátula estéril. Añadir 8 ml estéril MLB y mezclar bien. Este será el

10 -1 dilución.

3. Crema y productos a base de aceite . Asépticamente separación y pesado de 1 g de muestraen un tubo con tapón de rosca de 20 x 150 mm que contiene 1 ml de Tween estéril 80 más seis ycincuenta y cinco cuentas de vidrio de 5 mm (o de diez a quince cuentas de vidrio de 3 mm).Mezcle los contenidos totales con mezclador Vortex. Ajustar volumen total a 10 ml con estéril

MLB (8 ml) para el 10 -1 dilución.

4. Los aerosoles de polvos, jabones, líquidos y otros materiales . Descontaminar la boquilla deaerosol lo más posible en muestras de secreciones con una gasa humedecida con 70% (v / v) deetanol acuoso. Expulsar parte del producto para enjuagar la boquilla; luego rociar cantidadapropiada en la botella de dilución tarado, por ejemplo, 1 g de producto en 9 ml estéril MLB.

Mezcle bien el producto y el caldo, y pesar de nuevo. Este será un 10 -1 dilución si se obtuvoexactamente 1 g de muestra.

5. Materiales anhidros . Tratar como en el G-2 o G-3, según corresponda.

H. Evaluaciones microbiológicas

No todos los análisis descritos a continuación serán necesariamente realizarse, sin embargo, elrecuento de aerobios, enriquecimiento de la cultura y el recuento de hongos se deben realizar deforma rutinaria.

1. Recuento de placa aerobia (APC) . Utilice una técnica de extensión en placa para facilitar elreconocimiento de los diferentes tipos de colonias y, en caso necesario, para el recuentodiferencial. Utilice también Baird-Parker (BP) o Vogel-Johnson (VJ) agar si Staphylococcus spp.son sospechosos. Preparar y etiquetar conjuntos de duplicados de placas de Petri que contenían

agar modificado leten (MLA) y agar BP para muestras de 10 -1 a 10 -6 diluciones. Añadir ya sea 5o 10 ml de la preparación cosmética preparada ( ver G, más arriba) a 45 o 90 ml,

respectivamente, de la MLB, para 10 -2 dilución.

Diluir las muestras decimalmente en MLB ( NOTA : salvar diluciones para el paso de

enriquecimiento) para obtener series de dilución total de 10 -1 a 10 -6 . (Comienza con 10 -2 si

todo el 10 -1 dilución se ha agotado.) Mezclar bien las diluciones y pipeta de 0,1 ml de cadadilución en superficies de medios sólidos en platos petri premarcan. Spread inóculo sobre toda lasuperficie con varilla de vidrio doblado que se esteriliza primero por inmersión en etanol al 95% yrápidamente flameado para eliminar el etanol. Deje medio absorber inóculo antes de invertir eincubando las placas durante 48 horas a 30 ± 2 ° C (35 ° C para las placas de BP). Utilice elnuevo difusor para cada dilución (en diluciones bajas), ya que algunos restos del producto, podráarrastrar y afectar negativamente el procedimiento de llama-esterilización. Para la absorción deinóculo efectivo, asegúrese superficie del agar se secó (30 min a 35 ° C) cuando agar está reciénhecho.

Contar todas las colonias en placas que contienen 25 a 250 colonias, y registrar los resultadospor dilución contados. La media de los recuentos de colonias obtenidas, y multiplicar el promedio

por 10 y luego por el factor apropiado de dilución (10 -1 - 10 -6 ). Los resultados como APC / g(ml) de la muestra. Si las placas no contienen 25-250 colonias, dilución registro contó y númerode nota de las colonias encontrado.

