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MOLEKULARE UNTERSUCHUNGEN ZUR VIRULENZ UND
WIRTSADAPTATION VON INFLUENZA-A-VIREN VOM
SUBTYP H5N1 AN GEFLÜGEL UND SÄUGER
I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n
zur
Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Jessica Bogs
geboren am 26.02.1982
in Brandenburg an der Havel
Greifswald, 24.08.2011
Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser
1. Gutachter: Herr Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
2. Gutachter: Frau PD Michaela Schmidtke (Jena)
Tag der Promotion: 21.11.2011
Diese Arbeit wurde unter der wissenschaftlichen Betreuung von Dr. Jürgen Stech am
Institut für Molekularbiologie des Friedrich-Loeffler-Institutes, Bundesforschungs-
Anstalt für Tiergesundheit auf der Insel Riems vom Januar 2008 bis Dezember 2010
angefertigt.
„There is a crack in everything; that is how the light gets in.“
Leonhard Cohen (* 21.09.1934; kanadischer Schriftsteller, Komponist und Sänger)
INHALT
I Einleitung Influenza-A-Viren 1
II Zielsetzung 29
III Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse 31
IV Literaturverzeichnis 35
V “Highly pathogenic H5N1 influenza viruses carry virulence
determinants beyond the polybasic HA cleavage site.” 67
VI “Amino acids adjacent to the haemagglutinin cleavage site are relevant for
virulence of avian influenza viruses of subtype H5.” 76
VII “Reversion of PB2 627E to 627K during replication of an H5N1 clade 2.2
virus in mammalian hosts depends on origin of the nucleoprotein.” 86
IIX Zusammenfassung 95
IX Summary 97
X Anhang 99
1
I EINLEITUNG INFLUENZA-A-VIREN
Morphologie, Taxonomie und Genomorganisation
Influenza-A-Viren gehören zu der Familie der Orthomyxoviridae (Fauquet et al., 2005). Die
Viruspartikel weisen eine sphärische bis filamentöse Form mit 80 bis 100 nm Durchmesser
auf und sind von einer Hüllmembran umgeben, die von der Wirtszelle entstammt (Skehel and
Wiley, 1995). Sie zeichnen sich durch ein einzelsträngiges, segmentiertes RNA-Genom in
negativer Orientierung aus. Bisher gehören neben den Influenza-A-Viren vier weitere Genera
zu dieser Familie: die Influenza-B- und C-Viren, das Thogotovirus und das Isavirus (Fauquet
et al., 2005). Zur Differenzierung werden die serologischen Eigenschaften des
Nukleoproteins (NP) und des Matrixproteins (M1) herangezogen. Die Influenzaviren
unterscheiden sich auch in der Anzahl ihrer Segmente und der Oberflächenglykoproteine,
die in die Hüllmembran eingelagert sind: die Funktionen des Hämagglutinins (HA) und der
Neuraminidase (NA) der Influenza-A- und –B-Viren wird bei den Influenza-C-Viren in dem
Hämagglutinin-Esterase-Fusionsprotein (HEF) vereint. Daher besitzen die Influenza-C-Viren
nur sieben Segmente, während das Genom der Influenza-A- und –B-Viren auf acht
Segmente verteilt ist (Herrler et al., 1988; Herrler et al., 1981). Die Influenza-A-Viren werden
anhand der Glykoproteine in Subtypen unterteilt, von denen bisher 16 HA- (H1 - H16) und
neun NA- (N1 - N9) Typen bekannt sind (Fouchier et al., 2005; Rohm et al., 1996; Webster et
al., 1992).
Die Nomenklatur der Influenzaviren erfolgt nach der festgelegten Regel
Influenzavirustyp/Wirtsspezies/Isolationsort/Isolatnummer/Jahr (Subtyp) (WHO, 1980), z.B.
A/Cygnus cygnus/Germany/R65/06 (H5N1). Bei humanen Isolaten entfällt die Wirtsspezies,
z.B. A/Hong Kong/156/97 (H5N1).
Das Genom der Influenza-A-Viren umfasst ca. 13,6 kb und kann für bis zu elf bisher
bekannte Proteine kodieren. Die ersten 12 bzw. 13 Nukleotide (nt) am 3´- bzw. 5´-Terminus
sind sowohl innerhalb der einzelnen Segmente, als auch bei den verschiedenen Influenza-A-
Virusstämmen hoch konserviert und zueinander partiell komplementär (Desselberger et al.,
1980). In diesen untranslatierten Regionen (UTR) befinden sich die Promotorstrukturen für
die Transkription und Replikation durch die virale Polymerase (Li and Palese, 1992; Parvin et
al., 1989). Das „Korkenzieher-Modell“ besagt, dass nur einzelne nt der extremen Termini
Paarungen eingehen und es daher zu einer Windung der RNA kommt (Flick and Hobom,
1999). Neben diesen konservierten extremen Termini befinden sich weiterhin einige nt, die
sich bei jedem Segment unterscheiden, aber innerhalb der Influenza-A-Viren konserviert sind
(Ausnahme: NA-Subtypen).
2
Abbildung 1: Aufbau eines Influenzavirus-Partikels: Der Aufbau eines Influenzavirus-Partikels ist anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen (rechts, links) und einer schematischen Übersicht (mittig) dargestellt (Dr. Granzow, M. Jörn).
Die Abbildung 1 zeigt den Aufbau eines Influenza-A-Virus-Partikels. Die RNA-Segmente
liegen im Partikel als virale Ribonukleoprotein- (vRNP-) Komplexe vor: an jedes Segment ist
ein heterotrimerer Polymerase-Komplex gebunden, bestehend aus den Untereinheiten PB2
(polymerase basic 2), PB1 (polymerase basic 1) und PA (polymerase acidic) (Duesberg,
1969; Hay and Skehel, 1979). Die gesamte RNA liegt außerdem mit den NP-Molekülen
enkapsidiert vor, wovon jedes ca. 20 – 26 nt bedeckt (Compans et al., 1972; Ortega et al.,
2000). Fünf der acht Segmente sind monocistronisch; die von den Segmenten 7 und 8
transkribierten mRNAs werden jedoch alternativen Spleiß-Prozessen unterzogen und in die
Matrixproteine M1 und M2 sowie in das Nichtstrukturprotein (NS1) und das Nukleäre
Exportprotein (NEP/NS2) translatiert (Inglis and Brown, 1981; Lamb et al., 1980). Viele
Isolate weisen einen überlappenden offenen Leserahmen (open reading frame: ORF) im
Segment 2 auf, welches daher neben dem PB1 auch für das Protein PB1-F2 kodiert (Chen
et al., 2001). Bei wenigen Stämmen ist ein zweiter alternativer ORF im Segment 2
vorhanden, der in das Protein PB1-N40 translatiert wird und regulatorische Effekte haben
könnte (Wise et al., 2009). Kürzlich wurde bei humanen Viren ein stark konservierter ORF in
ambisense-Orientierung des Segmentes 8 entdeckt (Clifford et al., 2009). Da eine
Immunantwort gegen Epitope dieses Peptids entsteht, wird das Protein wahrscheinlich
während der Infektion exprimiert.
Replikationszyklus
Die Adsorption (Anheftung des Virus an die Wirtszelle) wird durch das Rezeptor-bindende
Oberflächenglykoprotein HA vermittelt (Hirst, 1942; Skehel and Wiley, 2000). Als Rezeptoren
dienen endständige N-Acetylneuraminsäuren (Neu5Ac) (allgemein Sialinsäuren) an der
Oberfläche der Wirtszelle (Rogers and D'Souza, 1989). Die Penetration (Eindringen in die
Wirtszelle) erfolgt über eine Clathrin-vermittelte oder Clathrin- und Calveolin-unabhängige
3
Endozytose (Lakadamyali et al., 2004; Rust et al., 2004). Durch zelluläre H+-ATPasen wird
eine Ansäuerung des Endosoms und damit eine Konformationsänderung des HA erreicht,
die eine Verschmelzung der endosomalen und viralen Membran bewirkt (Huang, 1991;
Maeda et al., 1981; Matlin et al., 1981; White et al., 1982). Für das Uncoating (Freisetzung
des Genoms) spielt das M2 eine essenzielle Rolle. Dieses Typ-III-Transmembranprotein
bildet Protonenkanäle, die bei niedrigem pH-Wert aktiviert werden und durch einen H+-
Einstrom eine Ansäuerung des Endosoms bewirken (Holsinger et al., 1994; Pinto et al.,
1992; Sugrue and Hay, 1991). Die vRNP-Komplexe werden vom M1 abgelöst, welches die
Innenseite der Hüllmembran auskleidet, und in das Zytoplasma freigesetzt. Sie werden
anschließend anhand einer Kernlokalisierungssequenz (nuclear localization sequence: NLS)
im NP durch zelluläre Transportproteine in den Zellkern transportiert (Wang et al., 1997;
Whittaker et al., 1996a).
Im Zellkern erfolgt die Transkription und Replikation der vRNAs durch den Polymerase-
Komplex (Shapiro and Krug, 1988), der dabei vom NP unterstützt wird (de la Luna et al.,
1993; Huang et al., 1990; Kimura et al., 1992). In infizierten Zellen werden drei Arten
spezifischer RNAs synthetisiert (Lamb and Choppin, 1983):
- mRNAs: Produkte der Transkription, Templates für die Translation, 5´-Cap, 3´-
Poly(A), Fehlen von 17 – 22 nt des 3´-Endes
- cRNAs: in (+)-Orientierung, komplette komplementäre Kopien der vRNA-Segmente,
Templates für die vRNA-Synthese
- vRNAs: in (-)-Orientierung, Produkte der Replikation, bilden das virale Genom
Die Polymerase synthetisiert virale mRNAs unter Verwendung eines ungewöhnlichen
Transkriptions-Mechanismus, dem „Cap-Snatching“ (Plotch et al., 1979; Plotch et al., 1981):
prä-mRNAs der Wirtszelle, deren Kernexport durch das virale NS1 verhindert wird (Nemeroff
et al., 1998), werden hierbei über das 5´-7-Methylguanosin-Cap durch PB2 an den
Polymerase-Komplex gebunden (Blaas et al., 1982; Braam et al., 1983) und 10 - 13 nt hinter
dem Cap durch die Endonuklease-Aktivität des PA geschnitten (Dias et al., 2009; Yuan et
al., 2009). Diese kurzen, gecappten Oligomere dienen dann als Primer für die Transkription
der mRNAs (Beaton and Krug, 1981, 1984; Krug et al., 1979), deren Elongation von PB1
durchgeführt wird (Braam et al., 1983). Zwanzig nt vor dem 5´-Ende der vRNA gerät die
Polymerase in einer Uridin-reichen Region ins „Stottern“, was zur Ausbildung des Poly(A)-
Schwanzes führt (Li and Palese, 1994; Luo et al., 1991; Poon et al., 1999; Pritlove et al.,
1999; Robertson et al., 1981). Anschließend erfolgt das Spleißen der Produkte der
Segmente 7 und 8 sowie der Export der viralen mRNAs in das Zytoplasma, welcher durch
zelluläre Proteine und das NEP vermittelt wird (Krug, 1993; Martin and Helenius, 1991;
Whittaker et al., 1996a).
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In der frühen Infektionsphase wird hauptsächlich mRNA synthetisiert, während in der
späteren Phase cRNA und vRNA gebildet werden („Umschalt-Modell“) (Portela and Digard,
2002). Ein alternatives Modell schlägt vor, dass in der frühen Phase sowohl mRNAs als auch
cRNAs gebildet werden, wobei die ungeschützten cRNAs aber Wirts-Nukleasen ausgesetzt
sind und degradiert werden, während die Cap-haltigen und polyadenylierten mRNAs
geschützt sind („Stabilisierungs-Modell“) (Vreede et al., 2004). Zu späteren Zeitpunkten
liegen genügend Polymerase-Komplexe und NP vor, welche die cRNAs vor dem Abbau
schützen.
Die Replikation wird ohne Primer initiiert, da das RNA-Genom (vRNA) ein terminales
Triphosphat am 5´-Terminus aufweist (Honda et al., 1998). Die cRNAs werden mit NP
enkapsidiert und dienen wiederum als Matrize für die vRNAs, welche anschließend aus dem
Kern transportiert und im späteren Assembly (Zusammenbau der Viruspartikel) als Genom
eingebaut werden (Deng et al., 2006; Hay et al., 1977; Hay et al., 1982). Kürzlich wurde
gezeigt, dass zur Replikation mehrere Polymerase-Komplexe in-trans zusammenarbeiten
(Jorba et al., 2009). Die Translation der Membran-assoziierten Proteine (HA, NA, M2) erfolgt
an der Membran des rauen endoplasmatischen Retikulums. Sie bleiben in der Membran
verankert und werden über das Trans-Golgi-Netzwerk an die Zelloberfläche transportiert
(Fields, 2001). Dabei finden posttranslationale Veränderungen dieser Proteine wie
Glykosylierungen (HA, NA), Phosphorylierungen (M2), Palmitoylierungen (HA, M2), die
Homotrimer- (HA) bzw. Homotetramer-Bildung (NA, M2) (Fields, 2001) sowie die
Aktivierungsspaltung des HA statt (Klenk and Garten, 1994; Stieneke-Grober et al., 1992).
Die anderen Proteine (PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, NEP) werden an den freien Ribosomen
im Zytoplasma translatiert und anhand ihrer NLS zurück in den Zellkern transportiert
(Neumann et al., 1997; Whittaker et al., 1996b).
Für das Assembly (Zusammenbau der Viruspartikel) werden zunächst die Proteine HA, NA
und M2 in die Zellmembran eingelagert, während das M1 sowie das Virusgenom in der Form
der vRNP-Komplexe anschließend an der Membran initiale Budding-Strukturen ausbilden.
Dabei wird das Nukleokapsid von der Hüllmembran umschlossen und das Virus durch
Knospung an der Zelloberfläche abgeschnürt (Schmitt and Lamb, 2005). Diese Freisetzung
erfolgt bevorzugt an „lipid rafts“, Cholesterin-reichen Lipidstrukturen auf der Oberfläche der
Wirtszelle (Scheiffele et al., 1999). Die NA spaltet anschließend die Sialinsäuren der
Zelloberfläche ab, um eine Aggregation der Nachkommenviren und eine Superinfektion
bereits infizierter Zellen zu verhindern (Air and Laver, 1989; Gottschalk, 1957; Huang et al.,
2008; Palese et al., 1974).
