Mikroteknik

A. Mikroteknik

Mikroteknik adalah ilmu yang mempersiapkan organ, jaringan atau bagian

jaringan agar dapat diamati dan ditelaah. Organ dan jaringan dapat berasal dari hewan

maupun tumbuhan.

Jaringan hewan dapat diambil dari hewan tersebut selagi masih dalam keadaan

hidup, setelah mengalami pembiusan maupun yang baru saja mati dan sesegera mungkin

dimasukkan dalam larutan fiksatif. Jaringan tumbuhan dapat diambil dari tumbuhan yang

sedang tumbuh dengan terlebih dahulu disimpan dalam air dan disayat setipis mungkin,

berwarna untuk dapat dilihat serta bersifat langgeng, baru kemudian dilakukan fiksatif.

Bahan pembius yang umum digunakan adalah kloroform, eter, dan alkohol.

B. Metoda Mikroteknik

Metoda yang umum digunakan dalam mikroteknik adalah sediaan utuh,

sediaan irisan, sediaan uraian, sediaan ulasan, sediaan rentang, sediaan gosok dan sediaan

supravital.

1. Sediaan Utuh (Whole Mounts)

Melalui metode ini, dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan

organism secara utuh. Melalui metode ini diusahakan agar kita mendapat kesan

bentuk aslinya dengan mempertahankan format tiga dimensinya. Pada metode ini

dihasilkan sediaan dengan ketebalan 0,2 mm – 0,5 mm dengan tingkat perbesaran 100

kali.

2. Sediaan Irisan (Sectioning)

Metode ini dianggap sebagai teknik rutin bagi penyiapan spesimen. Suatu

metode pembuatan sediaan dengan jalan membuat suatu irisan dengan tebal tertentu

sehingga dapat diamati melalui mikroskop. Tebal-tipisnya sayatan bergantung pada

tujuan pengambilan spesimen. Umumnya bersikat antara 6-15 mikron (1 mikron –

0,001 mm). Ukuran sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang dan lebar yaitu 3 x

2 cm. Ada 2 macam metode irisan yaitu :

a. Metode irisan dengan menggunakan tangan

Pada beberapa macam jaringan, terutama dalam lapangan botani, pembuatan

sediaan dengan cara ini masih dapat dipakai misalnya melihat susunan daun segar.

Dengan mempelajari sediaan seperti ini dapat diperoleh beberapa keterangan

mengenai luas maupun tipe fibrosis didalam jaringan yang patologis.

b. Metode irisan dengan menggunakan mikrotom yang mempunyai keuntungan yaitu

tebal irisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak pengguna.

Mikroteknik

3. Sediaan Uraian

Yaitu suatu metode yang “diuraikan” dengan menggunakan jarum

pengurai. Yang diurai adalah komponen maupun struktur tertentu sehingga

memungkinkan pengamatan dengan lebih sempurna. Contoh untuk metode ini adalah

penguraian guna mendemontrasikan struktur serta hubungan ujung-ujung syaraf.

4. Sediaan Ulasan (Smearing)

Yaitu suatu pembuatan sediaan dengan jalan mengoles dari substansi yang

berupa cairan maupun bukan cairan diatas kaca object yang bersih dan bebas lemas,

kemudian difiksasi, diwarnai dan ditutu dengan cover glass. Bahan yang sering

digunakan dalam metode ini adalah darah. Beberapa pewarnaan yang biasa digunakan

adalah Giemsa, May Grunwald (larutan eosin-methylen blue dalam methyl alcohol),

Pappenheim dan Wright. Pada metode sediaan ulasan ini mempunyai beberapa teknik

yaitu :

a. Teknik jenis sediaan natif

Teknik ini menggunakan ulasan darah yang tipis pada gelas preparat

ataupun pada kaca penutupnya. Darah pada bagian tengah kaca penutup

secepatnya digeserkan sehingga darah menyebar rata pada permukaan kedua kaca

penutup dengan menarik ujung-ujungnya yang bebas.

b. Teknik sediaan ulas

Teknik ini memerlukan dua kaca preparat. Misalnya darah diteteskan

pada salah satu kaca preparat pada bagian ujungnya. Ujung kaca preparat lainnya

menyentuh tetesan darah untuk kemudian ditarik dengan posisi 45 sehingga darah

akan rata pada permukaan kaca preparat

c. Teknik mendapatkan hasil tebal

Teknik ini digunakan untuk mengamati parasit yang terdapat dalam

darah, misalnya parasit malaria. Kesukaran dalam penyiapan darah tebal adalah

sulit menghindarkan agar darah tidak mengalir keluar kaca preparat.

