modul ajar praktek bioproses
TRANSCRIPT
MODUL AJAR
PRAKTIKUM BIOPROSES
Modul ajar ini dibiayai dari dana DIPANomor : 0622/023-04.2.01/15/2012 tanggal 9 Desember 2011
Politeknik Negeri Malang
Oleh :………………
NIP. ……………………………….
POLITEKNIK NEGERI MALANG
2013
i
LEMBAR PENGESAHAN
1. Judul Modul Ajar : PRAKTEK BIOPROSESDigunakan Pada Mata KuliahSemester
::
BIOPROSES1
2. Penulis Utama1. Nama Lengkap2. NIP3. Pangkat/golongan4. Jabatan5. Program Studi6. Jurusan
:::::::
IR. DIAH MEILANY, MT.19670505 199303 200 1Penata Tk 1/3dStaf PengajarTEKNIK KIMIATEKNIK KIMIA
3. Jumlah AnggotaTim Penulisa. Nama Anggota 1b. Nama Anggota 2
:::
3 orang……………………………….....……………………………….....
4. Bidang Ilmu : ……………………………….....5. Sumber Dana : Modul ajar ini dibiayai dengan dana DIPA Nomor :
0622/023-04.2.01/15/2012 tanggal 9 Desember 2012 Politeknik Negeri Malang
Malang, ................................Menyetujui,
Ketua Jurusan Teknik Kimia, Penulis Utama,
Ir. Hardjono, MT Ir. Diah Meilany, MTNIP. 19600205 198803 100 1 NIP. 19670505 199303 200 1
Mengetahui,Direktur
Politeknik Negeri Malang
Ir. Tundung Subali Patma, MT NIP. 19590424.1988031.002
ii
SURAT PERNYATAAN
Yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama Lengkap : Ir Diah Meilany, MT inuri, ST.NIP : 19670505 199303 200 1Bidang Ilmu : Bioproses Pangkat/Golongan : Penata Tk 1/3d I / IIIbJabatan Fungsional : LektorJurusan/Program Studi : Teknik Kimia/Teknik Kimia.Perguruan Tinggi : Politeknik Negeri Malang
Dengan ini menyatakan bahwa:
1. Naskah modul ajar bidang ilmu “Bioproses ” dengan judul:
”PRAKTEK BIOPROSES”
Belum pernah diterbitkan dan bebas dari plagiarisme.2. Bersedia menuntaskan naskah modul ajar sesuai waktu yang ditentukan. Demikian surat pernyataan ini dibuat dengan sebenarnya.
Malang, ……………….. 2012
Disahkan oleh,Ketua Jurusan Teknik Kimia, Yang membuat,
Ir. Hardjono, MT Ir. Diah Meilany, MT NIP 19600205 198803 100 1 NIP 19670505 199303 200 1
Mengetahui:Direktur
Ir. Tundung Subali Patma, M.T.NIP 19590424 198803 1 002
iii
KATA PENGANTAR
iv
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR i
DAFTAR ISI ii
DAFTAR TABEL vii
DAFTAR GAMBAR viii
TATA TERTIB LABORATORIUM BIOPROSES 1
BAB 1 STERILISASI.........................................................................................2
1.1 KOMPETENSI............................................................................2
1.2 METODOLOGI...........................................................................2
1.2.1 ALAT DAN BAHAN......................................................2
1.2.2 CARA KERJA.................................................................2
1.3 HASIL PENGAMATAN.............................................................5
BAB 2 MIKROSKOP.........................................................................................6
2.1 KOMPETENSI............................................................................6
2.2 METODOLOGI...........................................................................6
2.2.1 ALAT DAN BAHAN......................................................6
2.2.2 CARA KERJA.................................................................6
2.3 HASIL PENGAMATAN.............................................................9
2.3.1 PREPARAT JAMUR PERBESARAN 40 X...................9
2.3.2 PREPARAT JAMUR PERBESARAN 100 X...............10
2.3.3 PREPARAT JAMUR PERBESARAN 1000 X.............10
2.3.4 PREPARAT RAGI/YEAST PERBESARAN 40X........11
2.3.5 PREPARAT RAGI/YEAST PERBESARAN 100 X....11
2.3.6 PREPARAT RAGI/YEAST PERBESARAN 1000 X..12
2.3.7 PREPARAT BAKTERI PERBESARAN 40X..............12
2.3.8 PREPARAT BAKTERI PERBESARAN 100X............13
2.3.9 PREPARAT BAKTERI PERBESARAN 1000X..........13
2.3.10 PREPARAT ALGA PERBESARAN …………………
14
2.3.11 PREPARAT ALGA PERBESARAN ………………. 14
v
2.3.12 PREPARAT ALGA PERBESARAN
………………….......................................................................15
BAB 3 ISOLASI MIKROORGANISME METODE CAWAN TUANG........16
3.1 KOMPETENSI..........................................................................16
3.2 METODOLOGI.........................................................................16
3.2.1 ALAT DAN BAHAN....................................................16
3.2.2 CARA KERJA...............................................................16
3.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................19
3.3.1 KOLONI ……………...................................................19
3.3.2 KOLONI ………….......................................................19
3.3.3 KOLONI ………….......................................................20
3.3.4 KOLONI ………….......................................................20
3.3.5 KOLONI ………….......................................................21
3.3.6 KOLONI ………….......................................................21
3.3.7 KOLONI ………...........................................................22
3.3.8 KOLONI ………...........................................................22
3.3.9 KOLONI ………...........................................................23
BAB 4 ISOLASI MIKROORGANISME METODE CAWAN GORES.........24
4.1 KOMPETENSI..........................................................................24
4.2 METODOLOGI.........................................................................24
4.2.1 ALAT DAN BAHAN....................................................24
4.2.2 CARA KERJA...............................................................24
4.3 HASIL DAN PENGAMATAN.................................................28
4.3.1 KOLONI …...................................................................28
4.3.2 KOLONI ……...............................................................28
4.3.3 KOLONI ………...........................................................29
4.3.4 KOLONI ……...............................................................29
BAB 5 PENYIMPANAN KULTUR MURNI DI AGAR MIRING.................30
5.1 KOMPETENSI..........................................................................30
5.2 METODOLOGI.........................................................................30
5.2.1 ALAT DAN BAHAN....................................................30
5.2.2 CARA KERJA...............................................................30
vi
5.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................32
5.3.1 Koloni …………............................................................32
5.3.2 Koloni ………................................................................33
5.3.3 Koloni ……………........................................................33
BAB 6 PERHITUNGAN MIKROORGANISME............................................34
6.1 KOMPETENSI..........................................................................34
6.2 METODOLOGI.........................................................................34
6.2.1 ALAT DAN BAHAN....................................................34
6.2.2 CARA KERJA...............................................................34
6.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................39
BAB 7 PEWARNAAN NEGATIF...................................................................43
7.1 KOMPETENSI..........................................................................43
7.2 METODOLOGI.........................................................................43
7.2.1 ALAT DAN BAHAN....................................................43
7.2.2 CARA KERJA...............................................................43
7.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................44
7.3.1 PERBESARAN 100 X...................................................45
7.3.2 PERBESARAN 1000 X.................................................45
BAB 8 PEWARNAAN SEDERHANA............................................................46
8.1 KOMPETENSI..........................................................................46
8.2 METODOLOGI.........................................................................46
8.2.1 ALAT DAN BAHAN....................................................46
8.2.2 CARA KERJA...............................................................46
8.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................49
8.3.1 PERBESARAN 100 X...................................................49
8.3.2 PERBESARAN 1000 X.................................................49
BAB 9 PEWARNAAN GRAM........................................................................50
9.1 KOMPETENSI..........................................................................50
9.2 METODOLOGI.........................................................................50
9.2.1 ALAT DAN BAHAN....................................................50
9.2.2 CARA KERJA...............................................................51
9.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................53
vii
9.3.1 PERBESARAN 100 X...................................................53
9.3.2 PERBESARAN 1000 X.................................................53
BAB 10 PEWARNAAN SPORA.......................................................................54
10.1 KOMPETENSI..........................................................................54
10.2 METODOLOGI.........................................................................54
10.2.1 ALAT DAN BAHAN..................................................54
10.2.2 CARA KERJA.............................................................54