Para placas de BP, contar las colonias bien distribuidas que son convexos, de color negrobrillante, con o sin una zona clara que rodea la colonia. ( NOTA :.. colonias coagulasa positivos



producir claro, pero las colonias coagulasa negativo puede o no producir despejar Si coloniascoagulasa negativo claro, su irregularidad informa, que los distingue de las colonias coagulasa-positivo) Selección de placas que tienen más de 250 colonias, cuando los a una dilución mayor nocontienen tipos coloniales descritos anteriormente. Las placas de diluciones mínimas que tienenmenos de 25 colonias también se pueden utilizar si es necesario. De cada placa que demuestra elcrecimiento de BP, elegir una o más colonias típicas para confirmar su reacción coagulasa.Colonias de transferencia a tubos inclinados de agar de cualquier medio de mantenimientoadecuado, por ejemplo, tripticasa (tríptico) de agar de soja (TSA), la infusión de cerebro ycorazón (BHI) agar. Incubar tubos inclinados hasta que el crecimiento es evidente.

Calcular el número de Staphylococcus aureus organismos presentes mediante la determinación dela fracción primera de las colonias probadas que son coagulasa positiva. Multiplique esta fracciónpor el número promedio de Staphylococcus colonias contadas en las placas de BP. Multiplique elnúmero obtenido por el factor de dilución apropiado y reportar el número de S . aureus / g (ml)de la muestra.

Si no hay colonias se obtienen en los medios de MLA o BP, observar diluciones MLB ya preparadosmientras enriqueciéndolas a 30 ± 2 ° C durante 7 días. Examine enriquecimientos diaria para elcrecimiento. Después de 7 días de incubación, o cuando se sospecha de crecimiento, subcultivartodos los enriquecimientos en tanto MLA y placas de agar MacConkey. Incubar las placas 48horas a 30 ± 2 ° C.

2. Los hongos, levaduras y mohos recuento en placa . Transferir 0,1 ml cada vez de series dedilución (Hl, arriba) para etiquetado adecuadamente placas duplicadas de uno u otro agarextracto de malta (MEA) o agar papa dextrosa (PDA), ambos con 40 ppm de clortetraciclina.Corre el inóculo sobre la superficie del medio con varilla esparcidor de vidrio estéril. Después deinóculo es absorbida por medio, placas invertidas, incubar a 30 ± 2 ° C, y observar al día durante7 días. La media de los recuentos obtenidos en placas duplicadas, multiplicar por 10 para permitirel volumen chapada (0,1 ml), multiplicar por el factor de dilución, y reportar como levadura omoho recuento / g (ml) de la muestra. Para enriquecimientos fúngicas (opcional), diluir la muestrapreparada decimalmente en caldo de dextrosa de Sabouraud y se incuba como se describeanteriormente para las diluciones de MLB. Si se produce el crecimiento, la racha en el agar deSabouraud dextrosa, MEA o PDA. Los últimos dos agares deben contener tanto 40 ppmclortetraciclina.

3. Concentración de gérmenes anaerobios (usar sólo para talcos y polvos) . El propósitoprincipal de este procedimiento es para detectar el bacilo del tétanos ( Clostridium tetani ), quepuede ocurrir en estos productos. Realizar como se describió anteriormente para APC, utilizandoagar MLA, pre-reducida de agar anaerobio, y 5% de sangre de oveja desfibrinada de agar para elchapado. Incubar las placas de agar sangre en el 5-10% atmósfera de dióxido de carbono (frascocon vela o CO 2 incubadora), y las placas de agar anaeróbico en la marmita de anaerobios.

Incubar tanto para 48 h antes del cómputo. Reincubate durante 2 días más si no hay coloniasaparecen a las 48 h. Pre-reducir placas de agar anaeróbico antes de la inoculación mediante lacolocación de ellos en una atmósfera anaerobia durante la noche (12-16 h). Incubar las placasde agar anaeróbico en atmósfera anaerobia (recipiente de anaerobios, incubadora, o en laguantera) durante 2 días a 35 ± 2 ° C; incubar las placas aeróbicamente MLA durante 2 días a 35± 2 ° C como control aeróbico. Los anaerobios estrictos crecerán solamente en los frascosanaeróbicos. Se recomienda que una pequeña cantidad (0,1 ml) de inóculo puede utilizar paradisminuir la expansión del crecimiento causada por la humedad, y que las placas inoculadas secolocan en una atmósfera anaerobia en cuestión de minutos después de la inoculación paraminimizar la exposición al oxígeno. Anaeróbico Sospecha organismsmust subcultivarseaeróbicamente (bajo CO 2 ) y anaeróbicas para establecer su relación verdadera oxígeno.

