KAUNO TECHNOLOGIJOS UNIVERSITETO MAISTO INSTITUTAS

TVIRTINU: ………………………

KTU Maisto instituto direktorius

Antanas Šarkinas

2012 m. lapkričio mėn. 9 d.

MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR TAIKOMOSIOS VEIKLOS PROGRAMOS „MAISTO KOKYBĖ IR SAUGA“

Taikomojo tyrimo Nr. MT/11-19

INHIBITORIAI PIENE: PATEKIMO PRIEŽASTYS, NUSTATYMO METODAI, BIOLOGINIŲ

IR CHEMINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKA TYRIMO REZULTATAMS

2012 M. GALUTINĖ ATASKAITA

Tyrimo koordinatorė

Joana Šalomskienė

Tyrimo vadovai

Joana Šalomskienė (KTU MI)

Antanas Sederevičius (LSMU VA)

Kaunas

2012

2

VYKDYTOJŲ SĄRAŠAS

Daiva Jasinauskienė, KTU Maisto

instituto Mikrobiologijos mokslo

laboratorijos inžinierė

Atliko projekto KTU MI dalies tyrimus.

Dovilė Jonkuvienė, KTU Maisto instituto

Mikrobiologijos mokslo laboratorijos

inžinierė

Atliko projekto KTU MI dalies tyrimus

Daiva Knizikevičienė, LSMU VA

Virškinimo fiziologijos ir patologijos

mokslinio centro jaunesnioji mokslo

darbuotoja

Organizavo tyrimus ir dalyvavo rengiant projekto

LSMU VA dalies ataskaitą.

Irena Mačionienė, KTU Maisto instituto

Mikrobiologijos mokslo laboratorijos

vyresnioji mokslo darbuotoja, daktarė

Organizavo tyrimus ir dalyvavo rengiant projekto KTU

MI dalies ataskaitą ir leidinį.

Saulius Savickis, VĮ “Pieno tyrimai

direktorius

Atliko duomenų statistinę analizę ir pateikė duomenis

LSMU VA projekto dalies ataskaitai

Joana Šalomskienė, KTU Maisto instituto

mikrobiologijos mokslo laboratorijos

vedėja, vyriausioji mokslo darbuotoja,

habilituota daktarė

Sudarė darbo programą ir vadovavo projektui.

Organizavo darbus, derino projekto vykdymo planą bei

darbus su LSMU VA.

Rengė informacinį leidinį apie inhibitorius piene ir

projekto ataskaitą.

Antanas Sederevičius, LSMU VA

Anatomijos ir fiziologijos katedros

profesorius, Virškinimo fiziologijos ir

patologijos mokslinio centro vadovas,

daktaras

Sudarė savo darbo dalies programą ir derino vykdymo

planą bei darbus su KTU MI. Rengė projekto LSMU

LVA dalies ataskaitą.

Rasa Želvytė, LSMU VA Anatomijos ir

fiziologijos katedros profesorė, Virškinimo

fiziologijos ir patologijos mokslinio centro

jaunesnioji mokslo darbuotoja, daktarė

Organizavo projekto LSMU LVA dalies tyrimus ir rengė

ataskaitą

Renata Žvirdauskienė, KTU Maisto

instituto mikrobiologijos mokslo

laboratorijos jaunesnioji mokslo

darbuotoja, daktarė

Dalyvavo rengiant ataskaitą ir informacinį leidinį.

3

Turinys 1. Įvadas ................................................................................................................................................................... 4 2. Literatūros apžvalga ............................................................................................................................................ 7

2.1. Pieno kokybė ................................................................................................................................................ 7 2.2. Fiziologiniai veiksniai, turintys įtakos žaliavinio pieno kokybei ................................................................. 7

2.2.1. Laktacijos periodas ............................................................................................................................... 7 2.2.2. Gyvulio amžius ..................................................................................................................................... 8 2.2.3. Karvių veislė ......................................................................................................................................... 8 2.2.4. Fiziologinė gyvulio būklė ..................................................................................................................... 8

2.2.4.1. Pieno liaukos uždegimas ir jį sukeliantys mikroorganizmai .................................................... 9 2.2.4.2. Neinfekcinės ligos, turinčios įtakos pieno kokybei ................................................................ 11

2.3. Pagrindiniai kriterijai vertinant šviežio pieno kokybę ............................................................................... 12 2.3.1. Bendras bakterinis užterštumas ........................................................................................................... 12 2.3.2. Somatinės ląstelės ............................................................................................................................... 13 2.3.3. Inhibitoriai .......................................................................................................................................... 13

2.3.3.1. Inhibitorių grupės ................................................................................................................... 14 2.3.3.2. Pieno sudėtyje esančios antimikrobinės medžiagos ............................................................... 17 2.3.3.3. Inhibitorių patekimo į pieną priežastys................................................................................... 19 2.3.3.4. Inhibitorių nutatymo metodai ................................................................................................. 21 2.3.3.5. Inhibitorių poveikis ................................................................................................................ 23 2.3.3.6. Inhibitorių priklausomybė nuo somatinių ląstelių skaičiaus piene ......................................... 23

3. Tyrimų objektai ir metodai ................................................................................................................................ 24 3.1. Somatinių ląstelių skaičiaus ir inhibitorių nustatymo metodai .................................................................. 24

3.1.1. Mėginių ėmimas tyrimams ................................................................................................................. 25 3.1.2. Tyrimo metodai ................................................................................................................................... 25 3.1.3. Duomenų statistinis apdorojimas ........................................................................................................ 27

3.2. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų bei inhibitorių testų atrinkimas ir analizė ........................................ 28 4. Tyrimų rezultatai ............................................................................................................................................... 30

4.1. Somatinių ląstelių skaičiaus ir inhibitorių piene priklausomybė (2011 m. rezultatai) ............................... 30 4.2. Somatinių ląstelių skaičiaus ir inhibitorių piene priklausomybė (2012 m. rezultatai) ............................... 33 4.3. Mastito sukėlėjų nustatymas ...................................................................................................................... 33 4.4. Mikrobiologinių metodų palyginamoji analizė .......................................................................................... 34 4.5. Inhibitorių nustatymo ir riebalų–baltymų santykio priklausomybė ........................................................... 35 4.6. Somatinių ląstelių skaičiaus įtaka inhibitorinių medžiagų nustatymui ...................................................... 37 4.7. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų poveikis inhibitorių testams ............................................................ 37

4.7.1. Pieno ūkiuose naudojamų plovimo ir dezinfekavimo medžiagų cheminė sudėtis .............................. 37 4.7.2. Pieno ūkiuose naudojamų plovimo ir dezinfekavimo medžiagų įtaka inhibitorių nustatymo žaliame

piene rezultatams .......................................................................................................................................... 40 4.8. Informacinio leidinio apie inhibitorius piene rengimas ............................................................................. 46 4.9. Projekto rezultatų sklaida ........................................................................................................................... 47

5. Išvados ir rekomendacijos ................................................................................................................................. 48 5.1. Išvados ....................................................................................................................................................... 48 5.2. Rekomendacijos ......................................................................................................................................... 50

5.2.1. Rekomendacijos kaip elgtis gaminant žaliavinį pieną, aptikus inhibitorines medžiagas, ir kaip

išvengti jų patekimo į pieną .......................................................................................................................... 50 5.2.2. Rekomendacijos dėl plovimo ir dezinfekavimo medžiagų naudojimo pieno gamybos ūkiuose ........ 51

6. Literatūra ........................................................................................................................................................... 52 1 PRIEDAS ........................................................................................................................................................... 57 2 PRIEDAS ........................................................................................................................................................... 58 3 PRIEDAS ........................................................................................................................................................... 59

4

1. Įvadas

Inhibitoriai – įvairios biologinės ar cheminės prigimties medžiagos, slopinančios

mikroorganizmų augimą (antibiotikai, formalinas, vandenilio peroksidas, plovimo, dezinfekavimo,

konservavimo medžiagos ir kt.).

Inhibitoriai gali patekti į pieną iš gyvulio organizmo ir iš išorės. Piene visuomet esti

natūralių antimikrobinių medžiagų, nuo kurių priklauso pieno baktericidinė fazė. Tai lizocimas,

leukocitai, lakteninai, laktoferinas, imunoglobulinai bei medžiagos, sudarančios laktoperoksidazinę

sistemą (laktoperoksidazė, tiocianatas, vandenilio peroksidas). Jos nėra kenksmingos nei žmonių

sveikatai, nei technologiniu požiūriu. Tačiau į pieną gali patekti ir nenatūralių antimikrobinių

medžiagų, kurios yra dvejopos prigimties – mikrobinės ir cheminės. Didžiausius leistinus

farmakologiškai aktyvių medžiagų likučių kiekius (DLK) gyvūniniuose maisto produktuose nustato

Europos Parlamento ir Tarybos Reglamentas (EB) Nr. 470/2009, pakeitęs prieš tai galiojusį EEB

Reglamentą 2377/90.

Mikrobinės kilmės medžiagos – antibiotikai – gali būti naudojamos sergančioms mastitu ir

kitomis ligomis karvėms gydyti. Antibiotikų išsiskyrimo su pienu trukmė priklauso nuo antibiotikų

rūšies, jų patekimo į gyvulio organizmą būdo (oralinio, injekcijos į tešmenį, į raumenis), gyvulio

fiziologinės būklės, produktyvumo, laktacijos periodo. Nors pastaruoju metu veterinarinėje

praktikoje pradėta vartoti daug naujų antibiotikų, turinčių cefalosporinų, daugelis veterinarinių

vaistų, vartotų 1950-1960 m., vis dar populiarūs ir šiandien. Tai β-laktamai, sulfa vaistai,

tetraciklinai, aminoglikozidai, chloramfenikolis, makrolidai ir kt. Didžiausią dalį piene randamų

inhibitorių sudaro β-laktamai (penicilino grupės antibiotikai). Todėl daugelis metodų, skirtų

inhibitoriams piene nustatyti, yra pritaikyti penicilino grupės antibiotikams.

Iš cheminės kilmės medžiagų į pieną gali patekti formalinas, vandenilio peroksidas,

plovimo, dezinfekavimo ir konservavimo medžiagos. Pavyzdžiui, vandenilio peroksidas gali būti

panaudotas pienui konservuoti, plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių gali likti nepakankamai

išplautuose melžimo aparatuose, pieno surinkimo linijose bei pieno talpyklose.

Inhibitoriai piene nepageidaujami dėl dviejų priežasčių: pirma, jie yra kenksmingi žmonių

sveikatai. Vartojant tokį pieną, pakinta virškinamojo trakto normalios mikrofloros sudėtis, atsiranda

antibiotikams atsparių bakterijų, kurių neveikia gydymui skiriami preparatai, gali pasireikšti

alergijos. Antra, inhibitoriai stabdo pieno rūgšties bakterijų augimą, todėl gaminant raugintus pieno

produktus bei fermentinius sūrius yra iškreipiama mikrobiologinių ir biocheminių procesų eiga.

Pieno pramonėje dažniausiai taikomi mikrobiologiniai antibiotikų ir inhibitorių nustatymo

metodai, kurių esmę sudaro kai kurių pieno rūgšties ar aerobinių sporinių bakterijų metabolizmo

5

reakcijų slopinimas. Tada stabdomas bakterijų (tikslinių kultūrų) augimas, sulėtėja ar sustoja

rūgšties gamyba ir kartu pakinta dažų, pridėtų į terpę, spalva. Pastaraisiais dešimtmečiais

mikrobiologinių metodų, skirtų inhibitoriams nustatyti, reikalavimai smarkiai pasikeitė: anksčiau

buvo reikalaujama surasti užterštą pieną, kuris gali sukelti sunkumų fermentacijos procesuose

(„technologinis saugumas“), dabar dėl didelio dėmesio toksinėms ir alerginėms ligoms,

susijusiomis su antimikrobinėmis medžiagomis, neleidžiama naudoti žmonių maistui pieno,

kuriame aptikta inhibitorių daugiau kaip nustatyti didžiausi leistini kiekiai (angl. „Maximum

Residue Limits“ – MRL) („toksikologinio saugumo“ ribos).

Mikrobiologiniai metodai turi svarbią reikšmę kaip pieno rūšiavimo metodai, kadangi jais

galima aptikti daugelio antimikrobinių medžiagų likučių, ir metodų jautrumas atitinka ES

reikalavimus. Kaip patvirtinimo metodai, paprastai naudojami chromatografiniai metodai, kuriais

galima identifikuoti antimikrobinių medžiagų likučius. Spartieji (fermentiniai bei imuninio arba

receptorių tyrimo) metodai paprastai skirti vienam arba dviems antibiotikams ar jų grupei nustatyti.

Inhibitorių tyrimų rezultatams gali turėti įtakos įvairūs biologiniai veiksniai (gyvulių

fiziologinė būklė, jų infekcinės ir neinfekcinės ligos) bei cheminiai veiksniai (plovimo,

dezinfekavimo bei konservavimo medžiagų likučiai piene). Mėginių su inhibitoriais skaičius karvių

piene gali būti susijęs su kitais pieno kokybiniais rodikliais. Tiriant pieno mėginius, kai nustatomas

padidėjęs somatinių ląstelių skaičius (SLS), galima įtarti, kad karvė sirgo. Karvėms sergant, kinta

pieno cheminė sudėtis. Somatinių ląstelių padaugėja apsiveršiavusių karvių ir užtrūksiančių bei

tešmens ligomis sergančių karvių piene. Pastaruoju metu Lietuvos mokslininkai kelia hipotezę, kad,

padidėjus somatinių ląstelių skaičiui piene, jame galima aptikti inhibitorių dėl organizme vykstančių

fiziologinių procesų pokyčių.

Projekto tikslas – įvertinti biologinių ir cheminių veiksnių įtaką inhibitorių piene

nustatymui, parengti informacinį leidinį apie inhibitorius karvių piene, skirtą plačiam specialistų –

žemės ūkio, veterinarijos ir pieno pramonės – ratui.

2011 m. uždaviniai:

1. Ištirti sveikų Lietuvos juodmargių karvių pieno mėginiuose somatinių ląstelių skaičių bei

inhibitorių medžiagų kiekį;

2. Įvertinti inhibitorių kiekio priklausomybę nuo somatinių ląstelių skaičiaus piene, atlikti

gautų duomenų statistinę analizę;

3. Parengti rekomendacijas kaip elgtis, aptikus inhibitorines medžiagas žaliame piene;

4. Surinkti informaciją apie plovimo ir dezinfekavimo medžiagas, naudojamas melžimo

įrenginių, pieno indų plovimui ir dezinfekcijai, bei išanalizuoti jų cheminę sudėtį;

6

5. Ištirti inhibitorių nustatymo metodų – pamatinio ir Lietuvoje plačiausiai vartojamų

sparčiųjų testų – jautrumo ribas plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučiams piene nustatyti;

6. Parengti rekomendacijas dėl plovimo ir dezinfekavimo medžiagų naudojimo pieno

gamybos ūkiuose;

7. Parengti informacinio leidinio apie inhibitorius piene projektą, įtraukiant 2011 m. tyrimo

duomenis apie plovimo ir dezinfekavimo medžiagų įtaką inhibitorių testams.

2012 m. uždaviniai:

1. Ištirti sergančių Lietuvos juodmargių karvių pieno mėginiuose somatinių ląstelių

skaičių bei inhibitorių medžiagų kiekį ir dažniausiai pasitaikančius mastito sukėlėjus;

2. Atlikti inhibitorinių medžiagų nustatymui Lietuvoje atsiskaitymo tikslams patvirtintų

mikrobiologinių testų palyginamąją analizę;

3. Įvertinti riebalų ir baltymų santykio įtaką inhibitorinių medžiagų tyrimų rezultatams,

atlikti gautų duomenų statistinę analizę;

4. Įvertinti inhibitorių kiekio priklausomybę nuo somatinių ląstelių skaičiaus piene,

atlikti gautų duomenų statistinę analizę;

5. Parengti atnaujintas rekomendacijas kaip elgtis nustačius inhibitorines medžiagas

žaliame piene.

6. Parengti informacinio leidinio apie inhibitorius pirmąją redakciją.

7. Pateikti informacinio leidinio apie inhibitorius pirmąją redakciją suinteresuotoms

įstaigoms pastaboms ir pasiūlymams;

8. Įvertinti suinteresuotų įstaigų pastabas ir pasiūlymus ir parengti informacinio leidinio

apie inhibitorius galutinę redakciją, paruošti leidinį spaudai.

7

2. Literatūros apžvalga

2.1. Pieno kokybė

Pieno kokybė – tai jo normalios cheminės sudėties ir būdingų savybių visumos rodiklis

(Skimundris, 1993; Gudonis, 2002). Pieno sudėtį lemia riebalų, baltymų, laktozės kiekis piene, o

pieno kokybę rodo somatinių ląstelių ir bendras bakterijų skaičius. Pienas yra vienas vertingiausių ir

plačiai vartojamų maisto produktų, todėl gerinti pieno kokybę yra pagrindinis uždavinys tiek pieno

gamintojams, tiek jo perdirbėjams. Lietuva, tapusi Europos Sąjungos nare, privalo gaminti

konkurencingus ir saugius vartoti žmonėms pieno produktus.

Nuo 2004 m. gegužės 1 d. superkamo pieno kokybei taikomi reikalavimai nustatyti 2004 m.

balandžio 29 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentu (EB) Nr. 853/2004, nustatančiu

konkrečius gyvūninės kilmės maisto produktų higienos reikalavimus (bendras bakterinis

užterštumas turi neviršyti 100 tūkst./ml, somatinių ląstelių skaičius turi neviršyti 400 tūkst./ml,

inhibitorinių medžiagų neturi būti, o pieno užšalimo temperatūra turi būti ne aukštesnė kaip minus

0,515 °C). Iš pieno gamintojų superkamo pieno sudėtis ir kokybė vertinama, vadovaujantis Pieno

supirkimo taisyklėmis (Žin., 2001, Nr. 40-1406; 2009, Nr. 149-6669).

2.2. Fiziologiniai veiksniai, turintys įtakos žaliavinio pieno kokybei

Cheminė pieno sudėtis ir savybės priklauso nuo fiziologinių (biologinių) veiksnių, kurių

svarbiausieji yra: laktacijos periodas, gyvulio amžius, veislė bei fiziologinė jo būklė –-

sveikatingumas.

2.2.1. Laktacijos periodas

Pieno sudėties ir jo savybių kitimo atžvilgiu laktacijos periodą (vidutiniškai 305 d.) galima

suskirstyti į tris tarpsnius: a) krekenų išsiskyrimo (7 d. po apsiveršiavimo); b) normalaus pieno

išsiskyrimo (275 – 285 d.); c) užtrūksiančios karvės pieno išsiskyrimo (7 d. prieš užtrūkimą).

Kiek didesnis somatinių ląstelių skaičius sveikų karvių piene yra tuoj po apsiveršiavimo, bet

mažėja, mažėjant krekenų kiekiui. Normalu, kad SLS didėja laktacijos pabaigoje ir pirmąsias 5 – 6

dienas po apsiveršiavimo. Krekenų laikotarpiu pirmąsias 2 dienas SLS būna iki 2,5 mln./ml, iš

kurių 1 mln./ml leukocitų. 4-5 parą po apsiveršiavimo somatinių ląstelių būna mažiau negu 200

tūkst./ml. Antrą savaitę sveikų karvių piene somatinių ląstelių būna mažiau negu 100 tūkst./ml.

8

Sumažėjus karvės produktyvumui iki 4 kilogramų per parą, SLS šiek tiek padidėja. Slaptu mastitu

sergančių karvių SLS krekenose mažėja lėčiau negu sveikų karvių, o per laktaciją SLS sparčiai

didėja (Dunham ir kt.; 1985; Schulz ir kt.; 1990).

2.2.2. Gyvulio amžius

Manoma, kad vidutinio amžiaus galvijai (šešių laktacijų) duoda geriausios cheminės

sudėties ir technologinių savybių pieną lyginant su jaunesnių (dviejų laktacijų) ir senų galvijų

(dešimties laktacijų) pienu (Skimundris, 1993; Stankūnienė ir kt., 2008). Po ketvirtos-šeštos

laktacijos dažniausia mažėja kazeino, laktozės, sumažėja bendrasis rūgštingumas, truputėlį

pablogėja technologinės savybės, padidėja somatinių ląstelių skaičius (Dukštas ir kt., 1994).

2.2.3. Karvių veislė

Tos pačios veislės galvijų pieno sudėtis ir savybės gali skirtis, esant vienodoms šėrimo ir

laikymo sąlygoms. Tai priklauso nuo organizmo individualių savybių. Karvių bandų selekcijos

sėkmę lemia intensyvus bulių gerintojų panaudojimas. Parinkus bulių, gebantį pagerinti būsimo

prieauglio kūno tvirtumą, galūnes ir tešmens savybes, prailginamas produktyvusis karvės amžius.

Galvijų veislininkystėje moksliniais tyrimais nustatyta, kad karvės tešmens rezistentiškumo

procentas yra paveldimas iš tėvinės pusės (Gaidžiūnienė ir kt., 2007).