10.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................56
10.3.1 PERBESARAN 100 X.................................................56
10.3.2 PERBESARAN 1000 X...............................................57
BAB 11 PEWARNAAN ACID FAST................................................................58
11.1 KOMPETENSI..........................................................................58
11.2 METODOLOGI.........................................................................58
11.2.1 ALAT DAN BAHAN..................................................58
11.2.2 CARA KERJA.............................................................58
11.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................60
11.3.1 PERBESARAN 100 X.................................................60
11.3.2 PERBESARAN 1000 X...............................................61
BAB 12 PEMBUATAN KURVA PERTUMBUHAN.......................................62
12.1 KOMPETENSI..........................................................................62
12.2 METODOLOGI.........................................................................62
12.2.1 ALAT DAN BAHAN..................................................62
12.2.2 CARA KERJA.............................................................62
12.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................64
BAB 13 PEMBUATAN EKSTRAK KASAR RENNIN DARI MUCOR
PUSILLUS.............................................................................................................65
13.1 KOMPETENSI..........................................................................65
13.2 METODOLOGI.........................................................................65
13.2.1 ALAT DAN BAHAN..................................................65
13.2.2 CARA KERJA.............................................................66
13.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................67
BAB 14 PEMBUATAN KEJU CHEDDAR.......................................................68
viii
14.1 KOMPETENSI..........................................................................68
14.2 METODOLOGI.........................................................................68
14.2.1 ALAT DAN BAHAN..................................................68
14.2.2 CARA KERJA.............................................................68
14.3 HASIL PENGAMATAN...........................................................70
ix
DAFTAR TABEL
Tabel 6-1 Contoh penghitungan jumlah koloni (SPC) dengan pengulangan.........35
Tabel 6-2 Contoh penghitungan jumlah koloni (SPC) dengan lebih dari satu
cawan memenuhi syarat.........................................................................................36
x
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1-1 Tampak atas autoclave........................................................................4
Gambar 2-1 Langkah pembuatan preparat secara aseptic.......................................7
Gambar 3-1 urutan proses isolasi metode cawan tuang........................................17
Gambar 3-2 bentuk, tepian dan elevasi koloni hasil isolasi..................................18
Gambar 4-1 Sektor penggoresan cawan petri.......................................................25
Gambar 4-2 Pola goresan dan hasilnya.................................................................27
Gambar 4-3 Bentuk, tepian dan elevasi koloni.....................................................27
Gambar 6-1 Haemocytometer...............................................................................37
Gambar 6-2 Pembagian kotak hemasitometer......................................................38
Gambar 6-3 Ruang hitung hemasitometer dan cara menghitung..........................38
Gambar 7-1 Langkah – langkah pewarnaan negatif.............................................44
Gambar 8-1 Langkah kerja pembuatan preparat pewarnaan sederhana................48
Gambar 9-1 Langkah kerja pewarnaan gram........................................................52
Gambar 10-1 Langkah kerja pewarnaan spora.....................................................56
Gambar 11-1 Langkah kerja pewarnaan acid fast.................................................60
xi
TATA TERTIB LABORATORIUM BIOPROSES
1. Jangan membawa barang-barang berharga yang tidak akan digunakan dalam
praktikum ke dalam laboratorium (handphone atau gadget lainnya)
2. Pakaian kerja harus bersih untuk menghindari kemungkinan infeksi, atau
kontaminasi
3. Tidak boleh makan, minum dan merokok di dalam laboratorium, kecuali hal
tersebut ada hubungannya dengan acara praktikum seperti uji organoleptik
4. Dilarang memasukkan alat atau benda seperti pensil, bolpen ke dalam mulut
5. Alat-alat yang dipakai (mikroskop, meja praktikum) harus dalam keadaan
bersih
6. Ose yang telah dipakai harus dalam keadaan bersih, bila ada bahan yang
melekat di ose maka bakar hingga menjadi abu dan dapat dilepas
7. Apabila suatu biakan jatuh atau tumpah, harus didisinfeksi dengan sebaik-
baiknya. Tuangkan etanol 70% lalu seka dengan tisu dan selanjutnya tisu
dibakar
8. Semua bahan yang sudah tidak dipergunakan lagi seperti ose, pipet mikro,
korek api, kapas, kertas, benang harus diletakkan kembali ke tempatnya
semula
9. Semua biakan mikroba yang sudah tidak dipergunakan lagi harus dibuang di
tempat khusus yang disediakan dan disterilkan dalam otoklaf
10. Apabila terjadi kecelakaan (tertusuk, terluka, mata kemasukan sesuatu) harus
dilaporkan kepada dosen pembimbing supaya dapat mengambil tindakan yang
sesuai.
11. Setelah pekerjaan selesai, bersihkan semua peralatan dan meja kerja dengan
mendisinfeksi menggunakan etanol 70%
12. Sebelum meninggalkan laboratorium ,matikan keran air, cabut kabel listrik
peralatan dan cuci tangan dengan sabun desinfektan
xii
BAB 1 STERILISASI
1.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum STERILISASI, mahasiswa dapat
a. Menerapkan prinsip sterilisasi alat dan media di bidang ilmu Bioproses.
b. Menggunakan autoclave, oven dengan baik dan benar sesuai SOP
autoclave
1.2 METODOLOGI
1.3 ALAT DAN BAHAN
Cawan petri
Tabung reaksi beserta rak
Pipet ukur 10 ml
Labu takar 1000 ml
Batang pengaduk
Cawan arloji
Kertas pembungkus
Kain kassa
Kapas berlemak
Tali kasur
Hot plate
Gunting
Oven
Autoclave
Neraca analitis
Nutrient Agar bubuk (NA)
Potato Dextrose Agar bubuk
(PDA)
Aquadest
BAB 2 CARA KERJA
A. Sterilisasi alat
a. Cuci alat yang digunakan dengan air dan sabun hingga tidak terasa
berminyak, bilas dengan air mengalir kemudian dengan aquadest atau
alcohol. Tiriskan hingga kering.
b. Untuk tabung reaksi dan peralatan berleher disumbat dengan kapas
berbungkus kain kassa steril. Sumbatan harus padat dibagian luar agar
dapat menahan debu dan kotoran.
c. Bungkus semua peralatan dengan kertas kecuali erlenmeyer yang memiliki
sumbatan kapas.
xiii
d. Masukkan dalam autoclave pada suhu 121°C, selama 30 menit.
e. Setelah selesai disterilisasi, simpan alat dalam oven bersuhu 80ºC selama
24 jam. Selanjutnya alat disimpan dalam kotak peralatan steril yang sudah
disediakan.
B. Sterilisasi media NA/PDA
a. Larutkan nutrient agar (NA) atau Potato Dextrose Agar (PDA) bubuk
dengan aquadest sesuai keperluan
b. Panaskan larutan dengan hot plate sampai larut semua. Kehilangan
aquadest selama pemanasan diganti dengan penambahan aquadest.
c. Saring dengan kapas atau kain steril.
d. Sterilisasi dalam autoclave pada 121ºC selama 30 menit.
C. SOP Autoclave
Persiapan
a. Buka pengunci autoclave
b. Periksa kedalaman air. Tinggi air harus tepat di bawah plat berlubang
c. Jika kurang tambahkan aquadest dari bagian atas autoclave
d. Pasang keranjang sesuai kebutuhan
e. Tata alat/media yang akan disterilkan dalam keranjang sedemikan hingga
masih ada ruang untuk lewatnya kukus
Pelaksanaan
a. Tutup autoclave dan kunci dengan rapat, pastikan tidak ada yang bocor
b. Tutup kran kukus (20) dan kran udara (19)
c. Pilih tanda gunting untuk sterilisasi alat dan tanda erlenmeyer untuk
sterilisasi media menggunakan tombol (18). Pastikan penunjuk waktu
menunjukkan angka ”0” dan penunjuk suhu menunjukkan angka di bawah
102C dan tidak ada indikasi error.
d. Tekan tombol pilihan program (13) dan pilih sesuai kebutuhan. Untuk
modifikasi program :
e. Suhu, tekan tombol 9 dan 14/15 berbarengan
f. Waktu, tekan tombol 11 dan 14/15 berbarengan
g. Tekan tombol start (16)
xiv
h. Tunggu hingga proses pemanasan selesai, misal untuk program 2 (suhu
121C dan waktu 30 menit) dibutuhkan waktu sekitar 30 menit dan
mencapai tekanan ± 1 bar. Selama proses itu lampu heater (7) dan lampu
exhaust (6) menyala.
i. Bila tekanan sudah mencapai 1 bar, lampu heater dan lampu exhaust
padam sedangkan lampu steril (5) akan menyala berkedip-kedip selama 7
menit diiringi dengan penurunan suhu, waktu dan tekanan selama ± 30
menit
j. Setelah itu lampu steril (5) akan padam dan alarm (1) akan berbunyi
selama 10 detik , menandakan proses sterilisasi sudah selesai.
k. Tekan tombol stop (17) biarkan autoclave tertutup sampai tekanan dalam
autoclave turun dan menunjukkan 0,2 bar
l. Buka keran udara (19) dan keran steam (20)
m. Buka pengunci autoclave
n. Angkat dan keluarkan keranjang
Penyelesaian
a. Putar tombol (18) ke posisi off jika suhu sudah menunjukkan 40C
b. Bersihkan sisa-sisa air di sekitar autoclave
c. Tutup autoclave tanpa dikunci
Gambar 1-1 Tampak atas autoclave
2.1 HASIL PENGAMATAN
xv
Laporkan hasil pengamatan anda dalam tabel di bawah ini. Sesuaikan
dengan langkah kerja di atas.