5
Evolution und Epidemiologie
Das natürliche Reservoir der Influenza-A-Viren bildet freilebendes Wassergeflügel
(Easterday et al., 1968; Munster et al., 2006; Olsen et al., 2006). Viren aller HA- und NA-
Typen infizieren Vögel der Ordnungen Anseriformes (Enten, Gänse, Schwäne), während
H13- und H16-Viren vor allem aus Charadriiformes (Möwen, Meerschwalben, Strandläufer)
isoliert wurden (Munster et al., 2007a; Webster et al., 1992). Sie werden fäkal-oral
übertragen (Halvorson et al., 1983; Hinshaw et al., 1979) und verursachen asymptomatische
oder milde Erkrankungen (Webster and Bean, 1978; Webster et al., 1992). In ihrem
Reservoir befinden sich diese Viren in einem evolutionären Equilibrium, d.h. sie sind
hochgradig wirtsadaptiert und weisen eine hohe genetische Stabilität auf (Gorman et al.,
1990a; Gorman et al., 1992; Webby and Webster, 2001). Von ihren Reservoir-Wirten werden
Influenza-A-Viren aber häufig auf andere Wirte übertragen; dazu zählen Hausgeflügel,
Pferde, Schweine und auch der Mensch (Alexander and Brown, 2000).
Da die RNA-Polymerase der RNA-Viren keinen Exonuklease- und keinen „Proofreading“-
Mechanismus besitzt, arbeitet der replikative Komplex mit einer hohen Fehlerrate von ca.
einer Mutation pro 1,5 x105 nt und erzeugt so eine oder mehrere Punktmutationen im
Virusgenom pro Replikations-Zyklus (Parvin et al., 1986). Daher repräsentieren Virusstocks
immer eine Population von unterschiedlichen Genomen, der sogenannten Quasispezies
(Eigen and Schuster, 1982). Durch die Ansammlung von Punktmutationen in den antigenen
Domänen von HA und NA können die Viren der bestehenden Immunität der Wirtspopulation
entgehen. Dieser evolutionäre Prozess der antigenen Drift ist für die saisonalen Influenza-
Epidemien verantwortlich und erfordert die jährliche Neuzusammensetzung der Grippe-
Schutzimpfung (Laver et al., 1981; Pereira and Schild, 1971).
Durch das segmentierte Genom können bei der Ko-Infektion einer Zelle mit zwei Influenza-A-
Virus-Stämmen Nachkommenviren entstehen, die Genomsegmente beider Elternviren
enthalten. Betrifft dieses sogenannte Reassortment die HA- und/oder NA-Gene kommt es zu
einer sprunghaften Antigenveränderung, dem antigenen Shift (Pereira et al., 1967). Dem
Schwein wird dabei eine wichtige Rolle als Zwischenwirt von Reassortment-Ereignissen der
Influenza-A-Viren zugeschrieben („Mixing Vessel“-Theorie) (Castrucci et al., 1993; Ma et al.,
2008; Scholtissek et al., 1985; Shu et al., 1994), da es sowohl für humane als auch für aviäre
Viren empfänglich ist (Hinshaw et al., 1978; Kundin and Easterday, 1972; Shortridge et al.,
1977). Seit 1998 werden Doppel- (Human/Schwein) und Dreifach-Reassortanten
(Vogel/Human/ Schwein) aus Schweinen isoliert (Karasin et al., 2006; Karasin et al., 2002;
Karasin et al., 2000a; Karasin et al., 2000b; Webby et al., 2000; Zhou et al., 1999a).
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Werden Viren eines neuen Subtyps aus dem aviären Reservoir mit oder ohne Reassortment
in die humane Population eingeführt, kann ein Virustyp enstehen, der eine Erkrankung im
Menschen auslösen kann und gegen welchen die Bevölkerung keine Immunität besitzt
(Webster et al., 1992; Webster et al., 1993). Die weltweite Ausbreitung eines solchen
Subtyps erfüllt dann die Kriterien einer Pandemie (www.who.int). Die erste dokumentierte
Influenza-Pandemie von 1918/19, an welcher ca. 50 Millionen Menschen verstarben, ist auch
unter dem Begriff „Spanische Grippe“ bekannt (Johnson and Mueller, 2002; Taubenberger
and Morens, 2006). Das Virus wurde durch einen „archäo-virologischen“ Ansatz aus
Geweben tiefgefrorener Opfer rekonstruiert und als H1N1-Virus mit möglichem aviären
Vorläufer erkannt, in welchem sich adaptive Mutationen im HA, NA und PB1 ereignet haben
könnten (Pappas et al., 2008; Reid et al., 2004; Taubenberger, 2006; Taubenberger et al.,
1997; Tumpey et al., 2005). Von 1920 an zirkulierten abgeleitete H1N1-Viren ca. 40 Jahre
weltweit mit antigener Drift und saisonalen Endemien. Die „Asiatische Grippe“ von 1957/58
wurde durch ein H2N2-Virus verursacht, welches neue HA-, NA- und PB1-Gensegmente
durch Reassortment mit einem unbekannten aviären Influenzavirus des Subtyps H2N2
erworben hatte (Kawaoka et al., 1989; Scholtissek et al., 1978). Die im Jahr 1968
aufgetretene „Hong Kong“-Pandemie wurde durch ein H3N2-Virus (z.B. A/Hong Kong/1/68
(HK/68)) verursacht, welches ebenfalls durch Reassortment das HA und PB1 eines aviären
Influenzavirus erwarb und die restlichen sechs Segmente des 1957/58-Stammes behielt
(Kawaoka et al., 1989; Scholtissek et al., 1978). Dieses Virus wurde schnell endemisch und
tritt seitdem weltweit saisonal mit vielen antigenen Drift-Varianten auf (Morens et al., 2009).
Im Frühjahr 2009 wurde ein neuer H1N1-Stamm als Ursache für Erkrankungen in Mexiko
und Süd-Kalifornien erkannt, welcher von Schweinen auf Menschen übertragen wurde
(swine-originated Influenzavirus: S-OIV) (Perez-Padilla et al., 2009). Das Virus verbreitete
sich innerhalb weniger Wochen nahezu weltweit. Sequenzanalysen dieses neuen
pandemischen Virus zeigten, dass HA, NP und NS-Segmente von einem klassischen
Schweineinfluenzavirus (SIV), PB1 von einem humanen H3N2-Virus sowie PB2 und PA von
aviären Gensegmenten innerhalb der Tripple-Reassortanten-SIV stammen, während NA und
M den eurasischen SIV zuzuordnen sind (Garten et al., 2009; Shinde et al., 2009).
Klinik bei Mensch und Geflügel
Neben der Übertragung von Wasservögeln auf Nutzgeflügel können einige Subtypen eine
Vielzahl von Säugerspezies infizieren; stabile Linien haben sich jedoch nur in Menschen
(H1N1, H2N2, H3N2), Schweinen (klassische H1N1-SIV, „avian-like“ H1N1- und „human-
like“ H3N2-Viren) und Pferden (H7N7, H3N8) etabliert (Alexander, 1982; Brown, 2000;
Webster et al., 1992; Wilson, 1993).
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Erkrankung des Menschen: Klassische Virusgrippe
Humane Influenza-A-Viren stellen ein globales Gesundheitsproblem dar. Sie verursachen
normalerweise Infektionen des oberen Respirationstrakts und werden effizient übertragen.
Infektionen können in ihrer Stärke von asymptomatisch bis zu einer schweren fieberhaften
Krankheit variieren und sind durch Symptome wie Kopfschmerzen, Halsschmerzen,
trockener Husten, Schnupfen, Muskelschmerzen, Abgeschlagenheit, Schüttelfrost, in einigen
Fällen auch durch ein gastrointestinales Erscheinungsbild gekennzeichnet. Pathologisch-
anatomisches Korrelat ist eine Tracheobronchitis (Kuiken and Taubenberger, 2008).
Schwere oder tödliche Verläufe treten typischerweise bei Personen mit Vorerkrankungen der
Lunge oder des Herzens auf. Komplikationen stellen Entwicklungen einer primären
Viruspneumonie oder einer sekundären Pneumonie durch eine bakterielle Infektion dar
(Barker and Mullooly, 1982; Monto et al., 2000).
Zur Therapie stehen NA-Inihibitoren wie Zanamivir (Relenza®) oder Oseltamivir (Tamiflu®)
zur Verfügung (Eisenberg et al., 1997; von Itzstein et al., 1993), obwohl die Ausbildung von
Resistenzen zu verzeichnen ist (McKimm-Breschkin, 2000). Der Einsatz von M2-Ionenkanal-
Blockern wie Amantadin (Symmetrel®) oder Rimamantadin (Flumadine®) (Davies et al., 1964;
Rabinovich et al., 1969) wird aufgrund der hohen Verbreitung resistenter Virusstämme nicht
mehr empfohlen (Bright et al., 2005; Hayden and Hay, 1992). Ribavirin wird als antivirales
Agens mit Breitband-Wirkung angesehen und induziert keine Resistenz, da das Target ein
zelluläres Enzym ist (Sidwell et al., 2005; Sidwell et al., 1972). Die Vakzinen, die derzeit
gegen Influenza angewendet werden, bestehen aus inaktivierten Viruspräparationen, welche
in embryonierten Hühnereiern angezüchtet wurden (Alymova et al., 1998; Katz and Webster,
1989). Die Zusammensetzung des jährlichen trivalenten Impfstoffes beinhaltet zwei
Influenza-A-Stämme (H1N1 und H3N2) sowie einen Influenza-B-Stamm und wird von der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) anhand der Stämme mit den häufigsten Infektionen
weltweit empfohlen.
Erkrankung des Nutzgeflügels: Klassische Geflügelpest
Aviäre Influenzaviren werden anhand ihres intravenösen Pathogenitätsindex (IVPI) in
hochpathogene oder niedrigpathogene Viren eingeteilt (IVPI > 1,2: highly pathogenic avian
influenza virus: HPAIV; IVPI < 1,2: low pathogenic avian influenza virus: LPAIV) (Alexander,
2008; WHO, 2004). Werden Hühner mit einem LPAIV infiziert, beschränkt sich die
Replikation auf den Respirationstrakt und die Verdauungsorgane. Die Tiere können milde
Symptome einer respiratorischen Erkrankung sowie Wachstums-Verzögerungen und eine
verminderte Eiproduktion zeigen (Suarez, 2010).
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HPAIV sind limitiert auf die HA-Typen H5 und H7. Die systemische Replikation dieser Viren
führt zu einem raschen Tod mit einer Letalität von 75 % - 100 % innerhalb von zwei bis
sieben Tagen verbunden mit einer hohen Übertragungseffizienz (Swayne and Suarez, 2000).
Die Symptome sind Stillstand der Eiproduktion, hohes Fieber, rasselnder Atem, Sinusitis,
subkutane und interne Hämorrhagien, Nekrosen von Kamm und Kehllappen, Ödeme an Kopf
und Hals, sowie Zyanosen der unbefederten Haut (Swayne and Suarez, 2000). Man findet
diese Viren häufig im Endothel der Blutgefäße, den angrenzenden Parenchymzellen
(Ramirez et al., 2005), sowie im Kapillarendothel von vielen Organen, was zur
hämorrhagischen Manifestation führt (Brown, 2006; Kobayashi et al., 1996). Eine weitere
Eigenschaft dieser Viren ist der Tropismus für Neuronen und Kardiomyozyten (Shinya et al.,
2010). Außerdem unterstützen massive Schäden am Immunsystem die systemische
Ausbreitung (Shinya et al., 2005).
HPAIV vom Subtyp H5N1
H5N1 HPAIV in Vögeln
HPAIV H5N1-Viren wurden 1996 aus kranken Gänsen in der Provinz Guangdong in China
isoliert (A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1); (Gs/Gd/96)) und 1997 bei Geflügel in Hong Kong
nachgewiesen (Shortridge et al., 1998; Xu et al., 1999). Der Ausbruch wurde beendet, indem
sämtliches Geflügel in Hong Kong gekeult wurde (Shortridge et al., 2000). Seit 1999 wurden
hochpathogene H5N1-Viren wiederholt in offenbar gesunden Enten in Südchina gefunden
(Chen et al., 2004). Neuartigerweise führte die Infektionen bei Enten nach 2002 zu
systemischen, tödlichen Erkrankungen mit Anzeichen einer schweren Fehlfunktion des
Zentralen Nervensystems (ZNS), was auf gravierende Veränderungen der H5N1-Viren mit
ZNS-Beteiligung als Virulenzfaktor in Enten hindeutet (Pantin-Jackwood and Swayne, 2007;
Sturm-Ramirez et al., 2004). 2004 verursachten H5N1-Viren Ausbrüche in Enten, Gänsen
und Hühnern in China und seit 2005 wurden eine Vielzahl von Infektionen in kommerziellen
Geflügelhaltungen verzeichnet (Chen et al., 2006b). 2005 und 2006 infizierten sich Zugvögel
(v.a. Streifengänse, Anser indicus) im Nationalpark des Qinghai-Sees in Westchina, wobei
über 6000 Vögel verstarben (Chen et al., 2006a; Chen et al., 2005; Liu et al., 2005; Wang et
al., 2008; Zhou et al., 2006). Dieser Ausbruch stellt eine Besonderheit dar, da die
Reservoirspezies normalerweise keine Symptome aufweisen (Webster et al., 1992).
Pathogenesestudien zeigten, dass die meisten der Qinghai-Viren von 2005 letal für Hühner
und Mäuse sind und in Makaken transient Fieber auslösen (Chen et al., 2006a). Bis 2005
waren H5N1-Ausbrüche auf Südostasien begrenzt, doch seit den Ausbrüchen am Qinghai-
See vergrösserte sich die geografische Ausbreitung und auch das betroffene Wirtsspektrum:
diese Viren verbreiteten sich bis nach Westeuropa und Afrika und haben bis heute auch eine
9
Vielzahl von Säugerspezies, z.B. Hauskatzen, Leoparden, Tiger und wilde Katzen in Asien
und Europa infiziert (Keawcharoen et al., 2004; Klopfleisch et al., 2007a; Songserm et al.,
2006; Yingst et al., 2006). Im Frettchen-Modell weisen die HPAIV H5N1-Viren über die Zeit
ihrer Evolution eine gesteigerten Letalität auf (Maines et al., 2005).
Die Verbreitung nach Europa geht zwar mit der Bewegung der Zugvögel (Gilbert et al., 2006;
Normile, 2006) einher, andererseits lassen Ausbrüche in Gebieten ohne bekannte
Zugstrecken und die phylogenetische Verwandtschaft von H5N1-Viren in Südostasien den
legalen/illegalen Geflügelhandel als Quelle von HPAIV vermuten (Alexander, 2007; Kilpatrick
et al., 2006; Wang et al., 2008).
