microbiologia - informe 02
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA CURSO: MICROBIOLOGÍA GENERAL FACULTAD DE INGENIERÍA PROFESOR: ETERIO ALVA MUÑOZ
“AÑO DE LA INTEGRACIÓN NACIONAL PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA”
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO:
MICROBIOLOGÍA GENERAL
DOCENTE:
BLGO. MBLGO. ETERIO ALVA MUÑOZ
TEMA:
INFORME DE LABORATORIO N° 02
ESTUDIANTE:
SIFUENTES PENAGOS GABRIEL OMAR
CODIGO:
0201212039
CICLO:
IV
NUEVO CHIMBOTE2013
PRACTICA DE LABORATORIO N° 02
EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS BACTERIAS
I. INTRODUCCIÓN
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El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que
resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la
rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste entre la
célula y el medio que la rodea es la utilización de colorantes. Estos
pueden emplearse también para localizar estructuras específicas
en la célula o para distinguir entre tipos diferentes de células.
Las células generalmente son tratadas para coagular el
protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para
las bacterias la fijación por el calos es lo más corriente, aunque
también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación se realiza
habitualmente en células que han sido secadas sobre un
portaobjetos, tratando después este con el agente fijador y
siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación
produce generalmente el encogimiento de las células, la tinción,
por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo
que es realmente, de manera que las medidas de las células que
han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha
precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tiene
alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos
colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes
catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones)
y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes
incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de
colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula,
usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o
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depósitos de grasa. Un gran ejemplo de colorante liposoluble es
negro de Sudán.
Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula
haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un
colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un
mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina
con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora el
podrá atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células
para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de
tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa
sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce
un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en
muestra naturales, puesto que la mayor parte del material no
celular no se tiñe.
II. OBJETIVOS.
II.1. OBJETIVO GENERAL
II.1.1. Observar las formas y estructuras de las bacterias
a partir de muestras directas y de cultivo,
utilizando coloraciones, simples, diferenciales y
estructurales.
II.2. OBEJETIVOS ESPECÍFICOS
II.2.1. Observar las formas fundamentales de las
bacterias.
II.2.2. Describir las técnicas de coloración simple y
diferenciales.
II.2.3. Identificar colonias bacterianas en forma
macroscópica.
II.2.4. Observar estructuras bacterianas por técnicas de
coloraciones específicas.
III. MATERIAL Y MÉTODOS.
III.1. MATERIAL
III.1.1. Cultivos puros
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Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella
sp. Escherichia coli.
III.1.2. Muestras:
- Sarro dental.
- Mucosa labial.
- Cerumen.
III.1.3. Material de vidrio:
- Laminas cubreobjetos.
- Laminas portaobjetos.
- Tubos de ensayo.
- Placa Petri.
III.1.4. Equipos:
- Microscopio óptico de luz.
III.1.5. Otros:
- Coloraciones simples:
o Azul de metileno
o Cristal violeta
o Safranina
o Verde de Malaquita
o Ácido pícrico
o Fucsina ácida
- Coloraciones compuestas:
o Set de Wirtz
o Coloraciones de Maneval
- Aceite de cedro.
- Asa bacteriológica.
- Mecheros con un ron de quemar.
- Fósforo, etc.
III.2. METODO: (PROCEDIMIENTO)III.2.1. COLORACIÓN SIMPLE
Son técnicas en las que se emplean un solo colorante, por ejemplo, coloración con el azul de metileno, con el violeta de genciana, la fucsina fenificada básicas, el ácido pícrico, etc. Y se utiliza para determinar formas bacterianas sin distinción de grupos.
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Hacer un de la muestra en lámina portaobjetos con ayuda del asa bacteriológica y agua destilada o Solución Salina Fisiológica (SSF).
Fijar el frotis por exposición al calor suave cerca del mechero o a temperatura ambiente.
Teñir con cualquiera de los colorantes, proporcionado en los materiales, por un tiempo recomendado por especialistas (generalmente varía entre 0.5 a 5 minutos).
Lavar con agua de caño a chorro suave (de preferencia agua destilada), para eliminar el exceso de colorante.
Secar el preparado a calor suave o al medio ambiente (lograr que el secado sea uniforme en toda la lámina), para no tener interferencias en la observación.
Observar a menor y mayor aumento, teniendo en cuenta que la lámina este bien seca, sobre todo cuando se utiliza lente de inmersión. Es este último caso usar aceite de cedro.