Compruebe situados terminalmente esporas en caldo de carne cocida se incuba a 35 ° C durante2 días. El uso de una espora tinción diferencial para detectar esporas es obligatorio. Otrosmétodos pueden detectar artefactos nonspore, lo que podría conducir a la identificación de losesfuerzos desperdiciados. Si se aísla un formador de esporas anaerobias obligadas, consulte ADHitchins, FDA, Washington, DC 20204, para obtener información sobre cómo proceder.

4. Prueba de detección para el número total de microorganismos presentes en loscosméticos usados y no usados . Los medios sólidos, temperaturas de incubación y tiemposdescritos en H 1-3 se pueden aplicar, en su caso, a las muestras preparadas como se muestra enel G 1-5 para seleccionar los cosméticos para los recuentos totales antes de realizar lasevaluaciones microbiológicas completas como se describe en H 1-3 arriba. Si la muestra contiene

<10 ufc por ml de producto o g, una prueba de detección utilizando 1 ml de la 10 -1 dilución en latécnica de verter la placa deben arrojar resultados de crecimiento negativas. Si la muestra



contiene <100 ufc por ml de producto o G, una prueba de detección utilizando 0,1 ml de la 10 -1

dilución en la técnica de extensión en placa debería producir un resultado de crecimientonegativo.

La identificación de microbios

Los mohos y levaduras deben ser purificados y levaduras identificadas como medida de lo posible el uso dekits, por ejemplo, tarjeta de levadura y Vitek API tira de la asimilación de levadura. Si es necesario, envíeaislados fúngicos a Valerie H. Tournas, FDA, Washington, DC 20204, para la especiación. Para las bacterias,examine todas las placas y la racha morfológicamente tipos coloniales disímiles sobre soporte MacConkey yMLA. Preparar la tinción de Gram de todo tipo colonial morfológicamente diferentes obtenidos en cultivopuro. Con los métodos dan aquí, los aislados pueden ser identificados a nivel de género, en general, seenumeran las pruebas para la especiación, cuando sea necesario. Resultados de la prueba deben serevaluados utilizando el Manual de Bergey (12) o los métodos de Madden (14). Kits comerciales deidentificación, por ejemplo, API, Roche, Vitek, Hewlett-Packard ( ver Apéndice 1), se recomiendaencarecidamente.

A. Los métodos de identificación

1. Bacilos Gram-positivos . Informe bacilos Gram-positivos aeróbicos, ya sea como formadores deesporas o nonsporeforming. Para mejorar la esporulación, inocular placa de agar de almidón con elaislamiento e incubar 48 horas a temperatura ambiente. Prepare bien la tinción de Gram o lamancha endospore de colonia aislada y nota la posición de endospore dentro célula vegetativa(central, terminal, o subterminal), forma de endospora (redonda o elipsoidal), y la morfología deesporulación esporangio de células (hincha o no hinchada). Pruebe todas las barras deformadores de esporas aeróbicas para la motilidad por cualquiera de estos dos métodos:

a. Método de cultivo . Tubo Puñalada inocular de prueba de movilidad o medio-motilidad indolornitina. Incubar aeróbicamente 18-24 h a temperatura ambiente. El crecimiento de la líneade la puñalada (indicado por la turbiedad del medio alrededor de arma blanca) constituyeuna prueba positiva.

b. El examen microscópico . Inocular aislado colonia en caldo adecuado. Incubaraeróbicamente 18-24 h a temperatura ambiente. Coloque una gota de caldo de cultivo enportaobjetos limpio y cubrir con cubreobjetos. Motilidad se indica por las células bacterianasindividuales que se mueven en direcciones aleatorias. Observe en cada 400X o con aceite deinmersión.

Además de la caracterización de bacilos Gram-positivos generalmente no es necesario.Consulte refs. 7 y 12 si se requiere una mayor caracterización de estos organismos.