NO KONDISI AUTOCLAVE DATA PENGAMATAN KETERANGAN
1. PERSIAPAN
2. PELAKSANAAN
3. PENYELESAIAN
xvi
BAB 3 MIKROSKOP
3.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “MIKROSKOP”, maka mahasiswa dapat :
a. Membuat preparat mikroorganisme untuk dapat diamati dengan baik
dan benar
b. Menggunakan mikroskop binokuler dengan baik dan benar sesuai SOP
c. Mengamati bermacam-macam mikroorganisme seperti jamur, bakteri,
dan alga
d. Membedakan morfologi bermacam-macam mikroorganisme
3.2 METODOLOGI
3.3 ALAT DAN BAHAN
Mikroskop binokuler
Gelas benda (gelas
preparat)
Gelas penutup (cover
glass)
Tempe, roti atau makanan
yang sudah berjamur
Ragi roti yang sudah
diinkubasi 4 jam
sebelumnya
Biakan bakteri
Pipet tetes
Tisu bebas serat
Air selokan, air yang
tergenang, air aquarium
Pinset atau jarum suntik
Lup inokulasi (ose)
Pembakar spiritus
Korek api
Ethanol 70 %
Air steril
BAB 4 CARA KERJA
1. PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI
Cuci gelas benda dengan air sabun dan bilas bersih hingga tak ada sisa
sabun. Seka dengan tissue beralkohol dan kering anginkan.
Untuk gelas penutup seka dengan tissue beralkohol, lalu kering
anginkan.
xvii
Nyalakan pembakar spiritus, letakkan pada jarak ± 30 cm dari tubuh
anda
Tambahkan air steril ke permukaan gelas preparat menggunakan lup
inokulasi hingga membentuk kumpulan air berukuran ± 0,5 cm.
Pegang lup inokulasi di tangan kanan dan tabung berisi biakan di tangan
kiri anda. Lihat gambar 1, untuk lebih jelasnya, perhatikan posisi jari
tangan.
Pijarkan lup inokulasi hingga memerah supaya steril di seluruh bagian
lupnya. Lewatkan juga batang pemegangnya pada nyala api beberapa
kali.
Buka kapas tabung agar miring dengan jari kelingking tangan kanan
dan jepitkan ke telapak tangan anda. Lihat gambar 1 no 5, jangan
letakkan kapas di meja.
Gambar 2-2 Langkah pembuatan preparat secara
xviii
aseptic
Panaskan mulut tabung dengan api pembakar spiritus beberapa kali.
Jaga jarak lup di tangan kanan anda agar tidak lebih jauh dari 30 cm
terhadap api.
Masukkan lup inokulasi steril dan sentuhkan ujungnya ke cairan biakan
untuk mengambil biakan. Bila biakan murni berupa tabung agar miring,
sentuhkan ujung lup inokulasi ke permukaan agar miring beberapa kali.
Jangan ditekan terlalu keras supaya agar miring tidak terluka.
Keluarkan dengan hati-hati sedemikian hingga tidak menyentuh dinding
tabung
Panaskan lagi mulut tabung reaksi beberapa kali di api pembakar
spiritus lalu tutup tabung dengan kapas penutupnya.
Goreskan isi lup inokulasi ke permukaan gelas preparat yang sudah
terisi air steril lalu tutup dengan gelas penutup
Preparat siap untuk diamati dengan mikroskop
2. PEMBUATAN PREPARAT JAMUR
Cuci gelas benda dengan air sabun dan bilas bersih hingga tak ada sisa
sabun. Seka dengan tissue beralkohol dan kering anginkan.
Untuk gelas penutup seka dengan tissue beralkohol, lalu kering
anginkan.
Letakkan sejumlah air steril di permukaan gelas preparat dengan
menggunakan lup inokulasi secara aseptik
Sterilkan jarum suntik dengan api pembakar spiritus. Ambil miselia
jamur dari tempe/menjes/roti berjamur/nasi berjamur.
Letakkan miselia jamur di gelas preparat lalu tutup dengan gelas
penutup secara aseptik
Preparat siap untuk diamati dengan mikroskop
xix
3. PEMBUATAN PREPARAT ALGA
Cuci gelas benda dengan air sabun dan bilas bersih hingga tak ada sisa
sabun. Seka dengan tissue beralkohol dan kering anginkan.
Untuk gelas penutup seka dengan tissue beralkohol, lalu kering
anginkan
Letakan sejumlah air kolam/air selokan di permukaan gelas benda
dengan lup inokulasi secara aseptik
Tutup dengan gelas penutup
Preparat siap untuk diamati dengan mikroskop
4.1 HASIL PENGAMATAN
4.2 PREPARAT JAMUR PERBESARAN 40 X
JAMUR ………………………………… KETERANGAN
xx
BAB 5 PREPARAT JAMUR PERBESARAN 100 X
JAMUR ………………………………… KETERANGAN
BAB 6 PREPARAT JAMUR PERBESARAN 1000 X
JAMUR ………………………………… KETERANGAN
xxi
BAB 7 PREPARAT RAGI/YEAST PERBESARAN 40X
RAGI ………………………………… KETERANGAN
BAB 8 PREPARAT RAGI/YEAST PERBESARAN 100 X
RAGI ………………………………… KETERANGAN
xxii
BAB 9 PREPARAT RAGI/YEAST PERBESARAN 1000 X
RAGI ………………………………… KETERANGAN
BAB 10 PREPARAT BAKTERI PERBESARAN 40X
BAKTERI ………………………………… KETERANGAN
xxiii
BAB 11 PREPARAT BAKTERI PERBESARAN 100X
BAKTERI ………………………………… KETERANGAN
BAB 12 PREPARAT BAKTERI PERBESARAN 1000X
BAKTERI ………………………………… KETERANGAN
xxiv
BAB 13 PREPARAT ALGA PERBESARAN …………………
ALGA ………………………………… KETERANGAN
BAB 14 PREPARAT ALGA PERBESARAN ………………
ALGA ………………………………… KETERANGAN
xxv
BAB 15 PREPARAT ALGA PERBESARAN …………………..
ALGA ………………………………… KETERANGAN
xxvi
BAB 16 ISOLASI MIKROORGANISME METODE CAWAN TUANG
16.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “ISOLASI MIKROORGANISME METODE
CAWAN TUANG”, mahasiswa diharapkan dapat :
Menerapkan prinsip isolasi mikroorganisme metode cawan tuang
dengan baik dan benar
Menggunakan pipet mikro, vortex mixer dengan baik dan benar
Membuat pengenceran biakan secara aseptik dengan baik dan benar
Memindahkan biakan ke dalam cawan petri steril secara aseptic dengan
baik dan benar
Mengisolasi mikroorganisme dengan metode cawan tuang dengan baik
dan benar
16.2 METODOLOGI
16.3 ALAT DAN BAHAN
Cawan petri steril
Tabung reaksi steril
Pembakar spritus
Korek api
Pipet mikro 100 – 1000 µL
Tip pipet mikro steril
Pipet ukur steril 10 mL
Ball pipette
Vortex mixer
Incubator oven
Autoclave
Air steril
Ethanol 70%
Media (NA/PDA)
Biakan campuran
mikroorganisme
BAB 17 CARA KERJA
Tuliskan kode kelompok dan tanggal pada permukaan luar dasar cawan
petri .Beri nomor di bagian atasnya.
Ambil 6 tabung reaksi berisi air steril masing-masing 9 ml, letakkan di
rak tabung reaksi dan beri penomoran.
xxvii
Kocok tabung reaksi berisi suspensi campuran bakteri (disediakan)
dengan gerakan kesamping, jangan sampai sumbatnya basah.
Langkah selanjutnya dapat dilihat pada gambar 3-1 berikut.
Gambar 3-3 urutan proses isolasi metode cawan tuang
Ambil 1 ml campuran biakan secara aseptic dengan pipet mikro,
pindahkan ke tabung reaksi 1 , kocok.
Ambil 1 ml dari tabung reaksi 1 campuran biakan secara aseptic dan
pindahkan ke tabung reaksi 2, kocok. Lakukan hal yang sama sampai
kelima tabung reaksi berisi bakteri.
Dari masing-masing tabung, pindahkan 1 ml campuran biakan secara
aseptic ke 5 petridish steril (beri penomoran dan keterangan
pengenceran pada petridish sesuai dengan asal biakan tabung)
Untuk variasi pengenceran tanyakan pada dosen pembimbing
Tambahkan agar cair bersuhu ± 40C secukupnya ke dalam petridish
secara aseptik. Dengan posisi cawan petri di meja kerja, putar-putarkan
cawan petri searah jarum jam sebanyak 5 kali kemudian berlawanan
arah jarum jam juga sebanyak 5 kali. Selanjutnya putarkan cawan petri
hingga membentuk angka delapan sebanyak 5 kali. Kemudian biarkan
xxviii
beku. Bungkus dengan kertas pembungkus dan inkubasi selama 2 x 24
jam dalam incubator oven dalam keadaan terbalik (tutup cawan di
bawah) pada suhu yang sesuai.
Amati diameter (mm), warna, ketinggian koloni, tepian, bentuk,
konsistensi serta bau, lihat gambar 3-2 berikut.
