Metody molekulární biologie v ekologii a systematice

rostlin

12. AFLP

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011

Princip metody

AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism» Vos et al. 1995, Nucleic Acid Res. 23: 4407-4414

» název má upomínat na RFLP

» v podstatě trochu náhrada za některé varianty RFLP

► restrikční metoda» restrikce celkové DNA organismu

» vizualizace části fragmentů pomocí PCR

» dominantní data (přítomnost / nepřítomnost fragmentu dané délky)

► spolehlivá a opakovatelná metoda» velká specifita restrikčních enzymů, síla a spolehlivost PCR

» hodně fragmentů

» sleduje ± celý genom

Princip metody

0) Analyzujeme celkovou DNA» vysoké požadavky na čistotu

» relativně velké množsví (min. 50-100 ng,někt. protokoly i více)

» netřeba další informace o genomu

1) Restikce genomické DNA» enzymy EcoRI a MseI

(„rare cutter“ a „frequent cutter“)

MseI EcoRI

Princip metody

2) Ligace adaptorů

T4 ligaseATP

Mueller & Wolfenbarger 1999, TREE

Princip metody

3) Preselektivní amplifikace (PCR)» primery komplementární k

adaptorům

» +1 selektivní nukleotid

» namnožena 1/16 proužků, které mají MseI / EcoRI místo

Mueller & Wolfenbarger 1999, TREEselektivní nulkeotid

Princip metody

4) Selektivní amplifikace» templát = ředěný produkt preamplif.

» 3 selektivní nukleotidy (1/256 proužků z preamplifikace)

» jeden z primerů (typicky EcoRI)fluorescenčně značený

» primerové kombinace (složení selekt.nukleotidů) se „naslepo“ zkouší

• dostatek fragmentů, jasně odlišené, ± podobná intenzita

Mueller & Wolfenbarger 1999, TREE

Princip metody

5) Přečištění produktu

6) Fragmentační analýza» denaturace formamidem

» přidán velikostní standard

» analýza v sekvenátoru• dříve na denaturačním PAA gelu

» možnost smíchat až 4 barvy vzorku

Princip metody

► Teoreticky by mělo fungovat s jakýmikoliv 2 enzymy»„lepivé“ konce fragmentů» různá frekvence štěpení» v praxi pouze původní EcoRI + MseI

• běžné = levné, vyzkoušená metodika

► 3 třídy fragmentů» EcoRI + MseI» EcoRI + EcoRI

• velmi vzácné

» MseI + MseI• teoreticky nejhojnější• při značení EcoRI primeru neviditelné• vznikají překvapivě málo, lze použít i značení MseI primeru

A – EcoRI*+MseIB – EcoRI + MseI*C – MseI*I,II,III,IV - různé primerové kombinace

Vos et al. 1995

Standardizace

► stejná počáteční koncentrace DNA u všech vzorků

► stejné reakční podmínky (jednotný protokol a zdroj chemikálií, stejný profil PCR, ideálně stejný cycler)

► negativní kontroly (vyloučení kontamince)

► vyhodnocení dat pokud možno jednou osobou

► opakování cca 10% vzorků, výpočet error rate» error rate = počet rozdílů / (počet lokusů * počet vzorků)

► vyloučení pozic a) kde byl rozdíl, b) vzácnějších než error rate

► error rate by měla být malá, řádu jednotek %

► viz Bonin et al. 2004, Mol. Ecol. 13: 3261–3273

Vyhodnocení dat

► Vznik variability» mutace v restrikčním místě (vznik/ zánik)

» inserce/delece mezi restrikčními místy

► Předpoklady» homologie stejně migrujících fragmentů

• nebrat krátké fragemnty • rozmezí (50-)100-500 bp

» nezávislost lokusů (fragmentů)

► Skórovat jen jasné markery» rozumná intenzita píků, konzistentní mezi vzorky

» jsem schopný se vždy rozhodnout, jestli pík je nebo není

Vyhodnocení dat – metodické problémy

► Technické» nestejná intenzita píků mezi vzorky / opakováním vzorku» drobné posuny v určení velikosti fragmentu

► Neznámá genetická podstata proužků» nejistá homologie stejně dlouhých fragmentů» nejistá nezávislost lokusů (platí pro mutace v restrikčních místech,

ale ne pro indely uvnitř framentů – kodominantní)» neznámá dědičnost (jádro × chloroplast mitochondrie)

► Nespecifičnost postupu» fragmenty mohou vznikat i z jiné DNA – endofyti, epifyti, drobné

kontaminace, …» takto mohou vznikat drobné rozdíly mezi identickými vzorky

(např. různé ramety jednoho klonu)!

