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Procesos de identificacin de microorganismos a travs de una muestra problema por medio de tincin Gram y

Ziehl-Neelsen

Informe de prcticas de laboratorio. Bellatin Indiveri, Francesca Mara1

Bustamande Winder, Katherine1

Guanilo Lpez, Andrea Daniela Alejandra1

Leveau Daz, Mariela1

RESUMEN

Se tomaron muestras de suelo en las cercanas de la laguna de Villa 1- Universidad Cientfica del Sur para posteriormente sembrar una porcin de la muestra en medios de cultivos como agar licuado fundido (ALF) para la proliferacin de microorganismos y su consecuente identificacin con la tincin Gram y coloracin Ziehl-Neelsen. Posteriormente una vez realizada la proliferacin de dichos organismos se procedi a realizar una tincin Gram para la observacin en microscopio a 1000X. De la observacin se vio que las muestras obtenidas eran bacilos delgados y cortos Gram positivos en formaciones en cadenas y disposiciones predominantemente rectas. Se observ tambin una muestra de Mycobacterium tuberculosis con la coloracin Ziehl-Neelsen a 1000X lo cual devel bacilos cortos rosceos y dispersos. Se concluy que el mtodo de siembra es fundamental para la proliferacin de los microorganismos ya que provee condiciones ptimas para su desarrollo y que el funcionamento correcto de la tincin Gram y coloracin Ziehl-Neelsen dependen directamente del tipo de microorganismo con el que se est experimentando.

Palabras clave: Gram, Ziehl-Neelsen, tincin, identificacin, BAAR, siembra. 1 Alumnas de la Facultad de Ingeniera y Gestin Ambiental de la Universidad Cientfica del Sur.

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INTRODUCCION

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que permite el crecimiento de los microorganismos; siempre y cuando se encuentre en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas.

Un punto importante que se debe tener presente, es que cada medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, donde se determinan sus propiedades fisicoqumicas (apariencia, pH, etc.) y microbiolgicas (esterilidad y promocin de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso. [6]

Los Mtodos de siembra son aquellos mecanismos que se usan en el laboratorio para una identificacin presuntiva de los microorganismos presentes en la muestra problema.

Gram: es el tipo de tincin diferencial ms importante para la visualizacin de bacterias. Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: gram positivas y gram negativas [1]. Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.

Mientras que las bacterias gram negativas son constantes en su reaccin, los microorganismos

gram positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones. Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tien por la safranina apareciendo como gram negativas. Anlogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la tcnica. [2]

Ziehl Nielsen: Esta coloracin permite identificar micro organismos alcohol acido resistentes; por ejemplo: micro organismos con pared celular con abundante cantidad de lpidos.

Se realiza esta tincin en micro organismos con pared lipoide, estos lpidos presentes en la pared se conocen como cidos miclicos, ya que es de alto peso molecular lo que la vuelve cerosa a temperatura ambiente. Estos cidos miclicos son resistentes a la tincin gran, por eso la tincin gram no es satisfactoria para la deteccin de Mycobacterium.[10]

El objetivo principal de la siguiente prctica es poder reconocer y diferenciar los medios de cultivo, reconocer cuales son los mtodos de siembra necesario para cada tipo de necesidades y por ltimo el objetivo de esta prctica es poder realizar correctamente las tinciones para cada tipo de micro organismo, pudiendo as diferenciar su estructura (Gram) o su resistencia a alcohol acido.

MATERIALES Y MTODOS

Medios de cultivo y Mtodos de siembra

Estriado: Se coloc un poco de muestra extradade los alrededores de la laguna de la Universidad Cientfica del Sur- Villa 1 con el asa de siembra, luego se coloc una gota de agua y se homogeniz. Posteriormente, se colocde esta mezcla en la placa petri con fundido (ALF) previamente dividida en cuatro cuadrantes y se realiz la siembra con el mtodo de estriado en cada uno de los cuadrantes.

Diseminacin: Con la pipeta paster se pequea porcin de muestra (previamente diluida en agua), luego con la esptula drigalsky se realiz el pintado primero en un sentido y luego en el sentido contrario.

En ambos casos se dieron las condicioneptimas para la proliferacin de microorganismos.

Tincin Gram

Figura 1. Muestras de colonias bacterianas sembradras a partir de la muestra de suelo de Villa 1.