In Südost-Europa erschienen H5N1 HPAIV im Herbst 2005 und wurden im Februar 2006
erstmals in Deutschland in Singschwänen (Cygnus cygnus) auf der Insel Rügen entdeckt
(Starick et al., 2008; Weber et al., 2007). Innerhalb von zwei Wochen wurde das Virus in
sieben Bundesländern gefunden und es waren über 16 Spezies wilder Vögel, aber auch eine
Truthahn-Farm betroffen (Globig et al., 2009). Das Virus wurde auch auf drei freilaufende
Katzen (Felis domesticus) und einen Steinmarder (Martes foina) übertragen, vermutlich über
das Fressen kranker oder verendeter Vögel (Klopfleisch et al., 2007b). 2007 verbreiteten
sich H5N1 HPAIV von Russland aus erneut in Europa und eine kontinuierliche Anwesenheit
dieser Viren mit geringer Prävalenz in der Europäischen Union wird nicht ausgeschlossen
(Wilking et al., 2009).
Obwohl die meisten Segmente durch Reassortment ersetzt wurden, blieb das H5-Gen der
Gs/Gd/96-Linie erhalten (Cauthen et al., 2000; Chen et al., 2004; Smith et al., 2006). Die
enorme Evolution der H5N1-Viren erforderte ein neues Nomenklatursystem und die
Einteilung in Clades, basierend auf deren phylogenetischen Charakterisierung und
Sequenzhomologie des HA-Gens. Bis heute wurden zehn distinkte initiale Clades (0 – 9)
oder Clades erster Ordnung identifiziert (WHO, 2008). Da sich die Viren innerhalb der
Clades weiterentwickeln, entstehen Sublinien oder Clades zweiter bzw. dritter Ordnung.
Dieses System vereinfacht das bisherige uneinheitliche System, z.B. wurde aus der
„Qinghai“-Linie die Clade 2.2.
H5N1 HPAIV in Menschen
Grundsätzlich infizieren aviäre Influenzaviren Menschen und nicht-menschliche Primaten
ineffizient und umgekehrt replizieren humane Viren nicht effizient in Enten (Beare and
Webster, 1991; Murphy et al., 1982; Webster et al., 1978). Im Mai 1997 wurde erstmals ein
HPAIV H5N1-Virus aus einem 3-jährigen Jungen in Hong Kong isoliert, der an Reye´s
10
Syndrom, akuter Pneumonie mit Hypoxämie und Akutem Respiratorischen Distress
Syndrome (ARDS) verstarb; es gab Bedenken über den zoonotischen Charakter und das
pandemische Potenzial dieser Viren (de Jong et al., 1997). Die molekulare Untersuchung
des Isolats A/Hong Kong/156/97 (H5N1) (HK156) ergab die Abstammung aller acht
Gensegmente von einem aviären Influenzavirus der eurasischen H5N1-Linie, welches
zeitgleich in den Geflügel-Märkten in Hong Kong isoliert wurde und unterscheidet sich von
seinem nächsten aviären Verwandten A/Chicken/HK/220/97 (H5N1) nur durch 28
Aminosäuren (AS) (Claas et al., 1998; Suarez et al., 1998; Subbarao et al., 1998). Es gab
zunächst keine Hinweise auf die Eigenschaften des Isolats, welche den
Wirtsspeziesübergang vom Vogel zum Menschen ermöglichten, und man betrachtete den
Fall als isoliertes Ereignis.
Im November und Dezember 1997 gab es jedoch 17 weitere Fälle von fieberhaften
Atemwegserkrankungen in Hong Kong, welche durch H5N1-Viren (HK/97) verursacht
wurden und fünf Opfer forderten (Shortridge et al., 1998; Yuen et al., 1998). Als potentieller
Donor für das HA gelten Isolate der Gs/Gd/96-Viren; die internen Gene könnte es von
A/Quail/HK/G1/97 (H9N2)- oder von A/Teal/HK/W312/97 (H6N1)-ähnlichen Viren erlangt
haben (Guan et al., 1999; Hoffmann et al., 2000b; Xu et al., 1999). Die HK/97-Viren sind
ohne Adaptation letal in Mäusen und breiten sich im Gehirn aus, haben aber ihre Virulenz in
Hühnern behalten (Gao et al., 1999; Lu et al., 1999; Shortridge et al., 1998; Suarez et al.,
1998; Subbarao et al., 1998). 2003 wurden erneut zwei Menschen in Hong Kong infiziert und
einer von ihnen verstarb (Peiris et al., 2004). Seitdem kommt es in Südostasien und z. B.
auch in Ägypten immer wieder zu Übertragungen auf Menschen mit hohen Mortalitätsraten
von über 50 % (Li et al., 2004; Meleigy, 2007). Der Großteil der Infektionen ereignete sich
durch Exposition mit H5N1-infiziertem Geflügel, aber seltene Familien-Cluster in Thailand,
Indonesien und China geben Hinweise auf begrenzte Mensch-zu-Mensch-Übertragungen
über engen und langen, ungeschützten Kontakt mit schwerkranken H5N1-Patienten (Kandun
et al., 2006; Katz et al., 1999; Ungchusak et al., 2005).
Mit H5N1 HPAIV infizierte Patienten stellen sich bei ihrer Einweisung mit einem
Krankheitsbild verbunden mit Fieber, Husten und trockenem Hals, Kurzatmigkeit, Myalgie
und Pneumonie vor, welches sich häufig zu ARDS, reaktiver Hämophagozytose und
Multiorganversagen entwickeln kann (Yu et al., 2008). Die Laboruntersuchungen zeigen
Lymphopenie und Thrombozytopenie (Beigel et al., 2005). Eine systemische Ausbreitung
und Zytokinämie wurden als erschwerende Faktoren der Infektionen beschrieben. Weitere
Komplikationen umfassen pulmonäre Hämorhagie, Myokarditis, Perikarditis, Enzephalitis,
Nierenversagen und Sepsis (Hui, 2008). Die Viren befallen hauptsächlich die Pneumozyten
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des unteren Respirationstrakts und führen zu sich ausbreitenden Alveolarschäden sowie
einem prominenten Lungenödemen; daher versterben die Patienten meist an Atemversagen
(Gu et al., 2007; Liem et al., 2008; Uiprasertkul et al., 2005). Bei fatalen Infektionen (in
Menschen und Versuchsmäusen) ist die Erkrankung durch hohe Virustiter im Respirations-
Trakt, massive Infiltration von Makrophagen in die Lunge und eine Dysregulation der Zytokin-
und Chemokinantwort („Cytokine storm“) gekennzeichnet (de Jong et al., 2006).
Auch die Subtypen H7N7 (Campbell et al., 1970; Koopmans et al., 2004; Kurtz et al., 1996;
Webster et al., 1981a) und H9N2 (Butt et al., 2005; Peiris et al., 1999) sind für humane
Infektionen nach direkter Übertragung von Vögeln verantwortlich und stellen daher als
Zoonose-Erreger und mögliche Pandemie-Vorläufer eine Bedrohung für die öffentliche
Gesundheit dar (Hatta and Kawaoka, 2002; Horimoto and Kawaoka, 2001; Katz, 2003).
Pathogenität, Virulenzfaktoren und Adaptationsmechanismen
Die Pathogenität beschreibt die genetisch bedingte Fähigkeit eines Erregers, eine Krankheit
hervorzurufen, während die Virulenz den Grad dieser Pathogenität angibt und in
Tierexperimenten meist durch die LD50 quantifiziert wird (für 50 % der Tiere letale Dosis)
(Modrow, 2003). Daher sind Influenza-A-Viren grundsätzlich pathogen, unterscheiden sich
aber hinsichtlich ihrer Virulenz. Unter dem Wirtsspektrum versteht man die Gesamtheit aller
Arten, die sich durch einen Erreger effizient infizieren lassen und eine weitere Ausbreitung
ermöglichen. Die limitierte Kompatibilität zwischen dem Wirt und den Virusstämmen kommt
durch Speziesbarrieren zustande, die während des Prozesses der Wirtsadaptation
überwunden werden müssen (Kuiken et al., 2006). Adaptation kann als jede Veränderung in
der Struktur oder Funktion eines Organismus definiert werden, die diesem ein besseres
Überleben in seiner Umwelt ermöglicht und beruht im Falle von Influenza-A-Viren vor allem
auf der graduellen Akkumulation von Punktmutationen in den viralen Genen (Noah and Krug,
2005).
Influenza-A-Viren können von ihren Reservoir-Wirten auf Hausgeflügel wie Hühner, Puten,
Enten oder Truthähne übertragen werden und dort zu einer Infektion führen. Obwohl die
Spezies-Spezifität durch viele Gene bestimmt wird, gibt es eine gewisse Anzahl an
Mutationen, die zur erhöhten Pathogenität von H5N1-Viren in Hühnern führen oder die zur
Überwindung der Speziesbarriere zwischen Enten und Hühnern beitragen. Aviäre
Influenzaviren wurden aber auch aus Säugern wie Schweinen, Pferden, Seehunden, Walen
und Nerzen isoliert (Geraci et al., 1982; Hinshaw et al., 1986; Hinshaw et al., 1984;
Klingeborn et al., 1985; Lvov et al., 1978; Scholtissek et al., 1983; Webster and Guo, 1991).
12
Durch die serielle Passage von Influenza-A-Viren in Mäusen kann man die Adaptation an
Säuger imitieren, denn sie resultiert in der Selektion hoch-virulenter Varianten, welche
Mutationen in mehreren Genen erworben haben (Ward, 1997). Die Maus-adaptierte Variante
des pandemischen Isolats HK/68 weist elf AS-Substitutionen zum Ursprungsvirus auf (Brown
et al., 2001). Ein weiteres gutes Beispiel für eine solche Studie ist der artifizielle Stamm
SC35M: das Virus A/Seal/Massachusetts/1/80 (H7N7) wurde aus einem Seehund mit akuter
hämorrhagischer Pneumonie isoliert (Webster et al., 1981b) und später 35 mal in
Hühnerembryozellen (CEC) ohne Trypsin passagiert (SC35), wobei es drei basische AS in
der HA-Spaltstelle erwarb und hochvirulent für Hühner wurde (Li et al., 1990). Bei darauf
folgenden Lunge-zu-Lunge-Passagen in Mäusen adaptierte das Virus an die Maus und
resultierte in hoher Virulenz mit breitem Organtropismus (SC35M) (Scheiblauer et al., 1995).
Diese beiden Viren unterscheiden sich durch neun AS-Substitutionen, welche sich
hauptsächlich in den Polymerase-Proteinen und NP (3x PB2, 2x PB1, 1x PA, 1x NP)
befinden, aber auch in den Oberflächen-Proteinen HA (1x) und NA (1x) (Gabriel et al., 2005).
Ein Indikator für die Relevanz einer adaptiven Mutation ist die konvergente Evolution, also
das wiederholte, unabhängige Auftreten gleicher Mutationen in adaptierten Varianten (Bull et
al., 1997).
Hämagglutinin
Einfluss des HA-Spaltstellenmotivs auf die Virulenz
Die Struktur eines HA-Monomers ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Fusion der viralen
Membran mit der Endosomenmembran kann nur nach der Aktivierungs-Spaltung des HA-
Vorläuferproteins HA0 in seine reifen Untereinheiten HA1 und HA2 erfolgen, welche durch
Disulfid-Brücken verbunden bleiben (Dopheide and Ward, 1980; Huang et al., 1980; Klenk et
al., 1975; Maeda et al., 1981). Dabei wird das 20 AS-lange, hydrophobe Fusions-Peptid am
N-Terminus des HA2 exponiert, das die Verschmelzung der Membranen vermittelt (White et
al., 1982). Die aktivierenden Enzyme werden vom Wirt gestellt (Klenk and Garten, 1994;
Steinhauer, 1999).
Weist die HA-Spaltstelle nur eine basische AS auf, wie das der Fall bei den meisten
Influenza-A-Viren ist (z.B. -PQKETR/GLF- bei A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1)), wird es
durch Trypsin-ähnliche Proteasen während der natürlichen Reifung an der Zelloberfläche
gespalten (Bosch et al., 1981; Bosch et al., 1979; Garten et al., 1981; Steinhauer, 1999;
Zhirnov et al., 2002). Die Synthese dieser Proteasen ist auf die Epithelzellen des
Verdauungstraktes von Vögeln und den Atemtrakt von Vögeln und Säugern begrenzt, was
auch die Infektion auf die entsprechenden Organe limitiert (Klenk and Garten, 1994;
13
Steinhauer, 1999). In in-vitro-Studien konnten Trypsin-ähnliche Proteasen wie Plasmin oder
die Tryptase Clara identifiziert werden. In Hühnereiern spaltet eine Protease, die dem Blut-
Gerinnungsfaktor Xa ähnelt (Gotoh et al., 1990; Kido et al., 1992; Lazarowitz et al., 1973). Im
humanen Luftweg-Epithel wurden die Serin-Proteasen TMPRSS2 und HAT identifiziert, die
aber nicht in aviären Geweben gefunden wurden (Bottcher et al., 2006).
Abbildung 2: Struktur eines HA-Monomers (aus Chen et al., 1998): HA0-Vorläufer mit Spaltstellen-Region (gelb) und Spaltstelle (Pfeil), HA1 (blau) und HA2 (rot): Das als Homotrimer funktionelle HA ist ein integrales Typ-I-Membranprotein (Wiley and Skehel, 1977). Jedes Monomer besteht aus einem globulärem Kopf, welcher ausschließlich aus HA1 besteht, und einem Stiel, der aus dem gesamten HA2 und Teilen des HA1 besteht (Wilson et al., 1981). Der Kopf enthält die Rezeptorbindestelle, die in einer Antikörper-unzugänglichen Tasche liegt. Neben dem Membran-Anker und einer C-terminalen zytoplasmatischen Domäne weist der Stiel ein N-terminales hydrophobes Signalpeptid auf, welches aber während der Verankerung in der Membran entfernt wird (Air, 1979; McCauley et al., 1979).
Die Spaltstelle der H5- und H7-Viren kann jedoch mehrere basische AS aufweisen (z.B.
-PQGERRRKKR/GLF- bei A/Cygnus cygnus/Germany/R65/06 (H5N1)), welche durch die
Proteasen der Subtilisin-Familie (Furin, Proprotein-Konvertasen (PCs), MSPL, TMPRSS13)
anhand des Motives R-X-R/K-R-G erkannt und dann im trans-Golgi-Kompartiment
prozessiert wird (Horimoto et al., 1994; Klenk and Garten, 1994; Okumura et al., 2010;
Stieneke-Grober et al., 1992). Da diese Proteasen ubiquitär vorkommen, ermöglichen sie
den Viren eine systemische Replikation im Huhn. Die erhöhte Virulenz von natürlichen
HPAIV-Stämmen geht also mit einer erhöhten Zahl an basischen AS an der Spaltstelle
einher (Bosch et al., 1981; Klenk and Rott, 1988; Philpott et al., 1990; Wood et al., 1993) und
wird daher als Hauptdeterminate der Virulenz von HPAIV angesehen (Garten and Klenk,
1999; Kawaoka et al., 1987; Senne et al., 1996; Webster and Rott, 1987).