Vyhodnocení dat

► dominantní (binární) data = matice 0/1

► obvyklé postupy pro binární (dominantní) data» statistika lokusů (polymorfismus, privátní,…)

» shlukové analýzy, PCoA, neigbour-networks,

» popul. genetika (diverzita, AMOVA, odhady FST, kinship,…)

» Baysian clustering (STRUCTURE, BAPS,…)

» prostorová statistika, autokorelace,…

Vyhodnocení dat

DW-index (frequency-down-weighted marker values)

► Schönswetter & Tribsch 2005, Taxon 54: 725–732

► teoreticky použitelný i na ISSR apod., v praxi hlavně AFLP

nik počet výskytů fragmentu i v populaci kni počet výskytů fragmentu i v celém datovém souboru

► index měří míru izolovanosti (unikátnosti) populace» roste s výskytem vzácných fragmentů

► vyšší hodnoty jsou očekávány v populacích» dlouhodobě izolovaných» refugiálních

• pův. diverzita druhu, z níž jen část se rozšíří při expanzi areálu

i i

ikk n

nDW

AFLP - Srovnání s jinými metodami

Výhody

► není nutná znalost genomu (univerzální metoda)

► velké množství lokusů (desítky až >100 na jednu primerovou kombinaci)

► zobrazuje variabilitu celého genomu (ale opravdu ?)

► spolehlivost, vysoká reprodukovatelnost

Nevýhody

► vyšší nároky na množství a čistotu DNA

► cena

► komplikovaný postup

► dominatní data

► nejistá homologie fragmentů, neznámá dědičnost, …

► optimalizace (vyhledávání primerových kombinací)

Modifikace a podobné metody

► S-SAP a jeho varianty» pro PCR amplifikace použit 1 AFLP primer a primer

komplementární k nějaké sekvenci• Typicky transpozony, ale může být cokoliv jiného

» nutná sekvenční informace → hlavně modelové druhy

► SAMPL (selective amplification of microsatellite polymorphic loci)

» jako AFLP, ale v selektivní amplifikace 1 AFLP primer nahrazen primerem komplementárním k složenému mikrosatelitu (CACACAGAGAGA)

» primer ukotvený, nasedá přes „zlom“ v mikrosatelitní sekvenci

» část variability je dána délkovou variabilitou mikrosatelitu

Modifikace a podobné metody

► Microsatellite-AFLP (MFLP)» restrikce jen MseI, amplifikace s MseI primerem a 5‘anchored

jednoduchým mikrosatelitním primerem» variabilita je dána mikrosatelitem» obchází potřebu specifické sekvence pro mikrosatelity, ale zase je

nutné hledat vhodné primerové kombinace

► AFLP se speciálními restriktasami» např. studium metylace genomu» porovnání AFLP profilu restriktasy necitlivé k metylaci

(např. MspI) a isoschisomeru (= jiný enzym rozeznávající stejnou sekvenci) citlivého k metylaci (např. HpaII) (+ EcoRI)

» … a další finty v tomto duchu

► AFLP se třemi restriktasami, atd.

Použití AFLP

► fylogeneze» jen u příbuzných taxonů (max. druhy v rámci rodu)

► vnitrodruhová variabilita» taxonomie (vymezení blízce příbuzných druhů, poddruhů,…)

» fylogeografie

► populační biologie» chráněné a vzácné druhy; invaze

» jemná genetická struktura, prostorové vztahy, kinship,…

» klonální struktura

► hybridizace

► rozmnožovací systémy, parentage analysis

Fylogeneze, taxonomie

Bog et al. 2011, Planta 232: 609–619► taxonomie rodu Lemna, morfologicky

těžko neřešitelné► všech 13 uznávaných druhů► NJ strom, STRUCTURE

► 10 druhů povrzeno (větve v NJ, shluky v STRUCTURE)

► 2 druhy nepotvzeny (rozpadají sedo různých větví / shluků)

► 1 druh (L. gibba) se rozpadá do 4skupin = typické klony + asi hybridis jinými druhy + 1 skupina nejistépozice