Įvairios šalys vykdo galvijų selekciją ne tik produktyvumo ar eksterjero gerinimo, bet ir

sveikatingumo kryptimi. O vienu iš galvijų sveikatingumo rodiklių ir yra SLS indeksas. Jis nusako

prognozuojamą galvijų somatinių ląstelių skaičių piene bei jų atsparumą mastitams

(http://www.litgenas.lt/page.php?sk=8&id=1. [2011 m. rugsėjo 26d.]). Lietuvoje atliktų tyrimų

duomenimis, didžiausias SLS nustatytas didžiausio produktyvumo Švedijos, Vokietijos bei

Holšteinų juodmargių veislių karvių piene. Geriausia pieno kokybe pagal somatinių ląstelių skaičių

išsiskyrė prie vietinių sąlygų prisitaikiusios ir seniausiai į Lietuvą atvežtos Olandijos, Danijos ir

Anglijos juodmargės bei Lietuvos juodmargių veislės karvės (Juozaitienė ir kt., 2004; Žakas, 2002).

2.2.4. Fiziologinė gyvulio būklė

Pienas – labai sudėtinga biologinė sistema, o jo sudedamosios dalys nėra stabilios ir

priklauso nuo daugelio veiksnių, taip pat ir nuo karvės sveikatingumo (Sloth ir kt., 2003).

Susirgimai po veršiavimosi daro įtaką pieno rodikliams: padidėja SLS, pakinta riebalų ir baltymų

bei riebalų ir laktozės santykis (Klimienė ir kt., 2011). Sergančių karvių piene dažniausiai sumažėja

9

kazeino, riebalų, laktozės, dėl to pablogėja pieno maistinė, energetinė vertė bei technologinės

savybės. Sergančių galvijų pieno pokyčiai priklauso nuo ligos formos ir eigos. Svarbus uždegiminių

procesų karvių organizme arba pieno liaukoje rodiklis yra somatinių ląstelių skaičius (Skimundris,

1993). Sveikų karvių piene jų būna nedaug – 10-200 tūkst./ml. Atsižvelgiant į įvairių veiksnių

(šėrimo, laktacijos periodo, sveikatos būklės, amžiaus, veislės, metų laiko) įtaką karvės organizmui,

sveikų karvių piene leidžiamas somatinių ląstelių skaičius – iki 400 tūkst./ml. Karvei susirgus

tešmens uždegimu bei kitomis ligomis, somatinių ląstelių padaugėja net iki kelių dešimčių milijonų.

Laktacijos pabaigoje arba tuoj po apsiveršiavimo jų taip pat būna daugiau 1-6 mln/ml.

Pagrindinė priežastis, susijusi su sveikatos būkle, nuo kurios priklauso somatinių ląstelių

skaičius piene, yra mastitas (pieno liaukos uždegimas). Mastitus sukelia bakterijos ir kiti

patogeniniai mikroorganizmai, patekę per spenių kanalus į pieno liauką. Lietuvoje, remiantis VĮ

“Pieno tyrimai” duomenimis, kontroliuojamų karvių pieno somatinių ląstelių skaičiaus tyrimų

duomenys rodo, kad 30 % tirtų karvių serga slaptuoju mastitu.

Somatinių ląstelių skaičiaus padidėjimo priežastimi gali būti ir stresas (Japertas, 1999).

Stresas – organizmo fiziologinė ir psichinė įtampa, atsirandanti dėl įvairių dirgiklių: mechaninių

(melžimo taisyklių, dienotvarkės nesilaikymas, tešmens plovimas šaltu vandeniu, girdymas šaltu

vandeniu, triukšmas ir kiti), fizinių (netinkama temperatūra ir oro drėgnis patalpose), cheminių

(padidėjusi kenksmingų dujų koncentracija gyvulių laikymo patalpose ir kiti), grubaus elgesio

(Rushen ir kt.; 1999). Dėl nuolatinių stresų silpsta karvių, ypač produktyviųjų, organizmo

atsparumas, tešmens apsauginės funkcijos ir pieno baktericidinės savybės, susidaro palankios

sąlygos mikroorganizmams patekti į pieno liauką ir ten vystytis. Kaip atsakas į padidėjusį bakterijų

ir jų apykaitos produktų kiekį, piene padidėja somatinių ląstelių skaičius, sumažėja karvių

produktyvumas (Japertas, 1998).

2.2.4.1. Pieno liaukos uždegimas ir jį sukeliantys mikroorganizmai

Pagrindinė priežastis, susijusi su sveikatos būkle, nuo kurios priklauso somatinių ląstelių

skaičius piene, yra pieno liaukos uždegimas – mastitas. Uždegiminė reakcija tešmenyje lemia pieno

kiekybinius ir kokybinius pokyčius. Uždegimo metu padidėja kraujagyslių pralaidumas, dėl to

kraujo baltymai, kitos sudėtinės dalys ir uždegiminės ląstelės iš kraujo patenka į pieną. Dėl ligos

pieną gaminančios tešmens epitelio ląstelės tampa mažiau produktyvios, dėl to sumažėja ir

primilžis. Ląstelėms suirus, į pieną patenka jų fermentai, dėl kurių veiklos pagaminami

nepageidaujamo skonio ir kvapo produktai, kurie labai greitai genda. Stiprėjant uždegimui, cheminė

pieno sudėtis panašėja į kraujo, nes sudėtinės dalys iš kraujo apytakos filtruojamos į pieno liauką.

Pagrindinių sudedamųjų dalių kiekis pieno sausosiose medžiagose sumažėja 5–15 proc. Labai

10

pasikeičia riebalų sudėtis, padaugėja didelės molekulinės masės nesočiųjų riebalų rūgščių. Šie

pokyčiai skatina lipolizę (riebalų skaidymą), dėl to suprastėja pieno produktų kokybė. Uždegimo

paveiktame piene net 11–25 proc. mažiau bendrojo kazeino, o išrūginių baltymų daugiau negu

įprasta. Be to, mastito paveiktame piene suaktyvėja baltymus skaidančių fermentų veikla: baltymai

skaidomi ne tik pačiame tešmenyje, pamelžtame piene, bet ir iš jo pagamintuose produktuose.

Karvei susirgus mastitu, piene pasikeičia mineralų ir mikroelementų kiekis. Tai lemia pieno

perdirbimo savybes ir maistinę vertę.

Mastitus sukelia bakterijos ir kiti patogeniniai mikroorganizmai, patekę per spenių

kanalus į pieno liauką. Aplinkoje esančius mikroorganizmus apibūdina jų rūšis, kiekis,

virulentiškumas ir kt. Iš sergančių mastitu karvių pieno išskirta apie 150 įvairių mikroorganizmų.

Mastitą sukeliantys mikroorganizmai skirstomi į kontaginius (užkrečiamuosius) ir aplinkos

(oportunistus). Kontaginiai mikroorganizmai: auksinis stafilokokas (Staphylococcus aureus),

agalaktinis streptokokas (Streptococcus agalactiae), dysgalaktinis streptokokas (Streptococcus

dysgalactiae) ir mikoplazmos, perduodamos nuo karvės karvei per užkrėstas pašluostes, melžėjų

rankas, melžimo aparatus, stovėjimo vietose numelžtas pirmąsias čiurkšles ir per švirkštus.

Pagrindinis kontaginių mikroorganizmų šaltinis – užkrėstas tešmuo. Šių sukėlėjų sukeltas mastitas

dažniausiai yra lėtinis ir slaptasis, bet su periodiniais klinikiniais epizodais.

79 proc. atvejų mastitą sukelia Staphylococcus ir Streptococcus genčių bakterijos

(Keefe, 1997; Wilson, 2004).

Mastitu sergančios karvės gydomos antimikrobiniais preparatais, švirkščiamais į tešmenį

arba į raumenis. Kai mastitą sukelia streptokokai, gydymui dažniausiai naudojami siauro veikimo

spektro antibiotikai – natūralūs ir pusiau sintetiniai penicilinai, eritromicinas, linkomicinas. Be jų,

ypač esant mišriai infekcijai, taikomi ir plataus veikimo spektro antibiotikai – tetraciklinai,

gentamicinas, ampicilinas ar cefalosporinai (Deluyker ir kt., 2005).

Virulentiškiausias yra auksinis stafilokokas, kurio vos dešimties bakterijų pakanka, kad

patekus į tešmenį, karvė jau gali susirgti tešmens uždegimu. Sukėlėjas greitai įsiskverbia į tešmens

audinius, ir po šešių valandų jis jau randamas tešmens parenchimoje. Patekę į parenchimą

nepalankiomis sąlygomis, sukėlėjai sudaro mikropūlinukus. Nusilpus organizmui, iš šių

inkapsuliuotų pūlinukų bakterijos vėl patenka į alveoles, ir uždegimas atsinaujina. Šis sukėlėjas gali

formuoti neturinčius sienelių darinius (bakterijų L formas). Todėl auksiniai stafilokokai gali būti

atsparūs antibiotikams, kurie veikia būtent ląstelės sienelę (ß-laktamai ar penicilinai,

aminoglikozidai ir kt.). Be to, kai kurie stafilokokai gamina ir išskiria medžiagas (fermentus),

kurios trukdo antibiotikams juos sunaikinti.

11

Prie aplinkos mikroorganizmų priskiriamos Escherichia coli, tešmens streptokokai

(Streptococcus uberis), Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter genčių bakterijos. Jų šaltinis yra

aplinka, kurioje laikomos karvės (pavyzdžiui, gulėjimo vieta, mėšlas, dirvožemis). Šiais patogenais

karvė gali iš naujo užsikrėsti melžiant, bet dažniausiai užsikrečia tarp melžimų. Pavienius

susirgimus gali sukelti pseudomonos ir kiti retai pasitaikantys mikroorganizmai. Aplinkos

mikroorganizmai sukelia tešmens uždegimą, kai jų labai padaugėja karvės aplinkoje arba kai karvė

dėl minėtų priežasčių nusilpsta.

Apibendrinant karvių mastito priežastis, galima daryti išvadą, jog uždegimui pasireikšti

būtina, kad sąveikautų visi infekcinės grandinės elementai: karvė, jos aplinka ir patogeniniai

mikroorganizmai. Todėl kai kurie autoriai karvių mastitą aprašo kaip infekcinę ligą.

2.2.4.2. Neinfekcinės ligos, turinčios įtakos pieno kokybei

Didelėse bandose sunkiai išvengiama medžiagų apykaitos sutrikimų, kurie daugeliu

atvejų gali tapti kitų ligų priežastimi. Vienas iš paprastesnių būdų, nustatant šias ligas arba bent

įvertinant polinkį jomis sirgti, yra pieno sudėties tyrimai, kurie atliekami kiekvieną mėnesį, jeigu

bandoje yra vykdoma gyvulių produktyvumo kontrolė. Šiuo požiūriu labai svarbus ir informatyvus

yra pieno riebalų ir baltymų santykis (riebalų proc.:baltymų proc.). Jeigu šis santykis yra nuo 1 iki

1,5, tai didesnė tikimybė, kad karvės neserga pagrindinėmis medžiagų apykaitos ligomis, kurios

ypač dažnos po apsiveršiavimo. Jeigu gautas santykis yra mažesnis už 1, tai galima įtarti, kad

karvės serga acidoze. Jeigu gautas pieno riebalų ir baltymų santykis yra 1,5 ar didesnis, galima

įtarti, kad karvės serga ketoze. Tai dažniausia pieningų ir gerai įmitusių karvių medžiagų apykaitos

liga, kuria jos suserga, praėjus nuo 10 dienų iki 6 savaičių po veršiavimosi. Pagrindinė šios ligos

priežastis yra energijos trūkumas racione, kai karvės šeriamos nesubalansuotais, iš blogos kokybės

pašarų sudarytais racionais.

Didžiojo prieskrandžio subklinikinė acidozė yra dažna pieninių karvių liga (Cook ir kt.,

2004). Acidozės pavojų gali didinti, jei karvės šeriamos daug energijos turinčiais kombinuotais

pašarais. Juose esantys lengvai virškinami angliavandeniai skaidomi labai greitai, ir

prieskrandžiuose gali susikaupti daug tarpinių apykaitos produktų, sukeliančių įvairius organizmo

medžiagų apykaitos sutrikimus – acidozę ir kt. (Želvytė, 2000).

Sergant subklinikine ketoze, keičiasi ir pieno sudėtis (Mandebvu ir kt., 2003). Nustatyta

statistiškai patikima koreliacija tarp β-hidroksibutiratų koncentracijos kraujo serume ir pieno

riebumo bei baltymingumo (Duffield, 1997).Vienas iš pagrindinių subklinikinės ketozės požymių –

12

sumažėjęs produktyvumas. Jei subklinikinė ketozė stiprėja, didesnė rizika karvėms sirgti mastitais,

endometritais (Hardeng, 2001).

2.3. Pagrindiniai kriterijai vertinant šviežio pieno kokybę

Siekiant išsaugoti natūralias pieno savybes ir pagaminti kokybiškus produktus, didžiausias

dėmesys turi būti skiriamas šviežio pieno kokybei. Kaip minėjome anksčiau, pieno kokybę lemia

bakterijų ir somatinių ląstelių skaičius piene. Jei piene randamas didelis kiekis vandens arba

nustatomas inhibitorių buvimas piene, toks pienas laikomas netinkamu supirkimui.

2.3.1. Bendras bakterinis užterštumas

Bendras bakterijų skaičius rodo, kiek pienas yra užterštas bakterijomis. Bakterijų piene

visiškai išvengti neįmanoma, tačiau galima sumažinti jų skaičių. Palankiausia temperatūra

bakterijoms daugintis yra 20 – 40 °C. Yra ir tokių, kurios veisiasi užšalimo, o kitos – net 50 – 60 °C

temperatūroje. Kai sąlygos netinkamos, bakterijos apmiršta ir nesidaugina (krentant temperatūrai,

lėtėja jų dauginimasis). Tai viena iš priežasčių, dėl kurios pamelžtą pieną reikia greitai atšaldyti.

Pieno gamintojai turi rūpintis, kad į pieną nepatektų bakterijų, be to, greitai atšaldyti iki mažos

temperatūros (jei įmanoma, net iki 0-4 °C) (Japertas, 2000; Japertas ir kt., 2004). Užsienyje

ūkininkai pasiekia, kad karvių piene bakterijų būtų nuo 5 iki 10 tūkst./ml (Shearer ir kt.; 1992). Jei

tik šis skaičius padidėja, jie ima ieškoti priežasčių. Lietuvos ūkininkams kol kas sunkiau sekasi

pasiekti tokius rezultatus.

Pienas mikroorganizmais labiausiai užteršiamas, kai melžiant, košiant, laikant ir pristatant į

pieno supirkimo punktą nesilaikoma higienos reikalavimų. Daug mikroorganizmų patenka nuo

karvių odos ir plaukų, todėl būtina karves dažnai valyti, o tvartus kreikti sausu ir nesupelijusiu

kraiku (Riaukienė, 1999). Spenio kanale mikrofloros kiekis ir rūšinė sudėtis labai skiriasi. Ligų

sukėlėjai yra mikrokokai, korinebakterijos, streptokokai, stafilokokai, bacilos, enterobakterijos ir

pseudomonai. Mechanizuotai melžiant, pienas ištisai kontaktuoja su spenio oda, ir bakterijos

patenka į pieną. Pirminis užterštumas yra 10 tūkst. bakterijų 1 ml pieno. Tvartiniu laikotarpiu į

pieną tiesiog iš karvių patenka 5–10 kartų daugiau bakterijų nei per ganiavą. Spenių dezinfekcija po

melžimo gerokai sumažina streptokokų ir stafilokokų kiekį. Karvių, kurių piene daug somatinių

ląstelių (sergančių tešmens uždegimu), randamas ir didelis bendras bakterinis užterštumas. Be to,

tokių karvių piene yra ir bakterijų pagamintų toksinų. Auksiniai stafilokokai, patekę į pieno liauką

gamina karščiui atsparius enterotoksinus. Jie patenka į pieną, o perdirbant – į pieno produktus.

Valgant tokius pieno produktus, galima apsinuodyti (Japertas, 2002).

13

2.3.2. Somatinės ląstelės

Iš somatinių ląstelių skaičiaus piene sprendžiama ne tik apie tešmens sveikatingumą, bet ir

apie pieno kokybę. Nustatyta, kad padidėjus SLS piene, sumažėja riebalų, laktozės, kalcio, vitaminų

(ypač vitamino C), kazeino, pagausėja natrio, chloro, albuminų ir globulinų. Padidėja tokio pieno

pH (net iki 6,9 ir daugiau) oksidacinis aktyvumas (Hurley, 2003). Pagal ES reikalavimus žaliame

piene somatinių ląstelių skaičius negali viršyti 400 tūkst./ml. Kuo daugiau somatinių ląstelių piene,

tuo jis žemesnės kokybės ir menkesnės vertės.

Somatinės ląstelės – tai pieno liaukos epitelinės ląstelės ir leukocitai. Kai tešmuo sveikas,

apie 60 proc. somatinių ląstelių piene sudaro epitelinės ląstelės, o kai karvė serga tešmens

uždegimu, apie 75 proc. ląstelių sudaro leukocitai. Somatinių ląstelių skaičius priklauso nuo

sveikatos būklės, laktacijos periodo, gyvulio amžiaus, veislės, metų laiko, šėrimo, laikymo sąlygų.

Natūraliai jų visada padaugėja prieš karvėms užtrūkstant, pradėjus jas melžti vieną kartą per dieną,

taip pat pirmomis dienomis po veršiavimosi (Staniškienė ir kt., 2007). Didėjančiam somatinių

ląstelių skaičiui laktacijos metu turi įtakos melžimo reikalavimų nesilaikymas, netinkamas tešmens

paruošimas ir spenių antiseptikos taisyklių pažeidimas. Somatinių ląstelių skaičius piene parodo

atsparumą mastitams, kintančias karvių imunines savybes (Žakas, 2002; Pečiulionienė ir kt., 2004;

Šimkienė ir kt., 2007). Po traumų, veikiant cheminėms medžiagoms arba infekcinių ligų

sukėlėjams, somatinių ląstelių skaičius piene itin padidėja. Fiziologinis somatinių ląstelių skaičiaus

padidėjimas vyksta visuose tešmens ketvirčiuose vienodai, o sergant mastitu – dažniausiai viename

ar keliuose tešmens ketvirčiuose. Kadangi SLS kinta kas dieną, labai svarbu atlikti keletą pieno

tyrimų, o ne remiantis tik vienu testo rezultatu (Vaitlokas, 2005). Didesnis kaip 200 tūkst./ml

somatinių ląstelių skaičius – pagrindinis indikatorius, rodantis, kad karvė jau serga slaptuoju

mastitu. Nuo 1999 m. Lietuvoje įdiegus sistemą, pagal kurią už pieną atsiskaitoma pagal VĮ „Pieno

tyrimai“ analizių rezultatus, iš bandų buvo eliminuotos karvės, kurių piene buvo didelis somatinių

ląstelių skaičius ir kurio mažinimas buvo ekonomiškai nerentabilus. Tačiau ir vėlesniais metais

kontroliuojamų karvių bandų piene somatinių ląstelių išliko daug (Klimienė ir kt., 2005;

Rudejevienė, 2007).

2.3.3. Inhibitoriai

Inhibitorių likučių kontrolė turi apsaugoti vartotojus nuo kenksmingo šių medžiagų

poveikio. Lietuvai integruojantis į ES ir pasaulio rinką, būtina gerinti produktų kokybę, o tuo pačiu

– griežtinti reikalavimus žaliavai. Lietuvoje didžiausi leistini veterinarinės medicinos preparatų

14

likučių kiekiai gyvūniniuose maisto produktuose reglamentuojami [Europos Parlamento ir Tarybos

Reglamentas (EB) Nr. 470/2009].

2.3.3.1. Inhibitorių grupės

Inhibitoriais laikomos medžiagos, slopinančios mikroorganizmų augimą. Jos esti dvejopos

kilmės: mikrobinės – antibiotikai; cheminės – veterinariniai preparatai (pvz., sulfa vaistai),

plovikliai, dezinfekavimo medžiagos, konservuojančios medžiagos (formalinas, vandenilio

peroksidas) ir kt. Literatūros šaltiniuose šios medžiagos vadinamos įvairiai – antimikrobinėmis,

antibakterinėmis, inhibitoriais. Antibiotikai sudaro tik dalį šių medžiagų. Antibiotikai –

mikroorganizmų gaminamos specifinės organinės medžiagos, kurių maži kiekiai slopina arba

naikina kitus mikroorganizmus, o inhibitoriai – slopina mikroorganizmų augimą.