Bisher ging man davon aus, dass HPAIV nicht dauerhaft in der Wildvogelpopulation
vorkommen, sondern durch die Einführung von H5 und H7 LPAIV in terrestrisches Geflügel
und rascher Mutation zu HPAIV durch Insertionsmutationen an der Spaltstelle entstehen
(Kawaoka and Webster, 1985; Rohm et al., 1995). HPAIV-Stämme entstanden z.B. durch die
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Substitution HA-E324K und der anschließenden Insertion von R und K durch Duplikation der
nt HA-965-970 (Garcia et al., 1996; Perdue et al., 1996; Perdue et al., 1997). Verschiedene
HPAIV-Stämme haben aber auch Fragmente der ribosomalen 28S-RNA der Wirtszelle oder
von viralen Gensegmenten (NP, HA, M) desselben oder eines anderen Virus erhalten
(Khatchikian et al., 1989; Orlich et al., 1994; Pasick et al., 2005; Suarez et al., 2004).
Polybasische Spaltstellen-Motive könnten auch durch „Polymerase slippage“ generiert
werden: eine stabile Sekundärstruktur führt zur spontanen Duplikation einer unstabilen
Sekundärstruktur (Garcia et al., 1996; Perdue et al., 1996; Streisinger et al., 1966).
Während die Veränderung einer polybasischen HA-Spaltstelle in ein monobasisches Motiv
zu einer drastischen Reduzierung der Virulenz führt (Horimoto and Kawaoka, 1994), kann
die Einführung eines polybasischen Motivs in ein LPAIV zu unterschiedlichen Ergebnissen
führen: In einem H6N1-Isolat genügte eine entsprechende Insertion, um in Hühnern den
Phänotyp eines HPAIV zu verursachen (Munster et al., 2010), in einem H3N8-Stamm
dagegen blieb das resultierende Virus avirulent (Stech et al., 2009). In einer H9-
Reassortante führte die Modifizierung der Spaltstelle nur zu einem hohen IVPI, wenn die
restlichen Gensegmente von einem H5N1 HPAIV stammen (Gohrbandt et al., 2011).
Ein polybasisches Spaltstellen-Motiv hat aber nicht nur Auswirkungen auf die Virulenz in
Geflügel, sondern ist auch eine Voraussetzung für eine hohe Letalität von H5- und H7-
HPAIV in Mäusen (Gabriel et al., 2005; Hatta et al., 2001). Da das HA-Gen z. B. der HK/97-
Viren nicht ausreichend ist, um eine Erkrankung in Mäusen auszulösen, gilt es aber nicht als
Hauptdeterminante der Virulenz in Säugern (Cauthen et al., 2000).
Die Serin-Protease von Staphylococcus aureus erkennt ein monobasisches Spaltstellen-
Motiv und kann so zur Entwicklung einer Pneumonie nach kombinierter Virus-Bakterien-
Infektion führen (Scheiblauer et al., 1992; Tashiro et al., 1987). Weiterhin können bakterielle
Staphylokinase und Streptokinase Plasminogen zu Plasmin spalten, welches wiederum HA
spalten kann (Horimoto and Kawaoka, 2001). Auch die hohe Sterblichkeit der „Spanischen
Grippe“ wurde durch Pneumonien nach bakterieller Ko-Infektion verursacht (Morens et al.,
2008).
Die Rolle der Rezeptorbindung bei der Adaptation an Säuger
Da sich Influenza-A-Viren hinsichtlich ihrer Rezeptor-Präferenz unterscheiden, stellt die
Wirtszellmembran die erste Barriere bei der Adaptation an Säuger dar (Gambaryan et al.,
1997; Inkster et al., 1993; Ito, 2000; Ito and Kawaoka, 2000; Ito et al., 1999; Matrosovich et
al., 1997; Suzuki et al., 2000). Aviäre Influenzaviren nutzen Sialinsäuren, die über eine α-2,3-
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Bindung an Galaktose geknüpft sind und im Respirations- und Verdauungstrakt von
Wasservögeln vorkommen (Connor et al., 1994; Shinya et al., 2006). Human-adaptierte
Influenza-A-Viren hingegen binden bevorzugt an Sialinsäuren mit α-2,6-Bindung, ein
Hauptglykan des menschlichen Respirationsepithels (Rogers and D'Souza, 1989; Rogers
and Paulson, 1983; Suzuki et al., 2000). Die Anpassung der Bindungseigenschaften des HA
an Rezeptoren von Säugerzellen ist daher ein erster Schritt, um die Speziesbarriere zu
überwinden.
Die Spezifität wird durch bestimmte AS in der Rezeptorbindestelle determiniert: HA-226L und
-228S vermitteln die α-2,6-Gal-Präferenz der humanen H2- und H3-Viren (Matrosovich et al.,
2000; Skehel and Wiley, 2000), während HA-226Q und -228G mit der α-2,3-Gal-Spezifität
aviärer und equiner H3-Viren einhergeht (Naeve et al., 1984; Vines et al., 1998). Bei H3-
Viren wird außerdem HA-193S mit α-2,6-Gal-Spezifität und HA-193N/K mit α-2,3-Gal-
Spezifität von aviären und equinen Viren assoziiert (Medeiros et al., 2004). Für das
pandemische HK/68-Virus wurde gezeigt, dass nur wenige AS (HA-62, -144, -193 und -226)
in der Rezeptorbindestelle während der Anpassung verändert wurden (Bean et al., 1992).
Die Mutationen HA-N182K und HA-Q192R konvertierten die Rezeptorspezifiät aviärer H5N1-
Viren zu dem humanen Typ (Yamada et al., 2006).
Hühner und Wachteln weisen Sialinsäuren mit α-2,3- und α-2,6-Gal-Bindungen auf und
könnten daher auch als potentielle Zwischenwirte für die Entstehung von Viren mit
pandemischen Potential fungieren (Gambaryan et al., 2002; Perez et al., 2003; Wan and
Perez, 2006). Da auch eine α-2,3-Rezeptorverteilung im Atemtrakt von Säugern wie Katze,
Hund, Tiger und Schwein besteht, könnten diese Tiere ebenfalls eine Rolle als
Zwischenwirte haben (Ito et al., 1998; Suzuki et al., 1997; Thongratsakul et al., 2010). Die
Sialinsäuren im menschlichen Respirationstrakt sind ebenfalls nicht ausschließlich α-2,6-
verknüpft: während α-2,6-verbundene Sialyl-Oligosaccharide den vorrangigen Rezeptortyp
im humanen Nasenschleimhaut-Epithel und der Trachea stellen, exprimiert ein Teil der
respiratorischen Epithelzellen der humanen Trachea und der Alveolen im unteren
Respirationstrakt auch α-2,3-Gal-verbundene Sialinsäuren. Daher können auch Viren mit
aviärer Rezeptorspezifität Menschen direkt infizieren und zu einer tödlichen Erkrankung
führen, während eine Mensch-zu-Mensch-Übertragung nicht-adaptierter Influenzaviren
aviären Ursprungs limitiert ist (Matrosovich et al., 2004a; Shinya et al., 2006). Treten aber
Veränderungen in der Rezeptor-Bindungsaffinität aviärer Influenzaviren auf, die es diesen
Viren ermöglichen auch im oberen Respirationstrakt zu replizieren, könnte das in einer
effizienten Mensch-zu-Mensch-Übertragung und mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer
16
Pandemie führen (Maines et al., 2011; Shelton et al., 2011; Shinya et al., 2006; van Riel et
al., 2006).
Die Rolle des HA-Glykosylierungsmusters
Die Zahl und Position von N-gebundenen Oligosacchariden im HA determiniert die Virulenz
aviärer Influenzaviren, da z.B. dem Verlust einer Glykosylierungsstelle in der Nähe der HA-
Spaltstelle eine bessere Zugänglichkeit durch das spaltende Enzym folgt (Perdue et al.,
1995; Philpott et al., 1990). So führte die Substitution HA-N11D im Isolat
A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2) zu einer verbesserten HA-Spaltung und hoher
Virulenz (Deshpande et al., 1987). Eine Zuckerseitenkette kann im Gegensatz dazu aber
auch die Spaltstelle maskieren, so die Spaltung durch Furin verhindern und zum Verlust der
Virulenz führen (Kawaoka and Webster, 1989). Durch zusätzliche Insertion von basischen
AS in die Spaltstelle kann diese Maskierung aber wiederum aufgehoben werden (Ohuchi et
al., 1989).
Das HA-Glykosylierungsmuster kann auch die Rezeptorbindung beeinflussen (Aytay and
Schulze, 1991; Banks and Plowright, 2003; Deom et al., 1986; Inkster et al., 1993).
Entsprechende Veränderungen des Glykosylierungsmusters um die Rezeptorbindestelle
können oft infolge der Anpassung eines Virus an das embryonierte Hühnerei (Gambaryan et
al., 1999; Robertson et al., 1995), eine neue Zelllinie (Baigent and McCauley, 2001;
Crecelius et al., 1984; Gambaryan et al., 1998; Gunther et al., 1993; Romanova et al., 2003)
oder an einen neuen Wirt (Narasaraju et al., 2009; Ward, 1997), beobachtet werden. Dem
Stamm HK156 fehlt die Glykosylierungsstelle HA-154, welche sich beim Vorläuferisolat
A/Chicken/258/97 (H5N1) und den nicht-Maus-virulenten HK/97-Viren findet (Claas et al.,
1998; Gao et al., 1999). In dem Isolat A/NL/219/03 (H7N7), welches aus einem fatalen Fall
einer Pneumonie mit ARDS eines Veterinärmediziners nach einem H7N7 HPAIV-Ausbruch
stammt, führte die Mutation HA-A143T zu einer potentiellen Glykosylierungsstelle (de Wit et
al., 2010; Koopmans et al., 2004).
Der pH-Wert der katalysierten Fusion kann ebenfalls durch ein alternatives
Glykosylierungsmuster verändert werden (Smeenk and Brown, 1994). So verursacht die
Mutation HA-T156N im Stamm HK/68 den Verlust einer Glykosylierungsstelle und führt zu
molekularen Umordnungen mit der Folge einer erhöhten Virulenz in der Maus (Brown et al.,
2001; Ping et al., 2010). Eine Eliminierung der Glykosylierungsstellen HA-63 und -94 trat
während der Maus-Adaptation des humanen Isolates A/New Caledonia/20/99 (H1N1) auf
und diese beiden Mutationen wurden auch bei der Adaptation eines H3N8-
Pferdeinfluenzavirus an Hunde gefunden (Payungporn et al., 2008; Smee et al., 2007).
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Antigene Veränderungen des HA gehen ebenfalls mit der Entstehung einer
Glykosylierungsstelle einher, z.B. findet man HA-G218W bei Antikörper-Escape-Varianten
(Abe et al., 2004; Caton et al., 1982; Daniels et al., 1987).
Polymerase-Komplex und Nukleoprotein
Das virale Genom liegt in Form von acht vRNP-Komplexen vor. Diese bestehen aus der von
NP-Molekülen enkapsidierten vRNA und dem heterotrimeren Polymerase-Komplex aus PB2,
PB1 und PA (Abbildung 3). Da die Genom-Replikation von Influenza-A-Viren im Zellkern
stattfindet, ist es notwendig, dass die vRNP-Komplexe effizient durch die Kernporen
transportiert werden, wobei sie mit zellulären Transportproteinen wie den Importinen
interagieren (Wang et al., 1997). Nach der Zellmembran bildet die Kernmembran daher die
zweite Barriere bei der Anpassung an einen Säugerwirt. Es wurde gezeigt, dass PB2 und NP
aviärer Viren weniger effizient an humane Importine binden als die Proteine human-
adaptierter Viren und dass unter anderem die langsamere Akkumulation der vRNPs im Kern
zu einer niedrigeren Replikationsrate aviärer Viren in humanen Zellen führt (Gabriel et al.,
2008; Resa-Infante et al., 2008). Diese Barriere kann durch adaptive Mutationen im PB2 und
NP überwunden werden, welche zur Änderung des Interaktionspartners (Importin-α-3 zu
Importin-α-7) während der Adaptation an Säuger beitragen (Gabriel et al., 2011).
Durch die Mutation PB2-D701N kann sich ein aviäres Virus an eine humane Zelle anpassen,
indem die Interaktion mit dem humanen Importin-α erhöht wird (Gabriel et al., 2008;
Tarendeau et al., 2007). Diese Substitution ermöglichte H5N1-Viren und einem H7N7-
Seehund-Virus die Replikation in Mäusen (Gabriel et al., 2005; Le et al., 2009; Li et al., 2005;
Ping et al., 2010) sowie die Übertragung von H5N1-Viren auf Meerschweinchen (Gao et al.,
2009; Steel et al., 2009). Die Selektion dieser Mutation wurde während humaner Infektionen
beobachtet, z. B. in einigen HPAIV H5N1-Viren aus letalen Infektionen (de Jong et al., 2006).
Strukturanalysen einer freien und einer Importin-gebundenen NLS ergaben, dass PB2-
D701N eine Salzbrücke mit PB2-R753 in der NLS zerstört, so die Assoziationsrate erhöht
und die Bindung an Importin-α verstärkt (Gabriel et al., 2008; Tarendeau et al., 2007). Die
Substitutionen PB2-R702K und -S714R wurden in Maus-Adaptations-Experimenten
selektiert und befinden sich ebenfalls in der NLS. Sie erhöhen die Bindungsaffinität mit
humanem und aviärem Importin-α sowie die Polymerase-Aktivität (Boivin and Hart, 2011;
Gabriel et al., 2005).