2. Cocos Gram-positivos . Racha MLA placa de los medios de comunicación de APC (MLA o BP),incubar 18-24 horas a 35 ± 2 ° C, y el crecimiento resultante de ensayo para la actividad de lacatalasa y la producción de coagulasa (si catalasa-positivas).

a. Prueba de la catalasa . Añadir una gota de 3% de H 2 O 2 , ya sea a colonia aislada o para

limpiar portaobjetos de microscopio y lugar asa de platino llevando algún aislar dentro de lagota. La reacción es positiva si el gas oxígeno se desarrolla rápidamente (formación deburbujas). (Bucles de alambre de nicrom pueden dar reacciones positivas falsas.) Cuando H

O 2 se coloca directamente en una colonia de las bacterias morirán. Control positivo (

Staphylococcus o una bacteria entérica) y control negativo ( Streptococcus ) se debenejecutar al mismo tiempo para asegurar la calidad de la H 2 O 2 solución.

b. Prueba de la coagulasa . Inocular pequeña cantidad de crecimiento a partir de lainclinación de mantenimiento en el tubo de 13 x 100 mm que contiene 0,2 ml de caldo BHI.Incubar 18-24 horas a 35 ± 2 ° C, y luego añadir 0,5 ml de plasma de conejo liofilizadoreconstituido coagulasa (con EDTA) y mezclar bien. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 6 horas yexaminar para la coagulación. Débilmente cepas coagulasa productoras puede requeririncubación durante la noche para la formación de coágulos de ser evidente. Incluyaconocido coagulasa positivo y conocido organismo coagulasa negativos con cada serie demuestras. Considere todas las cepas que producen la reacción de coagulasa positivos comoS . aureus .

Si no se produce catalasa , inocular la bilis esculina inclinado de agar, un tubo de TSB quecontenía 6,5% de NaCl, y una placa de agar sangre de oveja al 5%. Incubar 18-24 horas a 35 ±



2 ° C. Si organismo ennegrece medio bilis esculina y crecerá en presencia de 6,5% de NaCl,reportarlo como "Grupo D enterococo" ( Enterococcus spp.). Si se ennegrece medio bilis esculina,pero no va a crecer en presencia de 6,5% de NaCl, reportarlo como "Grupo D Streptococcus , noenterococo. " Si no se oscurecerá medio bilis esculina, reportarlo, ya sea como alfa, beta, gammahemolítico o Streptococcus . Si agar 5% sangre de cordero no está disponible, reportarlo como "Streptococcus , no el Grupo D. " Realice especiación adicional de estreptococos, si es necesario,utilizando los procedimientos descritos en la ref. 7 o kits de serológicos disponiblescomercialmente para este propósito, por ejemplo, Phadebact (Pharmacia Diagnostics,Piscataway, NJ).

Si se produce catalasa , inocular los siguientes medios de comunicación con el recién aisladascolonia: agar sal manitol, tubos duplicados de-oxidativo fermentativa (DE) medio con dextrosa(overlay 1 tubo con vaspar estéril o aceite mineral, dejar 1 tubo flojamente tapado sinsuperposición) , y enriquecido inclinado de agar para su uso en la prueba de la coagulasa.

Informe organismo como S . aureus si es coagulasa positivo y / o fermentará manitol; S .epidermidis si es fermentativo y oxidativo en DE dextrosa, es coagulasa-negativos, y nofermentar el manitol, o Micrococcus especie si es oxidativo sólo en DE dextrosa.

3. Bacilos Gram-negativos . Inocular TSI inclinado de agar, placa de agar MacConkey, agarcetrimida, y la placa de MLA con todos los bacilos Gram-negativos. Incubar 18-24 horas a 35 ± 2° C. Reacciones ETI inclinación / a tope de A / A o K / A (A = ácido; K = alcalina) + H 2 S indican

un Enterobacteriaceae aislar. K / K, K / NC (NC = sin cambio) o NC / NC reacciones indican nofermentadores (NF) bacilos Gram-negativos. Si las reacciones de la ETI están enmascarados porla producción de sulfuro de hidrógeno, inocular lactosa y glucosa caldos de carbohidratos eincubar 18-24 horas a 35 ± 2 ° C. Para un Enterobacteriaceae aislar, perf las siguientes pruebasy uso de árbitros. 3, 6, 11 a 13 para interpretar los resultados. El API 20E o kit comercialequivalente pueden utilizarse para identificar a nivel de especie. Medios necesarios para laspruebas se enumeran en C, anteriormente.