Gambar 3-4 bentuk, tepian dan elevasi koloni hasil isolasi
CATATAN :setelah pengamatan, jangan dibuang atau dibersihkan
untuk digunakan dalam perhitungan koloni (colony counter).
xxix
17.1 HASIL PENGAMATAN
Data yang didapat ditampilkan dalam tabel di bawah. Untuk tiap cawan
diamati bentuk, tepian dan elevasi tiap koloni yang tumbuh. Untuk kontaminan
(bila ada) dilaporkan tersendiri.
BAB 18 KOLONI ……………
CAWAN ………………….. BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
BAB 19 KOLONI …………..
CAWAN …………………. BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
xxx
BAB 20 KOLONI …………..
CAWAN …………………….. BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
BAB 21 KOLONI …………
CAWAN …………….. BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
xxxi
BAB 22 KOLONI ………….
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
BAB 23 KOLONI …………
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
xxxii
BAB 24 KOLONI ………..
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
BAB 25 KOLONI ……….
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
xxxiii
BAB 26 KOLONI ……….
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
xxxiv
BAB 27 ISOLASI MIKROORGANISME METODE CAWAN GORES
27.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “ISOLASI MIKROORGANISME METODE
CAWAN GORES”, mahasiswa diharapkan dapat :
Menerapkan prinsip isolasi mikroorganisme metode cawan gores
dengan baik dan benar
Menginokulasi biakan secara aseptic ke dalam cawan petri dengan baik
dan benar
Mengisolasi mikroorganisme dari lingkungan asalnya menggunakan
metode cawan gores dengan baik dan benar
27.2 METODOLOGI
27.3 ALAT DAN BAHAN
cawan petri steril
lup inokulasi
pembakar spiritus
media agar NA/PDA steril
suspensi campuran bakteri, atau
cawan petri hasil isolasi dengan metode cawan tuang
BAB 28 CARA KERJA
Siapkan cawan petri kering dan steril
Nyalakan pembakar spiritus, bekerjalah pada radius 30 cm maksimal
dari api.
Panaskan bibir cawan beberapa kali di api pembakar spiritus
Letakkan di meja dan buka tutup cawan petri. Jangan terlalu lebar,
cukup untuk menuangkan media agar cair bersuhu ± 60C ke dalamnya
Isikan ± ½ bagian dari kedalaman cawan petri
xxxv
Biarkan tutup cawan terbuka sedikit untuk mendinginkan media agar
dan uap panas tidak mengembun di tutup cawan. Pastikan bekerja di
radius 30 cm dari nyala api spiritus!
Bila sudah beku, berarti cawan sudah siap untuk digores.
Tuliskan kode kelompok dan tanggal pada permukaan luar dasar cawan
petri .Beri nomor di bagian atasnya.
Baliklah cawan petri dan buatlah sketsa area penggoresan dengan
spidol, lihat gambar 4-1 di bawah
Gambar 4-5 Sektor penggoresan cawan petri
Dengan berpedoman pada gambar 4-1 di atas, lakukan langkah-langkah
berikut :
Letakkan cawan petri di atas meja dengan posisi tutup terletak di sisi
atas dan sector 0 di sisi kiri
Kocoklah tabung reaksi berisi campuran suspensi mikroba dengan
gerakan ke samping. Jaga agar sumbat kapas tidak basah. Atau gunakan
biakan yang sudah anda dapat dari isolasi dengan metode cawan tuang.
Pilih koloni yang bukan kontaminan, konsultasikan dengan dosen
pembimbing.
Panaskan bibir cawan petri dengan pembakar spiritus ± 3 putaran
Dengan lup inokulasi, pindahkan secara aseptik satu lup penuh biakan
miroba pada sektor 0 dan goreskan membentuk pola zig zag. Perhatikan
xxxvi
agar tutup cawan petri tidak terbuka terlalu lebar. Karena permukaan
agar dapat terlukai oleh lup, maka goresan dilakukan tanpa tekanan
berlebih tetapi mantap. Lingkaran di ujung lup harus terletak datar dan
horisontal terhadap permukaan agar. Bila biakan campuran tersedia
dalam bentuk padat, jaga agar inokulum yang dipindahkan tidak terlalu
banyak, cukup sentuhkan lup pada biakan yang akan digoreskan.
Pijarkan kembali lup dan biarkan dingin. Suhu lup dapat diperiksa
dengan menyentuhkannya ke pinggiran media agar dan bila mendesis
berarti masih panas. Pemijaran lup yang kedua kali ini akan mematikan
sel-sel yang masih tersisa sehingga membantu pengenceran jumlah sel.
Goreskan lup ke sektor 0 satu sampai tiga kali saja dan susul dengan
goresan ke arah tepi luar sektor 1. Lanjutkan dengan goresan zig zag
pada sektor 1 dan tidak tumpang tindih.
Putar cawan petri hingga sektor 1 terletak di sisi kiri anda, ulangi
langkah 5 di atas untuk mengencerkan biakan dari sektor 1 ke sektor 2.
Putar cawan petri hingga sektor 2 terletak di sisi kiri anda, ulangi
langkah 5 di atas untuk mengencerkan biakan dari sektor 2 ke sektor 3.
Perhatian : JANGAN LUPA UNTUK SELALU MEMIJARKAN LUP
SETIAP KALI BERPINDAH SEKTOR!!!
Panaskan sekali lagi bibir cawan petri dengan pembakar spiritus
kemudian bungkus rapi.
Inkubasikan cawan petri terbalik dalam inkubator oven pada suhu yang
sesuai selama 2 x 24 jam.
Amati diameter (mm), warna, ketinggian koloni, tepian, bentuk,
konsistensi serta bau, lihat gambar 4-2 dan 4-3 berikut
xxxvii
.
Gambar 4-6 Pola goresan dan hasilnya
Gambar 4-7 Bentuk, tepian dan elevasi koloni
xxxviii
28.1 HASIL DAN PENGAMATAN
Data yang didapat ditampilkan dalam tabel di bawah. Untuk tiap cawan
diamati bentuk, tepian dan elevasi tiap koloni yang tumbuh. Untuk kontaminan
(bila ada) dilaporkan tersendiri.
BAB 29 KOLONI …..
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
BAB 30 KOLONI …….
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
xxxix
BAB 31 KOLONI ………
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
BAB 32 KOLONI ……..
CAWAN ………………… BENTUK, TEPIAN, ELEVASI
xl
xli
BAB 33 PENYIMPANAN KULTUR MURNI DI AGAR MIRING
33.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PENYIMPANAN KULTUR MURNI DI
AGAR MIRING”, mahasiswa diharapkan dapat :
Membuat agar miring di tabung reaksi
Menginokulasi biakan secara aseptic ke agar miring dengan baik dan
benar
33.2 METODOLOGI
33.3 ALAT DAN BAHAN
Tabung reaksi steril
Rak tabung reaksi
Batang penyangga
Lup inokulasi
Pembakar spiritus
Korek api
Media agar NA/PDA cair steril
Biakan dari hasil isolasi cawan gores
Etanol 70%
Incubator oven
BAB 34 CARA KERJA
A. PEMBUATAN AGAR MIRING
Siapkan tabung reaksi kering dan steril lengkap dengan sumbat
kapasnya.
Nyalakan pembakar spiritus, bekerjalah pada radius 30 cm maksimal
dari api.
xlii
Pegang tabung reaksi di tangan kiri, buka sumbat kapas dengan tangan
kanan, gunakan jari kelingking dan jari tengah. Jangan letakkan sumbat
di meja kerja!!!!!!!!!
Panaskan bibir tabung reaksi dengan api pembakar spiritus beberapa
kali.
Tuangkan media agar cair bersuhu ± 60C hingga ± 1/3 tinggi tabung
reaksi (sesuaikan lagi dengan diameter tabung reaksi)
Panaskan lagi bibir tabung lalu tutup kembali sumbat kapasnya
Simpan dalam posisi miring, atur sedemikian rupa hingga media agar di
dasar tabung tidak terlalu tebal dan ujung agar miring cukup jauh (± 8
cm) dari mulut tabung.
Agar miring dinyatakan jadi bila tak ada embun di dalam tabung
B. INOKULASI
Tuliskan kode kelompok dan tanggal pada permukaan luar tabung agar
miring
Letakkan api pembakar spiritus pada jarak ± 30 cm dari anda.
Bersihkan meja kerja dan tangan anda dengan etanol 70%
Pegang cawan petri berisi isolat di tangan kiri dan lup inokulasi di
tangan kanan. Pijarkan lup inokulasi hingga memerah, kemudian
panaskan bibir cawan petri dalam beberapa putaran.
Gerakkan ibu jari tangan kiri ke arah atas sedemikian hingga tutup
cawan petri terangkat sedikit dan tahan dengan telunjuk dan jari tengah
tangan kiri.
Ambil satu lup biakan isolat yang sudah dipilih dan cepat tutup cawan
petri. Jangan lupa untuk memanaskan sekali lagi bibir cawan petri.
