mikroskopie ii. - biofizika.aok.pte.hu · zusammenfassung der vorlesung fluoreszenzmikroskopie...
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Zusammenfassung der Vorlesung
Fluoreszenzmikroskopie
Fluorophoren
Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops
Konfokalmikroskopie
Evaneszentfeldmikroskopie
Multiphotonenmikroskopie
Höchstauflösungsmikroskopie
STED
SIM
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Fluoreszenzmikroskopie
http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html
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Fluorophorenhttp://columbiabiosciences.homestead.com/dylightdyes.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_and_secondary_antibodies
http://www.rcsb.org/pdb/101/static101.do?p=education_discussion/educational_resources/GFP_activity.html
www.medizin.pte.huhttp://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/confocalintro.html
3D Bild eines Pollenkorns
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Klassische mikroskopische MethodenII. Total Internal Reflection Fluorescence(TIRFM)=Evaneszenzfeldmikroskopie
Pubs.rsc.org
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http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/tirf/tirfintro.html
http://cammer.net/historical/aif/instructions/tirf/index.htm
Die Intensität des evaneszenten elektrischen Kraftfeldes nimmt senkrecht zur Grenzfläche zwischen den beiden Brechmedien exponentiell ab:
z: der Abstand von der Grenzfläched: die Eindringtiefe bei Wellen, die unter einem größeren als dem kritischen Winkel einfallen
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Multiphotonenmikroskopie
https://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/fluoreszenz_mikroskop/5d_multiphoton.htm
Normale Fluoreszenz Multiphoton Fluoreszenz
1 kurzwelliges Anregungsphoton ≥ 2 langwellige Anregungsphotonen
1 langwelliges Emissionsphoton 1 kurzwelliges Emissionsphoton
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Jablonskidiagramm für 1 und 2-Photonen-Anregung von Molekülen vom Grundzustand S0 in höhere Singulett Niveaus (S1,S2).
hvA ist die Energie eines Photons bei Ein- bzw Zwei-Photonen-Anregung, hvF die Energie des induzierten Fluoreszenzphotons und hvP die Energie eines Phosphoreszenzphotons nach Intersystem-Crossing.
http://www.biophotonics.uni-hannover.de/a2biophotonik.html
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Stimulated Emission Depletion(STED)Nobelpreis für den Vater der Höchstauflösungsmikroskopie
Stefan Hell 2014
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Stimulierte Emission: Ein Lichtquant trifft auf ein Atom, das sich bereits im angeregten Zustand befindet.
Unter Aussendung von zwei Lichtquanten kann das Atom in den Grundzustand zurückzukehren.
Die beiden Photonen (Lichtquanten) sind exakte Kopien des eingefallenen Photons: Dadurch entsteht eine Vervielfältigung einer quantenphysikalisch genau bestimmten Sorte von Photonen.
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http://www.mpg.de/815357/forschungsSchwerpunkt?c=166398&force_lang=de
Übersättigen der Abregung bedeutet, dass eine höhere Intensität verwendet wird als die zu einer weitgehenden Abregung des Markers gebrauchtwird.
Die Population des angeregten Zustands und somit nimmt die Fluoreszenz exponentiell mit der Intensität des stimulierenden Lichtstrahls ab.
Wenn eine bestimmte Schwellenintensität überschritten ist, ist das Abregen quasi komplett.
https://www.youtube.com/watch?v=uyMZPFTcXG4
Übersättigung
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Structured Illumination Mikroskopie (SIM)
Eine strukturierte Beleuchtung wird benutzt (Interferenzeffekt,
Moire-Effekt).
Die fluoreszierende Probe wird mit einem Streifenmuster
angestrahlt.
Überlagerung des bekannten Gittermusters und der unbekannten Struktur.
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Aktin-Zellskelett (rot) und mit Clathrin überzogene Vesikel (CCV, grün) in einer HeLa-Zelle, abgebildet mit klassischer Weitfeldmikroskopie (a) und Mikroskopie mitstrukturierter Beleuchtung (b). Farbstoffe: Lifeact-tdTomato zur Visualisierung von F-Aktin, Clathrin-mEmerald zur Visualisierung der CCV. Maßstabsleiste: 5 Mikrometer.
http://www.laborwelt.de/spezialthemen/mikroskopie/3d-zeitserien-live.html