metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. izolace dna

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice

rostlin

3. Izolace DNA

Sběr materiálu na izolaci DNA

Obecné zásady:

v principu je možné použít kteroukoli část rostliny (i dřevo)

• ideální je čerstvý materiál

• problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy)

• brát tkáně s co nejnižším obsahem sek. metabolitů sbírat pokud možno zdravou tkáň (neinfikovanou ostatními

organismy) sběr omezit radši na jeden typ tkáně

• výsledky některých metod mohou být ovlivněné typem tkáně

(např. tkáňově nebo i sezonně specifická methylace DNA může ovlivnit restrikční krok u AFLP)

zabránit rozkladným procesům, kterými vznikají látky poškozující nebo jinak znehodnocující DNA (fixace materiálu)

Fixace materiálu před izolací

Vysoušení

silikagel – asi ideální; při recyklování silikagelu je vhodné aby použitý silikagel nebyl v přímém kontaktu se vzorky (vzorek dát do papírového sáčku a ten teprve to plastikového se silikagelem)

při pokojové teplotě (nebo v sušárně) – taky funguje, vhodné např. pro mechorosty, lišejníky; ale herbářové položky rostlin mohou být problematické

vysušený materiál je vhodné zamrazit (-20º nebo -80ºC) nebo alespoň skladovat v ledničce, a pokud možno co nejdřív dále zpracovat

Nakládání do koncentrovaného NaCl-CTAB roztoku

vhodné pro sukulenty, ale i křehké vodní rostliny, vydrží až měsíce při pokojové teplotě

Fixace materiálu před izolací

Nakládání do ethanolu

asi není moc výhodné (DNA tvoří nerozpustné komplexy s proteiny, nižší výtěžek, řeší to přidání proteinázy)

Zamrazováním čerstvého materiálu

bez problémů, ale není nutné

Vlastní DNA izolace

Volba extrakční metody

jak moc kvalitní DNA potřebujeme a v jakém množství

kolik máme peněz a času:

komerční kity vs. klasické protokoly (běžné chemikálie)

dražší (40-100 Kč/vz.) velmi levné (několik Kč/vz.)

ca 2h ca > 2h (dl. inkubační kroky)

čistá DNA, ale někdy málo vyšší výtěžek DNA, někdy problémy s čistotou


Kroky izolace DNA:

rozrušení buněčné stěny - homogenizace materiálu

lyze buněčných membrán - pomocí detergentu za zvýšené teploty (DNA se uvolní do roztoku, zvýšená teplota denaturuje proteiny, ale může způsobovat fragmentaci DNA)

odstranění kontaminantů:• proteiny – DNázy štěpící DNA, histony a mnoho dalších...• fenolické látky – jejich oxidací vznikají chinonické sloučeniny,

které můžou degradovat DNA nebo inhibovat enzym. reakce• huminové kyseliny – silný inhibitor, vznikají rozkladem tkání• polysacharidy• RNA

čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě


Homogenizace materiálu - mechanicky:

drobné vzorky pomocí homogenizačních tyčinek, v malém množství extrakčního pufru, příp. se sterilním pískem

větší kousky tkáně v mlýnku, drcení kovovými kuličkami (za sucha) – ideální pro větší počty vzorků (ale hlučné)

nebo klasická drtící miska (+ kapalný N2)


Homogenizace materiálu – chemicky nebo jinak:

sodium nebo potassium ethyl xanthogenát rozpouštějící celuózu

střídáním cyklů povaření/zamražení (např. řasy a sinice)

Nevysušený materiál:

je třeba homogenizovat pomocí kapalného N2 (zamražení chrání DNA před degradací DNazami)

pouze v případě materiálu naloženého v NaCl-CTAB je ideální drcení za pokojové teploty


Příklady klasických protoklů izolace DNA:

NaOH metoda

velmi rychlá a jednoduchá (1 vz. několik minut!)

zvýšené pH denaturuje kromě DNA i proteiny (DNazy), a pomáhá rozložit buněčnou stěnu; centrifugací se odstředí zbytky tkáně a supernatant se naředí pufrem (Tris-HCl)

vhodné i pro malé množství materiálu (mechorosty, lišejníky, cév. rostliny), který by ale neměl obsahovat příliš kontaminantů

nepříliš čistá DNA, použitelná pouze pro PCR; omezená trvanlivost?