Pegang tabung reaksi dengan tangan kiri dan lup inokulasi di tangan
kanan. Buka tutup kapasnya dengan kelingking tangan kanan dan
jepitkan ke telapak tangan kanan. Jangan letakkan kapas di meja!!!!!
Panaskan bibir tabung reaksi dalam beberapa putaran, lalu masukkan
lup inokulasi dan goreskan ke agar miring dalam tabung reaksi dengan
xliii
pola zig zag.
Panaskan bibir tabung sebelum kapasnya ditutupkan lagi. Lalu inokulasi
selama 2x24 jam dalam incubator oven pada suhu yang sesuai.
Lup inokulasi harus dipijarkan sebelum disimpan.
34.1 HASIL PENGAMATAN
Tempelkan foto masing-masing tabung agar miring hasil inokulasi anda
dalam tabel berikut. Jelaskan kondisi masing-masing inokulum dalam agar miring
anda.
BAB 35 Koloni ………….
TABUNG KE …………. KETERANGAN
BAB 36 Koloni ……….
xliv
TABUNG KE …………. KETERANGAN
BAB 37 Koloni ……………
TABUNG KE …………. KETERANGAN
xlv
BAB 38 PERHITUNGAN MIKROORGANISME
38.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PERHITUNGAN MIKROORGANISME”,
mahasiswa diharapkan dapat :
Mengetahui jumlah mikroorganisme dengan menggunakan metode
yang sesuai
Mengoperasikan colony counter dengan baik dan benar
Menentukan jumlah mikroorganisme dengan menggunakan colony
counter
Menggunakan haemocytometer dengan baik dan benar
Menentukan jumlah mikroorganisme dengan menggunakan
haemocytometer
38.2 METODOLOGI
38.3 ALAT DAN BAHAN
Biakan campuran yang sudah disediakan (yeast, bakteri dll)
Biakan hasil isolasi metode cawan tuang
Pipet mikro
Tip pipet mikro steril
Pembakar spiritus
Haemocytometer
Colony counter
Mikroskop binokuler
BAB 39 CARA KERJA
A. PERHITUNGAN DENGAN COLONY COUNTER
Siapkan cawan petri hasil isolasi dengan metode cawan tuang.
Perhatikan faktor pengencernya.
xlvi
Hidupkan colony counter, letakkan cawan petri di wadah yang sudah
disediakan dengan posisi tutup di bawah.
Tunjuk tiap titik koloni dengan spidol permanen hingga tercatat angka
yang menunjukkan jumlah koloni yang ada dalam cawan petri tersebut.
Angka yang diperoleh dikalikan dengan factor pengencernya. Misal :
koloni yang berasal dari cawan petri dengan pengenceran 1:1000000
memilki koloni sejumlah 155, maka jumlah mikroba per ml biakan
adalah 155 x 106 = 1,6 x 108 mikroba per ml biakan (dipakai 1 desimal
saja)
Bila dilakukan pengulangan, maka harus di rata-rata. Lihat tabel di
bawah.
Tabel 6-1 Contoh penghitungan jumlah koloni (SPC) dengan pengulangan
Biakan
10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
A 175
208
15
20
5
2
= (17.500+20.800)/2
= 1,9 x 104
Data lain < 30
B 135
165
45
45
5
8
= (13.500+16.500)/2
= 1,5 x 104
45.000/13.500 >2
45.000/16.500 >2, maka dilaporkan pengenceran terendah
C 275
285
35
40
5
7
= (27.500 + 35.000)/2 = a
= (28.500 + 40.000)/2 = b
(a+b)/2 = 3,3 x 104
35.000/27.500 < 2
40.000/28.500 < 2, maka dilaporkan hasil rata-rata
D 290
305
25
28
5
0
= (29.000+30.500)/2
= 3 x 104
25 < 30, dirata-rata meskipun 305 > 300
Bila ada lebih dari satu cawan yang memenuhi syarat, maka di lakukan
perhitungan sebagai berikut :
xlvii
Urutkan data anda sesuai faktor pengenceran dari yang paling kecil ke
yang paling besar
lakukan perhitungan seperti tabel di bawah.
Tabel 6-2 Contoh penghitungan jumlah koloni (SPC) dengan lebih dari satu cawan memenuhi syarat
Biakan 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan
A 295 40 5 = (29.500+40.000)/2
= 3,5 x 104
40.000/29.500 < 2
B 140 35 1 1,4 x 104 35.000/14.000 > 2
Demikian seterusnya sampai akhirnya hanya di dapat satu angka yang
menunjukkan jumlah koloni biakan.
Jumlah koloni adalah perkalian dari hasil perhitungan dengan angka
pengencerannya. (cfu/ml), (colony forming unit/ml)
B. PERHITUNGAN DENGAN HAEMOCYTOMETER
Bersihkan permukaan hitung hemasitometer dengan secarik tissue dan
setetes etanol 70%. Jangan digosok terlalu kuat karena kaca
hemasitometer mudah tergores. Bersihkan juga kaca penutup sampai
bersih.
Letakan kaca tutup hemasitometer di atas permukaan hitung
hemasitometer
Buat berbagai pengenceran (lihat SOP pengenceran) untuk suspensi
biakan mikroba hasil isolasi dengan metode cawan gores atau tuang.
Kocoklah suspensi biakan mikroba yang akan dihitung dengan baik
agar rata, jangan sampai sumbat basah. Kemudian gunakan pipet tetes
untuk mengambil suspensi sebanyak 0,1 – 0,5 ml.
Dengan cermat taruhlah ujung pipet tetes anda pada lekukan berbentuk
huruf V pada tepi kaca tutup hemasitometer dan biarkan ruang hitung
terpenuhi suspensi secara kapiler. Gunakan telunjuk anda untuk
mengatur laju aliran suspensi agar bagian bawah kaca tutup tidak terisi
xlviii
oleh cairan berlebihan. Usahakan agar tidak ada cairan masuk di antara
kaca tutup dan penyangga kaca tutup. Bila sampai terjadi, maka harus
diulang dari awal.
Gambar di bawah adalah haemocytometer yang dipakai dalam
praktikum.
Gambar 6-8 Haemocytometer
Letakkan hemasitometer di atas pentas mikroskop dengan hati-hati.
Amatilah dengan lensa obyektif berkekuatan rendah (40 x) dan
hitunglah jumlah sel yang terdapat pada 80 buah kotak kecil yang
terletak di dalam kotak bagian tengah yang berukuran 1 mm2
Perhatikan gambar 6-2 di bawah, pembagian ruang hitung
hemasitometer. Seluruhnya ada sembilan area, masing-masing
berukuran 1 mm². Kotak yang di tengah , yang kesemua sisinya dibatasi
garis ganda juga berukuran sama, dibagi menjadi 25 kotak besar. Setiap
kotak besar ini dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Sehingga di dalam
kotak tengah tersebut seluruhnya terdapat 25 x 16 kotak atau 400 kotak
kecil yang merupakan ruang hitung.
xlix
Gambar 6-9 Pembagian kotak hemasitometer
Sedangkan pembagian ruang hitung hemasitometer disajikan dalam
gambar 6-3 berikut.
Gambar 6-10 Ruang hitung hemasitometer dan cara menghitung
Kotak yang merupakan tempat sampling hitungan adalah 4 kotak besar
di ujung dan 1 kotak besar di tengah. Tiap kotak ini terdiri atas 16 kotak
kecil, hingga totalnya adalah 80 kotak kecil.
Bila ditemukan sel mikroba tepat di garis batas, maka yang boleh
dihitung HANYALAH yang terletak di sudut kiri atas kotak (lihat
gambar 6-3 kanan)
Andaikanlah menurut pengamatan anda terdapat 150 sel khamir di
dalam 80 kotak kecil. Maka jumlah sel khamir dalam setiap ml suspensi
asal adalah :
l
80 kotak kecil mempunyai luas 0,2 mm². Jadi dalam setiap mm²
terdapat 150 x 5 atau 750 sel. Kedalaman cairan di hemasitometer ialah
0,1 mm. Maka volume cairan yang tercakup oleh kotak berukuran 1
mm² ialah 0,1 mm³ . Artinya, terdapat 750/0,1 mm³ atau 7500 sel/mm³.
1 ml = 1 cm³ atau 1000 mm³ , Maka jumlah sel khamir dalam suspensi
asal ialah 7,5 x 10 sel/ml.
Jumlah yang akurat adalah bila sel terhitung dalam 80 kotak kecil antara
120 – 200 sel tetapi bila didapat sel lebih besar dari 200, maka encerkan
sampel. Sedang bila didapat jumlah sel lebih kecil dari 120, maka
prosedur perhitungan mengikuti prosedur seperti berikut :
Hitung sel dalam 4 kotak A, B, C dan D (lihat gambar 6-2) lalu bagi 4
jumlah sel ( per mm3) dan selanjutnya kalikan 104 untuk mendapatkan
jumlah sel tiap ml sampel.