Resultados:
Las bacterias se observar de color azul si se colorea con el azul de metileno. Si se colorea con fucsina fenicada el procedimiento es el mismo solo varía el colorante, las bacterias se observan de color rojo.
III.2.2. COLORACIONES DIFERENCIALES:Son las coloraciones que emplean más de un colorante y se utilizan para colorear las paredes celulares de las bacterias. Ejemplo: Coloración Gram, Coloración Ziehl Neelsen.
COLORACIÓN GRAM
Fue creada por Christian Gram, estudiante danés, entre 1884 y 1886. Se utiliza para diferenciar a las bacterias de acuerdo a la composición química de su pared celular en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas.
Procedimiento.
Realizar la extensión de la muestra.
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Secar la muestra a temperatura ambiente o el calor.
Cubrir la muestra con la solución fenicada de violeta de genciana o la de Hucker, por un tiempo de 30 a 60 segundos, aproximadamente.
Lavar con agua a chorro. Cubrir con Lugol y dejarlo actuar de 2 a 3
minutos. Lavar con agua de caño a chorro suave. Decolorar con alcohol acetona hasta que ya no
se desprenda más colorante de la lámina. Lavar con agua de caño a chorro suave. Contrastar con safranina de 10 a 30 segundos. Lavar, secar y observar a inmersión.
Resultado.
Bacterias color violeta: Gram positivos.
Bacterias color rosado: Gram negativos.
Los gérmenes Gram positivos son aquellos en los cuales se ha formado el complejo Cristal-Violeta-Yodo (CVI). Y, no son decolorados por acción de alcohol acetona, manteniendo por lo tanto la decoloración violeta.
Los gérmenes Gram negativos son aquellos en los cuales no se forma el forma el complejo Cristal-Violeta-Yodo (CVI).Y, por tanto son decolorados por acción del alcohol acetona, y al quedar sin decoloración están aptos para ser teñidos por la safranina.
En términos generales, en microbiología clínica, son Gram positivos todos los cocos a excepción de las neiserias, y son Gram negativos todos los bacilos a excepción de los esporulados, los micobacterias y las corinebaterias.
La técnica original de Gram ha sufrido diversas modificaciones, pero su fundamento sigue el mismo. Una de las modificaciones consiste en el empleo de la safranina como colorante de fondo en lugar de Ziehl.
COLORACION ZIEHL NEELSEN
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Se utiliza para colorear a las mico bacterias o llamadas también bacilos ácidos alcohol resistentes (b.a.a.r) ya que estos al poseer ácidos micólicos (ceras) como componentes de su pared celular, hacen que sea difícil la coloración con el Gram, haciéndose necesario el uso del mechero y mediante la emisión de vapores se permita el ingreso del colorante de Ziehl (fucsina fenicada básica). La coloración de Ziehl Neelsen se puede realizar de dos maneras en caliente (técnica más usual) o en frio (tinción de Kinyoun), que es más simple y rápida que el método en caliente. Facilita más simple y rápida que el método en caliente. Facilita además el examen de gran número de muestras (por ejemplo, en las encuestas epidemiológicas). Sin embargo, se utiliza una cantidad considerable de fucsina fenicada. Para el trabajo habitual, en un laboratorio general, es más adecuado el método en caliente.
El bacilo causante de la tuberculosis en el ser humano pueden ser de dos tipos: bacterias típicas (Mycobacterium tuberculosis) o bacterias atípicas. Estos bacilos son resistentes a los ácidos; es decir, una vez que se han teñido de rojo con la fucsina fenicada básica no se pueden decolorar por medio del alcohol ácido.
La fucsina fenicada básica tiñe de rojo todos los microorganismos que se encuentren en el esputo.
El alcohol ácido realiza la decoloración de todos los microorganismos y elementos celulares, exceptuando los bacilos ácido alcohol resistente (bacilos de la tuberculosis).
El azul de metileno tiñe de azul todos los microorganismos y decolorados por el alcohol ácido alcohol resistente se conservan teñidos de rojos.
Al realizar esta coloración se hace necesario aplicar medidas bioseguridad como es el uso de barbijos durante todo el proceso de coloración. Se puede reemplazar el uso del asa bacteriológica por un abate lenguas.
Procedimiento
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Realizar la extensión del frotis con el asa bacteriológica o con un abate lenguas.