vyizolovanou DNA nelze kvantifikovat ELFO ani spektrofotometricky



CTAB extrakce

NaCl-CTAB pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) CTAB je detergent; přidání PVP vychytá fenolické látky; RNasa A rozštěpí

RNA

CTAB vytváří komplex s proteiny, polysacharidy i DNA; za vysoké koncentrace solí (NaCl) ale zůstává CTA-DNA komplex rozpustný ve vodě

přidání směsi chloroform - isoamylalkohol, po centrifugaci:

◄ vodní fáze s DNA - opatrně odpipetovat

◄ rozhraní (proteiny) + odpadní organická fáze (lipidy, proteiny)

(krok s přidáním směsi a odpipetováním DNA fáze lze i 1-2 zopakovat)



CTAB extrakce

přidáním isopropanolu se vysráží CTA-DNA sůl, centrifugací DNA pelet (většina polyfenolů, proteinů a polysacharidů zůstane v supernatantu)

pozn.: selektivní vysrážení DNA - přidáním CTAB pufru s nižší konc. NaCl, odstranit supernatant, přidat NaCl nutný pro rozpuštění DNA peletu, zopakovat chloroform - isoamylalkoholovou separaci a pokračovat semikvantitativním isopropanolovým přesrážením

bílý DNA pelet(zabarvení značí nečistoty)

DNA pelet přečišťován přesrážením ethanolem a rozpuštěn v TE nebo vodě – použitý objem ovlivní koncentraci DNA roztoku

vhodné i pro malé množství materiálu, někdy problémy s čistotou DNA

zabere ~4 h a víc



SDS extrakce

izolační pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA)

po přidání SDS a octanu draselného se za snížené teploty vysráží kontaminanty (proteiny, polysacharidy)

vysrážené kontaminanty centrifugací sednou na dno, odebere se DNA supernatant, který je dále přečišťován přesrážením např. isopropanolem

RNasa A rozštěpí RNA

podobně jako CTAB někdy problémy s čistotou DNA

výhoda proti CTAB - nepoužívá toxické chemikálie

izolační pufr se sodium nebo potassium ethyl xanthogenátem rozpouštějící polysacharidy – u buněk s obtížně narušitelnými buněčnými stěnami (sinice)


Princip komerčně dostupných kitů na izolaci DNA:

lyzační fáze, odstranění proteinů proteinazou, vysrážení kontaminantů octany, ošetření RNasou A

navázání DNA na matrix – nejčastěji silika membrána (příp. magnetické silika kuličky nebo iontoměničová pryskyřice)

1. za vysoké koncentrace solí se DNA selektivně váže na membránu

2. DNA na membráně je dále promývána (roztoky s ethanolem)

3. uvolnění DNA z membrány snížením koncentrace solí, tj. vymytím TE pufrem nebo vodou

- objem použité kapaliny ovlivní koncentraci DNA (min. objem většinou udáváno 30 µl; čím víc kapaliny, tím více se DNA naředí)

koncentrace získané DNA ale často nižší! existují i speciální CleanUp kity na přečištění vyizolované DNA

1

2

3


Skladování DNA:

čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo voděTE pufr brání degradaci DNázami (EDTA vychytává ionty, které jsou kofaktorem enzymů)

krátkodobě (týdny) v ledničce, dlouhodobě v -20º nebo -80ºC

roztok DNA nevortexovat (mechanické poškození)

nevystavovat opakovanému rozmražování a zamražování(používat alikvoty)

DNA teoreticky velmi stabilní (několik let) – nejvíc záleží asi na čistotě

Kontrola kvality a kvantity DNA

1) pomocí spektrofotometru

A260 (vln. délka 260 nm = max. absorbance nukl. kyselin)• přístroj měří ~ 5 µl vzorku• vlastní hodnota A260 by měla být v rozmezí (0.01-)0.1-1.0 (jinak výpočty nepřesné, dá se ovlivnit ředěním vz.)• z ní přístroj vypočítá koncetraci (nutno brát s rezervou)

A260 je zkreslená absorbancí kontaminantů ... (např. proteiny – mají sice max. pík při A280, ale určitá hodnota absorbance je i při A260, proto má směs DNA/protein vyšší celkovou A260)

proto se používá A260/280, A260/230: čistá DNA má obě hodnoty >1.8(absorbance DNA směrem k A230 a A280 klesá)

A320: mělo by být blízké 0

jiné hodnoty indikují znečištění, a odhad koncentrace DNA je nadhodnocený(poměrně časté např. u CTAB izolace)

c [ng/µl] = 50 x A260 x dilution factor(pro odstranění efektu kontaminantů lze od A260 odečíst A320, a teprve výsledné číslo dosadit do vzorce – může pak vyjít i záporná koncentr.)


nanodrop - spektrofotometr pro malé objemy vz. (~ 1µl)

2) fluorimetricky• barvivo selektivní pro DNA (např. ethidium bromid, PicoGreen)• přesné stanovení koncentrace DNA: není ovlivnění kontaminanty, ale

nezjistíme jejich přítomnost!