5. Sediaan Rentang

Yaitu suatu metode pembuatan sediaan dengan cara merentangkan suatu

jaringan pada permukaan object glass sehingga dapat diamati dengan mikroskop.

Bahan yang dibuat adalah jaringan yang tipis misalnya pleura, mesenterium,

peritoneum, perikardium, dan lain-lain. Bahan pewarnaan yang biasa digunakan

adalah pewarnaan Mallory Acid Fuchsin, Hematoksilin dan Azure II-Eosin.

6. Sediaan Gosok

Mikroteknik

Yaitu metode pembuatan sediaan untuk jenis jaringan yang keras sifatnya

seperti tulang, gigi, dan kuku. Jaringan dipotong-potong kemudian digosok pada batu

gosok hingga cukup tipis untuk dapat diamati.

7. Sediaan Supravital

Yaitu metode untuk mendapatkan sediaan dari sel-jaringan yang hidup.

Pewarna yang biasa digunakan adalah Janus Green, Neutral Red, Methylen Blue

dengan konsentrasi tertentu.

8. Pencet (Squash)

Yaitu metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet

suatu potongan jaringan atau suatu organism secara keseluruhan sehingga didapatkan

suatu sediaan yang tipis dan dapat diamati dengan mikroskop. Metode ini digunakan

untuk jaringan yang sel-selnya mudah lepas misalnya lien, dan sumsum tulang.

Pewarna yang biasa digunakan adalah larutan carmine.

C. Metoda Parafin

Metoda paraffin termasuk metoda irisan yang merupakan metoda rutin. Dalam

membuat siapan melalui metoda paraffin untuk jaringan, diperlukan beberapa tahapan

yaitu :

1. Pembiusan (narcose)

Pembiusan dilakukan tergantung dari jenis hewan yang akan dijadikan

preparat. Pembius yang biasa digunakan adalah eter, kloroform, prokain, aseton,

morfin dan metan.

2. Pengambilan jaringan (diseksi)

Pengambilan jaringan umumnya menggunakan pinset dengan dibantu

dengan gunting bedah.

3. Fiksasi

Fiksasi bertujuan untuk memberikan perlakuan tertentu terhadap jaringan

sehingga dapat diawetkan dalam kondisi yang mendekati keadaan aslinya, mencegah

autolisis dan menaikkan daya pewarnaan. Fiksatif dapat dikelompokkan menjadi

cairan fiksatif tunggal yaitu formalin, alkohol, asam asetat dan asam pikrat, dan

fiksatif majemuk yaitu larutan bouin dan formol saline. Larutan yang biasa digunakan

pada fiksasi adalah larutan fisiologis NaCl dan larutan ringer.

4. Pencucian (washing)

Tujuannya adalah menghilangkan cairan maupun bahan yang masih

tertinggal pada jaringan. Pencucian dilakukan pada air yang mengalir. Pencucian

Mikroteknik

dilakukan sebelum proses fiksasi, sesudah proses fiksasi dan setelah proses

pewarnaan.

5. Dehidrasi

Yaitu proses mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan

bahan kimia tertentu. Proses dehidrasi umumnya dilakukan dua kali yaitu setelah

proses fiksasi dan pencucian serta setelah proses pewarnaan. Syarat larutan yang

digunakan dalam dehidrasi adalah :

a) Harus dapat menggantikan kedudukan air dalam jaringan

b) Dapat digantikan oleh medium penjerbih

c) Tidak merusak jaringan

Larutan yang biasa digunakan adalah alkohol. Larutan yang lain adalah

dioksan, N-butyl alkohol dan aniline oil.