Fylogeneze, taxonomie

Španiel et al. 2011, Plant Syst. Evol. 294: 1–25► taxonomie Alyssum montanum► tradičně 2 poddruhy (skály × písky) bez

ohledu na ploidii + drobné endemity

► PCoA + NJ identifikují hlavní skupinu +pár malých shluků; v rámci hlavní skupi-ny určitý rozdíl mezi 2x a 4x

► rozdíly mezi stanovišti neexistují► podobné výsledky i STRUCTURE a

AMOVA a morfometrika (!)► morfologické rozdíly mezi 2x a 4x malé

» nerozlišovat jako samostatné taxony► taxonomii druhu bude nutno překopat

PCoA vše

PCoA skály

×písky

Fylogeografie

Paun et al. 2008, Molec. Ecol. 17: 4263–4275

► Ranunculus alpestris agg.► Alpy, izolovaně Z Karpaty, J Karpaty► AFLP + cp DNA

► genetická diverzita × DW-index:» diverzita = průměrná He přes lokusy

diverzita

DW-index

genet.diverzita

DW refugia hojnost

genet. diverzita

(-) 0 ++

DW (-) +++ 0

www.slovenskevrchy.estranky.sk/

Fylogeografie

Paun et al. 2008, Molec. Ecol. 17: 4263–4275► AFLP: 3 hlavní skupiny (NJ, PCoA, Structure)

» Z Alpy, V Alpy + Karpaty, J Alpy + zbylé 2 endemické druhy (skoro monofyletické)

► cpDNA: 9 haplotypů, 2 hlavní skupiny:» R. alpestris + 1 populace R. bilobus» R. bilobus + R. traunfellneri a 2 pop. R. alpestris

► nesoulad = hybridizace» chloroplast capture

► více refugií, alopatrickáspeciace

► karpatské populace – migrace z vých Alp.

Hybridizace

Oberprieler et al. 2011, Plant Syst. Evol. 293: 177–191► Senecio ovatus × S. germanicus, čisté i směsné p.► AFLP + morfologie + sek. metabolity

► AFLP, Structure: ve většině směsných populací izolované, ale 1× hybridní roj

► silná korelace s morfologií i metobolity (matice vzdáleností, Mantel test)

► v hybridním roji hlavně zpětní kříženci k S. germ,chybí F1 a F2 hybridi (Structure, NewHybrids)

► kříží se vzácně, pakintrogrese do S. germ.

www.floraweb.de

ovatus

germanicus

BC-g

F1,F2

BC-o

Populační genetika

Cires et al. 2011, Plant Syst. Evol. 297: 75–85► Cochlearia pyrenaica (ochranářská genetika)► vzácný druh, větš. chráněný, Natura2000,…► 5 populací ze záp. Evropy

► nízká variabilita v populacích (He, Hsh,počet polymorfních lokusů), diferenciacemezi populacemi (GST = 0.38)

► AMOVA: 49% uvnitř. pop., 17% v regionu, 34% mezi regiony► doporučení pro ochranu

» každá oblast unikátní, třeba chránit vcelém areálu

» do různých záchranných kultivací, sbírky semen apod. zahrnout materiálz každé oblasti

http://flora.nhm-wien.ac.at/

Klonalita

Pfeiffer et al. 2011, Plant Syst. Evol. 292: 189–201► Gagea lutea (2n = 6x) a G. spathacea

(2n = 9x) v Německu► oba druhy podzemní dceřiné cibule +

u G. lutea v dospělosti jen semena,G. spathacea sterilní (lichá plodie)

► G. lutea: clonal diversity 0.5–0.6; asi1/3 genet klonálních, zbytek jen 1výskyt; rozsah klonů až 28 m

► G. spathacea: všechno 1klon (i různé lokality)» variabilita = somatické

mutace (v jedné popul.asi ano) nebo endofyt, houba rodu Ustilago

www.pbase.comG. lutea

G. spathacea

↓ Podobnost mezi vzorky – definice klonů

Prostorová struktura

Jump et al. 2009, Plant Biol. 11: 152–160

► populace Fumana thymifolia na ploše 80 × 60 m (9 plošek, 114 jedinců celkem)

► keřík, opylován hmyzem, cizosprašný,slabá autogamie (dělali pokus)

► průkazná isolation by distance► podobnost (kinship coefficient)

sousedů srovnatelná s hodnotoupro potomky 1 mateřské rostliny» velmi omezené šíření semen

► detekovatelná průkazná podob-nost do 20 m vzdálenosti» efektivní šíření pylu

de.wikipedia.org

průměrný kinship coefficient pro danou vzdálenostní třídu

95% conf. int.