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Microscopia Microscopios ópticos
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microscopio simple:
Con él se describieron por 1º vez las bacterias
microscopio compuesto:
Mejoró significativamente la calidad de imagen
del microscopio simple
Microscopia Microscopios ópticos
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Microscopia Microscopio ópticos invertido
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Microscopia Microscopio óptico invertido
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Microscopia Microscopios ópticos
A)Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos.
B)Objetivo: lente situada en el revolver. Amplía la imagen, es un elemento vital que permite ver a través
de los oculares.
C)Porta objetos: elemento transparente (vidrio) que sostiene el objeto a observar, y permitiendo que los
haces de luz lo atraviesen par a constituir la imagen.
D)Lentes de la iluminación (condensador): lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación.
E)Sujeción del portaobjeto (platina): Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que
se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación
situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de
cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de adelante hacia
atrás o de izquierda a derecha y viceversa. Puede estar fija o unida al brazo por una cremallera para
permitir el enfoque.
F)Fuente de luz: Originalmente espejos, actualmente lámparas LED, guían la luz hacia el objeto
G) Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.
H) Tubo: es la cámara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede estar unida al brazo mediante
una cremallera para permitir el enfoque.
G
H I J
I) Revólver: Es el sistema que porta los objetivos de diferentes aumentos, y que rota para poder utilizar uno u otro, alineándolos con el
ocular.
J)Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina o el tubo hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico
permite desplazamientos amplios para un enfoque inicial y el micrométrico desplazamientos muy cortos, para el enfoque más preciso.
Pueden llevar incorporado un mando de bloqueo que fija la platina o el tubo a una determinada altura. Ve
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Microscopia Microscopios ópticos
Características de la microscopía óptica con microscopios compuestos:
Se utiliza para estudiar objetos delgados, (cuanto mayor aumento se desea obtener, mas
delgada debe ser la muestra para obtener una imagen correcta), ya que la profundidad de
campo del microscopio óptico es muy limitada.
Generalmente se usan para observar extendidos finos o cortes de tejidos realizados con
equipos de corte muy delgado (micrótomos). La imagen formada depende de la luz que
atraviese la muestra, y usualmente son necesarias técnicas especiales para aumentar
el contraste de la imagen: con bajos aumentos (objetivo de 40X) se suelen realizar
observaciones directas en fresco (*), pero con máximos aumentos (objetivos de 100 X) se
requieren técnicas de tinciones y usualmente preparados en seco o fijados (**)
Las observaciones en fresco adquieren mayor definición en microscopios de luz común pero
con dispositivos especiales que permiten aplicar las técnicas de campo oscuro o contraste
de fases
(*): observación en fresco: se observa un objeto en las mismas condiciones en que el objeto se presenta naturalmente, pudiendo
agregar agua para facilitar la dispersión de las partes del material
(**) Preparados en seco o fijados: antes de observar, el objeto es «fijado» con calor y/o fijadores químicos, con el objeto de evitar
ser barridos en los procesos de tinción a los que será sometido antes de ser observado el material
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Microscopia Microscopios ópticos
Características de la microscopía óptica con microscopios compuestos:
La imagen vista bajo un microscopio convencional, (microscopio óptico de campo claro =
MOCC) es formada por el objetivo del microscopio, y finalmente se observa en el ocular que es donde la imagen se amplía.
Preparado sin colorear
Preparado coloreado Ve
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Si la muestra no absorbe la luz, no habrá esencialmente contraste
entre los objetos que constituyen la muestra y el espacio vacío entre
dichos objetos, y no podremos observar la imagen (veremos un
campo microscópico iluminado sin objetos dentro). Por ejemplo, la
mayoría de las células vivas absorben poca luz (a excepción de las
células rojas de la sangre y los cloroplastos) y por lo tanto, son
difíciles de visualizar a través de un MOCC. Mucho menos luz
absorben diferentes estructuras de los microorganismos,
esencialmente mas pequeños que una célula eucariota. Para
solucionar esta limitación es que se utilizan los colorantes, técnicas
que «engrosan» las estructuras, o microscopio de campo oscuro ó
contraste de fases.
Microscopia Microscopios ópticos
Límite de resolución óptica de un microscopio óptico compuesto:
El límite de resolución óptica (la menor distancia entre 2 puntos que permite a un microscopio óptico
identificar a dichos puntos como entes independientes) depende de un fenómeno físico óptico llamado
difracción .
En la determinación de la difracción participan varios factores:
1º) la apertura numérica (AN) del sistema
2º) la longitud de onda de la luz empleada
3º) aberraciones ópticas dependientes de la calidad de los lentes
Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, que se utiliza luz de lámpara o luz
solar mediante espejo (luz verde de 550 nm), la AN del aire (0,95) o la generada por uso de aceite
(1,5) , basándose en la siguiente fórmula podemos deducir que el limite de resolución con el mejor
microscopio óptico es de aprox. 0,2 micras.