Nustatyti inhibitorių buvimą piene yra labai svarbu, kadangi jie su pieno produktais patenka

į žmogaus organizmą, be to, iš pieno, turinčio inhibitorių, negalima pagaminti raugintų pieno

produktų (Krasauskaitė, 1991; Walstra ir kt.; 1999). Žmonėms, vartojantiems pieną su antibiotikų

priemaišomis, atsiranda alerginės reakcijos. Ilgesnį laiką vartojant tokį pieną, išsivysto

antibiotikams atsparios bakterijos (Kishida, 2007; Narkevičiūtė, 2008). Vaisto instrukcijoje

pateikiama išlauka (karencijos laikas) – laikotarpis paromis, kai dalis suleistų medikamentų

išsiskiria su pienu. Tokį pieną ar jo produktus draudžiamam vartoti maistui. Į gyvulio organizmą

antibiotikų gali patekti ir su pašarais, įvairiais premiksais. Falsifikacijos tikslais (norint sumažinti

bendrą bakterinį užterštumą) antibiotikų gali būti neleistinai pridedama į pamelžtą pieną. Pieno

pasterizavimas tik truputį prislopina antibiotikų aktyvumą, pvz., penicilino – tik 15-20 %, kitų

antibiotikų – dar mažiau. VĮ „Pieno tyrimų“ duomenimis dažniausiai nustatomos šios inhibitorinės

medžiagos: amoksicilinas, cefazolinas, cefchinomas, cefapirinas, klosaculinas, nafcilinas,

oksacilinas, penetamatas, penicilinas G ir kiti inhibitoriai.

Pieną gali užteršti daugybė cheminių medžiagų, kurios naudojamos karvėms gydyti,

melžimo sanitarijai, pieno perdirbimo įmonėse, dedamos į pašarus. Pesticidai – tai cheminės

medžiagos, kuriomis naikinami augalų kenkėjai, ligų sukėlėjai, piktžolės, ektoparazitai. Į pieną jų

gali pakliūti per užterštus pašarus arba per odą, apdorojus galvijus prieš įvairius ektoparazitus. Tam

tikslui dažnai naudojami fosforo organiniai junginiai, piretrinai, kurie yra toksiški ir gali būti

gyvulių ir žmonių apsinuodijimo priežastimi. Jais gali būti užteršti įvairūs gyvūniniai produktai

(pienas, sviestas ir kt.).

Labai svarbu taip pat įvertinti pašarų kokybę ir jų paskirtį pagal gyvūnų grupes. Karvės

neturi būti šeriamos kombinuotais pašarais ar premiksais su antibiotikų priedais, skirtais penimiems

gyvuliams šerti, taip pat neturi būti naudojami supeliję, mikotoksinais užteršti pašarai. Į pieną iš

15

aplinkos gali patekti kai kurių genčių grybų (Aspergillus, Mucor, Penicillium, Fusarium ir kt.).

Šiais grybais užkrėstuose pašaruose (šiene, šiauduose, žuvų miltuose ir kt.) pasigamina ir susikaupia

mikotoksinai. Galvijai gali apsinuodyti supelėjusiais pašarais ir dalis mikotoksinų gali išsiskirti su

pienu. Pavojingiausi iš mikotoksinų yra aflatoksinai – kancerogeninės medžiagos, kurias sintetina

Aspergillus ir kiti pelėsiniai grybai. Aflatoksinai ir jų metabolitai piene ir pieno produktuose

nustatomi chromatografijos metodu (Fink-Gremmels ir kt., 1999; Prandini ir kt., 2009).

Dažnai pieno taršos inhibitoriais priežastis būna netinkamas melžimo įrangos valymas, kai

plovimo ir dezinfekavimo medžiagos naudojamos nepaisant nurodytų koncentracijų, taip pat

plaunant įrangą nesilaikoma temperatūrinių režimų ar po dezinfekavimo blogai išplaunami

melžimo, pieno aušinimo ir kiti indai .

Kasdienis melžimo įrenginių ir inventoriaus valymas susideda iš dviejų pagrindinių

operacijų – plovimo ir dezinfekavimo. Šios operacijos atliekamos etapais: paviršiaus ir vidaus

nuplovimas vandeniu, plovimo priemonių naudojimas, šių priemonių išplovimas, dezinfekavimas

biocidais ir baigiamasis perplovimas vandeniu. Visais atvejais vanduo, skirtas melžimo įrenginių ir

pieno indų sanitariniam valymui, turi atitikti geriamojo vandens HN 24 reikalavimus. Po melžimo

įrenginys turi būti praplautas šiltu 30±5 °C vandeniu. Laiku neatlikus šios operacijos, išdžiūvusios

pieno liekanos ant melžimo įrenginio paviršiaus sudaro plėvelę, kuri apsunkina tolesnį valymą.

Tuomet dažniausiai naudojami didesni kiekiai plovimo medžiagų ir praskalaujama nedideliu kiekiu

vandens, dėl ko ant indų sienelių lieka plovimo priemonių. Kuo plovimo pradžioje aukštesnė tirpalo

temperatūra (70–90 °C), tuo geriau. Kai galutinė temperatūra yra ne žemesnė kaip 40 °C,

nešvarumai plaukioja plovimo tirpale. Tirpalo temperatūra, plaunant rankomis, turi būti 40–45 °C,

jai nukritus žemiau 40 °C, riebalai bei kiti nešvarumai vėl nusėda ant įrenginių sienelių. Jei kartu

naudojamos plovimo ir dezinfekavimo priemonės, plovimas turėtų trukti 8–10 min, jei naudojamos

tik dezinfekavimo priemonės – 5 min. Melžimo įrenginių sanitarinio apdorojimo metu labai svarbu

užtikrinti, kad į pieną nepatektų įvairių pašalinių medžiagų, todėl pieno linijas reikia plauti dideliu

vandens kiekiu (Sigurdson, 2011). Plovimo ir dezinfekavimo priemonių naudojimo efektyvumas

priklauso nuo šių veiksnių :

1) naudojamo vandens kokybės, nes vienas iš svarbiausių darbinių plovimo priemonių

tirpalų komponetų (90 %) yra vanduo, ir jo temperatūros;

2) koncentracijos ir plovimo proceso trukmės;

3) valomo paviršiaus būklės (lygus, šiurkštus, grublėtas, su duobutėmis) ir prigimties

(plastikas, guma, nerūdijantis plienas);

4) taikomo valymo metodo: rankinio, mechaninio (uždaros plovimo stotys), valymo putomis

ir valymo purškimo būdu (Reneau, 1997; Wirtanen ir kt., 2003; Sigurdson, 2011).

16

Vyraujančios medžiagos piene yra vanduo, riebalai, baltymai, angliavandeniai ir mineralinės

medžiagos. Žaliaviniame karvių piene vandens būna 85,8–89,5 %, pieno riebalai sudaro 2,5–6,0 %.

baltymai 2,9–3,85 %, angliavandeniai 3,6–5,5 % ir mineralinės medžiagos 0,6–0,9 %. Pieno

cheminė sudėtis lemia naudojamų pieno ūkiuose plovimo ir dezinfekavimo priemonių cheminę

sudėtį. Nuo melžimo įrangos paviršiaus pieno riebalai ir baltymai gali būti pašalinti šarminiais

plovikliais, mineralinės medžiagos – rūgštiniais plovikliais, o angliavandeniai, jų tarpe laktozė –

vandens pagalba. Sunkiausiai nuo įrangos paviršiaus pašalinami pieno baltymų likučiai. Baltymų

pašalinimui nuo plaunamo paviršiaus dažniausiai parenkami šarminiai plovikliai. Dažnai jų sudėtyje

yra oksidatoriai, tokie kaip natrio hipochloritas. Oksiduojantys agentai hidrolizuoja baltymus į

mažesnės molekulinės masės junginius, kurie lengviau ištirpsta vandenyje. Naudojami ir šarminiai

plovikliai su chloru, kurie efektyviai pašalina baltymus nuo plaunamo paviršiaus. Gali būti

naudojami ir šarminiai plovikliai su fermentais – proteazėmis. Tokie plovikliai naudojami

plaunamiems paviršiams, kurie jautrūs šarmų ar rūgščių poveikiui. Susidarius ant įrangos paviršiaus

„pieno akmeniui“, būtina po plovimo su šarminiais plovikliais plauti rūgštiniais plovikliais. Pieno

ūkių įrangos ir inventoriaus plovimui naudojami šarminiai ir rūgštiniai plovikliai.

Pagrindinės cheminės medžiagos, įeinančios į plovimo ir dezinfekavimo medžiagų sudėtį:

chloras, chloro junginiai, jodoforas, ketvirtiniai amonio junginiai, karboksilo rūgštis, peroksiacto

rūgšties junginiai. Dažnai plovimo priemonių sudėtyje yra paviršiaus aktyviosios medžiagos arba

drėkikliai, vandens minkštinimo priemonės, fermentai, oksidatoriai.

Plovimo dezinfekavimo medžiagos chloro pagrindu turi gerą ir platų antimikrobinio

aktyvumo veikimo spektrą ir yra nebrangios. Bet jos tampa paviršių korozijos priežastimi. Šių

priemonių negalima sumaišyti su rūgštimis, nes išsiskiria toksiškos chloro dujos.

Plovimo ir dezinfekavimo medžiagos su karboksilo rūgštimi pašalina mineralinių medžiagų

plėveles ir žudo mikroorganizmus. Jie turi gerą ir platų antimikrobinio aktyvumo veikimo spektrą,

tinkamos naudoti mechaniniam plovimui uždarose plovimo sistemose.

Plovimo ir dezinfekavimo medžiagos su jodoforu gaunamos, kuomet jodas sumaišomas su

paviršiaus aktyvia medžiaga. Jodas turi baktericidinių savybių rūgščioje aplinkoje, todėl preparate

visuomet yra ir mineralinių rūgščių. Jodoforas taip turi gerą plataus spektro antimikrobinį poveikį ir

naudojamas tešmens bei spenių higienai.

Plovimo ir dezinfekavimo medžiagos su peroksi junginiais gaunamos, kai vandenilio

peroksidas naudojamas kartu su trumpos grandinės organinėmis rūgštimis (pvz., acto rūgštimi).

Gauta peroksiacto rūgštis turi gerą ir platų antimikrobinio veikimo spektrą. Šie preparatai gerai

šalina mineralinių medžiagų plėveles ir naikina mikroorganizmus žemoje temperatūroje (Sigurdson,

2011).

17

Pieno kokybei gerinti, kartu ir mastito profilaktikai, svarbios tešmens ir spenių priežiūrai,

melžimo įrangai plauti ir dezinfekuoti skirtos plovimo ir dezinfekavimo medžiagos turi būti

nebrangios, baktericidiškos, greitai veikti, kuo mažiau dirginti odą, bet jos neturi patekti į pieną

(Špakauskas V. 2000; Mišeikienė ir kt., 2003). Šiuo metu Lietuvos rinkoje yra didelė pasiūla įvairių

plovimo ir dezinfekavimo priemonių, skirtų pieno ūkių melžimo įrangai, inventoriui, spenių ir

tešmens plovimui ir dezinfekavimui.

Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučiai gali slopinti bakterijų augimą (Mullan, 2003).

Konservuojančios medžiagos į pieną patenka rečiau. Iš neutralizuojančių medžiagų dažniausiai

pasitaiko šios: soda, amoniakas, vandenilio peroksidas. Jos dedamos į pieną, kad sumažėtų

rūgštingumas arba norint užmaskuoti pašalinio vandens buvimą. Pieno rūgštingumas padidėja dėl

per ilgo jo laikymo nesilaikant sanitarinių – higieninių reikalavimų (Gudonis, 2007).

Labai svarbu taip pat įvertinti pašarų kokybę ir jų paskirtį pagal gyvūnų grupes. Karvės

neturi būti šeriamos kombinuotais pašarais ar premiksais su antibiotikų priedais, skirtais penimiems

gyvuliams šerti, taip pat neturi būti naudojami supeliję, mikotoksinais užteršti pašarai. Į pieną iš

aplinkos gali patekti kai kurių genčių grybų (Aspergillus, Mucor, Penicillium, Fusarium ir kt.).

Šiais grybais užkrėstuose pašaruose (šiene, šiauduose, žuvų miltuose ir kt.) pasigamina ir susikaupia

mikotoksinai. Galvijai gali apsinuodyti supelėjusiais pašarais ir dalis mikotoksinų gali išsiskirti su

pienu. Pavojingiausi iš mikotoksinų yra aflatoksinai – kancerogeninės medžiagos, kurias sintetina

Aspergillus ir kiti pelėsiniai grybai. Aflatoksinai ir jų metabolitai piene ir pieno produktuose

nustatomi chromatografijos metodu (Fink-Gremmels ir kt., 1999; Prandini ir kt., 2009).

2.3.3.2. Pieno sudėtyje esančios antimikrobinės medžiagos

Bet kokios bakterijų augimą slopinančios medžiagos esančios piene, tiriant antimikrobinių

medžiagų likučius, gali rodyti teigiamą reakciją (Cullor et al, 1992).

Piene esančios mikroorganizmų augimą stabdančios medžiagos gali būti skirstomos į dvi

grupes:

• karvės organizme sintetinamos, skirtos naujagimiui apsaugoti;

• iš aplinkos per karvės organizmą arba tiesiogiai patenkančios į pieną inhibitorinės

medžiagos.

Pirmai antimikrobinių medžiagų grupei priskiriami lizocimas, laktoferinas,

laktoperoksidazinė sistema, imunoglobulinai ir vitaminus sujungiantieji baltymai (Significance of

the indigenous anti-microbial agents of milk to the dairy industry. Bulletin of the IDF. 1991. No.

264. P. 2–19). Nors šios sudedamosios dalys ir sudaro nedidelę dalį pieno baltymų, tačiau vaidina

labai svarbų vaidmenį tiesioginėje ir netiesioginėje organizmo apsaugoje (Séverin ir kt., 2005).

Antimikrobinių medžiagų aktyvi veikla yra neilga – šviežiame piene tęsiasi apie 2 valandas.

18

Baktericidinės fazės trukmė priklauso nuo pieno temperatūros. Greitas ir kokybiškas pieno

atšaldymas baktericidinę fazę prailgina.

Lizocimas yra hidrolazių klasės fermentas, ardantis bakterijų sieneles, kuris organizme

veikia kaip nespecifinis antibakterinis barjeras.

Laktoferinas yra daugiafunkcinis geležį pernešantis glikoproteinas, kuris taip pat vaidina

svarbų vaidmenį pirminėje apsaugoje nuo patogeninių mikroorganizmų. Jis turi antimikrobinių

savybių tiek prieš gramteigiamas, tiek prieš gramneigiamas bakterijas, bei veikia fungicidiškai

Candida genties grybus (Bellamy et. al., 1993). Yra įrodytas laktoferino ir imunoglobulino

komplekso antimikrobinis poveikis prieš gramneigiamas ir gramteigiamas bakterijas (Korhonen ir

kt. 2000; Drobni ir kt. 2004). Atliktų tyrimų metu in vitro buvo nustatytas laktoferino ir lizocimo

inhibitorinis poveikis Bacillus stearothermophilus var. calidolactis (Carlsson ir kt., 1987). Vėliau

Carlsson ir kitų mokslininkų atliktas tyrimas parodė, kad salmonelių toksinais užkrėtus karves ir

sukėlus mastitą, padidėja laktoferino ir lizocimo koncentracija piene (Carlsson ir kt., 1989).

Laktoperoksidazė yra pagrindinis kraujo grupės glikoproteinas. Laktoperoksidazė

katalizuoja reakcijas, kuriose vandenilio peroksidas redukuojamas, o tinkamas elektrono donoras

oksiduojamas. Karvių piene yra didelė laktoperoksidazės koncentracija (30 µg/ ml). Ji sudaro apie

1 proc. visų pieno serumo baltymų. Šis fermentas yra sintetinamas pieno liaukoje ir yra normali

pieno sudedamoji dalis (Mullan, 2003). Laktoperoksidazės galvijų piene yra maždaug 20 kartų

daugiau negu žmonių piene. Pati laktoperoksidazė antimikrobinių savybių neturi, tačiau kartu su

vandenilio peroksidu ir tiocionatu sudaro stiprią apsauginę sistemą, kuri pagrįsta bakterijoms

gyvybiškai svarbių fermentų gamybos slopinimu (Karen ir kt., 1998).

Krekenos yra svarbios naujagimių augimui ir sveikatai. Krekenose esanti imunoglobulinų

komplemento sistema užtikrina pagrindinę apsaugą nuo daugelio rūšių bakterijų, bei suformuoja

pasyvų imunitetą, kol veršeliui susiformuoja imuninė sistema. Galvijų serumo ir pieno išskyrų

sudėtyje yra 3 pagrindinių klasių imunoglobulinų: IgG, IgM ir IgA. Po apsiveršiavimo

imunoglobulinai iš serumo patenka į pieno liauką, todėl pirmosiose krekenose yra didelė jų

koncentracija (40 – 20 mg/ml). Per kelias dienas ji nukrenta iki 0,7 – 0,1 mg/ ml., tada

imunoglobulinai mažais kiekiais gali būti aptinkami galvijų piene (Korhonen ir kt., 2000).

Be visų šių antimikrobinį poveikį turinčių medžiagų, pieno sudėtyje yra įvairių lipidų,

pradedant nuo pagrindinių trigliceridų, kurie sudaro 98 proc. riebalų fazės, baigiant antraeiliais

lipidais, tokiais kaip fosfolipidai (Renner ir kt., 1989). Baktericidinis poveikis gramteigiamoms ir

gramneigiamoms bakterijoms siejamas su įvairiais pieno lipidais (Sprong ir kt., 2001).

Fosfotidilcholinai, fosfotidiletanolaminas ir sfingomielinas yra dominuojantys fosfolipidų

komponentai. Nors šių komponentų biologinė funkcija dar tiksliai nėra žinoma, tačiau rezultatai in

19

vitro rodo, kad trigliceridų ir fosfolipidų apykaitos skilimo produktai gali turėti antimikrobinių ir

antivirusinių savybių (Antonius ir kt., 2000).

2.3.3.3. Inhibitorių patekimo į pieną priežastys

Antibiotikai dažniausiai patenka į pieną gydant karvių mastitus. Karvių, gydytų

antibiotikais, pieno negalima vartoti nuo keliolikos valandų iki kelių parų po paskutinio antibiotikų

panaudojimo. Tai priklauso nuo antibiotikų rūšies, dozės, naudojimo dažnumo ir būdo (leidžiant į

raumenis arba į tešmenį).

Kartais, kad būtų išvengta ligos kritiniu gyvuliui laikotarpiu (atjunkant veršiukus nuo

karvės, pervežant iš vienos vietos į kitą), gyvuliams duodamas mažesnis antibakterinių preparatų

kiekis – tai vadinama profilaktiniu antibiotikų vartojimu (Mypox, 1991). Duodant gyvuliams

antibakterinių preparatų, būtina laikytis konkretaus vaisto vartojimo instrukcijos, kurioje turi būti

nurodytas karencijos laikas. Tai yra laikas, per kurį vaistai pasišalina iš gyvulio organizmo arba jų

sumažėja tiek, kad nebeįmanoma aptikti, ir jie nedaro įtakos gyvūninės kilmės maisto produktų

technologinėms savybėms bei vartotojų sveikatai (Antibiotic Resistance in the European Union

Associated with Therapeutic Use of Veterinary Medicines. Report and Qualitative Risk Assesment

by the Committee for Veterinary Medicinal Products. London, 1999. P. 6–20). Kol nepraėjęs

karencijos periodas, nei patys gyvuliai, nei jų produktai negali būti parduodami. Tačiau viena iš

priežasčių, dėl ko inhibitoriai patenka į pieną – karencijos periodo nesilaikymas (cit. pagal

Žvirdauskienė ir kt., 2004).

Vaistų bendrovės savo preparatų išsiskyrimo iš organizmo laiką nustato, atlikdamos tyrimus

su melžiamomis karvėmis. Tačiau daugelis vaistų gyvulio organizme laikosi ilgiau negu nurodyta

vartojimo instrukcijoje, ir tuo laiku tiriami pieno mėginiai inhibitorinių medžiagų atžvilgiu yra

teigiami. Taigi ne visada galima pasikliauti ir preparatų anotacijomis.

Pieno fermose svarbu nustatyti efektyvų šėrimo lygį. Netinkamai šeriant ar šeriant

nekokybiškais supelijusiais pašarais pieninius galvijus, ne tik sumažėja pieno išeiga, bet ir sutrinka

medžiagų apykaitos procesai jų organizme, karvės dažniau serga mastitu bei nagų ligomis. Todėl

reikalingas gydymas, kas sudaro prielaidą inhibitorinėms medžiagoms atsirasti piene. Remiantis VĮ

„Pieno tyrimai“ statistikos duomenimis (Statistika. Inhibitorinės medžiagos. http://www.pieno-

tyrimai.lt./.), inhibitorinės medžiagos piene dažniausiai nustatomos vasaros laikotarpiu. Tuo

laikotarpiu pasėliai purškiami chemikalais, karvės gali būti apipurškiamos repelentais nuo vabzdžių,

dėl ko piene gali būti nustatyta inhibitorinių medžiagų.

Dažnai sergančioms mastitu karvėms gydyti skiriama ne vienas, o iš karto keli,

kompleksiškai veikiantys antibiotikai. Kombinuotas gydymas taikomas norint sustiprinti

antimikrobinį poveikį, stabdyti atsparių mikroorganizmų plitimą, taip pat sumažinti toksiško

20

antibiotiko dozę. Intensyviai ir ekstensyviai naudojant keletą skirtingų klasių antimikrobinių

medžiagų, joms vystosi mikroorganizmų atsparumas. Roesch su grupe mokslininkų, atlikę

antimikrobinio atsparumo tyrimus, konstatavo, kad tiek pramoninėse, tiek tradicinėse melžiamų

karvių fermose (pastarosiose ribojamas antibiotikų naudojimas) mastito sukėlėjų atsparumas

antibiotikams buvo panašus (Roesch ir kt., 2006).

