mg 02 metodi colture pure crescita
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METODI DELLA MICROBIOLOGIA
•Microscopia:otticaelettronica: a trasmissione, a scansione.
•Sterilizzazione e inibizione della crescita:metodi fisici:
calore (umido, secco, incinerazione). radiazioni (UV; ionizzanti: X, gamma).filtrazione
metodi chimici•Coltivazione dei microrganismi:
terreni di colturaisolamento di microrganismi da ambienti naturalicolture pureanalisi della crescita batterica
Riferimenti:LaboratorioBrock, cap. 6, 14
METODI DELLA MICROBIOLOGIA
• LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI:
STRUMENTO INDISPENSABILE PER POTERLI IDENTIFICARE, STUDIARE, CARATTERIZZARE
CI FORNISCE INFORMAZIONI SUI FLUSSI DI MATERIA ED ENERGIA NECESSARI PER IL "MANTENIMENTO" E "RIPRODUZIONE" DELL'ORGANISMO
• RICHIEDE:
SERILIZZAZIONE DEL MATERIALE
FORMULAZIONE DEI TERRENI E DELLE CONDIZIONI DI COLTURA
Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica
Metodi fisici: CALORE
incinerazione: bunsen, forni crematori…
calore secco: stufa: 160 °C/2h; 170 °C/1h…
calore umido: autoclave (o pentola a pressione): 121 °C/15 min
per l'abbattimento della carica microbica:bollitura: 100 °C/30 minbollitura ripetuta 3 voltepastorizzazione: 63 °C/30 min
oppure 72 °C/15 sec
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Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica
tempo (min)
fraz
ione
di s
oprv
vive
nti
1
0.1
0.01
0.001
tempo di riduzione decimale
50 °C
60 °C70 °C
Metodi fisici: CALORE
Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica
Metodi fisici: RADIAZIONI: UV: 220-300 nm(lampade germicide)
radiazioni ionizzanti
Metodi fisici: FILTRAZIONE:
membrane filtranti 0.45 µm0.20 µm
Uso di COMPOSTI CHIMICI
• -STATICI (batteriostatici, fungistatici, virostatici…)
• -CIDI (battericidi, fungicidi, virocidi…)
• -LITICI (batteriolitici)
Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica Sterilizzazione e altri metodi di controllo della crescita microbica
Uso di COMPOSTI CHIMICI
• ANTISETTICI: Non (troppo) dannosi per pelle e mucose• DISINFETTANTI: Danneggiano i tessuti animali.
• CONSERVANTI: (non dovrebbero essere tossici se ingeriti)
• CHEMIOTERAPICI: tossicità selettiva• ANTIBIOTICI: ne riparleremo
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Antisettici e disinfettanti
Agente uso modo di azione
ANTISETTICIOrgano mercuriali pelle si combinano coi gruppi –SH delle proteineTintura di iodio pelle iodina le tirosine; agente ossidanteAlcol 70% pelle scioglie i lipidi, denatura le proteineDifenoli (esaclorofene) saponi detergente, danneggia le membraneDetergenti cationici saponi danneggiano le membraneAcqua ossigenata pelle agente ossidante……..
DISINFETTANTICloro gassoso acqua potabile agente ossidanteComposti di cloro industria alimentare agente ossidanteComposti fenolici superfici denatura le proteineOssido di etilene materiale di laboratorio agente alchilante
termosensibile (plastica…)Ozono acqua potabile forte agente ossidante…….
Terreni di coltura
•LIQUIDI
•SOLIDIcapsule di Petri (piastre)
Beute, provette, piastre (capsule di Petri)
. . ....
.. .
....
.
Terreni di coltura liquidi e solidi
Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi
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"striscio" con ansa per ottenere colonie isolate
Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi
- SPATOLAMENTO
- INCLUSIONE IN AGAR SCIOLTO
Tecniche asettiche per il prelievo e l'inoculo di microrganismi
PIASTRAMENTO CON AGAR MOLLE (TOP AGAR, SOFT AGAR)
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Terreni di coltura: composizione
•Minimi •Completi•Ricchi (brodi)
•Sintetici (chimicamente definiti)•Complessi
•Di arricchimento•Selettivi
COLTURA PURA
• Campionamento da ambienti naturali.
• Inoculo in terreno solido o liquido appropriato (di arricchimento, più o meno selettivo).