550 nm/2*0,95= 289 nm = 0,289 µ
550 nm/2*1,5= 183 nm = 0,183 µ
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Microscopia Microscopios ópticos: contraste de fases
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El microscopio de contraste de fases permite observar
preparados en fresco (células, y algunas de sus estructuras
especializadas) con mayor definición que un MOCC, sin
necesidad de fijar y teñir, por lo que resulta especialmente útil
para células vivas.
Se basa en el aprovechamiento de pequeñas diferencias entre
los índices de refracción de distintas partes de una muestra: la
luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción
experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto
al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra.
Utiliza una serie de anillos ópticos (uno a nivel del objetivo y
otro a nivel del condensador), que permiten anular la amplitud
de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un
contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la
imagen corresponden a las porciones densas de la muestra;
las partes claras de la imagen corresponden a porciones
menos densas.
El microscopio de contraste de fases, ilumina a la
muestra mediante un cono de luz hueco (luz en la
periferia y oscuridad en el centro), de manera similar a
lo que ocurre con el microscopio en campo oscuro.
Sin embargo, en el microscopio de contraste de fases
el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de
visión del objetivo, el cual contiene un dispositivo en
forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y
provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud
de onda.
Este tipo de iluminación provoca variaciones
minúsculas en el índice de refracción del objeto
observado en una muestra transparente, haciéndolo
visible ¿Por qué razón?
Microscopia Microscopios ópticos: contraste de fases
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Aunque las células absorben poca luz, tienen diversos
espesores y diversos índices de refracción en sus partes,
lo que conduce a las diferencias de fase de las ondas de
luz que pasan a través de ellas. La fase de un haz de luz
es inobservable a la vista (apenas se ve la intensidad, no
la fase).
Microscopia Microscopios ópticos: contraste de fases
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El diseñador del método de contraste de
fase, Zernike (por lo cual obtuvo un
premio Nobel de física) calculó la
manera de hacer que las diferencias de
fase se observaran en la imagen como
si se tratara de diferencias de
intensidad, logrando así visualizar
detalles que no eran posibles apreciar
en un microscopio convencional.
Cryptosporidium spp
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Microscopia Microscopios ópticos: contraste de fases
Células eucariotas en cultivos in vitro: la misma muestra, con MOCC (microscopia óptica de campo claro) y MOCF (microscopía óptica de contraste fe fase)
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Microscopia Microscopios ópticos: contraste de fases
Basidiosporas:
Estudios de factores de virulencia en infección
de plantas por Ustilago maydis
Hernandes: INCI v.28 n.5 Caracas mayo 2003
Semen:
Estudios de calidad espermática previo uso
para inseminación.
Microscopia Microscopio óptico de campo oscuro
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Microscopia Microscopios ópticos de fluorescencia
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Fitopatologia: Ustilago maydis como fitopatógeno,
tinción fluorescente de lectina con Alexa-fluor-488
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Andrología: estudio de integridad de ADN en
espermatozoides con naranja de acridina
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Observación con inmunofluorescencia directa
Observación con tinciones convencionales
Microscopia Microscopía confocal
Un microscopio confocal es un microscopio capaz de obtener imágenes tridimensionales de
una célula.
Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia: Para observar
preparaciones con este microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes o
marcarlas con sustancias (como los antoicuerpos) previamente conjugadas con fluorocromos.
Pero, las siguientes diferencias hacen de la microscopía confocal una técnica que permite
revelar estructuras y funcionamientos celulares con mayor detalle y de manera dinámica:
• Se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro después) capaces
de enfocar la iluminación en un único punto de la muestra.
• Se utiliza un láser como fuente luminosa, y con él se va barriendo la muestra por todo su
volumen, plano a plano, creando muchas imágenes bidimensionales simultáneas
• En vez de ser el ojo del operador el que captura las múltiples imágenes, éstas son
capturadas y analizadas por un ordenador, generando finalmente una imagen
tridimensional del objeto.
• Las imágenes son observadas mediante un monitor o fotográficamente.
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Colonización de un pelo de raíz de Poaceae (gramíneas) por Azospirillum spp
Microscopia Microscopía confocal
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Gfp-tagged bacteria (arrow heads) were visualized in the cortex (a) near the endodermis barrier (b), passing this barrier (c) and colonizing xylem vessels (d–
e). Other fluorescent microorganisms were visualized inside xylem vessels of inoculated cuttings (arrows in f) as well as of nontreated plants (arrows in g).
http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6941.2007.00410.x
Microscopia Microscopía confocal
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(a) Interaction between the wild-type strain Pseudomonas chlororaphis PCL1606 cells (in red) concentring around and colonizing R.
necatrix hyphae (in green). Disturbance of hyphal growth can be observed as changes in directionality, increase in the hyphal size and
in the number of vacuoles. (c) R. necatrix hyphal network in the rhizosphere of avocado roots not bacterized. The white asterisks in
picture a correspond to the colonies aggregates of the wild-type strain P. chlororaphisPCL1606 in close contact with the R.
necatrixCH53-GFP hyphae.
http://dx.doi.org/10.1111/1574-6941.12319
Microscopia
Microscopios electrónicos: barrido
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Microscopios electrónicos: barrido
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Microscopia Microscopios electrónicos: transmisión
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Microscopia
Microscopios comparación
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