Mtodos De Separacin De Protenas

Separacin proteica por dilisisSe basa en la separacin de protenas por medio de una membrana semipermeable en la que no pasan las protenas pero si otras molculas; se sumerge la protena que se quiere separar, en una solucin tamponada con lo que se formara una diferencia de concentracin entre los medios externos e internos de la membrana, saliendo molculas ms pequeas que las protenasEn la parte interna de la membrana se pueden ver protenas mientras en la externa solo pequeas molculasCromatografa en columnaSe introduce una columna con material solido poroso con propiedades adecuadas a la cual se le da el nombre de fase estacionaria y una solucin tamponada que se desplazara durante el proceso llamada fase mvil. Para el proceso de separacin se tienen en cuenta diversos factores como la carga de las molculas a separar, su tamao su afinidad electrnica.ElectroforesisUna protena se desplaza en un campo elctrico; se realiza en gel de poliacrilamida que retrasa el desplazamiento en una relacin carga/masa aproximadamente y al aplicar una corriente elctrica la protena se ira desplazando atreves del gel con una relacin V = q E / fV=velocidad a la que se mueve la partculaE=potencial elctrico (trabajoque debe realizar un campo electrostticopara mover unacargapositiva)q=carga neta de la molculaF=coeficiente friccionalGeneralmente se le agrega SDS, un detergente que rodea las protenas el cual ayuda al desplazamiento de las protenas. Tras la electroforesis se distribuirn las distintas protenas segn su carga las cargas netas de las protenas positivas irn al ctodo y la negativas al nodoIsoelectroenfoqueEn lugar de separar las protenas en funcin de su carga a un pH dado, se separan en funcin de su punto isoelctrico (pI): el punto isoelctrico es el pH en el que la carga neta de la protena es nula, y depende de la composicin aminoacdica de la protena. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos que estabilizan el pH a lo largo del gel. Cada protena migrar hasta alcanzar su punto isoelctrico, punto en el cual precipitar al acumularse.El pi nos indica el nivel de ionizacin de los aminocidos que forman la protenaPCR(reaccin en cadena del ADN polimerasa)La PCR es una tcnica para amplificar un fragmento de ADN; Amplificar ADN es hacer mltiples copias de determinado fragmento del ADN, utilizando la enzima ADN polimerasa, en una solucin buffer, a condiciones adecuadas para el trabajo enzimtico, como la enzima alcanza temperaturas hasta de 90C esta enzima es extrada de bacterias termo-resistentes (pueden soportar temperaturas extremas) y se emplea un Termociclador que regula la temperatura para que no se desnaturalicen las protenasTermociclador BOYNWestern blotEs una tcnica que se emplea para detectar y separar protenas con alta eficacia consiste en 4 fases, la primera es una electroforesis con la que se logra separar las protenas teniendo en cuenta caractersticas como su polaridad, una vez separadas se utiliza una red de nitrocelulosa donde sern absorbidas las protenas, estando en la nitrocelulosa las protenas son expuestas a anticuerpos muy precisos para el tipo de protena que se busca detectar, la ltima fase consiste en la deteccin del antgeno-anticuerpo por diversos mtodos como la fluorescencia o actividad enzimtica