• Purificazione: normalmente per strisci successivi (almeno 2-3) in terreno solido
• Rinnovo e mantenimento di ceppi puri
Colonie batteriche e fungine Colonie batteriche
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Formazione di una colonia (a)
http://www-micro.msb.le.ac.uk/Video/pneumo.mov
Crescita di batteri su un terreno solido (colonie)
(visti a occhio nudo dopo varie ore di incubazione)
Studio della crescitaMetodi per il conteggio dei microrganismi.Misurare l’incremento di una popolazione microbica.Curva di crescita.Descrizione matematica della crescita.
Velocità di crescita, Tempo di generazione.
Crescita “in batch”, crescita in continuo, chemostato. Resa di crescita.
Principi generali della nutrizione microbicaGruppi metabolici
diversità e versatilità metabolica dei procarioti
Studio della crescita
Crescita di una popolazione batterica in coltura liquida
-coltura “a termine” (in “batch”, in lotto)-coltura in continuo (chemostato)
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Allestiamo una coltura batterica
Inoculiamo 1 l di terreno di coltura appropriato con una colonia batterica (circa 1 milione di cellule).
Es.: Escherichia coli in brodocoltura.
Incubiamo il tutto in condizioni appropriateEs.: 37 °C, con aerazione.
Dopo neppure 24 ore vedremo che la coltura è diventata molto torbida per la presenza di nuove cellule batteriche identiche per forma, struttura e composizione alle cellule iniziali.
Come monitorare la presenza e la crescita batterica?
Metodi di conteggio: a. conta al microscopio
Camera di Petroff- Hauserb. Coulter Counterc. metodi turbidimetrici (torbidità, assorbanza)d. misura del peso (biomassa)
peso umido peso secco
e. conteggio vitale in piastra (UFC)
Come "contare" i microrganismi(o stimarne quantitativamente la presenza)
a. conta al microscopio: Camera di Petroff- Hauser
0.02 mmDistanza vetrino portaoggetto-coprioggetto0.02 mm3Volume totale
0.04 mm2Area di un quadrato grande1 mm2Griglia di 25 quadrati grandi (suddivisi in 16 quadratini)
1.5x107
1.5x104
12
= N/cm3x 1000= N/mm3N/(0.04x0.02) [Nx25x50]
N/0.04 mm2numero medio di batteri/quadrato grande
c. metodi turbidimetrici (torbidità, assorbanza)
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“Conta vitale”: il metodo più sensibile
colonie visibili a occhio nudo dopo varie ore di incubazione
e. conteggio vitale in piastra (UFC)
n colonietitolo (ufc/ml) = ----------------------- × Fattore di diluizione
volume seminato
n colonietitolo (ufc/ml) = -----------------------------------
volume seminato × diluizione
Fattore di diluizione: 1, 10, 100, 1000 ...Diluizione: 1/1; 1/10; 1/100; 1/1000 ...
Calcolo del titolo
Campione (µl) 10 10 100100
Diluente (ml)
Diluizione
Diluizionecomplessiva
Fattore didiluizione
10-0
100
1
10-2
10-2
102
0.9
10-1
10-5
105
0.9
10-1
10-6
106
1
10-2
10-4
104
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Allestiamo una coltura batterica
Inoculiamo 1 l di terreno di coltura appropriato con una colonia batterica (circa 1 milione di cellule).
Es.: Escherichia coli in brodocoltura.
Incubiamo il tutto in condizioni appropriateEs.: 37 °C, con aerazione.
Dopo neppure 24 ore vedremo che la coltura è diventata molto torbida per la presenza di nuove cellule batteriche identiche per forma, struttura e composizione alle cellule iniziali.