39.1 HASIL PENGAMATAN
a. PERHITUNGAN DENGAN COLONY COUNTER
PENGENCERAN KE …………. HASIL PERHITUNGAN
li
PENGENCERAN KE …………. HASIL PERHITUNGAN
PENGENCERAN KE …………. HASIL PERHITUNGAN
lii
PENGENCERAN KE …………. HASIL PERHITUNGAN
PENGENCERAN KE …………. HASIL PERHITUNGAN
liii
PENGENCERAN KE …………. HASIL PERHITUNGAN
B. HASIL PERHITUNGAN DENGAN HEMASITOMETER
PENGENCERAN KE …………. HASIL PERHITUNGAN
liv
BAB 40 PEWARNAAN NEGATIF
40.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEWARNAAN NEGATIF”, maka
mahasiswa dapat :
a. Membuat preparat bakteri untuk dapat diwarnai dengan baik dan benar
b. Mewarnai bakteri dengan baik dan benar
c. Mengidentifikasi bermacam-macam morfologi bakteri
40.2 METODOLOGI
40.3 ALAT DAN BAHAN
Mikroskop
kaca preparat
kaca penutup
lup inokulasi
pembakar spiritus
penjepit kayu
rak tabung reaksi
biakan bakteri murni atau hasil isolasi sebelumnya
Larutan nigrosin
kertas serap/tissue
etanol 70%
BAB 41 CARA KERJA
Bersihkan kaca obyek dengan sabun, bilas lalu seka dengan alcohol
sehingga bebas lemak, kemudian panggang di atas api pembakar
spiritus.
Setelah dingin ambil suspensi biakan murni bakteri atau hasil isolasi
anda dengan lup inokulasi secara aseptis, dan letakkan di atas gelas
preparat.
lv
Kemudian ambil nigrosine dengan lup inokulasi dan campurkan dengan
suspensi bakteri yang telah diletakkan di atas gelas obyek. Ratakan
suspensi ini sehingga membentuk lapisan yang tipis, lihat gambar 1.
Selanjutnya preparat dikering anginkan, jaga kesterilan area kerja anda.
Amatilah dengan mikroskop menggunakan pembesaran kuat (1000 X)
Gambar 7-11 Langkah – langkah pewarnaan negatif
41.1 HASIL PENGAMATAN
Gambar dengan baik data yang anda dapat dalam tabel berikut. Gunakan
pinsil berwarna.
lvi
BAB 42 PERBESARAN 100 X
GAMBAR KETERANGAN
BAB 43 PERBESARAN 1000 X
GAMBAR KETERANGAN
lvii
BAB 44 PEWARNAAN SEDERHANA
44.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEWARNAAN SEDERHANA”,
mahasiswa diharapkan dapat :
a. Membuat preparat bakteri untuk dapat diwarnai dengan baik dan benar
b. Mewarnai bakteri dengan baik dan benar
c. Mengidentifikasi bermacam-macam morfologi bakteri berdasar sifatnya
terhadap pewarna sederhana
44.2 METODOLOGI
44.3 ALAT DAN BAHAN
Gelas benda
Lup inokulasi
Pembakar spiritus
Mikroskop
Gelas benda
Bak pewarna
Botol semprot
Penjepit kayu
Kertas serap/tissue
Tabung reaksi berisi isolat
cair
Tabung agar miring/cawan
petri berisi isolat
Larutan zat warna biru
metilene Loffler
Larutan zat warna
karbolfuchsin
Air steril
Alkohol 70%
BAB 45 CARA KERJA
A. PEMBUATAN PREPARAT
Bersihkan dan cuci gelas benda dengan baik sehingga bebas lemak dan
kotoran
Dengan kaca obyek di tangan kiri, basahi telunjuk dan jari tengah
tangan kanan anda
Gosokkan kedua jari yang basah itu pada sabun pembersih
lviii
Gosok kedua permukaan gelas benda dengan kedua jari yang basah tadi
Bilas gelas benda dengan air hingga bersih dan tidak ada lagi sisa
sabun.
Bila gelas benda yang akan dipakai bekas diwarnai maka ulangi
langkah a hingga e hingga bersih betul.
Bilas gelas benda dengan alkohol, tiriskan dan biarkan kering
Setelah bersih pegang gelas benda hanya di bagian pinggirnya.
Buat gambar lingkaran di tengah gelas benda dengan pinsil kaca
berdiameter± 2 cm
a. Mikroba dalam media padat
Letakkan sejumlah air steril di permukaan gelas benda, sisihkan
Pegang biakan mikroba di tangan kiri dan lup inokulasi di tangan
kanan.
Pijarkan lup inokulasi hingga memerah, panaskan bibir tabung reaksi
atau cawan petri dalam beberapa putaran di api.
Buka tutup tabung reaksi atau cawan petri, ambil sejumlah biakan
dengan lup steril
Campurkan biakan dengan air steril di permukaan gelas benda hingga
rata.
Biarkan olesan kering di udara, lalu fiksasi dengan api pembakar
spiritus hingga terasa agak panas bila ditempelkan di punggung tangan.
Proses ini disebut fiksasi panas dan dimaksud untuk mematikan
organisme dan membuatnya menempel pada kaca obyek
b. Mikroba dari media cair
Kocok terlebih dahulu tabung reaksi dengan cara meutar-mutar tabung
diantara dua sisi tangan yang berisi biakan, jangan sampai sumbatnya
basah
Pegang biakan mikroba di tangan kiri dan lup inokulasi di tangan
kanan.
Pijarkan lup inokulasi hingga memerah, panaskan bibir tabung reaksi
dalam beberapa putaran di api.
Buka tutup tabung reaksi, ambil sejumlah biakan dengan lup steril
lix
Oleskan biakan di permukaan gelas benda hingga rata.
Biarkan olesan kering di udara, karena berupa cairan maka
membutuhkan waktu sekitar 30 menit.
Lalu fiksasi dengan api pembakar spiritus hingga terasa agak panas bila
ditempelkan di punggung tangan. Proses ini disebut fiksasi panas dan
dimaksud untuk mematikan organisme dan membuatnya menempel
pada kaca obyek
Gambar 8-12 Langkah kerja pembuatan preparat pewarnaan sederhana
lx
45.1 HASIL PENGAMATAN
45.2 PERBESARAN 100 X
GAMBAR KETERANGAN
BAB 46 PERBESARAN 1000 X
GAMBAR KETERANGAN
lxi
BAB 47 PEWARNAAN GRAM
47.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEWARNAAN GRAM”, mahasiswa
diharapkan dapat :
a. Membuat preparat bakteri untuk dapat diwarnai dengan baik dan benar
b. Mewarnai bakteri dengan baik dan benar
c. Mengidentifikasi bermacam-macam morfologi bakteri berdasar sifatnya
terhadap pewarna gram
47.2 METODOLOGI
47.3 ALAT DAN BAHAN
mikroskop
gelas benda
kaca penutup
lup inokulasi
bak pewarna
rak tabung reaksi
pembakar spiritus
botol semprot
penjepit kayu
biakan bakteri murni atau hasil isolasi sebelumnya
seperangkat pewarna gram :
i. ungu kristal (modifikasi hucker)
ii. Larutan KI
iii. Alkohol 95 % p.a
iv. Safranine
air suling
kertas serap/tissue
lxii
BAB 48 CARA KERJA
Ambillah sebuah gelas benda, bersihkan dengan tissue
Supaya debunya hilang, kemudian panaskan kira-kira 10-20 x di atas
nyala api sehingga lemaknya hilang.
Letakkan kaca obyek, dengan sisinya yang tidak berlemak pada bagian
atas rak tabung reaksi dan biarkan sampai dingin.
Kemudian taruhlah setetes air di atasnya (tetesan ini harus menyebar
sama rata). Jika tidak menyebar berarti lemaknya masih belum hilang
dan pekerjaannya harus diulang.
Bakar lup inokulasi hingga pijar. Dengan jarum ini, ambil sedikit
bakteri dari biakkannya dan letakkan di pinggir tetesan tersebut.
Kemudian campurkan bakteri dalam tetesan air dengan menggosokkan
lup inokulasi dalam suspensi tersebut hingga terdapat suatu lingkaran
dengan garis tengah kira-kira 1 cm.
Jumlah bakteri yang tepat ditunjukkan jumlah bakteri yang tepat keruh.
Pijarkan jarum yang telah dipakai. Keringkan suspensi bakteri
tersebut, sebaiknya jangan dipanaskan. Tetapi jika ingin mempercepat
keringnya suspensi tersebut, preparat boleh dipanaskan dengan hati-
hati dengan menggoyangkannya selama 30 menit di atas nyala api kecil
Buatlah dua garis tebal di kanan kiri peparat dengan sebuah potlot
kaca. Hal ini berguna untuk menahan aliran larutan zat warna keluar
dan sebagai penandaan.
Fikser-kan preparat tersebut dengan menggerakkan kaca obyek, dengan
bagian atas yang ada preparatnya. Hal ini dilakukan beberapa kali
dengan melalui api pembakar spiritus.