Si un organismo crece en agar cetrimida o se identifica como un bacilo NF Gram-negativo,determinar fluorescente y la producción de pigmento no fluorescente, la producción aeróbica deácido de cualquiera de glucosa, sacarosa, xilosa, manitol o, y la producción de gas de nitrógeno apartir de un nitrógeno inorgánico fuente; efectuar otros ensayos necesarios utilizando los mediosque figuran en el D, arriba. La acetamida utilización, el crecimiento a 42 ° C, y la licuefacción degelatina son pruebas importantes para distinguir las tres Pseudomonas especies, P . aeruginosa ,P . fluorescens , y P . putida . Para interpretar los resultados de estas pruebas, utilice refs. 4,11, 12, 19 o el kit y los datos no fermentadores API Base. Confirmar putativo P . aeruginosacepas mediante el método descrito a continuación.

4. Método para la identificación de Pseudomonas aeruginosa

Identificación de P . aeruginosa es especialmente preocupante porque este organismo sobreviveen los cosméticos del área del ojo (21) y se ha implicado en las infecciones de los ojos (20). Esoportunista patógena para los seres humanos (10) y altamente resistente a los agentesantibacterianos tales como compuestos de amonio cuaternario, penicilina y muchos antibióticosde amplio espectro.

a. La identificación presuntiva

Inclinados de agar TSI . Traslado colonias típicas bien aisladas a partir de placas de agarcetrimida para tubos inclinados de agar TSI. Superficie racha y culata de arma blanca.Incubar a 35 ° C durante 24 ± 2 h. Todos los cultivos inclinados que tienen crecimiento y unalcalino (rojo) de inclinación y alcalina (rojo) trasero deben ser considerados como presuntopositivo para Pseudomonas spp. y la prueba de oxidasa y otras reacciones bioquímicas.Algunas pseudomonas pueden producir sulfuro de hidrógeno ligero en TSI, pero esto sepuede confundir con pigmentos solubles producidos por algunas especies.

Prueba de oxidasa

Tiras de prueba de oxidasa (por Pseudomonas spp.) Tetrametil- p -fenilendiamina-dihidrocloruro 1,0 gEl ácido ascórbico 0,1 gAgua destilada 100 ml

Cortar el papel de filtro (Whatman N º 40) en pequeñas tiras de unos 10 x 40 mm. Sombraen el reactivo. Escurrir. Corre tiras sobre toallitas de papel en una bandeja. Shade contoallas de papel, porque la luz degrada el reactivo; seca en 35 ° C incubadora. (Reactivo



también degrada a temperatura más alta.) Cuando se haya secado, almacenar en botellasde color marrón a temperatura ambiente. Las tiras se deben proteger de la luz y la humedad,sino que debe ser de color blanco. Las tiras son estables indefinidamente.

Utilice asa de platino para desprestigiar a la masa de las células en la porción de la banda.(Nicrom da reacciones positivas falsas.) Leer a los 10 s, no hay más tiempo . Positiva seindica por un color morado oscuro; negativa se indica por la ausencia de color o cuandoaparece un color púrpura después de 10 s. Pseudomonas spp. son oxidasa-positivo.

b. Las pruebas bioquímicas

De cada uno de agar presuntiva inclinación ETI positivo inocular tubos inclinados de agar YEduplicados, el caldo de Koser citrato, malonato de caldo, medio que contiene argininadescarboxilasa, agar de nitrato de la motilidad, gelatina nutriente basal (CDC), agar dePseudomonas F, y Pseudomonas agar P.