Sergančias karves gydyti reikia racionaliai – tik tais antibiotikais, kuriems sukėlėjas jautrus.

Atsparūs antibiotikams mikroorganizmai gamina fermentus, kurie suardo antibiotikus, pakinta

atsparių mikroorganizmų medžiagų apykaitos tipas, pasikeičia mikroorganizmo ląstelės

apvalkalėlio pralaidumas, ir antibiotikas į protoplazmą nepatenka. Dėl to skatinama atsparių

padermių generacija (Roesch ir kt., 2006).

Lietuvoje bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimai atliekami seniai, tačiau

nėra gerai žinoma mikroorganizmų atsparumo šalyje situacija, ir kiek ji yra probleminė. Iki šiol

bakterijų atsparumo duomenys nebuvo sisteminami, tyrimai atliekami daugiausia atskirų įstaigų

mikrobiologijos laboratorijose, o rezultatai pateikiami tiesiogiai suinteresuotam ūkiui ar

veterinarijos gydytojui. Išsamesni moksliniai tyrimai pradėti neseniai, o publikacijų duomenys dar

nėra pakankamai išsamūs (Ružauskas ir kt., 2006).

Neteisingai gydant gyvulio organizmas pradeda gaminti junginius, kovojančius su užkratu.

Taip į pieną patenka „natūralaus antibiotiko“ lizocimo, kitų natūralių medžiagų, kurios kaip ir

cheminių antibiotikų ar ploviklių likučiai neleidžia daugintis mėgintuvėlyje terpėje esančioms

sporoms. Sergančių karvių pienas su natūraliais inhibitoriais netinkamas perdirbti kaip ir su kitos

kilmės inhibitoriais. Tokios karvės su įsisenėjusiu mastitu vieną kartą gali duoti visiškai švarų

pieną, o kitą kartą, jei lėtinė liga paūmėja – su „biologinės kilmės“ inhibitoriais.

Labiausiai tikėtinos inhibitorių piene atsiradimo priežastys:

Neteisingas vaistų pasirinkimas;

Netinkamai pasirinktas gydymas;

Neteisingas vaistų vartojimas arba ne pagal instrukciją (per didelė dozė);

Nekokybiški, supeliję pašarai arba pašarai, duodami ne toms gyvulių grupės,

kurioms jie skirti;

Karvių ganymas šalia miškų, apdorotų cheminėmis medžiagomis nuo kenkėjų

ir ligų, arba neseniai tręštose ganyklose;

gyvulių girdymas netinkamu vandeniu;

netinkamų tepalų naudojimas rankoms ir speniams gydyti;

nepakankamas melžimo ir pieno laikymo įrangos praplovimas geriamuoju

vandeniu;

Užtrūkimo ir laktacijos periodas;

Slaptas ligos periodas;

Bloga melžimo operatorių kvalifikacija;

Gydomų karvių melžimas;

21

Užkrėsto pieno maišymas su kitu;

Netinkamas užkrėsto pieno atskyrimas;

Netinkamas sausinimo, valymo priemonių naudojimas arba naudojimas

nesilaikant gamintojo instrukcijos.

2.3.3.4. Inhibitorių nutatymo metodai

Atsižvelgiant į tai, kad antibiotikų bei kitų medžiagų su antibakterinėmis savybėmis, kurios

gali būti vartojamos gyvulininkystėje, sąrašas yra labai ilgas ir jame daug skirtingos cheminės

sudėties junginių grupių, nėra vienos visų galimų medžiagų radimo bei identifikavimo metodikos.

Inhibitorių likučių nustatymo tyrimai paprastai atliekami dviem etapais: pirmiausiai,

mikrobiologiniu ar fermentiniu metodu randami inhibitorių likučiais užteršti mėginiai („teigiami“

mėginiai), po to šie mėginiai tiriami kitais patvirtinimo metodais, kad būtų nustatyta, kokių ir kiek

inhibitorių likučių rasta mėginyje (Žvirdauskienė ir kt., 2004).

Lietuvos rinkoje siūlomi testai inhibitoriams žaliame piene nustatyti: mikrobiologiniai,

atitinkantys pamatinį ES metodą su Bacillus stearothermophilus var. calidolactis kultūros sporomis:

Delvotest SP, Copan, LPT (gaminamas ir naudojamas tik VĮ Pieno tyrimai); su Streptococcus

thermophilus kultūra Valio T 101 ir spartieji – fermentinis − Penzym S, bei imuninio/receptorių

tyrimo (β -STAR, SNAP, ROSA) testai (Šalomskienė ir kt., 2005).

Tiksliems antibiotikų likučiams nustatyti yra taikomi efektyviosios skysčio chromatografijos

bei kolorimetriniai metodai (Rybinska ir kt., 1992). Ypač daug problemų sukėlusio

chloramfenikolio kiekiams nustatyti taikomas imunofermentinės analizės metodas (Maris ir kt.,

2002). Iki 0,2 μg/kg antibiotikų kiekį galima nustatyti, panaudojant masės spektrofotometrą (Kijak,

1994).

Didžiausius leistinus farmakologiškai aktyvių medžiagų likučių kiekius (DLK)

gyvūniniuose maisto produktuose nustato Europos Parlamento ir Tarybos Reglamentas (EB) Nr.

470/2009, pakeitęs prieš tai galiojusį EEB Reglamentą 2377/90. ES reglamentuojamų antibakterinių

preparatų DLK sąrašas vis labiau plečiamas. Pieno tiekėjai turi garantuoti, kad jų pristatomas pienas

neužterštas nei vienos iš reglamentuojamų antibakterinių medžiagų likučiais arba jie neviršija DLK

ribų. Tačiau daugelis siūlomų metodų negali garantuoti visų šių medžiagų nustatymo normų. Nors

dažniausiai veterinarijos praktikoje yra naudojamos β-laktaminės grupės antibakterinės medžiagos,

gali būti aptinkami taip pat sulfonamidai, tetraciklinai ir kitos medžiagos. Mikrobiologiniai

antibakterinių medžiagų likučių nustatymo metodai skirti plačiam medžiagų spektrui, todėl be β-

laktaminį žiedą turinčių antibiotikų jais galima nustatyti ir kitas medžiagas. Tačiau jais gali būti

neteisingai teigiamai įvertinami mėginiai, kuriuose yra natūralių antibakterinių medžiagų −

laktoferino, lizocimo − arba plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių. Daugeliu

22

imuninio/receptorių tyrimo metodų yra nustatoma β-laktaminė grupė, tačiau yra bent du

komerciniai metodai, kuriais nustatomas penicilinas, bet nerandama cefalasporino. Nors yra

gaminami imuninio/receptorių tyrimo testai sulfonamidams ir tetraciklinui nustatyti, jie turi būti

taikomi tyrimams atskirai, o tai yra nepatogu ir brangu (Šalomskienė ir kt., 2005). Pastaruoju metu

jau gaminami testai dviems antibiotikams nustatyti iš karto – penicilinui ir tetraciklinui (pvz.,

Charm ROSA MRL BL/TET ir Charm 3 MRL BL/TET2 (Charm Sciences Inc., JAV).

Antibiotikų likučių kontrolei yra skiriamas pakankamas dėmesys, tačiau iki 1 % pieno

mėginių būna su inhibitorinių medžiagų likučiais. Ne visada aišku, kokią įtaką technologiniai

veiksniai turi šių medžiagų suardymui ar inaktyvavimui. Lenkijoje ir JAV atlikti tyrimai rodo, kad

kai kurių antibiotikų kiekiai gali sumažėti po terminio pieno apdorojimo arba veikiant atitinkamais

fermentais (Krasauskaitė, 1991). Tačiau bandymai, atlikti LŽŪU bei VĮ „Pieno tyrimai“ su

antibiotiku chloramfenikoliu parodė, kad technologiniai veiksniai (temperatūra, laikymas,

mechaninis apdorojimas bei pieno rauginimo metu vykstantys biocheminiai procesai) šio junginio

kiekio sumažėjimui įtakos visiškai neturėjo (Urbienė ir kt., 2009). Šiuo metu atkreiptas dėmesys į

tetraciklino grupės antibiotikų likučius piene ir pieno produktuose, nes tetraciklino rasta 24 %

mėginių nuo bendro inhibitorių likučiais užterštų mėginių skaičiaus (Žvirdauskienė ir kt., 2004).

Difuzijos į agarą metodu buvo ištirta pieno gamybos technologinių veiksnių

(pasterizacijos, užšaldymo, atšildymo, homogenizacijos, rauginimo) įtaka antibiotiko tetraciklino

aktyviosios medžiagos pokyčiams. Nustatyta, kad visų technologinių procesų metu tetraciklino

veiklioji medžiaga sumažėjo (Urbienė ir kt., 2009). C. P. Champagne moksliniais tyrimais

nustatyta, kad ne tik antibiotikai veikia pieno rūgšties bakterijas, trukdydami joms vystytis, bet ir

bakterijos gali sumažinti antibiotikų veikliosios medžiagos kiekį. Tačiau tokiam poveikiui turi būti

atitinkamos sąlygos. Nustatyta, kad laikant pieną su penicilino likučiais ir bakterijomis šaltai (4 ir

10 °C temperatūroje) penicilino veikliosios medžiagos kiekis reikšmingai nesumažėjo. Tačiau

laikant 30 °C temperatūroje, penicilino veikliosios medžiagos kiekis sumažėjo labai ryškiai

(Champagne, 1992). Manoma kad, tai galėtų būti susiję su pieno rūgšties bakterijų atliekama

fermentacija (Šarkinas ir kt., 2011). Lietuvoje naujausi tyrimai atlikti tiriant technologinių veiksnių

įtaką penicilino kiekiui, gaminant pieno produktus. Nustatyta, kad pieno mėginiuose laikymo metu,

esant 8 °C temperatūrai, penicilino veikliosios medžiagos kiekis per 72 val. sumažėjo vidutiniškai

6,6 %. Kuo aukštesnė mėginių apdorojimo temperatūra, tuo labiau sumažėjo penicilino veikliosios

medžiagos kiekis. 80 °C temperatūros poveikyje veikliosios medžiagos kiekis sumažėjo 25–29,4 %.

Mechaninis poveikis penicilino veikliosios medžiagos kiekį sumažino iki 23,6%, o užšaldžius

mėginius esant –20 °C, po 15 parų veikliosios medžiagos nebuvo rasta. Šiame tyrime taip pat buvo

23

nustatyta, kad biotechnologinių procesų metu, veikiant pieno rūgšties bakterijoms, penicilino

veikliosios medžiagos kiekis sumažėjo iki 29,5 % (Šarkinas ir kt., 2011).

Šiuo metu dažnai naudojami spartieji (ekspres) testai. Jais pieną galima pripažinti netinkamu

iki jo supirkimo ar perdirbimo ir taip sumažinti galimybę užterštam pienui pasiekti vartotojus.

Šiems spartiesiems testams, vadinamiems konkurenciniais imunologiniais tyrimais, naudojami labai

specifiniai antikūnai. Jais galima nustatyti labai mažą antibiotikų kiekį piene (apie 1 mg/kg),

tyrimui atlikti. Poreikis sutrumpinti tyrimo laiką paspartino fermentinių, imuninio/receptorių tyrimo

metodų vystymąsi, kurie iš esmės yra žinomo ELISA metodo analogai. Daugelio metodu veikimas

pagrįstas konkurenciniu principu, kai antibakterinė medžiaga mėginyje varžosi su standartine

antibakterine medžiaga dėl imuninio receptoriaus (Šalomskienė ir kt., 2005).

Užsienyje mokslininkai savo tyrimuose nustatė, kad padidėjęs somatinių ląstelių skaičius,

imunoglobulinų koncentracija, pieno riebalai ar baltymai, gali turėti įtakos klaidingai teigiamiems

inhibitorinių medžiagų piene nustatytiems rezultatams (Andrew ir kt., 1997; Hillerton, 1999).

Inhibitorinių medžiagų piene gali būti aptinkama, jei užtrūkusios karvės buvo gydytos ilgo veikimo

vaistais, o jų užtrūkimo periodas trumpesnis nei vaisto veikimo arba šių karvių pienas parduodamas

pirmas 4 dienas po veršiavimosi (Andrew, 2001).

Natūralių inhibitorių koncentracijos padidėjimas nustatomas mastitu sergančių karvių piene

ir krekenose. Carlsson su kitais tyrėjais nustatė, kad inhibitorinių medžiagų Delvotest‘o klaidingai

teigiami rezultatai susiję su laktoferino ir lizocimo koncentracija. Delvotest‘o rezultatams įtakos taip

pat turi inkubacinis laikas, pieno sudėtis, pieno surinkimo metodas bei testo rezultatų vertinimo

trukmė. Kang ir Kondo 2001 m. tyrime nustatė, kad norint sumažinti klaidingai teigiamus

rezultatus, mėginius reikia pakaitinti (Carlsson ir kt.;1989; Kang ir kt.; 2001).

2.3.3.5. Inhibitorių poveikis

Inhibitorių likučiai piene turi įtakos:

pieno savybių pakitimui;

raugintų pieno gaminių ir sūrių gamybos technologiniam procesui;

pieno produktų gamybos išlaidų padidėjimui;

alerginių reakcijų žmonėms sukėlimui;

žarnyno mikrofloros pakitimui;

antibiotikams atsparių kultūrų išsivystymui;

sumažėjusiai vitaminų sintezei.

2.3.3.6. Inhibitorių priklausomybė nuo somatinių ląstelių skaičiaus piene

Padidėjęs mėginių su inhibitoriais skaičius karvių piene gali būti susijęs su kitais pieno

kokybiniais rodikliais. Manoma, kad jis priklauso nuo gyvulio organizmo fiziologinės būklės ir

somatinių ląstelių skaičiaus piene. Iki šiol ši problema Lietuvoje nenagrinėta, nors užsienio

24

mokslininkų paskelbtose publikacijose skelbiama, kad ryšys tarp somatinių ląstelių skaičiaus

padidėjimo ir antibiotikų likučių piene egzistuoja (Ruegg ir kt., 2000; Saville ir kt., 2000; Van

Schaik ir kt., 2002).

3. Tyrimų objektai ir metodai

3.1. Somatinių ląstelių skaičiaus ir inhibitorių nustatymo metodai

2011 m. įvairiuose Lietuvos ūkiuose ištirtas 735 Lietuvos juodmargių karvių pienas

somatinių ląstelių atžvilgiu. Siekiant ištirti sveikų Lietuvos juodmargių karvių pieno mėginiuose

somatinių ląstelių skaičių bei nustatyti inhibitorius, pagal pirminius SLS tyrimo rezultatus tyrimams

buvo atrinktos tik tos karvės, kurių SLS buvo ne didesnis kaip 200 tūkst./ml. Didesnis somatinių

ląstelių skaičius – pagrindinis indikatorius, rodantis, kad karvė jau serga slaptuoju mastitu

(Klimienė ir kt., 2005; Rudejevienė, 2007), todėl karvių, kurių SLS tyrimo rezultatai viršijo šį

rodiklį, pienas tirtas 2012 m.

Tiriant somatinių ląstelių skaičiaus įtaką inhibitorių nustatymui piene visos sveikos

karvės pagal somatinių ląstelių skaičių buvo suskirstytos į dvi grupes: karvės, kurių pieno mėginyje

SLS nustatyta iki 100 tūkst./ml. ir karvės, kurių pieno mėginyje SLS nustatyta 101 – 200 tūkst./ml.

Įgyvendinant 2012 m. uždavinius įvairiuose Lietuvos ūkiuose ištirta 2470 Lietuvos

juodmargių karvių pieno mėginių.

592 mėginiai buvo ištirti somatinių ląstelių, inhibitorinių medžiagų ir mastito sukėlėjų

nustatymui.

Atliekant inhibitorinių medžiagų nustatymo mikrobiologinių testų palyginamąją analizę,

1878 pieno mėginiai buvo ištirti trimis Lietuvoje atsiskaitymo tikslams patvirtintais metodais: LPT,

LPT2 ir Delvotest SP-NT.

Vertinant riebalų ir baltymų santykio įtaką inhibitorinių medžiagų nustatymui, 1878

pieno mėginiuose nustatytas riebalų ir baltymų kiekis. Pagal gautus tyrimo rezultatus apskaičiuotas

pieno riebalų ir baltymų santykis – riebalų proc.:baltymų proc. Pagal riebalų ir baltymų santykį tirti

pieno mėginiai buvo sugrupuoti į 3 klases:

1 klasė – riebalų ir baltymų santykis iki 1;

2 klasė – riebalų ir baltymų santykis 1 – 1,5 ;

3 klasė – riebalų ir baltymų santykis 1,5 ir daugiau.

Tyrimui dėl SLS įtakos inhibitorinių medžiagų nustatymui iš bendro mėginių skaičiaus

buvo atrinkta 414 mėginių (iš 592) ir pagal nustatytą SLS, jie suskirstyti į 4 grupes:

1 grupė – mėginiai (n=154), kuriuose SLS nustatyta iki 200 tūkst./ml (vid. 83,73 tūkst./ml);

25

2 grupė – mėginiai (n=86), kuriuose SLS nustatyta 201–400 tūkst./ml (vid. 296,99 tūkst./ml);

3 grupė – mėginiai (n=105), kuriuose SLS nustatyta 401–700 tūkst./ml (vid. 536,65 tūkst./ml);

4 grupė – mėginiai (n=69), kuriuose SLS nustatyta 701–1000 tūkst./ml (vid. 838,33 tūkst./ml).

Pagal somatinių ląstelių skaičių galima teigti, kad pirmoje grupėje buvo sveikų karvių pieno

mėginiai, antroje grupėje – sergančių slaptuoju mastitu karvių mėginiai, o trečioje ir ketvirtoje

grupėse – sergančių klinikiniu mastitu karvių mėginiai. Tyrimui naudojome tiek sveikų, tiek

sergančių karvių pieno mėginius, norint išsamiau įvertinti SLS įtaką inhibitorinių medžiagų

nustatymui.

3.1.1. Mėginių ėmimas tyrimams

2011 m. tyrimams buvo imami rytinio melžimo žalio pieno mėginiai pagal pieno mėginių

ėmimo taisykles (LST EN ISO 707:1999+P:2003 Pienas ir pieno produktai. Mėginių ėmimo

taisyklės). Paimti 169 sveikų karvių pieno mėginiai ištirti VĮ „Pieno tyrimai“ laboratorijoje.

Mėginiai buvo imami kiekvieną mėnesį nuo 2011 m.gegužės iki spalio mėnesio.

2012 metų tyrimams buvo imami rytinio ir vakarinio melžimo žalio pieno mėginiai ir ištirti

VĮ „Pieno tyrimai“ laboratorijoje.

Somatinių ląstelių skaičiaus ir pieno riebalų bei baltymų piene nustatymui mėginiai buvo

imami į specialius mėginio indelius po melžimo iš kiekvieno spenio. Žalio pieno mėginiai

somatinių ląstelių skaičiui nustatyti konservuoti „Sedupolo“ tabletėmis. Įdėjus konservanto, pienas

buvo gerai išmaišytas. Konservuoti pieno mėginiai buvo laikomi uždengtuose indeliuose esant ne

aukštesnei kaip 8 °C temperatūrai iki tyrimo.

Inhibitorinėms medžiagoms nustatyti žalio pieno mėginiai iš kiekvienos karvės buvo imami

aseptiškai į sterilius mėgintuvėlius melžimo pabaigoje iš pamelžto kiekvienos karvės bendro pieno

kiekio. Nekonservuoti pieno mėginiai atšaldomi iki 6 °C temperatūros ir specialioje taroje

transportuoti į laboratoriją.

Mastito sukėlėjui nustatyti iš kiekvieno karvės tešmens ketvirčio į sterilią tarą paimamas

pieno mėginys. Paimtas 20 ml mėginys buvo ženklinamas įprastine tvarka.

3.1.2. Tyrimo metodai

SLS nustatytas elektroniniu metodu, naudojant aparatą „Somascope MK 2“. Jis veikia

fluorooptoelektroniniu metodu, naudojant N– kiuvetę, kuri apšviečiama specialios ultravioletinės

lempos skleidžiamais spinduliais. Kiekviena nudažyta ląstelė pradeda švytėti, kompiuterinė

programa registruoja gautus signalus ir taip suskaičiuojamas somatinių ląstelių skaičius piene.

26

LPT ir LPT2 inhibitorių testai yra skirti plataus spektro antimikrobinių medžiagų aptikimui

žaliame piene. Testai pagaminti pagal ISO/TS 26844:2006 reikalavimus, vietoj mėgintuvėlių

naudojant mikroplokšteles ir atitinkamomis proporcijomis sumažinus dozuojamos terpės bei pieno

mėginius.

Į kiekvieną plokštelės duobutę dozuojama po 50 µl kontrolinio ar tiriamojo pieno mėginio. Po

vieną duobutę plokštelėje skiriama kontroliniams mėginiams.