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MATERIALES Y MTODOS

Medios de cultivo y Mtodos de siembra

un poco de muestra extrada de los alrededores de la laguna de la Universidad

con el asa de siembra, una gota de agua y se

Posteriormente, se coloc una gota ezcla en la placa petri con agar licuado

previamente dividida en cuatro cuadrantes y se realiz la siembra con el mtodo de estriado en cada uno de los cuadrantes.

Diseminacin: Con la pipeta paster se retir una de muestra (previamente diluida

en agua), luego con la esptula drigalsky se el pintado primero en un sentido y luego en

En ambos casos se dieron las condiciones ptimas para la proliferacin de microorganismos.

de colonias bacterianas sembradras a partir de la

En una placa porta objeto esterilizadouna gota de agua, con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llamase llev una pequea cantidad de una colonia de la muestra problema.Con el asa se extendisobre la lmina portaemulsin y se fij al calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

Se colore con cristal violeta (primer colorante) durante un minuto, paracristal violeta de la placaagreg lugol (mordiente) por 1 minuto y se el lavado con agua. Se agregcetona (decolorante) yagreg safranina (colorante de contraste) a la placa durante 1 minuto y sesecar al calor. Finalmente microscopio con aceite de inmersin.

Figura 2. Muestra el procedimiento con las coloraciones utilizadas en la tincin gram.http://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/puebas-bioquimicas-primarias/

objeto esterilizado se coloc una gota de agua, con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama del mechero,

una pequea cantidad de una colonia de tra problema.

i la gota de agua y muestra porta objeto hasta hacer una al calor, calentando suavemente

a la llama del mechero hasta que se seque.

con cristal violeta (primer colorante) para luego lavar el exceso de

cristal violeta de la placa con agua. Luego se (mordiente) por 1 minuto y se reiter

Se agreg despus el alcohol cetona (decolorante) y se lav. Por ltimo se

safranina (colorante de contraste) a la placa durante 1 minuto y se procedi a lavar y

Finalmente se observ a 1000X al microscopio con aceite de inmersin.

Muestra el procedimiento con las coloraciones utilizadas en la tincin gram. http://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/pueba

primarias/

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Coloracin Ziehl-Nielsen. (Placa con Mycobacterium Tuberculosis)

En una lmina porta objetos se coloc la muestra y se fij al calor, se le agreg fucsina (primer colorante) por 5 minutos en caliente. Luego se lav con alcohol cido (decolorante) y posteriormente con agua. Se colore con azul de metileno (segundo colorante) durante 1 minuto. Finalmente se reiter el lavado con agua, se sec y se observ a 1000X. En la prctica realizada se observ directamente la muestra con la aplicacin de la coloracin Ziehl-Nielsen mas no se realiz el procedimiento de coloracin.

Figura 5 Muestras de Mycobacterium tuberculosis observadas a 1000X.

RESULTADOS Y DISCUSIONES.

Coloracin Gram

Al realizar la experiencia se obtuvieron colonias de bacilos gram positivas, podemos asegurar que pertenecen a este grupo debido a que al aplicar la tincin gram se tiene como referencia que stas bacterias se teirn de un color violeta, as como pas en la prctica realizada (Figura 4). Esto se debe a que las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta, por lo cual se ven de un color violeta intenso, mientras que las Gram negativas pierden el color violeta con el agente decolorante que ente caso es el alcohol-acetona, y luego toman un color rojo al teirse con la safranina que se le agrega al final de la experiencia. [2]. Se debe resaltar que las Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglucano o murena y carecen de membrana externa, al tener una capa gruesa de peptidoglucano resisten a la decoloracin, mientras que las Gram negativas poseen una membrana externa y menor cantidad de peptidoglucano [4], lo cual hace que se

Figura 3 (Izquierda) y Figura 4 (derecha). Muestras de colonias bacterianas de la muestra de suelo utilizando tincin Gram observadas a 1000X

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optimice la retencin del colorante cristal violeta. Algunas bacterias se clasifican como Gram inciertas o variables debido a que simultneamente presentan tincin de Gram positivas y de Gram negativas debido a que tienen paredes cerosas o con alto contenido lipdico. Por otro lado podemos observar otras caractersticas que resaltan fcilmente, como por ejemplo la morfologa de estas: bacilos delgados y cortos, con disposiciones rectas y en algunos casos semi-curvados, unidos unos a otros formando cadenas, no hay evidencia de flagelos (Figura 4 y 6).