Secar a temperatura ambiente o al calor. Cubrir con el colorante de Ziehl de 3 a 5
minutos. Colocar el mechero de alcohol por debajo de
las láminas preparadas y observar la emisión de vapores por 3 o 5 veces.
Decolorar con alcohol ácido. Lavar con agua a chorro. Agregar el azul de metileno (colorante de
contraste) durante 30 segundos. Lavar, secar y observar a inmersión.
Resultados.
Las micro-bacterias se ven de color rojo sobre un fondo azul.
III.2.3. COLORACIONES ESTRUCTURALES.
Son aquellas en los que se utilizan 1 o más colorantes y se realizan para observar las estructuras bacterianas, como son: flagelos, cápsulas, esporas y corpúsculos metacromáticos.
COLORACIÓN DE FLAGELOS (MÉTODO DE LEIFFSON)
Se deposita una gota de suspensión bacteriana en una lámina portaobjetos.
Se agrega el colorante de Leiffson y se deja durante 5 minutos hasta que el alcohol se evapore.
Lavar con agua, secar y observar a inmersión.
Resultado
El flagelo se observa de un color rojo a negruzco.
COLORACIÓN DE CAPSULA (MÉTODO DE MANEVAL)
Realizar la extensión de la muestra en lámina portaobjetos.
Secar Agregar una gota de rojo de Congo. Agregar el colorante de Maneval durante 1
minuto.
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Lavar con agua destilada y evitar que la suspensión se despegue.
Secar y observar a inmersión.
Resultado
El cuerpo bacteriano de color rojo, cápsula y fondo azul.
COLORACIÓN DE ESPORAS (MÉTODO DE WIRTZ)
Hacer la extensión de la muestra y fijarla al calor.
Añadir verde de malaquita. Calentar hasta desprender vapores por 3 o 4
veces. Lavar Agregar safranina como colorante de contraste. Lavar, secar y observar.
Resultados
Espora de color verde y cuerpo bacteriano de color rojo.
COLORACIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMATICOS (MÉTODO DE LOEFFLER)
Realizar la extensión de la muestra y fijarla al calor.
Cubrir con colorante de Loeffler durante 3 minutos.
Lavar con agua destilada. Secar y observar a inmersión.
Resultado
El corpúsculo metacromatico se ve de un color azul oscuro y el cuerpo bacteriano de un color calor.
IV. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS
PROCEDIMIENTO
o Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
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o Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar.
o Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
o Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.o Lavar el exceso de colorante con agua.o Añadir el mordiente lugol, solución de yodo-ioduro potásico,
durante 1 minuto.o Lavar el exceso de mordiente con agua.o Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la
preparación, durante 30 segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto).
o Lavar inmediatamente con abundante agua.o Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1
minuto.o Lavar el exceso de colorante con agua.o Dejar secar al aire.o Añadir una gota de aceite de inmersión.o Observar con objetivo de inmersión (100 x).
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Tinción de Gram de Staphylococcus aureus.Apreciamos el color azul en esta bacteria, específicamente Staphylococcus aureus , un coco con coloración gram positiva, este color nos indica que es un Gram positivo y se debe a que el alcohol acetona lo decoloró ya que no formó el complejo cristal-violeta-iodo.
Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos). Microscopía de campo claro (100x).Apreciamos el color azul en esta bacteria, específicamente un bacilo cereus, un bacilo con coloración positiva, este color nos indica que es un Gram positivo y se debe a que el alcohol acetona lo decoloró ya que no formó el complejo cristal-violeta-iodo.
Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos). Microscopía de campo claro (100x).Apreciamos el color rojo en esta bacteria, específicamente E. coli, un bacilo con coloración negativa, este color nos indica que es un Gram negativo y se debe a que el alcohol acetona no lo decoloró ya que formó el complejo cristal-violeta-iodo.
Podemos afirmar que existen tanto cocos como bacilos con coloraciones gram positivas y gram negativas.
Es nuestra práctica de laboratorio N° 02. Apreciamos un bacilo Gram(+) como el Bacillus cereus y un bacilo Gram(-) como el E.coli
V. CONCLUSIONES
Observamos las formas y estructuras de las bacterias a partir de muestras
directas y de cultivo, utilizando la coloración compuesto o directa para
obtener las coloraciones Gram (+) y Gram (-), utilizando como colorantes al
cristal violeta, la safranina y el azul de metileno. También usamos un
reactivo que fue la solución yodada.