Plokštelė paliekama 1 h kambario temperatūroje ant lygaus paviršiaus. Po 1 h plokštelė

apverčiama, nesusigėręs į duobutėse esančią terpę pienas nupilamas, plokštelės paviršius

nusausinamas popierine servetėle ir užsandarinamas lipnia juosta. LPT ir LPT2 testų plokštelės

inkubuojamos 4 h 15 min. ± 30 min. 63,5ºC temperatūroje termostate. Rezultatai vertinami pagal

terpės spalvą duobutėse. Tinkama inkubavimo trukmė nustatoma pagal neigiamą konrolę –

duobutės su kontroliniu mėginiu terpės spalva turi būti pasikeitusi iš violetinės į geltoną.

Kontrolinių mėginių su antibiotikais terpės spalva turi būti violetinės ar šviesiai violetinės spalvos.

Metodas pagrįstas tuo, kad dauginantis terpėje esančioms jautrioms antibiotikams ir

sulfamidams kultūros Geobacillus stearothermophilus NIZO C953 sporoms susidaro rūgštis,

pakeičianti terpės spalvą iš violetinės į geltoną. LPT ir LPT2 testai skiriasi vienas nuo kito terpės

pH, naudojamais priedais ir jautrumu antibiotikams (žr. 1-ą priedą).

Delvotest SP-NT – mikrobiologinis antibiotikų nustatymo metodas su jautria kultūra –

Geobacillus stearothermophilus. Šiuo metodu galima nustatyti ES reglamentuojamus leistinus, o

kai kurių antibiotikų – mažesnius antibiotikų (penicilino, kloksacilino, sulfametazino, cepfaleksino

ir gentamicino) likučių kiekius.

Mastito sukėlėjo nustatymui pieno mėginys (0,01 ml) sėjamas į Petri lėkštelę ant

Kolumbijos agaro su 5 % avies kraujo, gerai išsklaidomas, kad išaugtų pavienės kolonijos. Pasėlis

inkubuojamas 24 val. 37 0C temperatūroje. Išaugusios kolonijos įvertinamos vizualiai. Įvertinamas

kolonijų dydis, spalva bei jų hemolizės zonos. Hemolizė gali būti skaidri (β), žalsva (α) arba gali

visai jos nebūti (γ).

Streptokokų kolonijos ant Kolumbijos agaro panašios į stafilokokų, tačiau charakteringos

streptokokų kolonijos yra mažesnės (<1 mm) ir permatomos.

Kiekvienos rūšies kolonijoms atliekamas kalio šarmo (KOH) testas. Taip atskiriamos gram

teigiamos ir gram neigiamos bakterijos. Testui atlikti naudojamas 3 % KOH tirpalas, kuris

užlašinamas ant objektinio stikliuko ir, uždėjus nuo terpės nuimtą koloniją, išmaišoma. Jei keliant

kilputę nuo objektinio stikliuko mišinys tįsta, tai tokios bakterijos gram neigiamos, o jei tąsumo

nėra – gram teigiamos. Norint įvertinti tiksliau daromas mikroskopinis tepinėlis, kilpele nuimama

nuo terpės ir paskleidžiama ant objektinio stikliuko bei nudažius Gramo dažais mikroskopuojama.

27

Streptokokai ir stafilokokai yra gram teigiamos rutulinės formos bakterijos (nusidažo

mėlynai arba melsvai). Streptokokai išsidėsto pavieniui ar grandinėlėmis. Stafilokokai

mikroskopiniame tepinėlyje išsidėsto pavieniui arba krūvelėmis, panašiomis į vynuogių kekę.

Gram teigiamoms kultūroms (kokams) atliekamas katalazės testas. Testuojama kolonija

mikrobiologine kilpele nuimama nuo terpės ir paskleidžiama ant objektinio stikliuko. Po 30

sekundžių užlašinamas lašas 3 % vandenilio peroksido H2O2. Esant teigiamai reakcijai, mišinys

intensyviai putoja. Šiuo testu streptokokai atskiriami nuo stafilokokų. Streptokokų katalazės

reakcija – neigiama, o stafilokokų – teigiama.

Stafilokokams atliekama agliutinacijos reakcija dėl Staphylococcus aureus atskyrimo nuo

kitų stafilokokų. Tam naudojome “Remel” firmos “Staphaurex” testą. Staphaurex yra greita latekso

agliutinacijos reakcija, skirta stafilokokų diferencijavimui, jiems būdingų agliutinavimo faktoriaus

baltymo A ir (arba) paviršinių antigenų nustatymui, kurie būdingi Staphylococcus aureus.

Gamintojo duomenimis testo tikslumas – 99,5 %.

Riebalų ir baltymų kiekio tyrimas atliekamas infraraudonosios spinduliuotės vidurinės

srities matuokliu LactoScopeFTIR (FT1.0. 2001; Delta Instruments, Olandija). Tiriant matuojama

kiekvieno komponento vidutinių infraraudonųjų spindulių specifinio bangų ilgio absorbcija. Pagal

sugertos energijos kiekį apskaičiuojamas šių pieno sudedamųjų dalių kiekis.

3.1.3. Duomenų statistinis apdorojimas

Tyrimų duomenys apdoroti statistinės analizės metodu statistiniu paketu „R 2.2.0.“

Naudojant „R“ statistinį paketą įvertinome tirtų mėginių (n) požymių aritmetinius vidurkius ( x ), jų

paklaidas (mx), pasikliautinus intervalus (PI). Aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas buvo

nustatomas t-testu. Tiesinių ryšių tamprumui tarp kiekybinių kintamųjų įvertinti paskaičiavome

Pearson koreliacijos koeficientą. Kategorinių kintamųjų įtaka normaliai pasiskirsčiusiems

kiekybiniams požymiams tirta dispersinės analizės (ANOVA) metodu.

Neparametrinė dažnių lentelių analizė atlikta naudojant χ2 testą. Duomenys laikomi

statistiškai patikimi, kai p≤0,05 (Juozaitienė, Kerzienė; 2001).

28

3.2. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų bei inhibitorių testų atrinkimas ir analizė

Darbas buvo vykdomas KTU Maisto instituto Mikrobiologijos mokslo laboratorijoje.

Tyrimo objektai – plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, naudojamos pieno ūkiuose

melžimo įrangai, inventoriui plauti ir dezinfekuoti bei tešmens ir spenių higienai bei

dezinfekavimui. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų įtakos inhibitorių testų rezultatams nustatymui

buvo parinkti plačiausiai Lietuvoje vartojami metodai – mikrobiologinis metodas Delvotest SP-NT

(DSM, Nyderlandai), analogas pamatiniui metodui LST ISO/TS 26844:2010; spartieji – imuninio

arba receptorių tyrimo metodai: Charm ROSA MRL BL/TET ir Charm 3 MRL BL/TET2 (Charm

Sciences Inc., JAV), β-STAR ((Nitrogen Corporation, JAV) ir fermentinis Penzym (Nitrogen

Corporation, JAV). Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų, gautų iš AB „Žemaitijos pienas“ pieno

supirkimo zonos, likučių įtaka nustatyta taip pat β-STAR testui, kadangi šis testas naudojamas

minėtoje įmonėje. Inhibitorių nustatymo testai buvo naudojami pagal gamintojų instrukcijas.

1 lentelė. Tyrimams parinktų inhibitorių nustatymo testų charakteristika

Testas Metodo veikimo principas Aptinkami inhibitoriai

Delvotest SP-NT

Mikrobiologinis metodas su

B. stearothermophilus var.

calidolactis C 953 padermės

sporomis

Penicilinas G daugiau kaip 0,004±0,001

TV/ml, sulfadiazinas 0,25 g/ml,

tetraciklinas 0,8 g/ml, eritromicinas

0,05 g/ml ir kt.

Charm ROSA MRL

BL/TET (8 min)

Imuninio/receptorių tyrimo

metodas, pagrįstas konkurentine

receptorine

reakcija

Penicilinas G 0,004 μg/ml,

amoksicilinas, ampicilinas, cefazolinas,

ceftiofuras, cefchinomas, cefaloniumas,

cefapirinas, kloksacilinas,

dikloksacilinas, oksacilinas, nafcilinas

Charm 3 MRL BL/TET2

(2 min)

Imuninio/receptorių tyrimo

metodas, pagrįstas konkurentine

receptorine

reakcija

Penicilinas G 0,004 μg/ml,

amoksicilinas, ampicilinas, cefazolinas,

ceftiofuras, cefchinomas, cefaloniumas,

cefapirinas, kloksacilinas,

dikloksacilinas, oksacilinas, nafcilinas

Penzym

Fermentinis metodas. Naudojamas

fermentas DD-karboksipeptidazė,

hidrolizuojanti R-D-Ala-D-Ala tipo

sintetinius substratus ir greitai

reaguojanti su beta-laktaminį žiedą

turinčiais antibiotikais, sudarydama

pastovų kompleksą

Penicilinas G 0,017 TV/ml;

β-STAR

Imuninio/receptorių tyrimo metodas,

pagrįstas specifine β-laktaminį žiedą

turinčių antibiotikų receptoriaus,

susijungusio su aukso dalelėmis, ir β-

laktaminį žiedą turinčių antibiotikų,

esančių piene, sąveika

Penicilinas G 0,003±0,001 TV/ml ir kiti

β-laktaminiai antibiotikai

29

Tirtos trys plovimo ir dezinfekavimo medžiagų koncentracijos žaliame piene: 1) dešimtkart

mažesnė koncentracija kaip rekomenduoja gamintojai (remiantis nuomone, kad plovimo ir

dezinfekavimo medžiagos kiekis žaliame piene teoriškai negali būti didesnis nei 10 %),

2) gamintojų rekomenduota, 3) du kartus didesnė už nurodytą rekomendacijose (turint tikslą aptikti

inhibitorines medžiagas tiriamajame mėginyje). Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų tirpalai ruošti

žaliame karvės piene, kuriame nerasta inhibitorių nė vienu naudotu testu iš anksto patikrinus.

Kontrolinis mėginys – pienas be inhibitorių (Negative control, DSM, Nyderlandai).

Tyrimams naudotos plovimo ir dezinfekavimo medžiagos pateiktos žemiau esančiose 2 ir 3

lentelėse.

2 lentelė. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos melžimo įrangai, inventoriui plauti ir

dezinfekuoti Eil.

Nr. Pavadinimas

Gamintojo rekomenduojama

koncentracija Gamintojas

1. Ultra 50-80 ml/ 10 l vandens DeLaval International AB

2. Cidmax 50-80 ml/ 10 l vandens _“_

3. Super 50- 80 ml/ 10 l vandens _“_

4. Cid 50-80 ml/ 10 l vandens

5. N – Cid 50-80 ml/ 10 l vandens _“_

6. C – Alka 50-80 ml/ 10 l vandens _“_

7. Fresh – 25 50-80 ml/ 10 l vandens _“_

8. DeLaval dish cleaner 80 ml/ 10 l vandens _“_

9. Qualiton SO 50 ml/ 10 l vandens Fink Tec GmbH

10. Qualiton A 50 ml/ 10 l vandens _“_

11. CircoTop SFM 40 ml/ 10 l vandens _“_

12. CircoTip AF 40 ml/ 10 l vandens _“_

13. Manuren 20-40 g/ 10 l vandens ITW Novadan ApS

14. Chloro tabletės 3,6 g/10 l vandens _“_

15. VIP 1 50-300g/ 10 l vandens _“_

16. VIP 2 500100 g/ 10 l vandnes _“_

17. F 206 Torkku 40-80 ml/ 10 l vandens Farmos Ltd.

18. F 210 Hygisept 200 g/ 10 l vandens _“_

19. F 209 Capo-Tab 3,2 g/ 8 l vandens _“_

20. F 207 Capo 3,5 g/ 10 l vandens _“_

21. F 205 Virkku 40-80 ml/ 10 l vandens _“_

22. F 261 Kloriitti forte 30ml/ 10 l vandens _“_

23. F 208 Nanneli 50 ml/ 10 l vandens _“_

24. F 201 Tisko 27-45 g/ 10 l vandens _“_

25. Desomix 60-80 g/ 10 l vandens AS Estko

26. Mixi 65-80 g/ 10l vandens _“_

30

Spenių higienai ir dezinfekavimui skirtos medžiagos pateiktos 3 lentelėje. Medžiagų, kurios

prieš naudojimą neskiedžiamos, buvo tiriama 10 %, 5 % ir 2,5 % koncentracijos žaliame piene.

3 lentelė. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos spenių higienai ir dezinfekavimui

Eil.

Nr.

Pavadinimas Gamintojo rekomenduojama

koncentracija

Gamintojas

1. Biofoam neskiedžiama DeLaval International AB

2. Blockade _“_ _“_

3. Fink Io Dip 25 _“_ Fink Tec GmbH

4. Nova-Dip Barriere _“_ ITW Novadan ApS

5. Viri Foam _“_ _“_

6. Viri-Barriere Dip _“_ _“_

7. Viri Te Dip _“_ _“_

8. LuxDip 50B _“_ GEA WestfaliaSurge GmbH“

9. Vissi-Tissi 50 ml/10 l vandens AS Estko

10. Vissi-Tipp 1:2 (vandens) _“_

Atliktų tyrimų kartotinumas – 3. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių piene

nustatymo testų palyginimui taikytas MacNemar testas (Guidelines for Establishing the Suitability

of Food Microbiology Methods. Ed. By C. L. Baylis, K. Jewell, C. A. Oscroft and F. L. Brookes.

Gudeline. No. 29. 2001).

4. Tyrimų rezultatai

4.1. Somatinių ląstelių skaičiaus ir inhibitorių piene priklausomybė (2011 m. rezultatai)

Ištyrus 735 Lietuvos juodmargių karvių pieno mėginius, nustatyta, kad 169 mėginiuose

somatinių ląstelių skaičius buvo iki 200 tūkst./ml, o likusiuose mėginiuose – virš 200 tūkst./ml

(1 pav.). Todėl pagal šių metų projekto uždavinius nagrinėjome tik sveikų karvių pieno mėginius.

Ištyrę 169 sveikų karvių žalio pieno mėginius, nustatėme, kad vidutinis somatinių ląstelių skaičius

buvo 86,37±4,41 tūkst./ml, t.y. gautas rezultatas atitinka sveikų karvių SLS rodiklį (Klimienė ir kt.,

2005; Rudejevienė, 2007). 17 pieno mėginių buvo rasta inhibitorinių medžiagų (2 pav.).

31

77%

23%

SLS>200 tūkst./ml SLS< 200 tūkst./ml

1 pav. Visų tirtų karvių, atrinktų pagal SLS skaičių, procentinė išraiška

Iš 1 pav. matyti, kad iš visų 735 tirtų karvių, sveikos karvės sudarė 23 proc.(169), o

likusios 77 proc.(566) pagal SLS > 200 tūkst./ml. priskirtos prie sergančiųjų.

Neigiami

91%

Teigiami

9%

2 pav. Visų testų rezultatų, tiriant inhibitorines medžiagas, procentinė išraiška

Kaip matyti iš 2 pav. duomenų, 9 proc. iš bendro tirtų mėginių skaičiaus buvo teigiami

inhibitorinių medžiagų atžvilgiu.

Karvių, kurių piene nustatytas SLS buvo ne didesnis kaip 100 tūkst./ml (vid. 43,2±2,76

tūkst./ml), nustatyti 4 teigiami testo rezultatai ir tai sudarė 4 proc. (3 pav.). Karvių, kurių piene SLS

buvo nuo 101 iki 200 tūkst./ml (vid. 144,5±3,32 tūkst./ml), nustatyta 13 teigiamų testo rezultatų ir

tai sudarė 15 proc. visų tirtų šios grupės mėginių (4 pav.). Taigi, manome, kad didėjant somatinių

ląstelių skaičiui piene, padidėja tikimybė rasti inhibitorinių medžiagų.

32

Neigiami

96%

Teigiami

4%

3 pav. Karvių, kurių piene SLS buvo iki 100 tūkst./ml, testų rezultatų, tiriant

inhibitorines medžiagas, procentinė išraiška

Neigiami

85%

Teigiami

15%

4 pav. Karvių, kurių piene SLS buvo 101–200 tūkst./ml, testų rezultatų, tiriant

inhibitorines medžiagas, procentinė išraiška

0

20

40

60

80

100

120

140

160

gegužė birželis liepa rugpjūtis rugsėjis spalis

SL

S

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Inh

ibit

ori

nės m

ed

žia

go

s

SLS INH teigiami

5 pav. SLS ir inhibitorinių medžiagų tyrimo rezultatai atskirais mėnesiais

Kaip matome iš 5 pav. pateiktų duomenų, daugiausiai teigiamų testų rezultatų

inhibitorinių atžvilgiu nustatyta rugsėjo ir spalio mėnesiais.

33

4.2. Somatinių ląstelių skaičiaus ir inhibitorių piene priklausomybė (2012 m. rezultatai)

2012 m. ištirti 592 Lietuvos juodmargių karvių pieno mėginiai, nustatant somatinių

ląstelių skaičių ir inhibitorines medžiagas. Nustatyta, kad vidutinis somatinių ląstelių skaičius buvo

1425 tūkst./ml. Kai pieno liaukoje yra uždegimas, vyrauja leukocitai, ir somatinių ląstelių skaičius

padidėja iki 500 tūkst./ml. Kai pieno liaukos uždegimas infekcinės kilmės, SLS būna daugiau nei

500 tūkst./ml. Taigi, mūsų gautas rezultatas parodo, kad karvės serga infekciniu ūminiu pieno

liaukos uždegimu. Ištyrus pieno mėginius LPT ir LPT2 metodais, nustatėme, kad 165 mėginiuose

buvo rasta inhibitorinių medžiagų (6 pav.).

28%

72%

teigiamų neigiamų

6 pav. Sergančių karvių teigiamų ir neigiamų mėginių inhibitorinių medžiagų

atžvilgiu pasiskirstymas

4.3. Mastito sukėlėjų nustatymas

Mėginiai, kuriuose buvo rasta inhibitorinių medžiagų, buvo ištirti mastito sukėlėjų

atžvilgiu. Siekiant išaiškinti tešmens uždegimo sukėlėjų kilmę, išskirti mastito kontaginiai

(užkrečiamieji) ir aplinkos (oportunistiniai) mikroorganizmai. Dažniausiai (n=69) nustatytas

sukėlėjas – Staphylococcus aureus, o iš aplinkos mikroorganizmų – gramneigiamos lazdelės (n=

24) (7 pav.).

34

7%

5%

42%

5%

12%

1% 3%

15%10%

Gramteigiamos lazdelės Gramneigiamos lazdelės Enterococcus spp.

Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus spp.

Staphylococcus spp. Mieliagrybiai Streptococcus dysgalactiae

7 pav. Procentinė mastito sukėlėjų išraiška

4.4. Mikrobiologinių metodų palyginamoji analizė

Nustatyta, kad daugiausiai – 57,6 proc. iš 1878 ištirtų pieno mėginių inhibitorinių

medžiagų rasta LPT metodu. LPT2 metodu tokių mėginių nustatyta 3,3 karto, o Delvotest SP-NT

metodu – 4,4 karto mažiau, nei LPT metodu. Metodai skiriasi vienas nuo kito terpės pH,

naudojamais priedais, jautrumu antibiotikams bei aptikimo ribomis, todėl tai galėjo turėti įtakos

gautiems rezultatams. LPT metodo mažesnės aptikimo ribos nustatant makrolidus (eritromiciną),

aminoglikozidus (gentamiciną) nei LPT2 ar Delvotest SP-NT metodais. Tyrimų duomenys pateikti

8 pav.

57,56

17,57

13,05

LPT LPT2 DELVO

8 pav. Metodų palyginamoji analizė pagal mėginių, kuriuose aptiktos inhibitorinės medžiagos,

skaičių, procentais

35

Neparametrinė analizė χ2 testu (4 lentelė) parodė, kad inhibitorinių medžiagų tyrimo

metodai, lyginant jais nustatytų mėginių dažnius, statistiškai patikimai siejosi, tiek lyginant atskirai

po du, tiek visus tris metodus kartu ( p<0,0001).

4 lentelė. Metodų tarpusavio ryšio įvertinimas

Metodai Χ2 df p <

LPT/LPT2/Delvotest SP-NT 1085,201 2 0,0001

LPT/LPT2 543,008

1 0,0001

LPT/ Delvotest SP-NT 211,951

1 0,0001

LPT2/ Delvotest SP-NT 27,159

1 0,0001

4.5. Inhibitorių nustatymo ir riebalų–baltymų santykio priklausomybė

Atlikus intervalinį pieno riebalų ir baltymų santykio grupavimą pagal klases, nustatėme,

kad 70,2 proc. požymio reikšmių yra susikoncentravusios ties vidurkiu (intervale nuo 1 iki 1,5) ir

nukrypę nuo aritmetinio vidurkio per ~0,5 standartinius nuokrypius (SD). Riebalų ir baltymų

santykis iki 1 nustatytas 8,5 proc. mėginių, o 1,5 ir daugiau – 21,3 proc. mėginių. Pagal gautus

tyrimo rezultatus matyti, kad daugumos karvių (n=1318) pieno sudėtis atitinka riebalų ir baltymų

santykio normą. Karvių, įtariamai sergančių ketoze (riebalų ir baltymų santykis >1,5), buvo 2,5

karto daugiau nei acidoze (riebalų ir baltymų santykis <1). Tyrimų duomenys apibendrinti 9

paveiksle.