Monitoriamo la concentrazione batterica a diversi tempi
Curva di crescita di una coltura microbica(X vs. t)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (ore)
OD
600
t (h) OD600
0.0 0.0140.5 0.0151.0 0.0161.5 0.0192.0 0.0332.5 0.0683.0 0.133.5 0.264.0 0.524.5 1.15.0 2.25.5 2.86.0 3.16.5 3.37.0 3.47.5 3.4
Curva di crescita di una coltura microbica(logX vs. t)
t (h) OD600 log OD6000.0 0.014 -1.850.5 0.015 -1.821.0 0.016 -1.801.5 0.019 -1.722.0 0.033 -1.482.5 0.068 -1.173.0 0.13 -0.893.5 0.26 -0.594.0 0.52 -0.284.5 1.1 0.045.0 2.2 0.345.5 2.8 0.456.0 3.1 0.496.5 3.3 0.527.0 3.4 0.537.5 3.4 0.53
-2.00
-1.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
0 2 4 6 8
tempo (ore)
log
OD
600
Curva di crescita di una coltura microbica(X vs. t su carta da grafico semilogaritmica)
t (h) OD600 log OD6000.0 0.014 -1.850.5 0.015 -1.821.0 0.016 -1.801.5 0.019 -1.722.0 0.033 -1.482.5 0.068 -1.173.0 0.13 -0.893.5 0.26 -0.594.0 0.52 -0.284.5 1.1 0.045.0 2.2 0.345.5 2.8 0.456.0 3.1 0.496.5 3.3 0.527.0 3.4 0.537.5 3.4 0.53
0.01
0.1
1
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (ore)
OD6
00
10
Grafici in scala lineare e semilogaritmica a confronto
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (ore)
OD6
00
0.01
0.1
1
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (ore)
OD6
00
La crescita esponenziale riflette il meccanismo di divisione binaria in una popolazione in crescita bilanciata
FASI: • adattamento (“lag”) • crescita esponenziale• fase stazionaria….• morte
1.E+06
1.E+07
1.E+08
1.E+09
0 2 4 6 8 10 12
tempo (ore)
titol
o (u
fc/m
l)
Crescita (moltiplicazione) batterica
DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA ESPONENZIALE
dX----- = kXdt
0.001
0.01
0.1
1
10
0 1 2 3 4 5 6 7tempo (ore)
OD6
00
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DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA ESPONENZIALE
X = qualsiasi parametro relativo alle cellule: torbidità (OD), biomassa, numero di cellule, ufc, n di ribosomi, quantità di proteine, di DNA, di peptidoglicano, etc…
/unità di volume di coltura
k = costante di crescita (t-1) (es.: h-1, min-1)
DESCRIZIONE MATEMATICA DELLA CRESCITA ESPONENZIALE
dX----- = kXdt
integrando: X2 = X1 ek (t2-t1)
lnX2 = lnX1 + k(t2-t1)lnX2-lnX1
k = --------------t2-t1
tempo di generazione g (= t2-t1 quando X2=2X1)
ln2k =
g
0.693g =
k
logX2-logX1 k = 2.3 --------------
t2-t1
Crescita esponenziale
t (h) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ... 5.0 10 n 0 1 2 3 4 5 ... 10 20 X 1 2 4 8 16 32 ... 1024 106 X exp2 20 21 22 23 24 25 ... 210 220
log2 X 0 1 2 3 4 5 ... 10 20 log10 X 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 ... 3 6
Esempio con g = 30 min (0.5h)
X = numero di cellulen = numero di generazonig = tempo di generazione
X2/X1 = 2n X2 = X1 × 2n
numero di generazioni n avvenute in un lasso di tempo t2-t1
X2/X1 = 2n log(X2/X1)= n log2
log(X2/X1) log(X2/X1)n = ------------------ = ------------------
log2 0.3
tempo di generazione g
(t2-t1)g = ---------
n
Numero di generazioni e tempo di generazione
ln2g =
k
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Parametri che caratterizzano la fase di crescita esponenziale: ricavare graficamente
0.01
0.1
1
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (ore)
O
D
6
0
0
g
0.001
0.01
0.1
1
10
0 2 4 6 8 10 120
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 20 40 60 80
tempo (h) [substrato limitante]
OD
600
OD
600
mas
sim
a
1x
64x
16x
4x
Fase stazionaria e substrato limitante
- la coltura cresce in uno stato di equilibrio permanente (steady state)
- il tasso di crescita può essere regolato variando il flusso del terreno
- la biomassa prodotta può essere regolata variando la concentrazione del fattore di crescita limitante
Chemostato
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Alcuni fattori che influenzano la crescita batterica