Comprendimos el principal fundamento de las coloraciones Gram en
bacterias.
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Todos los cocos y bacilos cuando se añade el cristal violeta, ambos se tiñen
de un color azul, es por ello que se lavan. Después de proceder al lavado, se
agregó la solución yodada la cual contenía el Lugol, es así como el Lugol y el
Cristal violeta forma un compuesto complejo llamado Cristal-violeta-yodo, el
cual hace que las bacterias resalten. Al lavar otra vez las muestras se
procedió a decolorar con el alcohol de acetona. El principal fundamente es
que los bacilos no forman un complejo cristal-violeta-yodo y es por ello que
se decoloran, pero a un coco no lo decolora porque si se forma un
compuesto cristal-violeta-yodo. Para finalizar se añadió el colorante
contraste safranina que nos da el color rojo y tenemos así bacterias rojas
(Gram -) y bacterias azules (Gram +).
VI. DISCUSIONES
1. La ausencia de colorantes provocaría la ausencia de contraste entre
las células y el medio que lo rodea, así, no se podría analizar las
células bacterianas porque resultarían difíciles de en el microscopio
óptico.
2. Los métodos de tinción pueden conducir a errores. Las moléculas de
colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen
estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante.
3. Los colorantes se emplean para distinguir entre tipos diferentes de
células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria, etc.
4. Los colorantes cargadas positivamente se combinan con intensidad
con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como
los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Mientras que los
colorantes cargados negativamente se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
proteínas.
5. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al
organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la
pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
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6. La ausencia de calor en algún método de tinción como por ejemplo la
espora, jamás el colorante no podrá permeabilizar a este
microorganismo en análisis ni la entrada del colorante a través de sus
capas externas.
7. Las bacterias gram positivas mantienen y conservan el complejo
cristal violeta-iodo, las bacterias gram negativas se decoloran
rápidamente con la aplicación del alcohol.
8. Si un microorganismo cuya coloración resiste la acción de alcoholes y
ácidos suaves (ácido-alcohol resistente) de otros que no resisten la
decoloración (no ácido-alcohol resistente) se utiliza la coloración de
Ziehl Neelsen.
VII. RECOMENDACIONES
1. Seguir estrictamente el procedimiento de tinción porque pueden
conducir a errores.
2. Durante las sesiones, siempre deberá usar un guardapolvo bien
abotonado, que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio.
3. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos
microbianos.
4. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no
relaciones con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos
personales (libros, mochilas, etc.) en la zona específica por el
profesor.
5. Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimentos o bebido
dentro del laboratorio de microbiología.
6. No se admite limpiar el lente de los objetivos con cualquier material,
en caso de requerirse, se realizara cuidadosamente con un papel.
VIII. ANEXOS.
NUEVAS METODOLOGÍAS EN MICROSCOPÍA CON FLUORESCENCIA
En la actualidad, se están desarrollando principalmente tres técnicas distintas de microscopía de fluorescencia de alta resolución, cuyo fundamento y aplicaciones comentaremos muy brevemente. La primera técnica de imágenes de alta resolución, caracterizada en 1994, es la denominada STED. Esta técnica combina dos fuentes de iluminación
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láser, con el fin de romper el índice de difracción. El primer láser, denominado de excitación, emite a la longitud de onda necesaria para excitar el flúor-cromo utilizado. El segundo ó láser STED se fija a una longitud de onda más larga, que inactiva rápidamente al flúor-cromo. Utilizando este esquema se ha conseguido hasta un poder de resolución de 20 nm. Otra alternativa tecnológica es FPALM que consigue resoluciones de 10 nm y se emplea generalmente en la localización génica ó proteica, utilizando como sonda la GFP (“Green fluorescent protein) ó sus derivados. El método FPALM se ha aplicado, por ejemplo, para estudiar la dinámica de cito esqueleto bacteriano. Por último, otra metodología de alta resolución es STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) que, al igual que la anterior, tiene resolución a nivel de nano escala y proporciona imágenes en tres dimensiones. Sin duda, esta microscopía de fluorescencia de super-resolución es una herramienta eficaz, alternativa a la microscopía electrónica de transmisión, que proporcionara detalles inéditos de la estructura sub-celular y funcionamiento de las células procariotas.