6. Penjernihan (clearing)

Tujuannya adalah menggantikan tempat alkohol dalam jaringan. Larutan

yang umum digunakan adalah xylol karena murah, bekerja cepat, membuat jaringan

cepat menjadi transparan dan cepat menyingkirkan dan menggantikan kedudukan

alkohol dari proses dehidrasi. Kekurangannya jika terlalu lama di xylol maka

menyebabkan jaringan menjadi kering, rapuh dan getas.

7. Infiltrasi

Yaitu usaha menyusupkan media penanaman ke dalam jaringan dengan

jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Media yang umum

digunakan adalah paraffin. Proses infiltrasi dilaksanakan dalam oven.

8. Penanaman (embedding)

Yaitu proses memasukkan atau menanam jaringan ke dalam blok-blok

paraffin sehingga memudahkan pada proses penyayatan. Blok-blok menggunakan

cetakan yang terbuat dari timah, kertas atau aluminium.

9. Penyayatan (section)

Penyayatan dilakukan agar menghasilkan sayatan tipis. Penyayatan

umumnya menggunakan mikrotom.

10. Afiksing

Yaitu proses pelekatan sayatan jaringan pada kaca preparat dengan

bantuan media perekat tertentu, yaitu albumin diatas hot plate.

11. Deparafinasi

12. Pewarnaan (staining)

Mikroteknik

Tujuannya agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen

jaringan sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. Zat warna dapat

dibedakan berdasarkan :

a) Berdasarkan sifatnya, zat warna dibedakan menjadi zat warna asam berupa garam-

garam dari sodium dan zat warna basa berupa sulfat basa organik.

b) Berdasarkan asalnya, zat warna dibedakan menjadi zat warna alami yang

diperoleh dari alam seperti Hematoxilin dan zat warna sintesis yang dibuat di

pabrik seperti basic fuchsin.

c) Berdasarkan kemampuan mewarnai jaringan, yaitu zat warna substantif yang

mampu mewarnai jaringan secara langsung misalnya Neutral red dan zat warna

ajektif yang mampu mewarnai jaringan dengan bantuan mordan misalnya

Hematoksilin.

d) Berdasarkan komposisi warna, yaitu pewarna tunggal missal Gentian violet,

pewarna ganda misalnya hematoksilin-eosin, pewarna rangkap tiga misalnya

formula Marllory triple stain dan pewarna rangkap empat.

Umumnya yang digunakan adalah pewarnaan dengan pewarna ganda. Pada

pewarnaan ganda, umumnya pewarna yang digunakan adalah yang bersifat asam dan basa

sehingga menyebabkan bagian-bagian jaringan yang bersifat asidotilik danbasotilik dapat

ditonjolkan. Tujuan penggunaan pewarna ganda bertujuan agar terjadi kekontarsan

pewarnaan sehingga pengenalan bagian tertentu dapat lebih cepat dan jelas terlihat.

Kombinasi yang umum digunakan adalah zat warna berwarna biru dengan merah,

contohnya Hematoksilin-Eosin. Hematoksilin selalu digunakan lebih dahulu dan setelah

proses diferensiasi, maka selanjutnya eosin digunakan. Hematoksilin-Eosin umumnya

digunakan untuk pewarnaan jaringan hewan, namun untuk jaringan tumbuhan tidak lazim

diwarnai dengan paduan warna tersebut. Hal ini dikarenakan eosin tampak kurang efektif

bagi jaringan tumbuhan. Untuk jaringan tumbuhan, biasanya digunakan pewarna

Erythrosin B.

D. Mikrotom

Yaitu instrument ilmiah yang memotong iris

tipis sesuatu untuk pemeriksaan mikroskopis atau suatu

alat berpresisi tinggi sehingga harus diperlakukan secara

hati-hati. Alat ini digunakan untuk menyayat jaringan

Mikroteknik

sebelum ditempelkan ke atas permukann object glass. Secara umum, suatu mikrotom

memiliki bagian-bagian terpenting yaitu :

1. Skala pengatur ketebalan sayatan, biasanya terdapat di bagian kanan atas badan

mikrotom. Skala ini dapat digeser ke kiri dan ke kanan sesuai dengan ketebalan

sayatan yang diinginkan.