YE agar inclinados . Inocular por duplicado agar inclinado YE. Incubar una inclinación a 35° C durante 24 ± 2 h y una inclinación a 42 ° C durante 24 ± 2 h. ( NOTA : Eq de agarinclinados a 42 ° C antes de la inoculación, ya que otras especies de Pseudomonas . puedencrecer ligeramente a 42 ° C en medios nonpreincubated, pero no van a crecer en cultivosinclinados precalentadas) Pocos Pseudomonas spp. que no sea P . aeruginosa crecerá a 42 °C. P . aeruginosa produce un olor a pescado de trimetilamina en agar YE. Aproximadamenteel 4% de todas las culturas encontradas rutinariamente dejan de producir pigmento. Debidoa que a menudo se confunden con Alcaligenes spp., Achromobacter spp., u otras especies,las cepas no pigmentadas deben realizar más pruebas antes de que se descartan.

Caldo citrato de Koser . Inocular el caldo y se incuba a 35 ° C durante 24 y 48 h.Utilización de citrato se indica mediante turbidez marcada.

Caldo malonato . Inocular el caldo malonato. Incubar a 35 ° C durante 24 ± 2 h. Unaprueba positiva para la utilización de malonato como única fuente de carbono se indicamediante un indicador de cambio de verde a azul (alcalina).

Agar motilidad nitrato . Para inocular agar motilidad nitrato, superficie racha y el culo dearma blanca. Incubar a 35 ° C durante 24 ± 2 h. Añadir unas gotas de cada uno de ácidosulfanílico y naftilamina. Un de color rosa oscuro resultante o el color rojo indica la reducciónde nitrato a nitrito. Un negativo en color, junto con la presencia de burbujas de gas ogrietas en el medio se consideró una reacción positiva e indica la reducción de nitrato anitrito a nitrógeno libre. NOTA : Siempre pruebe un tubo de control se incubaron en lasmismas condiciones.

Caldo de arginina descarboxilasa . Inocular la descarboxilasa de medio basal quecontiene arginina. Atornillar las tapas firmemente para evitar la aireación. Incubar a 35 ° Cdurante 24 ± 2 h. Examine para el crecimiento. Una reacción positiva para ladescarboxilación arginina se indica por ningún cambio en el color del medio de púrpura. Unareacción negativa se indica mediante un indicador de cambio a amarillo (ácido).

Licuefacción de gelatina . Inocular los tubos de gelatina de nutrientes y las nalgas dearma blanca. Incubar a 25 ° C (temperatura ambiente) durante al menos 72 h. Enfríe antesde examinar para la licuefacción. Incubar los tubos negativos 1 semana. Tubos negativos semantienen normalmente hasta 6 semanas antes de desechar, pero claramente esto no espráctico. Sin embargo, P . aeruginosa normalmente se licua rápidamente de gelatina.

Agar de Pseudomonas F y Pseudomonas agar P . Inocular vertió placas de agar F y P deagar por rayas. Incubar a 25 ° C durante al menos 3 días. Examine agar F con luz negro(onda larga UV). Pigmentos solubles en agua fluorescentes (pyoverdines) se difundirá enagar adyacente a rayas que contienen Pseudomonas spp.

Romper agar P con varilla de vidrio en aproximadamente la misma cantidad de agua destiladay agitar vigorosamente hasta que el agua se ha retirado la mayor cantidad de pigmento delo posible. Decantar en el separador. En una campana química, añadir 5-10 ml de cloroformoal agua en el separador y agitar (ventilación de vez en cuando para evitar que la presióninterna). El piocianina azul migrará a cloroformo. Trasvasar capa de cloroformo a tubo deensayo. Añadir alrededor de 3 ml de agua destilada. Añadir 1 gota 1 NH 2 SO 4 . Piocianina

se enrojece y se migra al agua. Deseche solvente en la botella de cloroformo-residuosespeciales.

Mancha flagelos . Si la cultura se reúne todos los otros requisitos para P . aeruginosa ,incluyendo pigmentos, no es necesaria la mancha flagelos. Utilizar métodos de Clark o seguircualquier otro método adecuado (7), por ejemplo, Leifson o métodos Bailey. Un método



rápido en fresco, con la tinción Ryu (8) ha sido reportado. P . aeruginosa tiene un soloflagelo polar. Las otras pseudomonas fluorescentes tienen varios flagelos.