8,5

70,2

21,3

iki 1 1-1,5 1,5 ir >

9 pav. Mėginių procentinė išraiška pagal riebalų-baltymų santykio klases

Daugiausiai teigiamų pieno mėginių, vertinant pagal riebalų-baltymų santykį, nustatyta

LPT metodu. Įtariamai acidoze sergančių karvių teigiamų pieno mėginių LPT metodu rasta 2,8

36

karto daugiau nei LPT2 ir 4,6 kartus daugiau nei Delvotest SP-NT metodu. Įtariamai ketoze

sergančių karvių teigiamų pieno mėginių LPT metodu rasta 6,7 karto daugiau nei LPT2 ir 5,5 karto

daugiau nei Delvotest SP-NT metodu. Tyrimų rezultatai rodo, kad LPT testas jautriausiai reagavo į

pakitusį riebalų ir baltymų santykį. Tyrimų rezultatai apibendrinti 5 lentelėje.

5 lentelė. Metodų jautrumas inhibitorinėms medžiagoms priklausomai nuo riebalų-baltymų

santykio pieno mėginiuose

Metodas

Riebalų ir baltymų santykis

iki 1 1-1,5 1,5 ir >

Nerasta Rasta Nerasta Rasta Nerasta Rasta

LPT 82 78 563 755 152 248

LPT2 132 28 1053 265 363 37

Delvotest

SP-NT

143 17

1135

183 355 45

Χ2= 69,326

DF = 2, p =

0,0001

Χ2= 685,801

DF = 2, p =

0,0001

Χ2= 358,596

DF = 2, p =

0,0001

Pieno riebalų ir baltymų santykis turėjo statistiškai reikšmingos įtakos inhibitorinių

medžiagų mėginių skaičiui, nustatytam skirtingais metodais tiek lyginant dažnių lentelių rezultatus

pagal atskirus metodus (5 lentelė), tiek visus tris metodus kartu ( 10 pav.)

0 10 20 30 40 50 60 70

iki 1

1-1,5

1,5 ir >

Rie

bal

ų ir

bal

tym

ų s

anty

kis

Mėginiai, kuriuose rasta inhibitorinių medžiagų , proc.

DELVO

LPT2

LPT

10 pav. Inhibitorinių medžiagų nustatymo metodo ir riebalų –baltymų santykio

priklausomybė

37

4.6. Somatinių ląstelių skaičiaus įtaka inhibitorinių medžiagų nustatymui

Tiriamuoju laikotarpiu daugiausiai mėginių, kuriuose nustatytos inhibitorinės

medžiagos, buvo 4 grupėje, kur buvo didžiausias SLS (701–1000 tūkst./ml.) ir skyrėsi 3,6 karto (11

pav.). Mėginių, kuriuose nustatytos inhibitorinės medžiagos, skaičius statistiškai reikšmingai

koreliavo su SLS karvių piene (χ2 = 64,527; l.n. = 3; p = 0,0001).

11,6

7,6

4,7

3,20

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1 grupė 2 grupė 3 grupė 4 grupė

SL

S,

tūkst.

/ml

0

2

4

6

8

10

12

14

INH

, p

roc.

SLS INH

11 pav. Somatinių ląstelių skaičiaus mėginiuose ir inhibitorinių medžiagų priklausomybė

Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad daugiausiai mėginių (11,6 proc.) su inhibitorinėmis

medžiagomis rasta ketvirtoje mėginių grupėje, kur SLS buvo daugiau kaip 701 tūkst./ml. Tai sutapo

su kitų mokslininkų duomenimis, patvirtinančiais SLS ir inhibitorinių medžiagų karvių piene

priklausomybę (Sargeant ir kt., 1998; Ruegg and Tabone, 2000; Saville ir kt., 2000; van Schaik ir

kt., 2002).

4.7. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų poveikis inhibitorių testams

4.7.1. Pieno ūkiuose naudojamų plovimo ir dezinfekavimo medžiagų cheminė sudėtis

Pradiniame darbo etape buvo analizuojama informacija apie naudojamas Lietuvoje pieno

ūkiuose plovimo ir dezinfekavimo medžiagas bei renkami šių medžiagų mėginiai. Šiuo metu

rinkoje yra didelė plovimo ir dezinfekavimo medžiagų, skirtų pieno ūkiams, pasiūla. Pagrindiniai

šių medžiagų tiekėjai yra firmos UAB „DeLaval“, UAB „Biržų žiemtiekimas“, UAB „Westfalia“,

AB „Lytagra“, UAB „Deimena“, UAB „Estko Kaunas“, UAB „Avena“. Siekiant užtikrinti

tyrimams naudojamų plovimo ir dezinfekavimo medžiagų kokybę ir autentiškumą, daugelis jų

38

gautos iš firmų-tiekėjų, kitos – iš pieno ūkių. Atlikus analizę, paaiškėjo, kad pieno ūkiuose

naudojamos plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, kurių pagrindinės veikliosios medžiagos yra

natrio hipochloritas, natrio ar kalio hidroksidai, aktyvusis chloras, vandenilio peroksidas, azoto

rūgštis, fosforo rūgštis, paviršiaus aktyviosios medžiagos, jodoforas (jodo-kalio jodido

kompleksas), pieno rūgštis. Dezinfekavimo medžiagos, priklausomai nuo jų cheminės sudėties,

įvairiai veikia mikroorganizmus. Plačiai naudojami preparatai, turintys savo sudėtyje aktyviojo

chloro ar jo junginių, kurie stipriai veikia baktericidiškai. Spenių higienai ir dezinfekcijai dažnai

naudojami preparatai su jodu ar jodoforu. Tyrimams naudotos plovimo ir dezinfekavimo medžiagos

suskirstytos į tris pagrindines grupes:

šarminės plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos melžimo įrangai, inventoriui

plauti ir dezinfekuoti;

rūgštinės plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos melžimo įrangai, inventoriui

plauti ir dezinfekuoti;

plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos spenių higienai ir dezinfekcijai.

Šių medžiagų cheminė sudėtis pateikta atitinkamai 6, 7 ir 8 lentelėse.

6 lentelė. Melžimo įrangai, inventoriui plauti ir dezinfekuoti skirtos šarminės plovimo ir

dezinfekavimo medžiagos ir jų sudėtis

Eil.

Nr.

Plovimo/ dezinfekavimo

medžiaga Pagrindinės veikliosios medžiagos

1. Ultra Natrio hipochloritas 5-10 %, natrio tripolifosfatas <5 %, kalio

hidroksidas 5-10 %

2. Super Natrio hipochloritas 5-15 %, natrio hidroksidas 5-15 %

3. C – Alka Natrio hipochloritas 1-5 %, natrio hidroksidas 10-20 %,

4. Fresh – 25 Natrio hidroksidas 5-10 %, natrio hipochloritas 10-20 %

5. Qualiton A Natrio hipochloritas (5,9 % aktyvaus chloro), natrio hidroksidas,

poliakrilatas

6. F 209 Capo-Tab Natrio dichlorizocianurato dehidratas (56 % aktyviojo chloro)

7. F 207 Capo Natrio dichlorizocianurato dehidratas (56 % aktyviojo chloro)

8. Mixi Natrio metasilikatas 5-15 %, natrio karbonatas >30 %, natrio

polifosfatas 5-15 %, paviršiaus aktyviosios medžiagos

9. VIP 1 Natrio hipochloritas<1 %, fosfatai <5 %, kalio hidroksidas <3 %

10. DeLaval dish cleaner Natrio hidroksidas 1-5 %, natrio laurilo polioksietileno eterio sulfatas

5-10 %

11. Chloro tabletės Natrio dichlorizocianurato dehidratas 30-60 %

12. CircoTip AF Natrio hipochloritas 2,5-10 %

13. F 205 Virkku Natrio hipochloritas <5 %, natrio hidroksidas 5-15 %

14. F 261 Kloriitti forte Natrio hipochloritas (<10 % aktyviojo chloro), natrio hidroksidas 0,5-

2,0 %

15. F 208 Nanneli Anijoninės paviršiaus aktyviosios medžiagos 5 %, glicerolis <5 %,

muilas 5-15 %

16. F 201 Tisko Natrio silikatas <5 %, natrio karbonatas 5-15 %, anijoninės paviršiaus

aktyviosios medžiagos 5-15 %, nejoninės paviršiaus aktyvioios

medžiagos <5 %

39

Eil.

Nr.

Plovimo/ dezinfekavimo

medžiaga Pagrindinės veikliosios medžiagos

17. Desomix Natrio dichlorizocianurato dehidratas (< 10 % aktyviojo chloro), natrio

metasilikatas, paviršiaus aktyviosios medžiagos

18. Manuren Natrio karbonatas 30-60 %, silicilo rūgštis <5 %, etoksilinti alkoholiai

1-5 %, dinatrio metasilikatas 5-15 % anijoninės paviršiaus aktyviosios

medžiagos 1-5 %

7 lentelė. Melžimo įrangai, inventoriui plauti ir dezinfekuoti skirtos rūgštinės plovimo ir

dezinfekavimo medžiagos ir jų sudėtis

Eil.

Nr.

Plovimo/dezinfekavimo

medžiaga Pagrindinės veikliosios medžiagos

1. Cidmax Fosforo rūgštis 10-20 %, sieros rūgštis 5-10 %

2. Cid Fosforo rūgštis 15-30 %, sieros rūgštis 5-15 %

3. N – Cid Azoto rūgštis 40-50 %

4. Qualiton SO Vandenilio peroksidas 2,8 %, sieros rūgštis, fosforo rūgštis,

alkoholio etoksilastas

5. F 210 Hygisept Sulfamino rūgštis 5-15 %, fosfatai 15-30 %, kalio persulfatas

>30 %, anijoninės paviršiaus aktyviosios medžiagos <5 %

6. VIP 2 Azoto rūgštis 15-30 %, fosforo rūgštis 5-15 %

7. CircoTop SFM Azoto rūgštis 10-20 %, fosforo rūgštis 5-15 %

8. F 206 Torkku Azoto rūgštis 30 %

8 lentelė. Spenių higienai ir dezinfekcijai skirtos plovimo ir dezinfekavimo medžiagos ir jų

sudėtis

Eil.

Nr.

Plovimo/ dezinfekavimo

medžiaga Pagrindinės veikliosios medžiagos

1. Biofoam Pieno rūgštis <2 %, etanolis <5 %

2. Fink Io Dip 25 Jodas 0,25 %, polivinilpirolidonas, lanolinpolietoksilatas,

glicerolis

3. Nova-Dip Barriere Polivinilpirolidono jodas 0,8 %

4. Viri Foam Kokamidopropilbetainas <5 %, anijoninės ir nejoninės

paviršiaus aktyviosios medžiagos <5 %, poliheksametileno

biguanidas <1 %

5. Viri-Barriere Dip Pieno rūgštis <5%, balinimo agentas <5% geraniolis <5%

6. Viri Te Dip Pieno rūgštis<5 %, dodecilbenzensulfoninės rūgšties natrio

druska <5 %

7. LuxDip 50B Jodas 0,5 %

8. Vissi-Tissi Amfoterinės ir anijoninės paviršiaus aktyviosios medžiagos 3-

15 %, glicerinas 0,5-2 %, natrio chloridas 1-3 %, etanolis 1-3 %

9. Vissi-Tipp Polivinilpirolidono jodas 3 %

10. Blockade Jodas 0,24 %

40

4.7.2. Pieno ūkiuose naudojamų plovimo ir dezinfekavimo medžiagų įtaka inhibitorių

nustatymo žaliame piene rezultatams

Netinkamai naudojant plovimo ir dezinfekavimo medžiagas pieno ūkiuose, jų likučiai galėtų

pakliūti į pieną. Atlikome tyrimus siekiant nustatyti, ar inhibitorių aptikimo testai yra jautrūs

plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučiams žaliame piene. Ištirta 18 šarminių, 8 rūgštinės

plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos melžimo įrangai, inventoriui plauti ir dezinfekuoti.

Naudoti keturi inhibitorių nustatymo testai (Delvotest SP-NT, Charm 3MRL BL/TET 2, Charm

ROSA MRL BL/TET, Penzym) ir tirtos trys kiekvieno preparato koncentracijos. Gauti tyrimų

rezultatai pateikti 9 ir 10 lentelėse.

9 lentelė. Šarminių plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių įtaka inhibitorių nustatymo

piene rezultatams

Eil.

Nr.

Plovimo/dezinfekavimo

medžiaga

Koncentracija

žaliame piene,

%

Metodo pavadinimas

Delvotest

SP-NT

Charm 3

MRL

BL/TET 2

Charm

ROSA MRL

BL/TET

Penzym

Neigiama kontrolė – – – – –

1. Ultra 0,08 – – – –

0,8

– – – ±

1,6 – x x ±

2. Super 0,08 – – – –

0,8 – – – ±

1,6 – x x ±

3. C-Alca 0,08 – – – –

0,8 – x – –

1,6 + x x –

4. Fresh-25 0,08 – – – –

0,8 – – – ±

1,6 – x x ±

5. F 205 Virkku 0,08 – – – –

0,8 – x – –

1,6 – x – –

6. F 261 Kloriitti forte 0,03 – – – –

0,3 – – – ±

0,6 – – – ±

7. F 201 Tisko 0,045 – – – –

0,45 + – – ±

0,9 + – – ±

8. Qualiton A 0,05 – – – –

0,5 – – – –

1,0 – – – –

9. F 209 Capo-Tab 0,0046 – – – –

0,046 – – – –

0,092 – – – –

10. Chloro tabletes 0,0036 – – – –

0,036 – – – –

41

Eil.

Nr.

Plovimo/dezinfekavimo

medžiaga

Koncentracija

žaliame piene,

%

Metodo pavadinimas

Delvotest

SP-NT

Charm 3

MRL

BL/TET 2

Charm

ROSA MRL

BL/TET

Penzym

0,072 – – – –

11. F 208 Nanneli 0,05 – – – –

0,5 – – – –

1,0 – – – –

12. F 207 Capo 0,0035 – – – –

0,035 – – – –

0,07 – – – –

13. Mixi 0,08 – – – –

0,8 + x x –

1,6 + x x ±

14. VIP 1 0,3 – – – –

3,0 + x x –

6,0 + x x –

15. DeLaval dish cleaner 0,08 – – – –

0,8 – – – –

1,6 + – – –

16. Desomix 0,08 – – – –

0,16 – – – –

0,8 + – – –

1,6 + x x ±

17. Circo Tip AF 0,04 – – – –

0,4 – – – –

0,8 – – – –

18. Manuren 0,04 – – – –

0,4 + – – –

0,8 + x – –

„+“ inhibitorių rasta; „–“ inhibitorių nerasta; „±“ įtariama, kad tiriamajame piene yra inhibitorių;

„x“ – testo reakcija nebūdinga (nesusidarė kontrolinė arba testų juostelės; supylus mėginį, jis neslinko per

rezultatų laukelį)

P.S. lentelėje paryškinta gamintojų rekomenduota koncentracija ir gauti inhibitorių nustatymo rezultatai

Remiantis tyrimų duomenimis, nustatyta, kad visuose mėginiuose, kuriuose plovimo ir

dezinfekavimo medžiagos koncentracija buvo dešimtkart mažesnė kaip rekomenduoja gamintojai,

inhibitorių nebuvo rasta. Tačiau esant gamintojų rekomenduotai ir du kartus didesnei plovimo ir

dezinfekavimo medžiagos koncentracijai, gauti skirtingi tyrimų rezultatai priklausomai nuo

naudojamo testo jautrumo ir veikliųjų medžiagų prigimties.

10 lentelė. Rūgštinių plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių įtaka inhibitorių nustatymo

piene rezultatams

Eil.

Nr.

Plovimo/dezinfekavimo

medžiaga

Koncentracija

žaliame piene,

%

Metodo pavadinimas

Delvotest

SP-NT

Charm 3

MRL

BL/TET 2

Charm

ROSA MRL

BL/TET

Penzym

Neigiama kontrolė – – – – –

1. Cidmax 0,08 – – – –

0,8 – x – ±

42

Eil.

Nr.

Plovimo/dezinfekavimo

medžiaga

Koncentracija

žaliame piene,

%

Metodo pavadinimas

Delvotest

SP-NT

Charm 3

MRL

BL/TET 2

Charm

ROSA MRL

BL/TET

Penzym

1,6 – x x ±

2. Cid 0,08 – – – –

0,8 – – – –

1,6 – x – –

3. N-Cid 0,08 – – – –

0,8 – x – +

1,6 – x – +

4. F 210 Hygisept 0,2 – – – –

2,0 – x x –

4,0 – x x ±

5. Qualiton SO 0,05 – – – –

0,5 – – x +

1,0 – x x +

6. VIP 2 0,1 – – – –

1,0 – x x –

2,0 – x x +

7. Circo Top SFM 0,04 – – – –

0,4 – – – –

0,8 – – – –

8. F 206 Torkku 0,08 – – – –

0,8 – – – +

1,6 – x x +

„+“ inhibitorių rasta; „–“ inhibitorių nerasta; „±“ įtariama, kad tiriamajame piene yra inhibitorių;

„x“ testo reakcija nebūdinga (nesusidarė kontrolinė arba testų juostelės; supylus mėginį, jis neslinko per

rezultatų laukelį)

P.S. Lentelėje paryškinta gamintojų rekomenduota koncentracija ir gauti inhibitorių nustatymo rezultatai

Ištyrus inhibitorių testų jautrumą (7 ir 8 lentelės), nustatyta, kad jautriausi šarminių ir

rūgštinių plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučiams buvo Delvotest SP-NT (inhibitorių aptikta

12 mėginiuose) ir Penzym (inhibitorių aptikta 7 mėginiuose ir 15 mėginiuose buvo įtariama, kad yra

inhibitorių). Delvotest SP-NT buvo jautrus šarminėms plovimo ir dezinfekavimo medžiagoms: F201

Tisko (0,45 %), Mixi (0,8 %), VIP 1 (3,0 %), DeLaval dish cleaner (1,6 %), Desomix (0,8 %),

Manuren (0,4 %). Penzym testas buvo jautrus ir šarminėms (15 mėginių, kuriuose įtariama, kad yra

inhibitorių), ir rūgštinėms (inhibitorinių medžiagų rasta) plovimo ir dezinfekavimo medžiagoms.

Juo aptiktos šių rūgštinių plovimo medžiagų likučiai piene: N-Cid (0,8 %), Qualition SO (0,8 %), F

206 Torkku (0,8 %). Naudojant inhibitorių testus Charm 3 MRL BL/TET 2, Charm ROSA MRL

BL/TET plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučiai piene nebuvo aptikti arba tyrimo rezultatai

buvo nebūdingi. Imunininio receptorių metodų testai Charm 3 MRL BL/TET 2, Charm ROSA MRL

BL/TET tyrimų rezultatai negalėjo būti įvertinami dėl kontrolinių ir testavimo juostelių

nesusidarymo ar bandymų procedūros sutrikimų (pakitusi pieno konsistencija). Tokiais atvejais

buvo galima tik įtarti, kad piene būta plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių.

43

Tyrimams naudota 10 plovimo ir dezinfekavimo medžiagų, skirtų spenių higienai ir

dezinfekcijai. Aštuoni preparatai naudojami neskiesti, todėl tirtos 10,0 %, 5,0 % ir 2,5 %

koncentracijos piene. Dviejų preparatų – „Vissi-Tissi“ ir „Vissi-Tipp“ – rekomenduojamą

koncentraciją nurodo gamintojai, todėl tirtos koncentracijos: rekomenduojama, dešimt kartų

mažesnė ir du kartus didesnė už rekomenduojamą. Gauti tyrimų rezultatai pateikti 11 lentelėje.

11 lentelė. Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų, naudojamų spenių higienai ir dezinfekcijai,

įtaka inhibitorių nustatymo piene rezultatams

Eil.

Nr.