Kontrola kvality a kvantity DNA3) elektroforéza (ELFO)

pro DNA stačí horizontální, agarózový gel (0.8-2% w/v) v TAE nebo TBE pufru

vzorky DNA se smíchají s loading buffer (glycerol pro zapadnutí vz. do jamky, obvykle 2 modrá barva pro detekci migrace vzorku)

záporně nabité molekuly DNA migrují k anodě (+), délková separace

Kontrola kvality a kvantity DNA3) elektroforéza (ELFO)

vlastní vizualizace DNA:

fluorescenční barviva, které se vážou na DNA – potenciální mutageny

• UV transluminátor – ethidium bromid (EtBr, asi mutagen), Sybr Green, Gel Red ...

• modré světlo – Sybr Green, Sybr Safe

◄ produkty restrikce PCR produktu: Sybr Green přidán do loading bufferu, stejné fragmenty migrují rozdílně (ovlivněno koncentrací DNA)

barvivo možné přidat do gelu nebo loading bufferu, ale způsobuje posuny a deformace bandů (kromě Sybr Safe); stačí pro hrubou kontrolu DNA

nebo obarvením gelu v roztoku barviva po dojetí forézy (post-staining) - dražší, ale nejvíc senzitivní a nezpůsobuje deformace a posuny bandů

Kontrola kvality a kvantity DNAELFO genomové DNA

• fragmentace příliš nevadí, pokud plánujeme PCR metody; obvyklá u klasických protokolů (u kitové izolace se fragmenty <100 bp nezachytí na membránu a jsou tak odstraněny)

• pokud na gelu vidíme alespoň nějakou DNA, je koncentrace dostačující na PCR • zabarvení izolátu: kontaminanty, které můžou inhibovat enzym. reakce!

... důležité je, aby DNA fungovala na další aplikace (i DNA viditelná na gelu nemusí fungovat, a naopak neviditelná DNA může dát PCR amplifikaci)

◄ ´stín´ jamek může indikovat špinavou DNA

◄ vysokomolekulární genomová DNA (intenzita bandu koreluje s koncentrací)

smear: fragmenty DNA (degradace) nečistoty, zbytky RNA

čistá, kvalitní DNA:


Příklad rozdílné efektifity izolačních metod: kořeny Festuca rubra, PCR amplifikace DNA mykorhizních hub (AMF)

MoBio Soil Kit

kvalitní, čistá DNA,

ale malý výtěžek,nutné použít

>15 mg kořenů

(na další 4 druhy Poaceae ze stejné lokality stačí klasická CTAB izolace)

Qiagen Plant Kit

dostatek DNA,ale nepoužitelné, zbarvený izolát,

inhibuje PCR

CTAB izolace

+ purifikace MoBio CleanUp kitem

ztráta části DNA, ale PCR funguje

CTAB izolace

dostatek DNA, ale nepoužitelné,

silně zbarvený izolát,

inhibuje PCR


Co s herbářovým materiálem?

recentní položky (<15? let) můžou být celkem bez problémů pro běžnou PCR, ale může se velmi lišit druh od druhu!

u staršího materiálu nutno vyzkoušet, nadějnější jsou klasické protokoly (CTAB, SDS; asi ale nemá cenu NaOH)

pozor na kontaminaci recentním materiálem!

• např. z úlomků čerstvých položek skladovaných se starým materiálem

• u mechů a lišejníků patrně i sporami aj. mikroskopickými částicemi! • při manipulaci s položkou zacházet opatrně, pinzety atd. čistit lihem

• výhodná je povrchová UV sterilizace herb. materiálu

doporučuje se separace místností na DNA izolaci, od prostor na další (PCR) zpracování, použití filtrovaných špiček

metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. izolace dna

Documents