Warnailah dengan karbon kristal violet, diamkan selama 20 detik
Cuci sebentar dengan air
Teteskan larutan lugol (iodium) pada preparat dan diamkan selama 1
menit
Cuci dengan menggunakan alcohol 95% selama 10 – 20 detik dengan
menggoyangkan preparat di dalam gelas kimia yang berisi alcohol.
Bilas dengan air sebentar saja
lxiii
Taruhlah preparat ini tegak lurus di atas kertas serap/tissue, sehingga
sebagian besar airnya diserap.
Warnailah dengan larutan safranine selama 20 detik
Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas serap/tissue.
Amati dengan mikroskop perbesaran kuat tanpa gelas penutup
Catat jenis mikroba yang diperiksa, dan bedakan antara gram negatif
dan gram positif.
Gambar 9-13 Langkah kerja pewarnaan gram
lxiv
48.1 HASIL PENGAMATAN
48.2 PERBESARAN 100 X
GAMBAR KETERANGAN
BAB 49 PERBESARAN 1000 X
GAMBAR KETERANGAN
lxv
BAB 50 PEWARNAAN SPORA
50.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEWARNAAN SPORA”, mahasiswa
diharapkan dapat :
a. Membuat preparat bakteri untuk dapat diwarnai dengan baik dan benar
b. Mewarnai bakteri dengan baik dan benar
c. Mengidentifikasi morfologi spora bakteri
50.2 METODOLOGI
50.3 ALAT DAN BAHAN
mikroskop
gelas benda
lup inokulasi
bak pewarna
rak tabung reaksi
pembakar spiritus
botol semprot
penjepit kayu
biakan bakteri murni atau hasil isolasi sebelumnya
seperangkat pewarnaan spora :
i. biru metilena Loffler
ii. safranine 0,5%
iii. malachite green 5%
iv. asam cuka 5%
air suling
kertas serap/tissue
BAB 51 CARA KERJA
Ambillah sebuah gelas benda, bersihkan dengan tissue
Supaya debunya hilang, kemudian panaskan kira-kira 10-20 x di atas
nyala api sehingga lemaknya hilang.
lxvi
Letakkan gelas benda, dengan sisinya yang tidak berlemak pada bagian
atas bejana untuk mewarna atau rak tabung reaksi dan biarkan sampai
dingin.
Kemudian taruhlah setetes air steril di atasnya (tetesan ini harus
menyebar sama rata). Jika tidak menyebar berarti lemaknya masih
belum hilang dan pekerjaan di atas harus diulang.
Bakar lup inokulasi hingga pijar. Dengan lup ini, ambil sedikit bakteri
dari biakkannya secara aseptis dan letakkan di pinggir tetesan tersebut
.Kemudian campurkan bakteri dalam tetesan air dengan
menggosokkan lup inokulasi dalam suspensi tersebut hingga terdapat
suatu lingkaran dengan garis tengah kira-kira 1 cm.
Jumlah bakteri yang tepat ditunjukkan jumlah bakteri yang tepat keruh.
Kemudian angin-anginkan, setelah itu fiksasi di atas nyala api
pembakar spiritus
Teteskan pada noda larutan malachite green berlebih dan biarkan
½ - 1 menit. Kemudian tutuplah olesan menggunakan kertas serap
dan uapkan di atas air mendidih selama kurang lebih 5 menit.
Cat yang berlebihan cuci dengan air mengalir selama 30 detik dan
keringkan dengan cara diangin-anginkan
Tetesi dengan cat safranin selama 30 detik.
Cuci dengan air mengalir dan keringkan dengan cara diangin-anginkan.
Amati dengan menggunakan mikroskop pembesaran kuat.
Gambar hasil pengamatan dan tentukan letak spora (sentral, terminal
atau sub terminal)
lxvii
Gambar 10-14 Langkah kerja pewarnaan spora
51.1 HASIL PENGAMATAN
51.2 PERBESARAN 100 X
GAMBAR KETERANGAN
lxviii
BAB 52 PERBESARAN 1000 X
GAMBAR KETERANGAN
lxix
BAB 53 PEWARNAAN ACID FAST
53.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEWARNAAN ACID FAST”, mahasiswa
diharapkan dapat :
a. Membuat preparat bakteri untuk dapat diwarnai dengan baik dan benar
b. Mewarnai bakteri dengan baik dan benar
c. Mengidentifikasi bakteri berdasar sifatnya terhadap pewarna acid fast
53.2 METODOLOGI
53.3 ALAT DAN BAHAN
mikroskop
gelas benda
lup inokulasi
bak pewarna
rak tabung reaksi
pembakar spiritus
botol semprot
penjepit kayu
biakan bakteri murni atau hasil isolasi sebelumnya
seperangkat pewarna tahan asam :
i. karbon fuksin Kinyoun 4%
ii. biru metilena Loeffler
iii. alcohol-asam (3%HCI dalam etanol 95 % )
air suling
kertas serap/tissue
BAB 54 CARA KERJA
Sediakan gelas benda yang bersih.
Siapkan olesan campuran mikroorganisme secara aseptis pada kaca
obyek dan sebarkan hingga rata.
lxx
Setelah selesai difiksasi, letakkan gelas bend anda di atas rak kawat
pada bak pewarna. Genangi olesan tersebut dengan karbolfuksin dan
uapi dengan air mendidih selama 5 menit. Lihat gambar 5. Tambahkan
pewarna bila pewarnanya teruapkan
Dengan gelas benda dalam posisi miring, setelah dingin lakukan
pemucatan terhadap olesan dengan alcohol – asam sampai latar
belakang olesan tampak merah muda pucat. Pemucatan biasanya
membutuhkan waktu 15 – 20 detik.
Hentikan pemucatan, bilaslah olesan baik-baik dengan botol pijit.
Kembalikan gelas benda di atas rak dan genangi olesan dengan biru
metilena selama 30 detik.
Miringkan gelas benda dan bilaslah dengan air dari botol pijit.
Tiriskan gelas benda dan seraplah kelebihan air pada olesan dengan
menggunakan kertas serap.
Sediakan gelas benda yang bersih.
Siapkan olesan campuran mikroorganisme secara aseptis pada kaca
obyek dan sebarkan hingga rata.
Setelah selesai difiksasi, letakkan gelas bend anda di atas rak kawat
pada bak pewarna. Genangi olesan tersebut dengan karbolfuksin dan
uapi dengan air mendidih selama 5 menit. Lihat gambar 5. Tambahkan
pewarna bila pewarnanya teruapkan
Dengan gelas benda dalam posisi miring, setelah dingin lakukan
pemucatan terhadap olesan dengan alcohol – asam sampai latar
belakang olesan tampak merah muda pucat. Pemucatan biasanya
membutuhkan waktu 15 – 20 detik.
Hentikan pemucatan, bilaslah olesan baik-baik dengan botol pijit.
Kembalikan gelas benda di atas rak dan genangi olesan dengan biru
metilena selama 30 detik.
Miringkan gelas benda dan bilaslah dengan air dari botol pijit.
Tiriskan gelas benda dan seraplah kelebihan air pada olesan dengan
menggunakan kertas serap.
lxxi
Gambar 11-15 Langkah kerja pewarnaan acid fast
54.1 HASIL PENGAMATAN
54.2 PERBESARAN 100 X
GAMBAR KETERANGAN
lxxii
BAB 55 PERBESARAN 1000 X
GAMBAR KETERANGAN
lxxiii
BAB 56 PEMBUATAN KURVA PERTUMBUHAN
56.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEMBUATAN KURVA
PERTUMBUHAN”, mahasiswa diharapkan dapat :
a. Membuat kultur mikroorganisme dalam media cair atau padat dengan baik
dan benar
b. Menentukan massa mikroorganisme dengan metode yang tepat secara baik
dan benar
c. Membuat kurva pertumbuhan mikroorganisme dengan baik dan benar
56.2 METODOLOGI
56.3 ALAT DAN BAHAN
Erlenmeyer 250 ml
Kapas berbungkus kassa
Labu ukur 1000 mL
Lup inokulasi
Incubator shaker
Pipet mikro dan tip
Vortex mixer
Spatula
Gelas arloji
Oven
Pembakar spiritus
Corong gelas
Cawan arloji
Kertas saring Whatman 42
Neraca analitik 4 digit
Air steril
Inokulum padat
Aspergillus oryzae
Sukrosa 30 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
NaNO3 2 g
K2HPO4 1 g
KCl 0,5 g
FeSO4.7H2O 0,01 g
BAB 57 CARA KERJA
A. PERTUMBUHAN INOKULUM ASPERGILLUS ORYZAE
Larutkan semua bahan media pada erlenmeyer atau gelas kimia dengan
aquadest sampai 1000 mL.
lxxiv
Kemudian pindahkan ke erlenmeyer 250 ml milik tiap kelompok,
sesuaikan volumenya.