Plovimo/dezinfekavimo

medžiaga

Koncentracija

žaliame piene,

%

Metodo pavadinimas

Delvotest

SP-NT

Charm 3

MRL

BL/TET 2

Charm

ROSA

MRL

BL/TET

Penzym

Neigiama kontrolė – – – – –

1. Biofoam 2,5 – – – ±

5,0 – – – ±

10,0 + – – ±

2. Fink Io Dip 25 2,5 – – – –

5,0 – – – –

10,0 – x – ±

3. Viri Foam 2,5 + – – –

5,0 + – – –

10 + – – x

4. Nova-Dip Barriere 2,5 – – – –

5,0 – – – –

10,0 – x – x

5 Viri Te Dip 2,5 – – – –

5,0 – – – –

10,0 + x – ±

6. LuxDip 50B 2,5 – – –

5,0 – – –

10,0 – – – ±

7. Viri-Barriere Dip 2,5 – – – –

5,0 – – – –

10,0 – x – x

8. Blockade 2,5 – – – –

5,0 – – – –

10,0 – – – –

9. Vissi-Tissi 0,05 – – – –

0,5 – – – –

1,0 – – – –

10. Vissi-Tipp 3,3 – – – –

33 ,0 ± – – –

66,0 + – – –

„+“ inhibitorių rasta; „–“ inhibitorių nerasta; „±“ įtariama, kad tiriamajame piene yra inhibitorių;

„x“ testo reakcija nebūdinga (testo spalva po inkubavimo neatitinka skalėje nurodytoms spalvoms,

nesusidarė kontrolinė arba testų juostelės; supylus mėginį jis neslinko per rezultatų laukelį)

P.S. Lentelėje paryškinta gamintojų rekomenduota ir 10 % koncentracijos bei gauti inhibitorių nustatymo

rezultatai

44

Iš 11 lentelės duomenų matyti, kad jautriausi spenių higienai ir dezinfekavimui skirtų

medžiagų likučiams buvo Delvotest SP-NT (inhibitorių aptikta 6 mėginiuose) bei Penzym (6

mėginiuose buvo įtariama, kad yra inhibitorių). Be to, naudojant Penzym testą pienui su preparatų

Viri Foam (10 %), Viri-Barriere Dip (10 %), Nova-Dip Barriere (10 %) likučiais, gauta nebūdinga

ryškiai raudona spalva. Naudojant testus Charm 3 MRL BL/TET 2, Charm ROSA MRL BL/TET

rezultatai buvo neigiami arba nebūdingi, ir todėl buvo galima tik įtarti, kad piene būta plovimo ir

dezinfekavimo medžiagų likučių.

Atlikus tyrimus paaiškėjo, kad plačiausiam plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių

spektrui jautriausias yra mikrobiologinis metodas Delvotest SP-NT (jautrus 10 medžiagų) ir Penzym

testas (jautrus 7 medžiagoms). Naudojant Penzym testą plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių

aptikimui žaliame piene, dažniau (19 medžiagų) buvo gautas rezultatas, kad įtariamas inhibitorinių

medžiagų buvimas.

AB „Pieno žvaigždės“ prašymu nustatyta žalio pieno konservanto „Sedupolas“ įtaka

inhibitorių testų rezultatams. Tyrimams parinkta rekomenduota pienui konservuoti koncentracija bei

du kartus didesnė ir mažesnės už rekomenduojamą atitinkamai 10 ir 15 kartų. Žalio pieno

konservanto „Sedupolas“ pagrindinės medžiagos yra bronopolas (8 mg) ir natamicinas (0,3 mg).

Jautriausias šioms medžiagoms buvo Delvotest SP-NT. Inhibitorinės medžiagos aptiktos

mėginiuose su rekomenduojama, 2 kartus didesne ir 10 kartų mažesne koncentracija. Esant 15 kartų

mažesnei koncentracijai, inhibitorinių medžiagų nerasta visais metodais. Penzym testu aptikta

inhibitorinių medžiagų, kai konservanto koncentracija buvo du kartus didesnė už rekomenduojamą

(12 lentelė).

12 lentelė. Konservanto „Sedupolas“ įtaka inhibitorių nustatymo piene rezultatams Žalio pieno

konservantas

Konservanto kiekis piene Metodo pavadinimas

Delvotest SP-NT

Charm 3

MRL

BL/TET 2

Charm

ROSA

MRL

BL/TET

Penzym

Sedupolas 1 tabletė/600 ml pieno – – – –

1 tabletė/400 ml pieno + – – –

1 tabletė/40 ml pieno + – – –

1 tabletė/20 ml pieno + – – ±

„+“ inhibitorių rasta; „–“ inhibitorių nerasta; „±“ įtariama, kad tiriamajame piene yra inhibitorių

P.S. Lentelėje paryškinta žalio pieno konservavimui naudojama koncentracija ir gauti tyrimo rezultatai

45

Plovimo ir dezinfekavimo medžiagų, gautų iš AB „Žemaitijos pienas“ pieno supirkimo

zonos, likučių įtaka inhibitorių testų rezultatams nustatyta naudojant β-STAR testus. Gauti tyrimų

rezultatai pateikti 13 lentelėje.

13 lentelė. Testo β-STAR jautrumas plovimo ir dezinfekavimo medžiagų (gautų iš AB

„Žemaitijos pienas“ pieno supirkimo zonos) likučiams Testo

pavadinimas

Plovimo/dezinfekavimo medžiaga, koncentracija žaliame piene, %

Desomix F 201 Tisko Vissi-Tissi Vissi-Tipp

0,08 0,16 0,8 0,05 0,1 0,5 0,01 0,05 0,5 3,3 6,6 33

β-STAR – + + – – + – – – – – x

„+“ inhibitorių rasta; „–“ inhibitorių nerasta „x“ testo reakcija nebūdinga (išnyko kontrolinė ir testų

juostelės)

P.S. Lentelėje paryškinta gamintojų rekomenduota koncentracija ir gauti tyrimo rezultatai

Spartusis testas β-STAR buvo jautrus tik 0,16 proc. Desomix ir 0,5 proc. F 201 Tisko

koncentracijai.

Gautų tyrimų rezultatų palyginimas atliktas naudojant MacNemar testą. Naudojant Penzym,

Charm ROSA MRL BL/TET Charm ir 3 MRL BL/TET 2 buvo gauti nebūdingi rezultatai, kai buvo

galima įtarti, kad piene yra plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių. Todėl atliekant testų

palyginimą su pamatinio metodo analogu Delvotest SP-NT, tyrimų rezultatai, kurie buvo nebūdingi,

vienu atveju buvo priskirti prie neigiamų (inhibitorių nerasta) tyrimo rezultatų, kitu atveju priskirti

prie teigiamų (inhibitorių rasta) (14 ir 15 lentelės).

14 lentelė. Delvotest SP-NT (pamatinio metodo analogo) palyginimas su kitais testais, kurių

nebūdingi rezultatai nepriskirti teigiamiems

Metodas Reikšmė Z

z/21 Palyginimo rezultatas

Delvotest SP-NT – Charm 3

MRL BL/TET 2 3,74

2 1,96 preparatų jautrumas skiriasi

Delvotest SP-NT – Charm

ROSA MRL BL/TET 3,74 1,96 preparatų jautrumas skiriasi

Delvotest SP-NT – Penzym 1,723 1,96 tarp preparatų jautrumo skirtumo nėra

(NN/2)-1=53. 1z/2= 1,96 randamas normalinio skirstinio N (0,1) kritinių reikšmių lentelėse.

2 kai Z> z/2, preparatų jautrumas skiriasi.

3 kai Z< z/2, tarp preparatų jautrumo skirtumo nėra.

15 lentelė. Delvotest SP-NT (pamatinio metodo analogo) palyginimas su kitais testais, kurių

nebūdingi rezultatai priskirti teigiamiems

Metodas Reikšmė Z

z/21 Palyginimo rezultatas

Delvotest SP-NT – Charm 3

MRL BL/TET 2 1,46

2 1,96 tarp preparatų jautrumo skirtumo nėra

Delvotest SP-NT – Charm

ROSA MRL BL/TET 0,84 1,96 tarp preparatų jautrumo skirtumo nėra

Delvotest SP-NT – Penzym 1,44 1,96 tarp preparatų jautrumo skirtumo nėra

(NN/2)-1=53. 1z/2= 1,96 randamas normalinio skirstinio N (0,1) kritinių reikšmių lentelėse.

2 kai Z< z/2, tarp preparatų jautrumo skirtumo nėra.

46

Atlikus testų palyginimą, kai Charm ROSA MRL BL/TET, CHARM 3 MRL BL/TET 2,

Penzym nebūdingi tyrimo rezultatai priskirti teigiamiems, nustatyta, kad tarp tirtų inhibitorių

nustatymo testų jautrumo statistiškai reikšmingų skirtumų nėra.

Tyrimų rezultatai rodo, kad plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučuiams žaliame piene

nustatyti labiausiai tinka preparatai Delvotest SP-NT ir Penzym. Spartieji testai Charm 3 MRL

BL/TET 2 ir Charm ROSA MRL BL/TET skirti penicilino ir tetraciklino likučių piene nustatymui.

Kai tiriant pieną sparčiaisiais testais gautų tyrimų rezultatai nebūdingi ar neįvertinami (neišryškėja

kontrolinė arba kontrolinė ir antibiotikų – penicilino ir tetraciklino – buvimą rodančios testų

juostelės, supylus mėginį, jis neslenka per rezultatų laukelį ir pan.), galima įtarti, kad tiriamajame

piene yra plovimo bei dezinfekavimo medžiagų likučių.

4.8. Informacinio leidinio apie inhibitorius piene rengimas

2011-2012 m. susisteminta surinkta medžiaga – literatūros duomenys, per pastarąjį

dešimtmetį KTU MI bei 2011-2012 m. LSMU VA atliktų tyrimų rezultatai – inhibitorių piene

klausimu ir parengta informacinio leidinio pirmoji redakcija, kuri pateikta ataskaitos 3 priede.

Leidinio 1 priede pateikti mikrobiologinių metodų, skirtų inhibitoriams (antimikrobinėms

medžiagoms) identifikuoti, aprašymai, o 2 priede – šiuo metu pasaulio rinkoje visų esančių

mikrobiologinių ir imuninio arba receptorių tyrimo metodais pagrįstų testų aprašymai pagal

Tarptautinės pienininkystės federacijos medžiagą. Leidinio pagrindą 2011 m. parengė KTU MI,

2012 m. leidinys papildytas nauja literatūra ir LSMU VA atliktų tyrimų rezultatais. Leidinio 4

skyrių rengė LSMU (su atitinkama literatūros apžvalgos dalimi), o likusius – KTU MI darbuotojai.

Autorių siūlymu leidinio, skirto plačiam žemės ūkio, veterinarijos ir pieno pramonės

specialistų ratui, pavadinimas pakeistas iš buvusio 2011 m. „Inhibitorių problemos pienininkystėje“

į „Biologinių ir cheminių veiksnių įtaka antimikrobinių medžiagų tyrimams piene“.

2012 m. lapkričio 6 d. su KTU MI raštu (KTU MI rašto kopija – 2 priedas) leidinio pirmoji

redakcija išsiųsta suinteresuotoms įstaigoms (ŽŪM, VMVT, VĮ „Pieno tyrimai) pastaboms ir

pasiūlymams. Lapkričio mėn. pabaigoje, gavus pastabas ir pasiūlymus, bus paruošta galutinė

leidinio redakcija, tada leidinys bus paruoštas spaudai.

47

4.9. Projekto rezultatų sklaida

Publikacijos

1. Straipsnis “Impact of the Residues of Detergents and Disinfectants Used in Dairy Farms on

the Results of Inhibitor Tests for Raw Milk” (aut. Šalomskienė J., Mačionienė I.,

Žvirdauskienė R., Jonkuvienė D.) atiduotas į „Veterinarija ir zootechnika“ redakciją š.m.

spalio mėn.

2. Straipsnis „Somatinių ląstelių ir inhibitorinių medžiagų tyrimai ganykliniu laikotarpiu“ (aut.

Kondrotaitė D., Musayeva K., Želvytė R., Juozaitienė V., Mockevičienė I., Sederevičius A.)

atiduotas į „Veterinarija ir zootechnika“ redakciją š.m. rugsėjo mėn.

3. Tezės “Impact of Disinfectant Residues on the Results of Inhibitor Tests for Raw Milk” (aut.

Šalomskienė J., Mačionienė I., Žvirdauskienė R., Jonkuvienė D., Jasinauskienė D.) 23rd

International ICFMH Symposium FoodMicro 2012. Global Issues in Food Microbiology.

Abstract Book, p. 90.

Pranešimai

1. 2012 m. rugsėjo 4 d. J. Šalomskienės žodinis pranešimas 23-iame tarptautiniame ICFMH

simpoziume FoodMicro 2012 Stambule.

2. 2012 m. rugsėjo 27-28 d. tarptautinėje mokslinėje konferencijoje „Žemės ūkio gyvulių

fiziologija“ stendinis pranešimas „Comparison of Delvo SP-NT and LPT methods for

determining inhibitors in raw milk“.

3. 2012 m. lapkričio 9 d. J. Šalomskienės žodinis pranešimas „Dezinfekantų likučių įtaka

inhibitorių testų, skirtų žaliam pienui, rezultatams“ KTU MI konferencijoje „Inovatyvūs ir

įprastiniai maisto produktai, tyrimai ir rezultatai“.

4. 2012 m. lapkričio 9 d. R. Žvirdauskienės žodinis pranešimas „Pieno perdirbimo įmonėse

naudojamų plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučių poveikis inhibitorių testams“ KTU

MI konferencijoje „Inovatyvūs ir įprastiniai maisto produktai, tyrimai ir rezultatai“.

5. 2012 m. spalio 26 d. J. Šalomskienės žodinis pranešimas „Dezinfekantų likučių įtaka

inhibitorių testų, skirtų žaliam pienui, rezultatams“ seminare AB „Rokiškio sūris“

darbuotojams.

6. Numatomas J. Šalomskienės pranešimas „Dezinfekantų likučių įtaka inhibitorių testų, skirtų

žaliam pienui, rezultatams“ Lietuvos Pienininkystės Nacionalinio komiteto nariams š. m.

gruodžio mėn.

7. Numatomas A. Sederevičiaus pranešimas LSMU VA projekto dalies tematika Lietuvos

Pienininkystės Nacionalinio komiteto nariams š. m. gruodžio mėn.

48

5. Išvados ir rekomendacijos

5.1. Išvados

4.1 dalies 2011 m. išvados:

1. Ištyrus 735 sveikų karvių žalio pieno mėginius, nustatyta, kad 9 proc. tirtų mėginių

rasta inhibitorinių medžiagų.

2. Karvių, kurių piene somatinių ląstelių skaičius (SLS) buvo nuo 101 iki 200 tūkst./ml,

inhibitorinių medžiagų nustatyta 11 proc. daugiau palyginus su karvių, kurių piene SLS buvo ne

didesnis kaip 100 tūkst./ml. Taigi, didėjant SLS piene, didėja tikimybė rasti inhibitorinių medžiagų.

3. Daugiau inhibitorinių medžiagų nustatyta rugsėjo ir spalio mėnesiais.

4.2-4.6 dalies 2012 m. išvados:

1. Ištyrus 592 žalio pieno mėginius, nustatyta, kad 28 proc. tirtų mėginių rasta

inhibitorinių medžiagų. Vidutinis somatinių ląstelių skaičius buvo 1425 tūkst./ml, todėl galima

įtarti, kad karvės sirgo dažniausiai pasitaikančia infekcine liga – mastitu. Dažniausiai nustatytas

mastito sukėlėjas buvo Staphylococcus aureus.

2. Ištyrus pieno mėginius inhibitorinių medžiagų aptikimui Lietuvoje atsiskaitymo

tikslams patvirtintais mikrobiologiniais metodais (LPT, LPT2, Delvotest SP-NT) daugiausiai (58

proc.) teigiamų rezultatų nustatyta LPT metodu.

3. Ištyrus pieno mėginius inhibitorinių medžiagų aptikimui Lietuvoje atsiskaitymo

tikslams patvirtintais mikrobiologiniais metodais (LPT, LPT2, Delvotest SP-NT), riebalų ir baltymų

santykis turėjo statistiškai reikšmingos įtakos inhibitorinių medžiagų mėginių skaičiui. LPT testas

jautriausiai reagavo į neatitinkantį normos riebalų ir baltymų santykį, ypač kai pieno riebalų ir

baltymų santykis buvo 1,5 ir daugiau (inhibitorinės medžiagos nustatytos 62 proc. mėginių).

4. Tarp somatinių ląstelių skaičiaus ir inhibitorinių medžiagų nustatyta tiesioginė

priklausomybė, t.y. kuo piene daugiau somatinių ląstelių, tuo didesniame mėginių skaičiuje aptiktos

inhibitorinės medžiagos.

49

4.7 dalies išvados:

1. Išanalizavus gautus tyrimų duomenis, nustatyta, kad iš šiuo metu Lietuvoje

naudojamų inhibitorių nustatymo testų jautriausi plovimo ir dezinfekavimo medžiagų likučiams

piene yra mikrobiologinis metodas Delvotest SP-NT ir fermentinis metodas Penzym.

2. Delvotest SP-NT aptiktos šios šarminės plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos

melžimo įrangai ir inventoriui plauti ir dezinfekuoti: C Alca 1,6 %, F201 Tisko (0,45 %), Mixi

(0,8 %), VIP 1 (3,0 %), DeLaval dish cleaner (1,6 %), Desomix (0,8 %), Manuren (0,4 %).

3. Penzym testu aptiktos šios rūgštinės plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, skirtos

melžimo įrangai ir inventoriui plauti ir dezinfekuoti: N-Cid (0,8 %), Qualiton SO (0,5 %), VIP 2

(2,0 % ), F 206 Torkku (0,8 %).

4. Patekus į žalią pieną preparatų, skirtų spenių higienai ir dezinfekcijai (10 % Biofoam,

10 % Viri Te Dip bei 2,5 % Viri Foam), Delvotest SP-NT testais jame aptinkami inhibitoriai.

5. Spartieji testai – Charm 3 MRL BL/TET 2, Charm ROSA MRL BL/TET – skirti

penicilino ir tetraciklino likučių piene nustatymui, tačiau, kai tiriant pieną šiais testais gautų tyrimų

rezultatai nebūdingi (nesusidaro kontrolinės arba testavimo juostelės, nebūdinga testo spalva),

galima įtarti, kad tiriamajame piene yra plovimo bei dezinfekavimo medžiagų likučių.

50

5.2. Rekomendacijos

5.2.1. Rekomendacijos kaip elgtis gaminant žaliavinį pieną, aptikus inhibitorines medžiagas,

ir kaip išvengti jų patekimo į pieną

1) Aptikus inhibitorines medžiagas, pienas negali būti vartojamas maistui, jis turi būti

sunaikinamas.

2) Gydomas karves būtina atskirti nuo sveikų, paženklinant specialiais raiščiais ar kitais būdais.

3) Gydant gyvulius, laikomasi veterinarijos gydytojo nurodymų ir paskirto vaisto vartojimo

instrukcijos, ypač atkreipiant dėmesį į vaisto karencijos periodą. Gydymo ir vaisto karencijos

metu pienas yra kenksmingas žmonių sveikatai.

4) Privaloma užregistruoti žurnale apie vaistų panaudojimą.

5) Sergančius galvijus būtina melžti pabaigoje, į atskirą talpyklą. Po melžimo šį pieną reikia

sunaikinti arba panaudoti ne maisto gamybai.

6) Jei karvei buvo suleisti preparatai prieš mastitą, pieną po kiekvieno melžimo reikia tirti dėl

inhibitorinių medžiagų. Tik neradus jų, šį pieną galima naudoti.

7) Po plovimo ir dezinfekavimo būtina gerai išplauti melžimo, pieno aušinimo ir kitus indus

dideliu kiekiu vandens.

8) Jei prieš užtrūkstant karvei (po paskutiniojo melžimo) buvo sušvirkšti ilgo veikimo

antimastitiniai preparatai, ir karvė atsivedė anksčiau negu buvo numatyta, tai po kiekvieno

melžimo tokios karvės pieną būtina ištirti, ar jame nėra inhibitorinių medžiagų. Tik įsitikinus,

kad jų nėra, šį pieną galima pilti į bendrą talpą ir jį parduoti.

9) Melžiamų karvių negalima šerti supelijusiais, mikotoksinais užterštais pašarais.

10) Siekiant, kad žaliava su inhibitorinėmis medžiagomis nepatektų į gamybą, o pieno gamintojai,

perdirbėjai ir pardavėjai nepatirtų didžiulių ekonominių nuostolių, papildomą inhibitorinių

medžiagų kontrolę pagal patvirtintą įmonės savikontrolės sistemą turi vykdyti ir pačios

perdirbimo įmonės, prieš pradėdamos gaminti pieno produktus.

11) Sergančios lėtiniu mastitu karvės turi būti brokuojamos, nes jos yra vienintelis mastito

infekcijos šaltinis visai bandai.

12) Jeigu karvės negydomos, bet piene aptiktos inhibitprinės medžiagos, rekomenduojama atlikti

sudėties ir somatinių ląstelių skaičiaus tyrimus.

51

5.2.2. Rekomendacijos dėl plovimo ir dezinfekavimo medžiagų naudojimo pieno gamybos

ūkiuose

1. Netinkamas plovimo ir dezinfekavimo medžiagų naudojimas bei nepakankamas melžimo įrangos

bei inventoriaus išplovimas po dezinfekavimo gali būti viena iš pieno taršos inhibitoriais priežasčių.

2. Siūloma pakaitomis naudoti šarmines ir rūgštines plovimo ir dezinfekavimo medžiagas. Melžimo

įrangą bei inventorių po plovimo ir dezinfekavimo reikia praplauti dideliu kiekiu vandens ir taip

pašalinti naudotų medžiagų likučius.

3. Kadangi Delvotest SP-NT ir Penzym testais buvo aptiktos tik gamintojų rekomenduotos arba už

jas didesnės plovimo ir dezinfekavimo medžiagų koncentracijos (t.y. tokios, kurių piene negali

būti), teoriškai galinčių patekti į pieną minėtų medžiagų koncentracijų (iki 10 % nuo pieno kiekio)

šie metodai neaptinka.