B. Resultados bioquímicos. Examinar datos con el fin, como se muestra. No se salte .

TSICulo Ácido, cuña alcalina, + gas - No P . aeruginosaCulo Ácido, inclinación ácido, gas + - No P . aeruginosaCuña alcalina y las nalgas, + H 2 S - Posiblemente P . aeruginosa

Agar YENo hay crecimiento a 42 ° C - No P . aeruginosaCrecimiento a 42 ° C - Probablemente P . aeruginosaArginina descarboxilasaNegativo - Probablemente no P . aeruginosaPositivo - Probablemente P . aeruginosaCitrato de KoserNo hay crecimiento - Probablemente no P . aeruginosaCrecimiento - Posiblemente P . aeruginosaUtilización MalonatoNegativo - Probablemente no P . aeruginosaPositivo - Posiblemente P . aeruginosaReducción de nitratoNegativo, no hay gas - Probablemente no P . aeruginosaPositivo - Posiblemente P . aeruginosaMotilidadNegativo - Probablemente no P . aeruginosaPositivo - Posiblemente P . aeruginosaFlagelaciónFlagelos polares - Posiblemente P . aeruginosaCualquier otro flagelación - No P . aeruginosaAgar Pseudomonas FSin pigmento fluorescente - No P . aeruginosaPigmento soluble en agua Fluorescente (pyoverdine) - P . aeruginosaAgar Pseudomonas PSin pigmento - No P . aeruginosaSi el pigmento está presente, confirmarlo como procyanine- P . aeruginosa

C. Interpretación

Los productos cosméticos no se espera que sea aséptica, sin embargo, deben estar completamentelibre de alta virulencia de patógenos microbianos, y el número total de microorganismos aerobios porgramo deben ser bajos. Dado que no existen estándares ampliamente aceptables para los números, laspautas temporales se utilizan en su lugar. Para los productos del área del ojo, el recuento no debe sermayor de 500 unidades formadoras de colonias (UFC) / g de conformación; para los productos no áreade los ojos, el recuento no debe ser superior a 1000 UFC / g. La presencia de patógenos seríaparticularmente importante en la evaluación como inaceptable un cosmético con un recuentomarginalmente aceptable, por ejemplo, de 400 UFC / g para un producto para los ojos-área. Lospatógenos o patógenos oportunistas, cuya incidencia sería de especial preocupación, especialmenteen área de los ojos, los productos cosméticos incluyen S . aureus , Streptococcus pyogenes , P .aeruginosa y otras especies, y Klebsiella pneumoniae . Algunos microbios normalmente consideradoscomo no patógeno oportunista patógena pueden ser, por ejemplo, en las heridas.

D. Eficacia conservante cosmético . Las directrices anteriores para la interpretación de los resultadosse aplican a los productos cosméticos antes de la hora de uso. Cosméticos contienen conservantesantimicrobianos y por lo tanto se espera que soportar una cierta cantidad de abuso por parte de losusuarios. Anteriormente, no había pruebas validadas para la eficacia de conservación de cosméticos(9), aunque la prueba de la eficacia farmacéutica conservante en la Farmacopea de EE.UU. (2) o laprueba de cosméticos en las directrices técnicas de la Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association(CTFA) ( 1) se utilizaron. Recientemente, la prueba de la CTFA se ha validado la AOAC (2b) para suuso con cosméticos líquidos. Se ha propuesto una prueba de la eficacia conservante cosmética sólida(18). Cosméticos en kits de prueba reutilizables, tales como aquellos en tiendas al por menor, puedenser microbiológicamente evaluaron semicuantitativamente por una prueba de hisopo estéril (17).



Referencias

1. Anónimo. 1985. La preservación de las pruebas de líquido acuoso y cosméticos para los ojos semi-líquidos. En : Directrices técnicas CTFA. La Asociación de Cosmética, Artículos de Tocador yFragancias, Inc., Washington, DC.

2. Anónimo. 1990. Los conservantes antimicrobianos - efectividad. En : Farmacopea de Estados Unidos,22 de Revisión, p. 1478. Convención de la Farmacopea EE.UU., Rockville, MD.