18
(A)
(B) (C)
(A)
(B) (C)
Abbildung 3: Aufbau des viralen Ribonukleoprotein-Komplexes: (A) Schematisches Modell der vRNP-Organisation (aus Portela and Digard, 2002): „supercoiled Ribbon“-Strukturen mit dem heterotrimeren Polymerase-Komplex (PB2, PB1, PA) an einem Ende des Supercoils, aber in Assoziation mit beiden Enden der vRNA (Klumpp et al., 1997; Murti et al., 1988; Pons et al., 1969). NP-Monomere erkennen die Template-RNA durch Kontakte mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat, wodurch die Basen zugänglich für Modifikationen bleiben (Baudin et al., 1994). (B) 3D-Modell des Polymerase-Komplexes und Lokalisierung spezifischer Domänen im PB2 (N-Terminus, rot), PB1 (C-Terminus, grün) und PA (C-Terminus, violett) (aus Coloma et al., 2009): Es wurden Regionen am N- und C-Terminus von PB1 identifiziert, welche an den C- und N-Terminus von PA und PB2 binden; daher interagieren die Polymerase-Untereinheiten in der „Kopf-an-Schwanz-Anordnung“ PA-PB1-PB2 (Digard et al., 1989; Gonzalez et al., 1996; Toyoda et al., 1996). Weiterhin konnten die katalytischen Zentren (Asano and Ishihama, 1997; Biswas and Nayak, 1994) sowie die Domänen für Protein-RNA-Kontakte (Albo et al., 1995; Elton et al., 1999b; Fechter et al., 2003; Gonzalez and Ortin, 1999a, b; Li et al., 1998) und NP-Interaktionen (Biswas et al., 1998) identifiziert werden. (C) 3D-Modell eines rekombinanten Mini-vRNP, bestehend aus 248 nt mit NP-Molekülen enkapsidierter viraler RNA sowie dem Polymerase-Komplex (aus Coloma et al., 2009).
Die viralen Prozesse der Transkription, Translation und des Protein-Verkehrs benötigen
Interaktionen mit einer Vielzahl zellulärer Faktoren (Nagata et al., 2008; Watanabe et al.,
2010). Daher scheint eine dritte Barriere für die Säugeradaptation aviärer Influenzaviren in
der Bildung der vRNP-Komplexe aus den Polymerase-Untereinheiten und NP zu bestehen,
deren Interaktion mit Proteinen der Wirtszelle sowie der Replikationseffizienz (Biswas et al.,
1998; Gabriel et al., 2007; Rameix-Welti et al., 2009). Wahrscheinlich wird durch bisher
unbekannte zelluläre Faktoren insbesondere die Änderung der PB2-NP-Interaktion
beeinflusst (Labadie et al., 2007; Mehle and Doudna, 2008, 2009; Naffakh et al., 2008). Es
konnte gezeigt werden, dass sich durch bestimmte Mutationen im Polymerase-Komplex die
Virulenz von aviären und equinen Viren im Säuger steigern lässt (Gabriel et al., 2005; Hatta
et al., 2001; Salomon et al., 2006; Shinya et al., 2007). Bei Untersuchungen von
SC35/SC35M-Reassortanten wurden sechs Mutationen identifiziert, die für die erhöhte
Virulenz von SC35M in Mäusen verantwortlich sind und mit einer erhöhten Polymerase-
Aktivität einhergehen: PB1-L13P, PB1-S678N, PB2-D701N, PB2-S714R, PA-K615N und
NP-N319K (Gabriel et al., 2007; Gabriel et al., 2005). Diese Mutationen werden teilweise
19
auch in den human-pathogenen H5N1-Stämmen, aber auch in anderen Säuger-Isolaten
gefunden (de Jong et al., 2006; Gabriel et al., 2005).
PB2 bestimmt den Wirtsbereich und die Virulenz von Influenza-A-Viren in Modelltieren
(Almond, 1977; Hatta et al., 2001; Li et al., 2005; Yao et al., 2001). Es enthält unabhängige
N- und C-terminale Domänen für die Bindung von NP (Perales et al., 1996; Poole et al.,
2004), die RNA-Cap-Bindungsdomäne (Fechter et al., 2003; Guilligay et al., 2008; Honda et
al., 1999) und NLS-Motive (Mukaigawa and Nayak, 1991; Naito et al., 2007; Tarendeau et
al., 2007). Eine weitere Domäne beinhaltet bestimmte AS-Reste, die für die Interaktion mit
Wirtsproteinen verantwortlich sind (Tarendeau et al., 2008).
Speziell die AS PB2-627 bestimmt die Replikations-Fähigkeit von Influenza-A-Viren in Vogel-
oder Säugerzellen. K an dieser Position ist charakteristisch für die meisten humanen
Influenza-A-Viren (H1N1, H2N2, H3N2) und scheint die Replikation in Säugerzellen zu
verstärken, während E in den meisten aviären Isolaten gefunden wird und die Replikation in
Säugerzellen attenuiert (Gorman et al., 1990b; Subbarao et al., 1993). Die eingeschränkte
Replikation einer Virusreassortante mit aviärem PB2 und den restlichen Segmenten eines
humanen Virus wurde nach Passagen in Säugerzellen und der Mutation PB2-E627K wieder
hergestellt (Clements et al., 1992; Subbarao et al., 1993). Diese Substitution kann
ausreichen, um die Adaptation eines aviären Virus an den Menschen zu vermitteln (Naffakh
et al., 2000). Interessanterweise wies auch das 1918er Pandemie-Virus PB2-627K auf,
obwohl es sich um ein aviäres Virus handelte (Taubenberger, 2005). Die HK/97-Viren
unterschieden sich hinsichtlich der AS an dieser Position, aber es gab einen Zusammenhang
von PB2-627K und dem tödlichen Verlauf nach experimenteller Infektion von Mäusen, wobei
es zu aggressiverem Wachstum in einer Vielzahl von Organen der infizierten Tiere führte
(Gao et al., 1999; Hatta et al., 2001; Shinya et al., 2004). Die Substitution PB2-E627K erhöht
auch die Replikation anderer H5N1-Viren in Mäusen (Fornek et al., 2009; Hatta et al., 2001;
Hatta et al., 2007; Lu et al., 1999). Des Weiteren wird PB2-627K mit tödlichen
Krankheitsverläufen bei Patienten mit H5N1-Infektionen in Vietnam 2004/05 und mit erhöhter
Transmission im Meerschweinchen-Modell in Verbindung gebracht (de Jong et al., 2006;
Hatta et al., 2007; Le et al., 2009; Steel et al., 2009). Auch das H7N7-Virus des letalen Falles
in den Niederlanden 2003 weist die Substitution PB2-E627K auf (Munster et al., 2007b). Eine
weitere Studie zeigte, dass dies die wichtigste Mutation für die erhöhte Virulenz eines Maus-
adaptierten H7N7-Pferdeisolats war (Shinya et al., 2007).
Die strukturelle Auflösung des C-Terminus zeigt, dass sich PB2-627 an der Oberfläche des
Moleküls innerhalb eines basischen Areals befindet und die Mutation zu einem
20
Ladungswechsel führt, welcher wahrscheinlich molekulare Interaktionen verändert (Kuzuhara
et al., 2009; Tarendeau et al., 2008). Des Weiteren wird die abgeschwächte Replikation
aviärer Influenzaviren bei niedrigeren Temperaturen durch die Mutation PB2-E627K z.T.
aufgehoben (Hatta et al., 2007; Massin et al., 2001). Der beeinträchtigte Zusammenbau des
aviären vRNP-Komplexes in einer humanen Zelle wurde durch diese Mutation wieder
möglich (Labadie et al., 2007; Rameix-Welti et al., 2009). Eine fehlende Interaktion mit einem
für die Virusreplikation essenziellen, aber noch unbekannten Kofaktor in Säugerzellen ist für
die Restriktion des Wirtsspektrums verantwortlich, doch die Interaktion mit diesem oder
einem alternativen Kofaktor kann durch die Substitution PB2-E627K wieder hergestellt
werden (Mehle and Doudna, 2008; Moncorge et al., 2010).
Eine effiziente Replikation der S-OIV H1N1-Viren in Säugern wird durch eine basische AS
(R/K) an PB2-591 vermittelt, welche die Abwesenheit von PB2-627K und -701N kompensiert,
indem sie die veränderte Struktur und Ladung der PB2-Oberfläche wieder herstellt. Diese
Substitutionen könnten die Interaktion mit dem gleichen Kofaktor ermöglichen, wie PB2-
627K, da sie in räumlicher Nähe liegen (Mehle and Doudna, 2009; Yamada et al., 2010). Das
gemeinsame Auftreten der Mutationen PB2-627K und -701N ist ein sehr seltenes Ereignis
und man geht davon aus, dass sich diese beiden Mutationen gegenseitig bei der
Säugeradaptation kompensieren können (de Jong et al., 2006; Ping et al., 2010).
PB1 ist für die Initiation und Elongation der Transkription und Genomreplikation
verantwortlich (Biswas and Nayak, 1994; Braam et al., 1983), enthält Motive anderer RNA-
Polymerasen (Poch et al., 1989) und bindet an Promotorsequenzen von cRNA und vRNA
(Gonzalez and Ortin, 1999b). In den pandemischen Viren von 1957 und 1968 waren die
Segmente aviären Ursprungs HA, NA und PB1 (Kawaoka et al., 1989). Aviäre PB1-Proteine
scheinen besser mit humanen PB2, PA und NP zu kooperieren als humanes PB1 (Naffakh et
al., 2000). Der Erwerb eines aviären PB1 vermittelt also einen selektiven Vorteil bei der
Adaptation nach Reassortment.
PA fungiert als Endonuklease für den Cap-Snatching-Prozess (Dias et al., 2009; Yuan et al.,
2009) und ist für die Elongation der vRNA-Synthese (Perales et al., 2000) sowie für den
Zusammenhalt des funktionalen Komplexes verantwortlich (Kawaguchi et al., 2005). Die
Substitution PA-K615N wurde bei dem Sequenzvergleich von SC35 und SC35M gefunden
und führte dort zu erhöhter Polymerase-Aktivität (Gabriel et al., 2007; Gabriel et al., 2005). In
humanen H1N1-Isolaten, einigen H5N1-Isolaten wie HK156, aber auch bei verschiedenen
H9N2-Stämmen ist PA-615N oder auch -615R zu finden (Gao et al., 1999). Die AS PA-97, -
21
349 und -550 werden ebenfalls mit der Adaptation von H5N1 HPAIV an Säuger assoziiert
(Rolling et al., 2009).
NP ist als ss-RNA-bindendes Protein das Strukturprotein zur Enkapsidierung der vRNPs und
ihm kommt eine wichtige Rolle bei der Transkription und dem Transport der vRNPs zwischen
Zytoplasma und Nukleus zu (Baudin et al., 1994; Digard et al., 1999; Neumann et al., 1997).
Es wurden zwei Regionen gefunden, die für die Multimerisation verantwortlich sind (Elton et
al., 1999a; Ng et al., 2008), mehrere Sequenzen, die die Bindung mit PB2 und PB1
vermitteln (Biswas et al., 1998) sowie N-terminale NLS-Motive (Neumann et al., 1997; Wang
et al., 1997; Weber et al., 1998). In vielen Studien wurde NP als Determinante der Spezies-
Spezifität identifiziert; außerdem zeigte der Sequenzvergleich von SC35 und SC35M die
Substitution NP-N319K (Gabriel et al., 2007; Gabriel et al., 2005; Scholtissek et al., 1985;
Tian et al., 1985). Während aviäre Viren NP-319N aufweisen, besitzen humane und equine
Isolate, aber auch einige H5N1-Viren wie HK156 NP-319K (Zhou et al., 1999b). Auch diese
AS befindet sich an der Oberfläche des Proteins und vermittelt eventuell eine Bindung an
eine andere Polymerase-Untereinheiten (Ye et al., 2006). NP- und PA-Mutationen finden
sich häufig gemeinsam bei den HK/97-Viren (Gao et al., 1999). Die Kombination von PB2-
701N und NP-319K verstärkt die Bindung dieser Proteine an Importin-α (Gabriel et al., 2008).
Während der Virusreplikation wird NP durch Phosphokinasen der Wirtszelle modifiziert;
dabei scheint das Phosphorylierungsmuster die Replikationsfähigkeit von Influenza-A-Viren
in verschiedenen Zelllinien zu beeinflussen (Kistner et al., 1985).
Interessanterweise haben neuere Studien gezeigt, dass die Polymerase-Untereinheiten und
NP auch zur Adaptation und Virulenz in aviären Spezies beitragen. So vermitteln PB2, PB1
und NP von H5N1-Viren eine erhöhte Replikation in Hühnern (Tada et al., 2011; Wasilenko
et al., 2008). Die Substitutionen PB1-H436Y und PA-A515T in H5N1-Viren werden hingegen
mit der Letalität bei Enten assoziiert (Hulse-Post et al., 2007). NP-184K wird ebenfalls mit
hoher Pathogenität in Hühnern in Verbindung gebracht; NP-105V erhöht die Polymerase-
Aktivität und kann den Speziesübergang von Enten-Isolaten auf Hühner vermitteln (Tada et
al., 2011; Wasilenko et al., 2009). Der Sequenzvergleich zweier Gs/Gd/96-Isolate, welche
sich hinsichtlich ihrer Replikation in Hühnern unterscheiden, ergaben 5 AS-Unterschiede im
PA, NP, M1 und NS1 (Li et al., 2006b).
22
Weitere Virulenzfaktoren
Neuraminidase
Die Muzin-Schicht des Respirationstraktes ist reich an Sialinsäuren, fungiert daher als Köder
für Viren und verhindert deren Anheftung an Zelloberflächen. Aber durch die Spaltung dieser
Sialinsäuren durch NA wird die Ausbreitung der Viren gefördert (Baum and Paulson, 1990;
Matrosovich et al., 2004a, b). Die als Homotetramer funktionelle NA ist ein integrales Typ-II-
Membranprotein, dessen aktives Zentrum hochkonserviert ist (Colman et al., 1983; Colman
and Ward, 1985). Das NA-Molekül besteht aus einer enzymatisch aktiven Kopf-Domäne und
einem Stiel-Bereich, der in die Virushülle eingelagert ist (Gong et al., 2007). Die Länge und
Sequenz des NA-Stieles variiert erheblich zwischen verschiedenen Virusstämmen (Blok and
Air, 1982). Viren mit längerem Stiel wachsen zu höheren Titern im embryonierten Hühnerei,
in Mäusen sowie in Zellkultur, was sich durch eine höhere Freisetzung von der
Zelloberfläche durch die verbesserte Zugänglichkeit des enzymatischen Kopfes an sein
Substrat erklären lässt (Castrucci and Kawaoka, 1993; Luo et al., 1993; Matrosovich et al.,
1999). Eine Deletion im Stiel der NA vermindert deren enzymatische Aktivität (Blok and Air,
1982) und wird mit erhöhter Virulenz (Baigent and McCauley, 2001; Banks et al., 2001;
Deshpande et al., 1985) sowie mit der Adaptation von aquatischen aviären Viren an
terrestrisches Geflügel wie Puten und Hühner assoziiert (Castrucci and Kawaoka, 1993;
Munier et al., 2010). Des Weiteren steigert eine solche Deletion auch die Virulenz im Maus-
Modell (Matsuoka et al., 2009). Man geht davon aus, dass somit Änderungen in der HA-
Rezeptorspezifität kompensiert werden (Baigent and McCauley, 2001). Die H5N1-Viren,
welche sich in Hong Kong 1997 und seit 2002 an terrestrisches Geflügel angepasst haben,
weisen NA-Stalk-Deletionen auf und gleichen so eventuell eine schwächere Interaktion des
H5 mit dem Rezeptor in Hühnern im Vergleich zu dem im aquatischen Geflügel aus (Li et al.,
2004; Matrosovich et al., 1999; Peiris et al., 2007; Subbarao et al., 1998). Solche Deletionen
sind neben den HK/97-Viren ebenfalls bei H9N2-Viren nach der Übertragung auf Hühner zu
finden (Claas et al., 1998; Guo et al., 2000).