OSSIGENO
TEMPERATURA
pH
"Attività" H2O
OSSIGENO
Crescita in AmbienteGruppo Aerobio Anaerobio Effetto/ruolo
dell’ O2
Aerobi obbligati + - respirazione aerobia
Microaerofili (<0.2 atm) + - idem
Anaerobi obbligati - + Tossico
Anaerobi facoltativi + + utilizzato, non(Aerobi facoltativi) indispensabile
Anaerobi Aerotolleranti + + non richiesto, non utilizzato
Forme tossiche (reattive) dell’ossigeno
anione superossido [.O2-]
ossigeno [O2]
perossido di idrogeno [H2O2]
radicale ossidrile [.OH] ione ossidrile [OH-]
Formazione di specie reattive dell’ossigeno
radiazioni ionizzanti
radiazioni UV
respirazione (sottoprodotto)
reazioni dedicate (neutrofili, macrofagi)
composti chimici, antibiotici (adriamicina, bleomicina)
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Brock-F.5.23
Formazione di specie reattive dell’ossigeno nel processo di respirazione
O2 + e- [.O2-] superossido
[.O2-] + e- + 2H+ H2O2 perossido di H
H2O2 + e- + H+ H2O + .OH radicale ossidrile.OH + e- + H+ H2O acqua
O2 + 4e- + 4H+ 4H2O
STRESS OSSIDATIVO
Le specie reattive dell’ossigeno
son forti ossidantiinducono la formazione a catena di radicali liberidanneggiano molecole (lipidi, DNA) della cellula
Gli organismi aerobi o aerotolleranti hanno sviluppato sistemi diversi di detossificazione, che difendono la cellula dagli effetti dannosi delle specie reattive dell'ossigeno.
Detossificazione di radicali dell’Ossigeno
2[.O2-] + 2 H+ O2 + H2O2
superossido dismutasi(SOD)
2H2O2 2H2O + O2
catalasi
H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+perossidasi
Saggio della catalasi
Brock-F.5.25
H2O2 H2O + 1/2 O2
catalasi
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TemperaturaTemperatura: psicrofili, mesofili, termofili
Temperatura
Temperature di crescitaminima ottimale massima
Psicrofili ≤ 0 ≤ 15 20Mesofili > 15 20-40 45Termofili > 45Ipertermofili > 70
Psicrotrofi < 15 > 15 >20Termotolleranti: sopravvivono alla pastorizzazione
-filo-trofo-tollerante
Batterio Minima Ottimale MassimaListeria monocytogenes 1 30-37 45Vibrio marinus 4 15 30Pseudomonas maltophilia 4 35 41Thiobacillus novellus 5 25-30 42Staphylococcus aureus 10 30-37 45Escherichia coli 10 37 45Clostridium kluyveri 19 35 37Streptococcus pyogenes 20 37 40Streptococcus pneumoniae 25 37 42Bacillus flavothermus 30 60 72Thermus aquaticus 40 70-72 79Methanococcus jannaschii 60 85 90Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90Pyrobacterium brockii 80 102-105 115
Temperatura minima, massima, ottimale (°C)
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pH: acidofili, neutrofili, alcalofili
Organismo Minimo Ottimale Massimo
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0- 2.8 4.0- 6.0Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.0-3.0 5.0Bacillus acidocaldarius 2.0 4.0 6.0Zymomonas lindneri 3.5 5.5- 6.0 7.5Lactobacillus acidophilus 4.0 -4.6 5.8- 6.6 6.8Staphylococcus aureus 4.2 7.0- 7.5 9.3Escherichia coli 4.4 6.0- 7.0 9.0Clostridium sporogenes 5.0 -5.8 6.0-7.6 8.5- 9.0Erwinia carotovora 5.6 7.1 9.3Pseudomonas aeruginosa 5.6 6.6-7.0 8.0Thiobacillus novellus 5.7 7.0 9.0Streptococcus pneumoniae 6.5 7.8 8.3Nitrobacter spp 6.6 7.6-8.6 10.0
pH minimo, massimo e ottimale.
pH
Disponibilità di acqua (Aw - osmolarità-salinità)
alofili deboli NaCl 1- 6 %moderati NaCl 6-15 %estremi NaCl 15-30 %
alotolleranti
osmofili
osmotolleranti
xerofili
Organismo Aw minima per crescere
Caulobacter 1.00Spirillum 1.00Pseudomonas 0.91Salmonella/E. coli 0.91Lactobacillus 0.90Bacillus 0.90Staphylococcus 0.85Halobacterium 0.75
Disponibilità di acqua (Aw - osmolarità-salinità)
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Disponibilità di acqua (osmolarità-salinità)
a: non alofilob: alotollerante (es.: Stafilococus aureus)c: alofilo estremo (Halococcus)