Tutup erlenmeyer dengan kapas berbungkus kasa lalu sterilkan dalam
autoclave
Siapkan tabung reaksi berisi biakan inokulum Aspergillus oryzae, lalu
tambahkan air steril kedalam tabung inokulum
Kocok tabung reaksi hingga air steril menjadi keruh, kalau perlu
gunakan lup inokulasi untuk mengaduk seluruh spora yang yang ada di
permukaan agar miring
Pindahkan air yang sudah keruh ke dalam erlenmeyer berisi media steril
secara aseptik
Inkubasi dalam incubator shaker pada kecepatan 150 rpm dan 30C
(Langkah pengamatan konsultasikan ke dosen pembimbing)
B. ANALISA MASSA SEL KERING
Oven kertas saring pada 105C selama 2 jam, simpan dalam desikator
untuk menurunkan suhunya (± 10 menit).
Timbang dan catat massa kertas saring hingga didapat berat konstannya
Bila kultur mikroba berupa pellet maka dapat langsung disaring dengan
kertas saring Whatman 42. Tetapi bila kultur mikroba berupa suspensi,
maka harus dipisahkan dengan sentrifugasi terlebih dahulu.
Tabung sentrifuge dikeringkan pada suhu 80C selama 24 jam,
dinginkan dalam desikator dan timbang
Sebanyak 10 ml cairan kultur dimasukan ke dalam tabung sentrifuse,
dan disentrifuse pada 3000 x g dalam 15 menit (untuk kultur yang peka
digunakan 1500 x g).
Cairan jernih (supernatant) dituangkan secara hati-hati ke dalam labu
erlenmeyer, dan dapat dipakai untuk analisa produk-produk metabolism
dan pengukuran konsentrasi sisa substrat (S)
Massa sel di cuci dengan 10 - 20 ml aquadest, disentrifugasi kembali,
dan supernatant dipisahkan dengan hati-hati dengan menggunakan
corong yang diberi kertas saring. Tetapi pellet mikroba dapat langsung
dioven.
lxxv
Massa sel pada kertas saring dikeringkan dalam oven atau pada suhu
80C selama 48 jam, atau dalam oven vakum pada suhu 40C selama 24
jam, timbang sampai beratnya konstan
Berat sel kering =
57.1 HASIL PENGAMATAN
Tabulasikan hasil pengamatan dari tiap Erlenmeyer ke dalam tabel berikut.
No. Kel. Hari keMassa kertas saring
(g)
Massa kertas saring
+ sel (g)Massa sel, g
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
lxxvi
BAB 58 PEMBUATAN EKSTRAK KASAR RENNIN DARI MUCOR PUSILLUS
58.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEMBUATAN RENNIN DARI MUCOR
PUSILLUS”, mahasiswa diharapkan dapat :
a. Membuat kultur pertumbuhan Mucor pusillus dalam media cair dengan
baik dan benar
b. Menumbuhkan Mucor pusillus dengan baik dan benar
c. Memisahkan ekstrak kasar rennin menggunakan sentrifus dengan baik dan
benar
d. Menentukan aktivitas ekstrak kasar rennin dengan baik dan benar
58.2 METODOLOGI
58.3 ALAT DAN BAHAN
Erlenmeyer 500 ml
Cawan arloji
Pemusing sentrifugal
Oven
Tabung reaksi
Rak tabung reaksi
Gelas kimia 1000 mL
Batang pengaduk
Stopwatch
a. Media pertumbuhan :
Aquadest 100 mL
4 % tepung maizena
0,2 % KH2PO4
0,05 % MgSO4.7H2O
0,5 % KCl
0,1 % urea
lxxvii
1 % pepton
b. Substrat uji aktivitas rennin
Susu skim
Ekstrak kasar rennin
Larutan CaCl2 0,05 M
BAB 59 CARA KERJA
a. Pembuatan ekstrak kasar rennin
Masukkan semua media pertumbuhan ke dalam Erlenmeyer 500 mL
Lalu sterilkan dalam autoclave
Inokulasikan 10 ml suspensi Mucor pusillus yang mengandung 4,7 x 10 5 spora per ml
Inkubasikan selama 116 jam pada suhu 37°C
Selanjutnya pisahkan dalam pemusing sentrifugal dan filtrat yang
diperoleh dipekatkan dalam oven vakum
b. Penentuan aktivitas ekstrak kasar rennin
Panaskan gelas kimia berisi air hingga bersuhu ± 50°C.
Larutkan 12 g susu skim dalam 100 mL CaCl2 0,05 M, panaskan hingga
bersuhu 40°C dalam beaker tersebut
Tempatkan 1 mL ekstrak kasar rennin pada tabung reaksi dan panaskan
enzim dalam beaker yang sama selama 5 menit. Proses di atas bertujuan
untuk mengaktifkan ekstrak kasar rennin
Campurkan ekstrak kasar rennin dan larutan susu tadi lalu diamkan
pada suhu 40°C
Catat waktu yang dibutuhkan untuk menggumpalkan susu
Hitung aktivitas ekstrak kasar rennin sesuai rumus berikut :
Dengan P = waktu yang diperlukan untuk menggumpalkan substrat uji
q = jumlah enzim yang digunakan
lxxviii
Unit aktivitas didefinisikan sebagai kemampuan1 ml ekstrak kasar
rennin untuk menggumpalkan susu dalam 1 menit
59.1 HASIL PENGAMATAN
Tabulasikan hasil pengamatan di tabel berikut untuk setiap hasil yang
didapat.
No. Kel.Volume ekstrak kasar
rennin, mlWaktu menggumpal
Aktivitas ekstrak
kasar renin
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
lxxix
BAB 60 PEMBUATAN KEJU CHEDDAR
60.1 KOMPETENSI
Setelah mengikuti praktikum “PEMBUATAN KEJU CHEDDAR”,
mahasiswa diharapkan dapat :
a. Membuat keju cheddar secara baik dan benar
b. Menerapkan prinsip higinitas dalam pembuatan produk makanan
60.2 METODOLOGI
60.3 ALAT DAN BAHAN
Seperangkat alat pasteurisasi susu (kompor, panci, penangas air,
thermometer)
Seperangkat alat pemecah curd (pisau, pengaduk/sendok)
Seperangkat alat pengepres keju (Alat pengepres, kain saring,)
Pipet ukur 10 ml
Lidi bersih
Timbangan
Susu sapi (jumlah ditentukan oleh pembimbing)
Enzim rennin Mucor miehei 0,25 % dari volume susu sapi
Larutan CaCl2 25 % sebanyak 0,04 % dari volume susu sapi
Suspensi starter keju berupa biakan Lactobacillus bulgaricus dan
Streptococcus thermophilus (2 : 1) sejumlah 2 % dari volume susu sapi
Garam halus
BAB 61 CARA KERJA
Susu dipasteurisasikan pada suhu 72-73C selama 15 detik
Dinginkan sampai 44C dan tambahkan starter keju, diaduk rata dan
setelah itu biarkan selama 15 menit pada suhu tersebut (harus
dipertahankan)
Tambahkan enzim rennin dan larutan CaCl2 25 % dengan suhu tetap
dipertahankan 44C, selama 30-60 menit (sampai terbentuk
lxxx
gumpalan/curd)
Uji kekompakan curd dengan cara menekan perlahan permukaan curd
dalam panci dengan pisau
Jika kekompakan curd masih pecah dan terlihat ada sisi curd yang
terikut (curd sulit lepas dari permukaan pisau), berarti curd belum
kompak. Maka diamkan lagi dengan suhu tetap 43-44C sampai kompak
Uji lagi, kekompakan curd dengan cara menekan perlahan permukaan
curd dalam panci dengan pisau
Jika pada permukaan pisau tidak terlihat ada sisa curd yang terikut
(curd mudah memisah), berarti curd sudah kompak.
Jika telah kompak, curd dipotong kecil-kecil berbentuk kubus 1 x1 x 1
cm3 dengan pisau
Diamkan selama 5 menit, sehingga terpisah antara curd dan whey
(cairan/dadih)
Keluarkan whey dengan mengunakan sendok sampai tersisa ½ bagian
whey
Curd di potong-potong kecil lagi, kemudian ditambah air panas (suhu
40C) selanjutnya diamkan sampai curd menyatu kembali
Proses cheddaring dilakukan, dengan cara whey dibuang dan curd
dikumpulkan ke tengah panci dengan menggunakan sendok
Setiap 15 menit curd dibalik dan sisa whey dibuang
Curd/gumpalan dicetak/dipres dengan pemberat
Hasil cetakan dikeluarkan dan direndam dalam larutan garam jenuh
selama 1 jam kemudian tiriskan selama 2 jam, pada suhu 17C
61.1 HASIL PENGAMATAN
Tabulasikan hasil keju cheddar anda di tabel berikut.
lxxxi
No. Kel.Massa keju
(g)
Data pendukung (jumlah
garam, masa rendam)Hasil
1.
2.
3.
4.
lxxxii
No. Kel.Massa keju
(g)
Data pendukung (jumlah
garam, masa rendam)Hasil
5.
6.
7.
8.
lxxxiii
No. Kel.Massa keju
(g)
Data pendukung (jumlah
garam, masa rendam)Hasil
9.
10.
11.
12.
DAFTAR PUSTAKA
lxxxiv
lxxxv