No hubo presencia de bacterias del tipo gram negativas en ninguna de las muestras observadas. Se debe tomar en cuenta el lugar en donde fueron recolectadas las muestras, que en este caso se llevo a cabo cerca a una de las lagunas internas de Villa 1, de la Universidad Cientfica del Sur.

Coloracin Ziehl-Neelsen En otra de las experiencias llevadas a cabo en laboratorio, se observaron muestras de Bacilos Alcohol cido Resistente(BAAR), (especficamente del Gnero Mycobacterium tuberculosis), estas a diferencias de las gram no se detectarn si se usa el mtodo de tincin gran (se encuentran en la clasificacin de Gram Inciertas), es por eso que se tiene que realizar la tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen para su identificacin. Estos organismos se caracterizan por poseer pared celular con abundante cantidad de lpidos (cerca del 40% del su peso total), debido a esta caracterstica, normalmente se encuentran formando colonias hidrfobas de aspecto ceroso, que son difciles de teir. Estas caractersticas solo lo poseen los gneros Mycobactrium y Nocardia.[7] En las muestras se observaron bacilos alargados de coloracin roscea, no hay evidencia de que se encuentren agrupados formando colonias (Figura 5).

REFERENCIAS

1. Aquiguali Ramos M. Prez Chavela M. Manual de prcticas del laboratorio de microbiologa. Universidad Autnoma Metropolitana. Mxico. Unidad 3. 28-32 ppg. http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAHUATL_RAMOS_MARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.pdf

2. Departamento de microbiologa. Universidad de Salamanca. (2008). Prcticas de

Figura 6. Muestras de colonias bacterianas, no hay evidencia de flagelos.

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microbiologa. Salamanca- Espaa. Unidad 1. 5-7 ppg. http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pdf

3. Garca V. Introduccin a la microbiologahttp:[Base de datos]. Extrado de google books: //books.google.com.pe/books?id=K_ETVnqnMZIC&pg=PA47&lpg=PA47&dq=gram+positiva+y+negativo&source=bl&ots=ZfunyojLXn&sig=2eF0UqYLi7p7Lwkl8D22Sp04C8k&hl=es&sa=X&ei=PaBCUPLlD4qm8ASl_IHYDw&ved=0CDQQ6AEwAQ#v=onepage&q=gram%20positiva%20y%20negativo&f=false

4. Gamboa M, Garca J, Hernndez F, Rodriguez E. (2005).Bacteriologia general, principios y prcticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica,465pp (63-64 ).[Base de dato] [ disponibles en http://books.google.com.pe/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=frontcover&hl=es&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false

5. Laboratorio de Microbiologa. Instrumentacin y principios bsicos. Mtodos de siembra. Cuba. http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library?e=d-00000-00---off-0prelicin--00-0----0-10-0---0---0direct-10---4-------0-0l--11-0-50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-0gbk-00&cl=CL3.3&d=HASH01ebc63ab80c0bbb5a17ddab.20.4&hl=1&gc=0&gt=0

6. Laboratorio de microbiologa. Universidad Cesar Vallejo. Lima- Per. Unidad 6. 9-11 ppg.

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf

7. Olivas Evangelina. Manual de prcticas de Microbiologa I y II y Parasitologia. Evangelina Olivas. Universidad autnoma de ciudad de Jurez. Instituto de ciencias biomdicas de microbiologa y parasitologa. Departamento de ciencias bsicas. Mexico (pag 33). [ base de dato]. [disponible en : http://books.google.com.pe/books?id=q1gALTKvynsC&pg=PA17&lpg=PA17&dq=Bacterias+alcohol+acidorresistentes&source=bl&ots=Ud1z1jhgof&sig=RSMiluPM5VkBxmHoQH2yHtAUr3E&hl=es&sa=X&ei=6qZCUPaDDJHU8wSBl4G4BQ&ved=0CDAQ6AEwAQ]

8. Peas Parrilla M. (2008-2009). Microbiologa Clnica (Guin de prcticas). Espaa. 2-3 ppg. www.unavarra.es/genmic/microclinica/practicas.pdf

9. Sridhar Rao P. Microbiology notes. Dept. of microbiology JJMMC, DAVANGERE. 1ppg http://www.microrao.com/micronotes/acidfast.htm

10. Surgical pathology - histology. staining manual microorganism. 1-2ppg. http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/MANUALS/AFB.PDF