2. Pisau mikrotom, merupakan komponen yang bisa menentukan kualitas sayatan.

3. Pegangan blok jaringan, merupakan komponen yang menghubungkan mikrotom

dengan blok jaringan yang hendak disayat.

4. Pengatur jarak berfungsi untuk mengatur blok jaringan dengan mata pisau.

Dari beberapa jenis mikrotom yang ada, jenis-jenis mikrotom yang umum

dikenal dan digunakan dalam mikroteknik adalah :

1. Mikrotom putar

Umumnya dipakai pada metode paraffin. Posisi kedudukan pisau tetap

sementara jaringan yang dilekatkan pada holder bergerak turun naik sehingga

diperoleh sayatan yang umumnya berbentuk pita.

2. Mikrotom sorong

Sering digunakan pada metode paraffin dan umumnya digunakan dalam

celloidin. Kedudukan jaringan diam sementara pisau bergerak maju mundur.

3. Mikrotom beku

Digunakan untuk penyayatan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun

celloidin namun dibekukan dengan karbon dioksida ataupun Freon.

4. Mikrotom Schantz

Yaitu mikrotom dimana pada saat menyayat, blok jaringan yang hendak

disayat tetap diam di tempatnya sementara pisau melewati blok paraffin tersebut.

5. Mikrotom Spencer

Yaitu mikrotom dimana pada saat menyayat dapat menghasilkan pita

sayatan yang panjang sehingga cocok untuk pembuatan preparat sayatan serial.

Pisau mikrotom harus selalu dibersihkan setelah selesai dipakai, karena jika

tidak maka akan menimbulkan korosi. Pisau yang biasa digunakan pada mikrotom adalah:

1. Pisau plane-edge (simple wedge razor), biasanya digunakan untuk sayatan beku dan

blok paraffin.

2. Pisau konkaf, biasa digunakan untuk sayatan blok celloidin dan plastic.

3. Pisau bikonkaf sering digunakan untuk menyayat blok paraffin.

Mikroteknik

Cara kerja mikrotom adalah proses pemotongan blok preparat dengan

menggunakan mikrotom. Sebelum melakukan pemotongan, yang harus dilakukan adalah

1. Persiapan pisau mikrotom

Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong

dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau mikrotom

kemudian diletakkan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu. Rekatkan

blok paraffin pada holder dengan menggunakan spatula. Letakkan tempat duduk blok

paraffin beserta blok preparat pada tempatnya di mikrotom.

2. Persiapan Kaca Objek Kaca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated

(disalut) dengan zat perekat seperti albumin (putih telur), gelatin atau tespa

3. Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C

4. Persiapan sengkelit atau kuas.

Teknik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut

1. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di

mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan

pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.

2. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya sudut

kemiringan berkisar 20-30 derajat.

3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 5-7

mikrometer.

4. Gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok preparat

secara teratur dan ritmis. Buang pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan hingga kita

mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan..

5. Pita parafin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati

menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur 37-

40C dan biarkan beberapa saat hingga poita parafin tersebut mengembang.

6. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita parafin tersebut pada

kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam

waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Dengan menggunakan sengkelit

atau kuas pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat kaca objek

digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat.

7. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur 40-

45C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan kaca

objek di atas api sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek.

Mikroteknik

8. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek

berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.

Mikrotom sebaiknya ditutup dengan plastik, atau dimasukkan ke kotaknya jika

tidak sedang digunakan. Jangan memindahkan mikrotom dengan cara memegang bagian

yang dapat bergerak, karena dapat menggangu akurasinya. Sebelum dan sesudah

digunakan, sebaiknya mikrotom dibersihkan dari serpihan parafin dengan cara melap

dengan kain lap yang telah dibasahi dengan xilol. Mikrotom harus selalu diminyaki untuk

mencegah keausan dan kemacetan.