4. Patekus į žalią pieną 2,5 % – 10 % preparatų, naudojamų spenių higienai ir dezinfekcijai

nepraskiedus, inhibitorių testais gali būti aptikti inhibitoriai.

5. Kai tiriant pieną sparčiaisiais testais gautų tyrimų rezultatai neaiškūs, nebūdingi ar neįvertinami

(nesusidaro kontrolinės ir/ar testavimo juostelės, nebūdinga testo spalva), pagal šiuos šalutinius

požymius galima įtarti, kad tiriamajame piene yra plovimo bei dezinfekavimo medžiagų likučių.

6. Konservuojant Sedupolu žalio pieno mėginius, skirtus kitų rodiklių nustatymui, elgtis su jais

atsargiai, kadangi 10 kartų praskiestame konservuotame pagal instrukciją mėginyje Delvotest SP-

NT metodu aptinkami inhibitoriai.

SUDERINTA: ………………………

Žemės ūkio ministerijos

Maisto ūkio tyrimų priežiūros komisijos

pirmininkė

Lilija Tepelienė

2011 m. …………………… mėn. ….. d.

52

6. Literatūra

1. Andrew S. M. Effect of Composition of Colostrum and Transition Milk from Holstein Heifers

on Specificity Rates of Antibiotic Residue Tests // J. Dairy Sci. 2001. Vol. 84. P. 100–106.

2. Andrew S. M., Frobish R. A., Paape M. J., and Maturin L. J. Evaluation of selected antibiotic

residue screening tests for milk from individual cows and examination of factors affecting the

probability of false positive outcomes // J. Dairy Sci. 1997. Vol. 80. P. 3050–3057.

3. Antonius C. M. van Hooijdonk, Kussendrager K. D. and. Steijns J. M. In vivo antimicrobial

and antiviral activity of components in bovine milk and colostrum involved in non-specific

defence // British Journal of Nutrition. 2000, 84, Suppl. 1, S. 127-134.

4. Bellamy W., Wakabayashi H., Takase M., Kawase K., Shimamura S. and Tomita M. Killing of

Candida albicans by lactoferricin B, a potent antimicrobial peptide derived from the N-terminal

region of bovine lactoferrin // Med. Microbiol. Immunol. (Berl), 1993.182. P. 97–105.

5. Carlsson A., Björck L., and Persson K. Lactoferrin and lysozyme in milk during acute mastitis

and their inhibitory effect in Delvotest P // J. Dairy Sci. 1989. Vol. 72. P. 3166–3175.

6. Carlsson, A., and L. Björck. The effect of some indigenous antibacterial factors in milk on the

growth of Bacillus stearothermophilus var. calidolactis // Milchwissenschaft. 1987. 42. S. 282.

7. Champagne C. P. Effect of penicillin on free or immobilized loctococci: milk acidification and

residual antibiotic level // Journal of Food Safety. 1992.Vol. 12. N 4. P. 327–337.

8. Commission decision of 14 February 1991 laying down certain methods of analysis and testing

of raw milk and heat-treated milk (91/180/EEC) // Official Journal of the European

Communities. 1993. No. 1. P. 0001–0048.

9. Cullor J. S., Van Eenennaam A., Smith W., Dellinger J., Perani L., and Jensen L. Antibiotic

residue assays: can they be used to test milk from individual cows? // Journal of Dairy Science

Vel. Med. 1992. 87. P.477.

10. Darbutas J., Čiurlys K. Kai kurių genetinių ir negenetinių veiksnių įtaka Lietuvos juodmargių ir

Lietuvos žalųjų karvių pieno baltymingumui // Žemės ūkio mokslai. 1999. Nr. 1. P. 57– 61.

11. Dėl didžiausių leistinų veterinarinės medicinos preparatų likučių kiekių gyvūniniuose maisto

produktuose. LR Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2000 m. gruodžio 29

d. įsakymas Nr. 395 // Valstybės žinios. 2001. Nr. 13. P. 66–98.

12. Drobni P., Naslund J. and Evander M. Lactoferrin inhibits human papillomavirus binding and

uptake in vitro. Antiviral Res. 2004.64. P. 63–68.

13. Dūkštas J., Kačerauskis D., Liutkevičius A., Ramanauskas R. Pieno perdirbimo technologija.

Vilnius.: MII IĮ "Mokslo aidai". 1994. P.1–65.

14. Dunham J. R., Smith J. F. Characteristics of Low Somatic Cell Count (SCC) Herds // Dairy

Science. 1985. October. P. 1– 5.

15. Fink-Gremmels J., Mycotoxins: their implications for human and animal health // Vet. Q.

1999. 21. P. 115–120.

16. Gaidžiūnienė N. Selekcija galima pagerinti pieno kokybę. Ūkininko patarėjas. 2003. Nr. 61.

17. Gaidžiūnienė N., Meškauskienė S. Pieninių galvijų selekcija. Vilnius: Ogamas. 2007. P. 32 -

35, 94 – 95, 109.

18. Gudelines for Establishing the Suitability of Food Microbiology Methods. Ed. By C. L. Baylis,

K. Jewell, C. A. Oscroft and F. L. Brookes. Gudeline. No. 29. 2001.

53

19. Gudonis A. Pieno ir pieno produktų ekspertizė. Kaunas: Technologija. 2002. 164 p.

20. Gudonis A. Pieno kokybė. Kaunas, 2007. P. 56.

21. Hillerton, J. E., Halley B. I., Neaves P., and Rose M. D. Detection of antimicrobial substances

in individual cow and quarter milk samples using Delvotest microbial inhibitor tests // J.Dairy

Sci. 1999. Vol. 82. P. 704–711.

22. Hurley W. L. Lactation biology. Departament of Animal Science university of Illinois. 2003. P.

43–233.

23. Japertas S. Kad pienas būtų kokybiškesnis // Mano ūkis. 2000. Nr. 1. P. 22.

24. Japertas S. Somatinės ląstelės – tešmens uždegimo rodiklis // Mano ūkis. 1998. Nr.12. P. 18–

19.

25. Japertas S. Stresas ir pieno kokybe // Mano ūkis. 1999. Nr. 6. P. 4.

26. Japertas S., Minkevičius V. Pienas ir jo kokybė. Valstybės įmonė „Pieno tyrimai“. 2002. 56 p.

27. Japertas S., Minkevičius V. Pienas ir jo kokybė. Valstybės įmonė „Pieno tyrimai“. 2004. 4-31p.

28. Juozaitienė V., Kučinskienė J., Juozaitis A., Malevičiūtė J. Lietuvoje veisiamų juodmargių

galvijų veislių įtakos somatinių ląstelių kiekiui piene įvertinimas // Veterinarija ir zootechnika.

2004. T.28 (50). 83 – 87 p.

29. Kang J. H., and F. Kondo. Occurrence of false-positive results of inhibitor on milk samples

using the Delvotest SP assay // J.Food Prot. 2001. 64. P.1211–1215.

30. Karen J. Losnedahl, Hong Wang, Mueen Aslam, Sixiang Zou, and Walter L. Hurley.

Antimicrobial Factors in Milk. Illini DairyNet Papers 1998.

31. Kijak P.J. Confirmation of chloramphenicol residues in bovine milk by gas chromatography /

mass spectrometry // Journal of the AOAC International. 1994. Vol. 77, No. 1. P. 34–40.

32. Kishida K. Food Control. 2007, 18. P.301–305.

33. Klimienė I., Mockeliūnas R., Butrimaitė-Ambrozevičienė Č. ir kt. Karvių mastitas. Tyrimai

Lietuvoje // Veterinarija ir zootechnika. 2005. N. 31. P.67–76.

34. Klimienė I., Mockeliūnas R., Špakauskas V., Gintautas J. Apsiveršiavusių karvių susirgimų

įtaka kraujo biocheminiams rodikliams, reprodukcijai ir produktyvumui // Veterinarija ir

zootechnika. Kaunas. 2011. T. 53 (75). P.14-22.

35. Korhonen, H., Marnila, P. and Gill, H.S. Milk immunoglobulins and complement factors // Br J

Nutr 84 (Suppl. 1), S75–S80. British Journal of Nutrition. 2000. Vol. 84. P. 75-80.

36. Krasauskaitė D. Antibiotikai neigiamai veikia pieno produktų kokybę... // Pienininkystė. 1991.

Nr. 5. P. 14–16.

37. Maris P., Gaudin V. Report: Proficiency study for the analysis of chloramphenicol residues in

milk by ELISA. AFSSA Fougeres. 2002.

38. Maślanka T., Jaroszewski J., Gonkiewicz B., Sobczak J. Residues of inhibitory substances in

milk and antibiotics in animal tissues // Medycyna Wet. 2004. Vol. 60(3). P. 320–322.

39. Mišeikienė R., Šiugždaitė J., Stankevičius H., Tacas J., Stankūnienė V. Plaunamųjų ir

dezinfekavimo medžiagų karvių tešmeniui paruošti prieš melžimą laboratoriniai tyrimai //

Veterinarija ir zootechnika. Kaunas. 2003. T. 23 (45). P. 88–91.

40. Mypox B. И. Лекарственные cpeдcтва, применяемые в сельском хозяйстве, как

возможные контаминанты пищевыx продуктов // Boпpocы питания. 1991. № 6. С. 21–26.

41. Mullan M., W.M.A. 2003. Inhibitors in milk. Internetinė prieiga:

http://www.dairyscience.info/inhibitors-in-milk/51-inhibitors-in-milk.html. Žiūrėta 2011 m.

spalio 25 d.

54

42. Narkevičiūtė I. Bakterijų atsparumo antibiotikams problemos // Gydymo menas. 2008. Nr.

10(157). P. 10–11.

43. Orsi N. The antimicrobial activity of lactoferrin: Current status and perspectives. Kluwer

Academic Publishers. 2004. P. 189–196.

44. Pečiulionienė I., Pauliukas K. Superkamo žaliavinio pieno kokybės dinamika ir ją įtakojantys

veiksniai Lietuvos Respublikos pieno perdirbimo įmonėse. Magistro darbas. Kaunas. 2004. P.

20–27.

45. Prandini G., Tansini S., Sigolo l. Filippi M., Laporta and Piva G. On the occurrence of aflatoxin

M1 in milk and dairy products // Food Chem. Toxicol. 2009.Vol. 47. P. 984–991.

46. Renner E., Schaafsma G. & Scott K. J.. Micronutrients in milk. In Micronutrients in Milk and

Milk-based Food Products, [E Renner, editor]. 1989, New York: Elsevier Applied Science. P.

1-70.

47. Reneau J. K. Factors to Consider in udder Preparation for Quality Milk Production // Milker

Training Seminar. 1997.

48. Riaukienė D. Kodėl ne visas pienas kokybiškas? // Mano ūkis. 1999. Nr. 2. P.12 – 13.

49. Rybinska K, Postupolski J, Szczesna M. Residues of antibiotics and other inhibitory substances

in milk // Rocz Panstw Zakl Hig. 1995. Vol. 46 (3). P. 239–241.

50. Rybinska K., Karkocha I. Determination of antibiotic residues in selected foods of animal

origin // Roczniki Panstwowego Zakladu Higiene. 1992. Vol. 43, No. 3/4. P. 241–244.

51. Roesch M., Perreten V., Doherr M. G., Schaeren W., Schällibaum M. and J. W. Blum.

Comparison of Antibiotic Resistance of Udder Pathogens in Dairy Cows Kept on Organic and

on Conventional Farms // J Dairy Sci. 2006. Vol. 89. P. 989–997.

52. Rudejevienė J. Karvių slaptasis mastitas. Kaunas. 2007. P. 11–45.

53. Ruegg, P.L., and T.J. Tabone. The relationship between antibiotic residue violations and

somatic cell counts in Wisconsin dairy herds // J. Dairy Sci. 2000. 83. P. 2805-2809.

54. Rushen J., De Passille A.M.B., and Munksgaard L. Fear of People by Cows and Effects on

Milk Yield, Behavior, and Heart Rate at Milking // J Dairy Sci. 1999. Vol. 82. P.720–727.

55. Ružauskas M., Klimienė I., Zienius D. Survey of antimicrobial susceptibility among some

pathogenic and commensal bacteria isolated from pigs // Medycyna Weterynaryjna. 2006.

Vol. 62. P. 397–400.

56. Saville, W.J.A., T.E. Wittum, and K.L. Smith. Association between measures of milk quality

and risk of violative antimicrobial residues in grade-A milk // J. Am. Vet. Med. Assoc. 2000.

217. P. 541-545.

57. Schulz M., M. Van Raden P. m., Boetther P.J.and Hansen L. B. Relationship of somatic cell

score and linear type trait evaluations of Holsteinn sires // J. Dairy Sci. 1990. Vol. 76. P. 658.

58. Sigurdson Ch. G. Practical Hygiene and Disinfection on Dairy Farms. Internetinė prieiga:

http://www.cvm.umn.edu/dairy/prod/groups. Žiūrėta 2011-10-01.

59. Séverin S, Wenshui X. Milk biologically active components as nutraceutical // Review. Crit.

Rev. Food Sci. Nutr. 2005. Vol. 45. P. 645-656.

60. Shearer J.K., Bachan J.K., Boosinger J. The Production of Quality Milk. Dairy production

guide. 1992. P. 1–7.

61. Shitandi A., Sternesjo A. Detection of antimicrobial drug residues in Kenian milk // Journal of

Food Safety. Vol. 21(4). 2001. P. 205–214.

62. Skimundris V. Pienininkystė. V.: Mokslo ir enciklopedijų leidykla. 1993. P. 8–77.

55

63. Sloth K. H., Friggens N. C., Løvendahl P., Andersen P. H., Jensen J., Ingvartsen L. Potential

for Improving Description of Bovine Udder Health Status by Combined Analysis of Milk

Parameters // J. Dairy Sci. 2003. Vol. 86. P. 1221–1232.

64. Sprong, R.C., Hulstein, M.F. and Van der Meer, R. Bactericidal activities of milk lipids //

Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001. Vol. 45, No. 4. P. 1298-1301.

65. Staniškienė B., Šernienė L. ir kt. Pieno ir jo produktų kokybės įvertinimas. Kaunas: Naujasis

lankas. 2007. P. 24 – 25.

66. Stankūnienė V., Tacas J., Mišeikienė R. Pieno ūkio savininkui. Kaunas: UAB Priuntėja. 2008.

P. 9 – 11, 20 – 21.

67. Suhren G. Antibiotisch wirksame Substanzen in Milch: Bedeutung, rechtliche Aspekte und

Nachweis // DMZ, Lebensmittelindustrie und Milchwirtschaft. 2002. Vol. 123(6). P. 22–231.

68. Šalomskienė J., Žvirdauskienė R. Inhibitorių žaliame karvių piene nustatymo problemos //

Maisto chemija ir technologija: KTU MI mokslo darbai. 2005. T. 39, Nr. 2. P. 54–61.

69. Šarkinas A., Urbienė S., Šarka A., Sasnauskaitė L. Technologinių veiksnių įtaka penicilino

kiekiui gaminant pieno produktus // Žemės ūkio mokslai. 2011. T. 18, Nr. 1, P. 22-34.

70. Šimkienė A., Juozaitienė V. Įvairių veiksnių įtakos laktozės kiekiui karvių piene tyrimai //

Veterinarija ir zootechnika. 2007. T. 39 (61). P. 81–85.

71. Špakauskas V. Karvių mastito ankstyva diagnostika, profilaktika ir gydymas. 2000. P. 76–81.

72. Tenhagen B.A., Schmedt auf der Günne H., Kutzer P., Forderung Heuwieser D. Do

antibacterial milk constituents interjere with microbiological examination of clinical mastitis? //

Acta Veterinaria Scandinavica. 2003, 44(Suppl 1). P 10.

73. Urbienė S., Savickis S., Steponavičienė A., Stančikas M. Technologinių veiksnių įtaka

chloramfenikolio kiekio kitimui gaminant pieno produktus // Veterinarija ir zootechnika. 2009.

T. 48 (70). P. 32–39.

74. Vaitlokas L. Mastito profilaktika – pieno kokybės gerinimo pagrindas. Vilnius: petro ofsetas.

2005. P. 23 – 24.

75. Valintėlienė R. Antibiotikai – didžiulis medicinos išradimas ir nemenka problema // Farmacija

ir laikas. 2006. Nr. 2. P. 30–31.

76. Van Schaik, G., M. Lotem, and Y.H. Schukken. Trends in somatic cell counts, bacterial counts,

and antibiotic residue violations in New York State during 1999-2000 // J. Dairy Sci. 2002. 85.

P. 782-798.

77. Walstra P., Geurts T. J., Noomen A., Jellema A., Van Boekel M. A. J. S. Dairy Technology.

New York Basel. 1999. 727 p.

78. Wirtanen G., Salo S. Disinfection in food processing – Efficacy testing of disinfectants //

Environmental Science and Biotechnology. 2003. P. 293–306.

79. Žakas A. Genetinių ir aplinkos veiksnių įtaka karvių pieno kokybei pagal somatinių ląstelių

skaičių. Daktaro disertacija. Biomedicininiai mokslai, zootechnika. 2002. P. 7–59.

80. Žvirdauskienė R., Šalomskienė J., Urbšienė L. Inhibitorių grupių nustatymas žaliame karvių

piene mikrobiologiniais metodais // Maisto chemija ir technologija. 2004. T. 38. Nr. 2. P. 55–

60.

56

PRIEDAI

57

1 PRIEDAS

Mikrobiologinių metodų inhibitorinių medžiagų nustatymui aptikimo ribos

Antibiotikų ir kitų

kenksmingų medžiagų

pavadinimas

MRL

(leistina

maksimali

riba, ES)

Įmonių naudojami

testai VĮ Pieno tyrimai testai

β - Laktamai

Delvotest®SP-NT

(laboratorijose) LPT LPT2

Aptikimo ribos

Penicilinas (benzinpencilinas) 4 1-2 2 2

Ampicilinas 4 4 - -

Amoksicilinas 4 2-3 3 3

Kloksacilinas 30 20 15 30

Dikloksacilinas 30 10 - -

Oksacilinas 30 10 - -

Cefacetrinas 125 20 - -

Cefaleksinas 100 50 80 80

Cefaloniumas 20 5-10 - -

Cefoperazonas 50 40 - -

Ceftiofurai 100 25-50 - -

Cefapirinas 60 5 - -

Cefazolinas 50 25 - -

Tetraciklinai

Chlortetraciklinas(sum) 100 200 >1800 150

Doksiciklinas 0 100-150 - 100

Oksitetraciklinas(sum) 100 250-500 700 100

Tetraciklinas (sum) 100 250-500 700 50

Sulfonamidai

Sulfametazinas 100 50 400 -

Sulfadiazinas 100 25-50 150 -

Dapsonas 0 0,5-1 1 -

Makrolidai

Eritromicinas 40 40-80 5 -

Spiramicinas 200 400-600 - -

Tilozinas 50 30 - -

Aminoglikozidai

Gentamicinas 100 50 4 100

Kanamicinas 150 5000 - -

Neomicinas 1500 100-200 30 100

DH Steptomicinas 200 > 1000 30 400

Įvairūs chinolonai

Bacitracinas 100 1000-2000 - -

Chloramfenikolis 0 250 - -

Kolistinas 50 1000-5000 - -

Linkomicinas 150 200 - -

Novobiocinas 50 1000 - -

Rifaksiminas 60 >25 - -

Pirlimicinas 100 20-100 - -

Tiamfenikolis 50 > 1000 - -

Trimetoprimas 50 50-100 - -

58

2 PRIEDAS

Žemės ūkio ministerijai

Valstybinei maisto ir veterinarijos tarnybai

VĮ „Pieno tyrimai“

2012-11-06 Nr. DV19-F-68-73

DĖL PASTABŲ IR PASIŪLYMŲ

Siunčiame pastaboms ir pasiūlymams leidinio „Biologinių ir cheminių veiksnių įtaka

antimikrobinių medžiagų tyrimams piene“ (autoriai J. Šalomskienė, A.Sederevičius, I.Mačionienė,

R.Žvirdauskienė) pirmąją redakciją, parengtą pagal MTTV projekto „Inhibitoriai piene: patekimo

priežastys, nustatymo metodai, biologinių ir cheminių veiksnių įtaka tyrimo rezultatams“ vykdymo

planą (Žemės ūkio, maisto ūkio ir žuvininkystės mokslinių tyrimų ir taikomosios veiklos projekto

vykdymo sutartis 2011-05-10 Nr. MT/11-19 tarp NMA prie ŽŪM ir KTU).

Lauksime Jūsų pastabų ir pasiūlymų iki š.m. lapkričio 20 d. Jeigu iki tos dienos

pastabų ir pasiūlymų negausime, laikysime, kad leidinio projektui pritarta.

PRIDEDAMA. Leidinys, 96 lapai.

Direktorius Antanas Šarkinas

Joana Šalomskienė, tel. (8-37) 312 380, el. paštas: joana.salomskiene@ktu.lt

59

3 PRIEDAS

KAUNO TECHNOLOGIJOS UNIVERSITETAS

MAISTO INSTITUTAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

J. Šalomskienė, A. Sederevičius, I. Mačionienė, R. Žvirdauskienė

Biologinių ir cheminių veiksnių įtaka antimikrobinių medžiagų

tyrimams piene

Kaunas, 2012