Azul de metileno
Nombre químico 3,7-bis (dimetilamino)-Cloruro de fenazationioCloruro de tetrametiltionina
Fórmula química C16H18N3ClSMasa molar 319,85 g/molNúmero CAS [61-73-4]Número EC 200-515-2Densidad 1.757 g/cm³Punto de fusión 100 °CPunto de ebullición
Se descompone
SMILES CN(C)c3ccc2nc1ccc(N(C)C)cc1[s+]c2c3.[Cl-]
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CRISTAL VIOLETA
El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados como indicadores de pH y colorantes.
En la forma pura, el violeta de cristal se presenta como lustrosos cristales azul verdosos que funden a 137° Celsius (279°Fahrenheit). Los violeta de metilo son solubles en agua, etanol, dietilenglicol, y dipropilenglicol. En particular, el violeta de metilo 6B es soluble en agua al 2.93% y soluble en etanol al 15.21%.
Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-rosanilinas. Por la mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el colorante final. Cuanto más metilado esté el colorante, su color será de un violeta más oscuro:
o Tetrametilo (cuatro metilos) es conocido como Violeta de metilo 2B, y encuentra usos específicos en química y medicina.
o Pentametilo (cinco metilos) es conocido como Violeta de metilo 6B, y es más oscuro como colorante que 2B.
o Hexametilo (seis metilos) es conocido como Violeta de metilo 10B, o específicamente violeta cristal. Es mucho más oscura que la 2B, y aún más oscura que la 6Bk
SafraninaFórmula estructural
Cl−
Nombre común SafraninaCAS 477-73-6Sinónimos Safranina T, Safranina O, Safranina B,
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3,7-Diamino-2,8-dimetil-5-fenil-fenaziniumcloro,rojo básico 2
Fórmula química C20H19ClN4
Peso molecular 350,85 g/molPunto de fusiónDensidad g/cm3
IX. CUESTIONARIO
1. FUNDAMENTO DE LA COLORACIÓN DE GRAM Y DE ZHIEL NEELSEN
COLORACIÓN GRAM.
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de péptido glucano, además de dos clases de ácidos:
o Anclado en la cara interna de la pared celular y unida a la membrana plasmática, se encuentra elácido lipoteicoico.
o En la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el péptido glucano (también conocido como mureína).
Por el contrario, la capa de péptido glucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (decomposición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipo-polisacárido.
Conclusión:
Ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea.
Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de péptido glucano, no son susceptibles a
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la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.
Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).
PRODUCTOS QUE SE UTILIZAN
REACCIÓN Y COLORACIÓN DE LAS BACTERIAS
GRAM + GRAM -
CRISTAL VIOLETA
Células color violeta Células color violeta
LUGOL SOLUCIÓN IODADA
Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta.
Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta.
ALCOHOL Se deshidratan las paredes Eliminación por extracción de
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celulares. Se contraen los poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las células que continúan teñidas de color violeta.
grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la célula.
SAFRANINA Células no decoloradas; quedan teñidas de color violeta.
Células decoloradas; se tiñen de color rosado.
COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.
Visualización de Mycobacterium tuberculosis usando la tinción de Ziehl-Neelsen.
2. SE PUEDEN REEMPLAZAR LOS COLORANTES DE CONTRASTE EN LAS DIVERSAS COLORACIONES.
No, porque el tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más
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simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes). Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones).
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción.
Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
Examen microscópico directo de las muestras clínicas Sin Tinción
Examen microscópico de las muestras clínicas levemente modificadas Tinción Simple
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Examen microscópico de las muestras clínicas muy modificadas
Tinción Diferencial
3. QUE SUCEDE SI EN LA COLORACION DE ESPORAS Y EN LA ZIEHL NEELSEN SE OVBIA EL CALENTAMIENTO POR TRES VECES CONSECUTIVAS.
Se aplica el mismo fundamento para ambos, es decir, si a una espora no se somete al calor jamás el colorante no podrá permeabilizar a este microorganismo en análisis ni la entrada del colorante a través de sus capas externas, ya que la principal función del colorante es para contrastar entre la célula y el medio que la rodea, y sin esto, no se podrá analizar en el microscopio.
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4. QUE SUCEDERÍA SI LA LÁMINA PORTAOBJETOS AL TÉRMINO DE LA COLORACIÓN HAY PRESENCIA DE GOTAS DE AGUA.
No se observaría varios campos ni encontrar aquél que permita una identificación de la morfología, estructura y reacción al Gram.