2b. AOAC INTERNACIONAL. 2000. Métodos oficiales de análisis, 17 ª ed., Method 998.10. AOACINTERNATIONAL, Gaithersburg, MD.

3. Brenner, DJ, JJ Farmer, FW Hickman, MA Asbury, y AG Steigerwalt. 1977. Taxonómico y lanomenclatura Cambios en enterobacterias . Centros para el Control de Enfermedades, Atlanta, GA.

4. De Navarra, MG 1941. La química y la fabricación de cosméticos. Van Nostrand, Nueva York.

5. Dunningan, AP 1968. Control microbiológico de los productos cosméticos. Drogas Cosmet. Ind. 102:43-45, 152-158.

6. Ewing, WH 1986. Identificación de Edwards y Ewing de Enterobacteriaceae , 4 ª ed. Elsevier, NuevaYork.

7. Gerhardt, P., RGE Murray, RN Costilow, EW Nester, WA Wood, NR Krieg, y GR Phillips. 1981. Manual deMétodos para Bacteriología General. American Society for Microbiology, Washington, DC.

8. Heimbrook, ME, WLL Wang, y G. Campbell. 1989. La tinción flagelos bacterianos fácilmente. J. Clin.Microbiol. 27 :2612-2615.

9. Hitchins, AD 1993. Conservación y seguridad de los cosméticos:. Estado de FDA J. Assoc. AlimentosDrogas Funcionarios 57 :42-49.

10. Iglewski, B. 1989. Sondeo de Pseudomonas aeruginosa , un patógeno oportunista. ASM Noticias 55:303-307.

11. King, EO 1964 (revisada en 1972). La identificación de las bacterias Gram-negativas patógenasinusuales. Centros para el Control de Enfermedades, Atlanta, GA.

12. Krieg, NR, y JG Holt. 1984. Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática. Williams & Wilkins,Baltimore.

13. Balows, A., WJ Hausler, Jr., KL Herrmann, HD Isenberg, y HJ Shadomy. 1991. Manual deMicrobiología Clínica, 5 ª ed. American Society for Microbiology, Washington, DC.

14. Madden, JM 1984. . Métodos microbiológicos para cosméticos, pp 573-603 En : Cosméticos yMedicamentos de Conservación: Principios y Práctica. JJ Kabara (ed). Marcel Dekker, Nueva York yBasilea.

15. Morse, LJ, HL Williams, FP Grenn, Jr., EE Eldridge, y JR Rotta. 1967. Septicemia debida a Klebsiellapneumoniae procedentes de una mano de crema dispensador. N. Engl. J. Med.. 277 : 472-473.

16. Inteligente, R., y DF Spooner. 1972. Deterioro microbiológico de los productos farmacéuticos ycosméticos. J. Soc. Cosmet. Chem. 23 :721-737.

17. Tran, TT, y AD Hitchins. 1994. Encuesta microbiológico de de uso compartido kits de pruebas decosméticos disponibles para el público. J. Ind. Microbiol. 13 :389-391.

18. Tran, TT, AD Hitchins y SW Collier. 1990. Método de membrana de contacto directo para evaluar laeficacia conservante en cosméticos sólidos. Int.. J. Cosmet. Ciencia. 12 :175-183.

19. Weaver, RE, DG Hollis, WA Clark, y P. Riley. 1983. Tablas revisadas para la identificación de lasbacterias Gram-negativas patógenas inusuales (EO King). Centros para el Control de Enfermedades,Atlanta, GA.

20. Wilson, LA, y la DG Ahearn. 1977. Pseudomonas úlceras corneales inducidos asociados conmáscaras de ojos contaminados. Am. J. Ophthalmol. 84 :112-119.

21. Wilson, LA, AJ Jilian, y la DG Ahearn. 1975. La supervivencia y el crecimiento de microorganismos enel rimel durante el uso. Am. J. Ophthalmol. 79 : 596-601.

Hipertexto Fuente: Manual Analítico Bacteriológico, 8 ª Edición, Revisión A, 1998. Capítulo 23.

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