Da das effiziente Wachstum der Influenza-A-Viren von einer ausgeglichenen Funktion
zwischen der Rezeptorbindungsaffinität des HA und der Rezeptor-zerstörenden Aktivität der
NA abhängt, sind Veränderungen in der HA-Rezeptorpräferenz auch oft mit Änderungen der
Substratspezifität und Spaltungsaktiviät der NA verbunden (Baum and Paulson, 1991;
Kaverin et al., 1998; Mitnaul et al., 2000; Rudneva et al., 1993; Wagner et al., 2000). So
erhöhte sich die α-2,6-Gal-Spaltungs-Aktivität der NA nach der Einführung des
pandemischen Virus von 1957 in die menschliche Population als Anpassung auf die α-2,6-
23
Gal-Präferenz des HA (Baum and Paulson, 1990; Kobasa et al., 1999; Neumann and
Kawaoka, 2006).
Der Laborstamm A/WSN/33 (H1N1) besitzt eine monobasische HA-Spaltstelle, kann aber in
Zellkultur ohne Trypsin wachsen und eine systemische Infektion mit Neurotropismus in
infizierten Mäusen hervorrufen (Goto and Kawaoka, 1998; Goto et al., 2001; Ward, 1996).
Die Ursache hierfür liegt an der besonderen Eigenschaft der NA, welche Plasminogen
rekrutieren und sequestrieren kann (Lazarowitz et al., 1973). Die erhöhte Konzentration
dieses ubiquitären Protease-Vorläufers und dessen Prozessierung zu Plasmin führt zur HA-
Spaltung. Ein C-terminales K, sowie eine fehlendes Glykan an NA-146 sind für diese
Eigenschaft verantwortlich (Goto and Kawaoka, 1998; Li et al., 1993).
Nichtstrukturprotein NS1
Das NS1 ist ein multifunktionales Protein, welches sowohl ssRNA als auch dsRNA bindet
und mit vielen Proteinen der Wirtszelle interagiert (Hale and Randall, 2007; Hatada and
Fukuda, 1992; Hatada et al., 1992). Es bildet keine strukturelle Komponente des Virions,
wird aber in infizierten Zellen stark exprimiert (Krug and Etkind, 1973). NS1 kann die virale
Translation durch die Bindung an den Translationsinitiationsfaktor eIF4GI verstärken und die
mRNA-Prozessierung der Wirtszelle unterbinden (Aragon et al., 2000; Burgui et al., 2003;
Krug et al., 2003), reguliert die virale RNA-Synthese (Falcon et al., 2004; Wolstenholme et
al., 1980) und inhibiert den Kernexport durch Bindung an die mRNA-Export-Maschinerie
sowie den Kernporenkomplex (Satterly et al., 2007). Des Weiteren hemmt es das Spleißen
und die Polyadenylierung der prä-mRNA durch die Bindung an U6 snRNA, den Cleavage
and Polyadenylation Specificity Factor 30 (CPSF30) und das Poly-A Binding Protein II
(PABPII) (Chen et al., 1999; Nemeroff et al., 1998; Qiu and Krug, 1994).
Eine weitere wichtige Funktion des NS1 ist die Rolle als Antagonist von Typ-I-Interferonen
(IFN) (Kochs et al., 2007). Die angeborene, IFN-vermittelte Immunantwort ist ein antiviraler
Mechanismus des Wirtes, welcher die Replikation und Ausbreitung von Viren limitieren kann.
Typ-I-IFN, wie IFN-α und IFN-β sind lösliche Zytokine, welche von Zellen als Antwort auf
eine Virusinfektion gebildet werden und sowohl in autokriner, als auch in parakriner Weise
die Expression von über 300 IFN-stimulierten antiviralen Genen aktivieren (Randall and
Goodbourn, 2008). Aviäre Influenzaviren ohne NS1 sind nicht zur effizienten Replikation in
IFN-kompetenten Systemen fähig und erzeugen nur in Mäusen eine hohe Virulenz, denen
antivirale Mediatoren wie STAT1 oder die dsRNA-aktivierte Poteinkinase R (PKR) fehlen
(Bergmann et al., 2000; Garcia-Sastre et al., 1998; Kochs et al., 2007).
24
Das Influenzavirus-Genom wird in der Wirtszelle direkt durch den zytoplasmatischen
Pathogensensor Retinoic Inducable Gene 1 (RIG-I) erkannt (Pichlmair et al., 2006). NS1
bildet einen Komplex mit RIG-I und blockiert so die IFN-β-Induktion (Guo et al., 2007;
Mibayashi et al., 2007; Opitz et al., 2007; Wang et al., 2000). Des Weiteren vermittelt NS1
Resistenz gegenüber den IFN-induzierten antiviralen Prozessen durch Bindung an die IFN-
Effektoren PKR und 2´-5´-Oligo-Adenylatsynthetase (2´-5´-OAS), welche beide Schlüssel-
Regulatoren der Transkription und Translation von viralen Genen sind (Li et al., 2006a; Min
and Krug, 2006). Es kann außerdem die frühzeitige Apoptose verhindern, indem es mit Pi3K
interagiert und die Phosphorylierung von Akt induziert (Hale et al., 2010; Hale and Randall,
2007).
Der C-Terminus der NS1-Proteine der H5N1-Viren von 1997 und 2003, aber auch des
H1N1-Virus von 1918 enthält eine post-synaptic Density Protein-95 disc-large tumor
suppressor protein, zonula occlude(n)s-1 (PDZ)-Ligand Domäne (Obenauer et al., 2006).
Diese Protein-Protein-Erkennungsmodule spielen eine wichtige Rolle bei Signalwegen der
Zelle; so kann die Bindung von NS1 an bis zu 30 PDZ-haltige Proteine zelluläre Signalwege
stören und damit zur Virulenz beitragen (Jackson et al., 2008).
Obwohl die Hauptfunktion des NS1 die Bekämpfung der angeborenen Immunantwort des
Wirtes ist, können die genauen Mechanismen Stamm-spezifisch variieren (Hayman et al.,
2006; Wolff and Ludwig, 2009). Viele Studien haben Mutationen wie NS1-S42P/G, -D92E
und -V149A identifiziert, die die Virulenz in Hühnern und Säugern erhöhen (Jiao et al., 2008;
Li et al., 2006b; Lipatov et al., 2005; Seo et al., 2002). Die Mutationen NS1-F103L und M106I
von HK/97-Viren führen zum Verlust der Bindung an CPSF30, inhibieren die IFN-Induktion
und wurden auch in Maus-Adaptationsstudien gefunden (Dankar et al., 2011; Guan et al.,
1999; Twu et al., 2007). Anhand des NS1 des Stammes A/Puerto Rico/8/33 (H1N1) (PR8)
wurde gezeigt, dass es die dsRNA- und Virus-vermittelte Aktivierung der
Transkriptionsfaktoren IRF-3, NFκB und c-Jun/ATF2 verhindert, welche normalerweise für
die IFN-β-Induktion essentiell sind (Ludwig et al., 2002; Talon et al., 2000; Wang et al.,
2000). Das NS1 der HK/97-Viren erhöht die Expression von proinflammatorischen Zytokinen
in Mäusen und Schweinen und hat so direkten Einfluss auf den virulenten Phänotyp (Cheung
et al., 2002; Lipatov et al., 2005; Seo et al., 2002).
Die Induktion der Zytokin- und Chemokin-Produktion (IFN, Interleukine, Tumornekrose-
Faktoren) bzw. dessen Umgehung kann als vierte Barriere bei der Adaptation an einen
neuen Wirt angesehen werden (Peiris et al., 2009). Auch bei der Anpassung an Geflügel
spielt das NS1 eine wichtige Rolle und es treten Veränderungen auf, um der initialen
25
Spezifität für alpha-2,3-Gal-Rezeptoren
Spezifität für alpha-2,6-Gal-Rezeptoren
Bindung an humane Importine
(PB2/NP)
Furin- vermittelte Aktivierungs-Spaltung
(polybasisches HA-
Spaltmotiv)
Kooperation der
Polymerase-
Untereinheiten/NP
mit Wirtsfaktoren
Effiziente Freisetzung
(NA-Stalk-Länge)
Umgehung der
Immunantwort
(NS1, PB1-F2)
Spezifität für alpha-2,3-Gal-Rezeptoren
Spezifität für alpha-2,6-Gal-Rezeptoren
Bindung an humane Importine
(PB2/NP)
Furin- vermittelte Aktivierungs-Spaltung
(polybasisches HA-
Spaltmotiv)
Kooperation der
Polymerase-
Untereinheiten/NP
mit Wirtsfaktoren
Effiziente Freisetzung
(NA-Stalk-Länge)
Umgehung der
Immunantwort
(NS1, PB1-F2)
Immunantwort von Hühnern oder den antiviralen Zytokinen der Wirtszelle entgegenzuwirken.
Spezifische AS wie A149V wurden mit erhöhter Virulenz im Huhn assoziiert (Li et al., 2006b).
Außerdem wurde gezeigt, dass eine Deletion der AS 80-84 die Virulenz von H5N1-Viren in
Vögeln erhöht (Long et al., 2008).
In der Abbildung 4 sind die wichtigsten adaptiven Mechanismen noch einmal
zusammengestellt.
Abbildung 4: Zusammenfassung der adaptiven Mechanismen: Darstellung der wichtigsten molekularen Mechanismen der Adaptation von Influenza-A-Viren an Geflügel (rot), Säuger (blau) oder zur allgemeinen Virulenzsteigerung (schwarz) im Replikationszyklus (modifiziert nach Modrow, 2010).
PB1-F2
Das PB1-F2 Protein ist ein kurzes Protein der Influenza-A-Viren, welches von einem +1-
Leserahmen aus translatiert wird und in der Länge stark variieren kann (Chen et al., 2001;
Zell et al., 2007). Die PB1-F2-Expression erhöhte die Virulenz im Mausmodell (Zamarin et
al., 2006). Der C-Terminus des PB1-F2 Proteins enthält eine mitochondriale
Lokalisierungssequenz und die Proteinexpression eines Volllängen PB1-F2 wird mit
mitochondrialer Lokalisierung und Apoptose vor allem von Immuneffektorzellen sowie der
damit verbundenen Herunterregulation der Immunantwort assoziiert und kann so zur
Virulenz beitragen (Chen et al., 2001; Gibbs et al., 2003). Die Phosphorylierung von PB1-F2
ist notwendig, um die Apoptose auszulösen (Mitzner et al., 2009). PB1-F2 induziert die
26
Zytochrom-c-Freisetzung aus den Mitochondrien über eine Interaktion mit dem inner
mitochondrial membrane adenine nucleotide translocator 3 (ANT3) und dem mitochondrial
membrane voltage channel 1 (VDAC1) und führt zur Permeabilität der Mitochondrien; diese
Funktion wurde aber bisher nur bei dem Stamm PR8 gefunden (McAuley et al., 2010;
Zamarin et al., 2005).
Eine diffuse zelluläre Verteilung des PB1-F2-Proteins findet man in Zellen, die mit einigen
H5N1-oder H7N7-Stämmen infiziert wurden. Dementsprechend zeigt PB1-F2 von HK156
keine Fähigkeit zur Apoptoseverstärkung, da eine L-reiche Sequenz am C-Terminus fehlt
(Chen et al., 2010; Zell et al., 2007). Die AS-Substitution N66S im PB1-F2 wurde bisher für
die hohe Virulenz des pandemischen Virus von 1918, aber auch von einigen HK/97-Viren
verantwortlich gemacht und geht mit erhöhter Letalität in infizierten Mäusen einher
(Conenello et al., 2007). PB1-F2 des HPAIV A/Vietnam/1203/04 (H5N1) verstärkt die
Entzündungsantwort in der Lunge, was zu größeren pathologischen Schäden führt
(Conenello et al., 2007; McAuley et al., 2010). Das PB1-F2 wirkt in den Makrophagen der
Alveolen und ist mit bakteriellen Sekundärinfektionen und Virulenz in der Maus assoziiert
(Coleman, 2007; McAuley et al., 2007). Da die PB1-Segmente der pandemischen Viren
1918, 1957 und 1968 von aviären Viren stammen, wird diskutiert, dass die pro-
inflammatorische Wirkung von PB1-F2 wichtig für den Speziesübergang ist, aber während
der kontinuierlichen Adaptation im neuen Wirt verloren ging (McAuley et al., 2010).
Matrixproteine
Ein Beispiel für die Beteiligung des M1 ist die Mutation M1-T139A, welche die Virulenz in
Mäusen steigern kann (Smeenk and Brown, 1994; Ward, 1995). Die Substitution M1-T167A
ist seit 1972 in der humanen H3N2-Linie fixiert und es wird diskutiert, dass sie mit einer
Veränderung der Rezeptorspezifität koinzidiert, da M1 mit HA und NA interagiert und über
diese Bindung eventuell die HA-Funktionen beeinflusst (Ali et al., 2000; Brown et al., 2001;
Ito et al., 1997).
Avirulente und virulente Viren scheinen sich auch in der M2-Ionenkanal-Aktivität zu
unterscheiden, da sie eine unterschiedliche Fähigkeit zur pH-abhängig induzierten
Konformationsänderung in intrazellulär gespaltenen HAs aufweisen (Takeuchi and Lamb,
1994). Reassortment-Studien zeigten, dass das M-Segment auch von einem virulenten Virus
stammt, wenn das HA-Segment von einem virulenten Virus ist (Ogawa and Ueda, 1981).
Des Weiteren kann ein Caspase-Spaltmotiv im M2 (und NP) die Virulenz in Hühnern steigern
(Zhirnov and Klenk, 2009).
27
Reverse Genetik
Im Gegensatz zur klassischen Genetik (vom Phänotyp zum Gen) versteht man unter der
reversen Genetik die Veränderung eines Gens und der anschließenden Aussage über
dessen Funktion anhand des Phänotyps. In der Virologie kann man die reverse Genetik aber
auch als die Generierung eines Virus anhand einer Volllängen-DNA-Kopie des viralen
Genoms definieren. Sie bildet damit ein wichtiges genetisches Werkzeug in der modernen
virologischen Forschung. Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Prinzip der reversen
Genetik ist in der Abbildung 5 dargestellt. Es beruht auf einem Plasmid-basierten
Transfektions-System für die Generierung von Influenza-A-Viren aus klonierter cDNA und
erfordert die Konstruktion von acht Plasmiden, die je eine Kopie eines cDNA-Segmentes
darstellen (Hoffmann et al., 2000a).
Abbildung 5: Prinzip der reversen Genetik (aus Hoffmann et al., 2000a):
Nach Transfektion von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T) mit den acht Plasmiden werden zwei Arten von RNA-Molekülen synthetisiert: Die humane RNA-Polymerase-I synthetisiert negativ-orientierte vRNAs, welche die nicht-kodierenden Regionen am 5´- und 3´-Ende aufweisen. Die Transkription durch die RNA-Polymerase-II erzeugt mRNAs mit 5´-Cap-Struktur und dem 3´-poly(A)-Schwanz, welche anschließend in virale Proteine translatiert werden. Auf diese Weise werden infektiöse Viruspartikel generiert, die durch Infektion von Mardin-Darby Hundenieren- (MDCK-) Zellen repliziert werden.
Zur Klonierung der viralen cDNAs wird zunächst die vRNA des Influenza-A-Virusstammes
isoliert und die reverse Transkription mit einem Primer, der zu den 12 konservierten nt am 3´-
Ende der vRNA komplementär ist, durchgeführt. Anschließend werden die einzelnen cDNA-
Segmente mit Segment-spezifischen Primerpaaren amplifiziert, welche aus den 13 bzw. 12
konservierten nt am 5´- bzw. 3´-Terminus und einigen nt, welche für das jeweilige Segment
spezifisch sind, bestehen (Hoffmann et al., 2001). Danach wird die virale cDNA jedes der
acht Segmente in einen Vektor zwischen dem humanen Polymerase-I-Promotor und
28
Polymerase-I-Terminator inseriert. Die Polymerase-I-Transkriptionseinheit wird von dem
Polymerase-II-Promotor des humanen Cytomegalovirus und dem Poly(A)-Signal des bovinen
Wachstumshormons flankiert.
Die Anwendung der „Target-primed Plasmid-Amplifikation“, in welcher die PCR-Amplikons
als „Megaprimer“ in einer weiteren PCR eingesetzt werden, ermöglicht eine
Restriktionsstellen-unabhängige Klonierung (Stech et al., 2008). Die Verwendung des
veränderten Vektors pHWSccdB erhöht die Wahrscheinlichkeit positiver Klone, da die
Insertion des Influenzavirus-Segmentes die Entfernung des negativen Selektionsmarkers
ccdB zur Folge hat, welcher sonst in empfänglichen E. coli-Stämmen zur Lysis führen würde
(Rice and Bayles, 2008; Stech et al., 2008).
Mittels zielgerichteter Mutagenese können Punktmutationen in die Plasmide eingeführt und
deren Auswirkung in-vitro und in Tierversuchen untersucht werden. Durch den Austausch
von Plasmiden verschiedener Influenza-A-Stämme können außerdem Reassortment-
Ereignisse nachgestellt werden.
29
II ZIELSETZUNG
Es wurde gezeigt, dass sich HPAIV aus LPAIV-Vorläufern durch den Erwerb eines
polybasischen Spaltstellen-Motivs im Zuge der Adaptation an terrestrisches Geflügel
entwickeln. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich daher mit der Frage, ob durch die
Einführung eines solchen Motivs in ein H5N1 LPAIV unmittelbar der Phänotyp eines HPAIV
erreicht wird. Dazu soll zunächst das revers-genetische System für das LPAIV-Isolat
A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) (TG05) etabliert und anschließend das polybasische
Spaltstellen-Motiv des HPAIV-Isolates A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) in das HA
inseriert werden. Die auf diese Weise generierten Viren sollen auf ihre Unterschiede in der
Trypsin-unabhängigen Replikation und auf die Virulenz im Huhn hin untersucht werden. Um
die Auswirkungen des ganzen HA und der anderen viralen Proteine auf die Virulenz zu
beurteilen, sollen außerdem Reassortanten generiert und in die Untersuchungen einbezogen
werden: das komplette R65-HA im Hintergrund des TG05 und umgekehrt das TG05-HA mit
polybasischer HA-Spaltstelle im Hintergrund des R65.
Die meisten HPAIV des Subtyps H5 weisen in der Umgebung der HA-Spaltstellen die
Aminosäure 346S/T auf, während fast alle LPAIV H5-Stämme 346V besitzen. Außerdem
besteht die Spaltstelle der meisten LPAIV H5-Viren aus dem Motiv ETR/G, was darauf
hindeutet, dass die Erlangung der polybasischen HA-Spaltstelle während der Evolution von
LPAIV zu HPAIV zum Verlust des T an Position 2 des Spaltstellen-Motivs führt. Daher sollen
im zweiten Teil der Arbeit verschiedene HA-Spaltstellen-Mutanten des HPAIV R65 mit AS-
Substitutionen in der Spaltstellen-Umgebung generiert und hinsichtlich der Trypsin-
unabhängigen Replikation und der Virulenz im Huhn untersucht werden.
Die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 verbreiteten sich über infizierte Vögel von Südostasien nach
Europa, infizierten aber auch eine Vielzahl von Säugerspezies. Normalerweise weisen aviäre
Influenzaviren PB2-627E auf; im Gegensatz dazu besitzen die Clade 2.2-Viren PB2-627K,
was sonst in humanen Stämmen zu finden ist. Um die Rolle dieser Mutation beim
Wirtswechsel der Clade 2.2 Viren auf Säuger zu untersuchen, soll im dritten Teil der Arbeit
die ursprüngliche Situation aviärer Viren, also PB2-627E, im R65 wieder hergestellt und die
Auswirkung auf die Replikation und Polymerase-Aktivität in Vogel- und Säugerzellen sowie
auf die Virulenz im Huhn und in der Maus untersucht werden. Im Falle einer Reversion der
Mutation nach Passage in Säugerzellen sollen virale Proteine identifiziert werden, die eine
solche Reversion unterstützen. Dazu werden Reassortanten generiert und passagiert, deren
replikativer Komplex aus R65-Proteinen und Proteinen des HPAIV-Isolats A/Hong
30
Kong/156/97 (H5N1) besteht, welches natürlicherweise PB2-627E enthält und dessen
revers-genetisches System ebenfalls etabliert werden soll.
Die daraus gewonnenen Erkenntnisse dienen dem besseren Verständnis der molekularen
Mechanismen zur Adaptation aviärer Influenzaviren an Geflügel und Säuger. Außerdem
legen sie die Grundlage für eine differenzierende Risikoabschätzung bei dem Auftreten
neuer hochpathogener Influenzaviren in Geflügel sowie für die Entstehung neuartiger
pandemischer Stämme.
31
III ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG UND DISKUSSION DER ERGEBNISSE
Das Prinzip der reversen Genetik von Influenzaviren ermöglicht es, gezielt die molekularen
Mechanismen der Adaptation an Geflügel und Säuger zu untersuchen. So kann die
Relevanz vermutlicher Virulenzfaktoren gezeigt werden, indem sie in avirulente Stämme
eingeführt oder aus hochvirulenten Stämmen entfernt werden. Beide Ansätze wurden in der
vorliegenden Arbeit angewendet.
(1) Highly pathogenic H5N1 influenza viruses carry virulence determinants beyond
the polybasic HA cleavage site.
Um die Fähigkeit eines LPAIV H5N1-Stammes zur Erlangung eines HPAIV-Phänotyps zu
untersuchen, wurde zunächst das revers-genetische System des LPAIV
A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) (TG05) etabliert. Die Einführung des polybasischen HA-
Spaltmotivs des HPAIV A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) führte nicht zur erfolgreichen
Generierung des rekombinanten Virus. Daher wurde alternativ das polybasische HA-
Spaltmotiv des HPAIV A/Duck/Shanghai/13/01 (H5N1) zur Generierung von TG05poly mittels
zielgerichteter Mutagenese genutzt. Des Weiteren wurden zwei Reassortanten erzeugt:
TG05-HAR65 mit dem kompletten R65-HA im genetischen Hintergrund des TG05 und
umgekehrt R65-HATG05poly mit dem mutierten TG05-HA im R65-Hintergrund.
Grundsätzlich unterscheiden sich LPAIV von HPAIV durch die Abhängigkeit von einer
Protease monobasischer Spezifität. Für die in-vitro-Replikation wird daher Trypsin
verwendet. Mit Hilfe von Plaquetests konnte gezeigt werden, dass TG05 nur bei Trypsin-
Zusatz zur Plaque-Bildung fähig ist, während alle generierten Viren mit polybasischem HA-
Spaltmotiv auch ohne Trypsin Plaques bildeten. Im Western-Blot wurde nachgewiesen, dass
der HA-Vorläufer HA0 des TG05 ohne Trypsin-Zusatz nicht gespalten wird; im Gegensatz
dazu erfolgte bei den Viren mit polybasischer HA-Spaltstelle die HA-Spaltung in HA1 und HA2
Trypsin-unabhängig. In der Wachstumskinetik in Hühnerfibroblasten (DF-1) wurde ebenfalls
die Trypsin-Unabhängigkeit aller Viren mit polybasischem HA-Spaltmotiv gezeigt.
Anschließend wurde die Virulenz der rekombinanten Viren im Huhn untersucht. TG05 führte
nicht zu Symptomen, während TG05poly in einer zeitlich begrenzten Erkrankung resultierte.
Die Infektion mit TG05-HAR65 führte zum Tod von drei von zehn Tieren, doch die höchste
Letalität wies R65-HATG05poly auf, da acht von zehn Hühnern verstarben. Die
histopathologische Untersuchung infizierter Tiere zeigte, dass der Organtropismus und die
Ausprägung der Läsionen mit dem Erkrankungsbild übereinstimmen. Der Neurotropismus
32
kann durch das R65-HA allein vermittelt werden, die systemische Ausbreitung wird aber
auch durch die internen Gene bestimmt.
Während der Anfertigung dieser Arbeit wurden ähnliche Versuche mit anderen Subtypen
durchgeführt: Die Insertion einer polybasischen HA-Spaltstelle in einen H6N1-Stamm
resultierte in-vitro und im Huhn in der Ausprägung eines HPAIV-Phänotyps. In einem H3N8-
Stamm dagegen blieb das resultierende Virus avirulent, obwohl die Trypsin-Unabhängigkeit
in-vitro gezeigt wurde. Entsprechend der vorliegenden Arbeit führte die Modifizierung der
HA-Spaltstelle einer H9-Reassortante nur zu einer hohen Letalität, wenn die restlichen
Gensegmente von einem HPAIV stammen. Da aber die Einführung der polybasischen HA-
Spaltstelle in TG05 zu Symptomen in infizierten Hühnern führte, weisen LPAIV H5N1-
Stämme bereits verdeckte Virulenzdeterminanten auf. Das HA-Gen eines HPAIV H5N1 trägt
zwar maßgeblich zur Virulenz bei, aber der gesamte genetische Hintergrund ist zur vollen
Ausprägung des HPAIV-Phänotyps nötig. Vergleicht man die Sequenzen des LPAIV TG05
und des HPAIV R65 werden neben der HA-Spaltstelle weitere Unterschiede sichtbar. In der
NA des R65 findet sich eine Deletion der AS 49 – 68 im Stiel-Bereich, welche ebenfalls mit
der Adaptation an Hühner und der Virulenz-Steigerung assoziiert wird. Ein Grund für die
erfolglose Generierung des TG05 mit HA-Spaltstellenmotiv des R65 könnte ein gestörtes
Gleichgewicht von HA-Affinität und NA-Aktivität sein, denn die Kombination von R65-
Spaltstelle im TG05-HA und Deletion im TG05-NA führte zu „lebensfähigem“ Virus. Des
Weiteren befindet sich im NS1 des R65 eine Deletion der AS 81 – 85, deren Beteiligung an
der Virulenz noch ungeklärt ist. Durch die Herstellung entsprechender NA- und NS-
Deletionen in TG05 in Kombination mit dem polybasischen HA-Spaltmotiv oder
entsprechende NA- und NS-Insertionen in R65 könnte der Beitrag dieser Faktoren zur
Adaptation an Geflügel bzw. zur Virulenzsteigerung weiter untersucht werden.
(2) Amino acids adjacent to the haemagglutinin cleavage site are relevant for
virulence of avian influenza viruses of subtype H5.
Zur Untersuchung der HA-Spaltstellenumgebung wurde zunächst das polybasische Motiv
des R65-HA in die monobasischen Motive ER/G und ETR/G mutiert und die Viren R65mono-S-
ER und R65mono-S-ETR generiert. Weiterhin wurde die Substitution HA-S-346V eingeführt,
woraus die monobasischen Varianten R65mono-V-ER und R65mono-V-ETR sowie die
polybasische Variante R65-V resultierten. Sowohl R65 als auch R65-V zeigten eine Plaque-
Bildung in Abwesenheit von Trypsin, während alle Virus-Varianten mit monobasischem
Spaltstellen-Motiv nur bei Trypsin-Zusatz Plaques ausbildeten. Diese strenge Trypsin-
33
Abhängigkeit konnte ebenfalls im Western-Blot nachgewiesen werden und beweist den
LPAIV-Phänotyp der Spaltstellen-Mutanten mit monobasischem Motiv. In der
Wachstumskinetik replizierten alle Virus-Mutanten zu ähnlich hohen Titern, wenn Trypsin
zugegeben wurde. Bei Trypsin-Abwesenheit blieb die Replikation von R65 und R65-V
unbeeinflusst, während alle Varianten mit monobasischer Spaltstelle nur zu einer stark
verkürzten Replikation fähig waren. R65mono-S-ETR zeigte dennoch die höchste
Replikationseffizienz; R65mono-V-ER replizierte dagegen am schlechtesten. HA-346S scheint
daher einen Vorteil bei der Replikation zu vermitteln. Im Gegensatz zu R65mono-V-ETR und
R65mono-V-ER, welche keine Symptome in Hühnern verursachten, führte die Infektion mit
R65mono-S-ETR und R65mono-S-ER zu einer sehr milden Klinik. Durch die Entfernung der
polybasischen HA-Spaltstelle werden andere Virulenz-Determinanten vollständig maskiert.
Eine Infektion mit R65 führte zum Tode aller Hühner innerhalb von zwei Tagen nach
Infektion, während ein Teil der R65-V-infizierten Tiere erst am Tag drei verstarb. HA-346V
trägt damit zu einer leicht verlängerten Überlebenszeit bei. Interessanterweise schützte die
Infektion mit R65mono-V-ETR vor einer letalen Belastungsinfektion mit R65.
(3) Reversion of PB2 627E to 627K during replication of an H5N1 clade 2.2 virus in
mammalian hosts depends on origin of the nucleoprotein.
Zur Untersuchung der Bedeutung der Substitution PB2-E627K in H5N1 HPAIV der Clade 2.2
auf die Virulenz in Säugern wurde mit Hilfe der reversen Genetik und zielgerichteter
Mutagenese PB2-K627 im Isolat R65 durch PB2-627E ersetzt und das Virus R65-PB2K627E
generiert. Während sowohl R65 als auch R65-PB2K627E ähnlich gut in Vogelzellen (DF-1, QT-
6) replizierten, führte die Substitution PB2-K627E zu einem stark eingeschränkten Wachstum
in Säugerzellen (A549, Vero). Die Aktivität der rekonstituierten replikativen Komplexe wurde
mit Hilfe eines Luciferase-Reporters bestimmt. Dabei führte die Mutation zu einer drastischen
Reduzierung der Polymerase-Aktivität in Säugerzellen (5%), aber auch zu einer moderaten
Einschränkung in aviären Zellen (50%). Die Substitution PB2-K627E führte zu keiner
Virulenzänderung im Huhn, da beide Viren alle infizierten Tiere innerhalb von drei Tagen
töteten und die gleichen makroskopischen Läsionen erzeugten. Die Maus hat sich als
Säugermodell zur Untersuchung der Virulenz von Influenzaviren erwiesen; daher wurde die
letale Dosis 50 (LD50) beider Viren in der Maus bestimmt. Im Gegensatz zur hohen Virulenz
von R65 (LD50<10 pfu) führte die Substitution PB2-K627E zur drastischen Reduzierung der
Virulenz (LD50>104 pfu) sowie zu weniger stark ausgeprägtem Gewichtsverlust und
geringeren Virustitern in Lunge, Herz und Gehirn drei Tage nach der Infektion. Anhand der
Sequenzierung von Organhomogenaten infizierter Mäuse konnte gezeigt werden, dass
34
bereits nach einer Passage in der Maus eine Reversion der eingeführten Mutation PB2-
K627E zurück zu K auftritt. Solche Revertanten waren bereits nach drei Tagen in der Lunge
präsent. Der erste Virus-Nachweis im Gehirn erfolgte nach fünf Tagen und beinhaltete
bereits einen erheblichen Anteil revertierter Sequenz. In den Organen infizierter Hühner
konnte keine Reversion gezeigt werden.
Um zu untersuchen, ob auch andere virale Proteine für diese Rückmutation notwendig sind,
wurden Reassortanten generiert, welche R65-PB2-K627E und ein oder mehrere
Gensegmente des R65 im genetischen Hintergrund des HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1)
tragen, welches natürlicherweise PB2-627E aufweist. Diese Reassortanten wurden fünfmal
in Vogel- und Säugerzellen passagiert und die Überstände sequenziert. Während in den
aviären Zellen keine Reversion zu verzeichnen war, begann bereits bei der zweiten Passage
in Säugerzellen eine Reversion zu PB2-627K und der Anteil revertierter Sequenzen nahm
mit jeder weiteren Passage zu. Interessanterweise geschah dieses aber nur bei Anwesenheit
des R65-NP, was für eine wichtige Rolle dieses viralen Proteins bei der Selektion von PB2-
627K spricht.
Vermutlich wird eine eingeschränkte PB2-NP-Interaktion durch PB2-627K kompensiert.
Weitere Studien wie ein PB2-NP-Bindungs-Assay mit PB2-627K und PB2-627E könnten
diese Erkenntnis weiter stützen. Der hohe Anteil revertierter Sequenzen beim Virus-
Nachweis im Gehirn deutet darauf hin, dass PB2-627K im Säuger eine Rolle bei der
Neuroinvasion spielen könnte. Aufgrund der schnellen Reversion von R65-PB2K627E zu PB2-
627K im Säuger muss man davon ausgehen, dass Clade 2.2 H5N1 HPAIV in ihrer Evolution
Säuger-Zwischenwirte hatten. Da diese Substitution keinen Nachteil im Vogel vermittelt,
wurde PB2-627K in diesen Wirten beibehalten. Da man den genauen Wirkungs-
Mechanismus der Mutation PB2-627K während der Adaptation an Säuger noch nicht kennt,
könnte man durch Live-Cell-Imaging mit Fluoreszenz-markierten Viren die zelluläre Barriere
identifizieren, die durch diese Substitution überwunden wird.
35
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V HIGHLY PATHOGENIC H5N1 INFLUENZA VIRUSES CARRY VIRULENCE
DETERMINANTS BEYOND THE POLYBASIC HA CLEAVAGE SITE
Highly Pathogenic H5N1 Influenza Viruses CarryVirulence Determinants beyond the PolybasicHemagglutinin Cleavage SiteJessica Bogs1, Jutta Veits1, Sandra Gohrbandt1, Jana Hundt1, Olga Stech1, Angele Breithaupt2, Jens P.
Teifke2, Thomas C. Mettenleiter1, Jurgen Stech1*
1 Institute of Molecular Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Germany, 2 Institute of Infectology,
Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Germany
Abstract
Highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) originate from avirulent precursors but differ from all other influenzaviruses by the presence of a polybasic cleavage site in their hemagglutinins (HA) of subtype H5 or H7. In this study, weinvestigated the ability of a low-pathogenic avian H5N1 strain to transform into an HPAIV. Using reverse genetics, wereplaced the monobasic HA cleavage site of the low-pathogenic strain A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) (TG05) by apolybasic motif from an HPAIV (TG05poly). To elucidate the virulence potential of all viral genes of HPAIV, we generated tworeassortants carrying the HA from the HPAIV A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) plus the remaining genes from TG05(TG05-HAR65) or in reversed composition the mutated TG05 HA plus the R65 genes (R65-HATG05poly). In vitro, TG05poly andboth reassortants were able to replicate without the addition of trypsin, which is characteristic for HPAIV. Moreover, incontrast to avirulent TG05, the variants TG05poly, TG05-HAR65, and R65-HATG05poly are pathogenic in chicken to an increasingdegree. Whereas the HA cleavage site mutant TG05poly led to temporary non-lethal disease in all animals, the reassortantTG05-HAR65 caused death in 3 of 10 animals. Furthermore, the reassortant R65-HATG05poly displayed the highest lethality as 8of 10 chickens died, resembling ‘‘natural’’ HPAIV strains. Taken together, acquisition of a polybasic HA cleavage site is onlyone necessary step for evolution of low-pathogenic H5N1 strains into HPAIV. However, these low-pathogenic strains mayalready have cryptic virulence potential. Moreover, besides the polybasic cleavage site, the additional virulencedeterminants of H5N1 HPAIV are located within the HA itself and in other viral proteins.
Citation: Bogs J, Veits J, Gohrbandt S, Hundt J, Stech O, et al. (2010) Highly Pathogenic H5N1 Influenza Viruses Carry Virulence Determinants beyond thePolybasic Hemagglutinin Cleavage Site. PLoS ONE 5(7): e11826. doi:10.1371/journal.pone.0011826
Editor: Linqi Zhang, Tsinghua University, China
Received February 22, 2010; Accepted July 5, 2010; Published July 27, 2010
Copyright: � 2010 Bogs et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: Forschungssofortprogramm Influenza of the German government (FSI 2.44) and European Commission [SSPE-CT-2006-44372 (Innflu)]. The funders hadno role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
Introduction
Highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) are the
causative agents of fowl plague [1,2] which causes devastating
economic losses in gallinaceous poultry. In addition, several
HPAIV strains are able to infect humans and, therefore, are
considered as potential precursors for future influenza pandemics
[3]. For infection, the envelope glycoprotein hemagglutinin (HA)
precursor HA0 requires proteolytic cleavage by cellular proteases
into the two subunits HA1 and HA2. Mammalian and low-
pathogenic avian influenza A viruses (LPAIV) carry an HA
cleavage site with a monobasic motif susceptible to trypsin-like
proteases which confine viral replication to the respiratory or
gastrointestinal tract. In contrast, HPAIV possess a polybasic HA
cleavage site cleavable by furin [4,5], which is ubiquitous and thus
supports systemic viral replication. This polybasic HA cleavage site
is the prime virulence determinant of HPAIV [6,7,8] which
originate from LPAIV precursors [4,9,10,11,12,13,14,15,16].
Acquisition of a furin recognition motif was shown to result from
different events such as recombination of the HA gene with 28S
ribosomal RNA [17] or with sequences encoding other viral
proteins like the nucleoprotein (NP) gene of an unrelated virus [15]
or the HA and matrix protein genes (M) from the same virus [16].
An alternative proposed mechanism is polymerase slippage on
template regions with stable secondary structures [13,14]. In
mammalian influenza viruses, virulence determinants have been
attributed to the HA [18,19,20,21,22], NA [18,23], NS1 [24,
25,26,27,28], NP and polymerase proteins [18,29,30,31,32,
33,34]. In HPAIV, beside the polybasic HA cleavage site, the
caspase cleavage motif in the M2 protein and deletions within the
NA stalk region were associated with increased virulence
[35,36,37,38,39,40]. Furthermore, introduction of the NS gene
from an H5N1 HPAIV into an H7N1 fowl plague strain rendered
it virulent for mice [41]. Recently, we demonstrated that the
acquisition of a polybasic cleavage site by an LPAIV H3N8 strain
is not sufficient for immediate transformation into an HPAIV, and
that additional virulence determinants other than the polybasic
HA cleavage site are required [42]. However, it remained to be
analyzed whether H5 or H7 LPAIV, which are considered
HPAIV precursors, have to undergo further evolutionary changes
prior to or after acquisition of a polybasic cleavage site. Therefore,
we addressed in this study the question whether a polybasic
PLoS ONE | www.plosone.org 1 July 2010 | Volume 5 | Issue 7 | e11826
cleavage site engineered into the HA of an H5N1 LPAIV leads to
immediate transformation into an HPAIV. To elucidate the
virulence potential of all viral genes of H5N1 HPAIV in chicken
further, we generated two H5N1 reassortants carrying an HPAIV
HA plus the remaining LPAIV genes, or, in reversed composition,
the LPAIV HA with engineered polybasic cleavage site plus the
HPAIV genes.
Results
Generation of Recombinant VirusesAs parental strains we used a recent H5N1 LPAIV isolated in
Germany in 2005, A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) [43]
as well as the first HPAIV H5N1 isolate derived from the outbreak
in wild swans on the island of Rugen in February 2006, A/Swan/
Germany/R65/06 (H5N1) [44]. First, plasmid-based reverse
genetics systems were established for both strains, resulting in
the recombinant viruses TG05 (this study) and R65 [45],
respectively. To introduce a polybasic HA cleavage site into
TG05 (H5N1), we replaced its monobasic HA cleavage site with a
polybasic motif from HPAIV A/Duck/Shanghai/13/01 (H5N1)
by site-directed mutagenesis and used this plasmid for generation
of the mutant TG05poly. Considering possible structural con-
straints within the HA of the parental TG05, we also adapted the
amino acids adjacent to the cleavage site to those from the HA of
A/Duck/Shanghai/13/01 (H5N1) (Table 1). Furthermore, we
rescued two reassortants carrying the HA from HPAIV R65 plus
the remaining seven genes from TG05 (TG05-HAR65), or, in
reversed composition, the mutated TG05 HA plus the remaining
R65 genes (R65-HATG05poly). Remarkably, we could not rescue a
mutant of TG05 with the polybasic cleavage site region from R65
suggesting structural impairments of the mutated HA.
TG05poly has in-vitro properties of an HPAIVTo address the question whether the HA cleavage site mutant
and the two reassortants are dependent on trypsin for multicycle
replication, we performed plaque assays. Whereas the parental
TG05 required exogenous trypsin for plaque formation, all the
viruses with a polybasic HA cleavage site, TG05poly, TG05-
HAR65, and R65-HATG05poly, yielded plaques independent of
trypsin (Fig. 1). Proteolytic HA cleavage was analyzed by
immunoblotting. Corresponding to plaque assays, the HA0
precursor of TG05 remained uncleaved in the absence of trypsin
in contrast to HA0 of TG05poly, TG05-HAR65, and R65-
HATG05poly (Fig. 2), which were cleaved into the HA1 and HA2
fragments. The HA0 cleavage was incomplete in all viruses
studied. Multicycle growth kinetics of TG05 showed a strong
dependence on exogenous trypsin as the virus failed to replicate
efficiently in the absence of trypsin. TG05poly replicated both in
the presence and in the absence of trypsin, although with a delay
compared with the other viruses. However, both reassortant
viruses TG05-HAR65 and R65-HATG05poly replicated to high titers
irrespective of trypsin (Fig. 3). In summary, these results
demonstrate that TG05poly, TG05-HAR65, and R65-HATG05poly
undergo multicycle replication in the absence of trypsin in contrast
to their parent virus TG05 and, thus, display HPAIV phenotypes
in-vitro.
Pathogenicity in chickenTo investigate the virulence of TG05, TG05poly, TG05-HAR65,
and R65-HATG05poly in chicken, 10 animals each were infected
with 105 pfu of the respective virus oculonasally, and observed
daily for clinical symptoms for 10 days (Table 2 and Fig. 4). In
contrast to the low-pathogenic parental virus TG05 which proved
to be completely innocuous as expected, the HA cleavage site
mutant TG05poly and the two reassortants TG05-HAR65 and R65-
HATG05poly were pathogenic in chicken to an increasing degree.
Infection with TG05poly led to temporary non-lethal disease in all
animals (predominantly mild symptoms such as ruffled feathers,
depression or diarrhea mainly from day 3 to 6). After inoculation
with TG05-HAR65 3 of 10 animals died, whereas R65-HATG05poly
displayed the highest lethality as 8 of 10 infected chickens died,
thus exhibiting the phenotype of a natural HPAIV (Table 2).
Organ tropism and tissue lesions in chickenOn day 4 post inoculation, samples from cerebellum, cerebrum,
lung, nose, trachea, caecum, duodenum, kidney, and pancreas
from three (TG05, TG05poly and TG05-HAR65) and four (R65-
HATG05poly) additionally infected birds per group were removed
and investigated for viral spread in organs and the extent of lesions
in affected tissues. No influenza virus antigen or histomorpholog-
ical lesions were found in organs of TG05 infected birds. In one of
the three TG05poly-inoculated birds, single positive neurons,
pneumocytes II, endothelial cells, lymphocytes, and macrophages
could be detected in cerebrum, lung, nasal conchae, trachea,
caecum, and duodenum. Furthermore, in one TG05-HAR65-
infected bird, small clusters of infected cells were present in
cerebellum and cerebrum suggesting that already the introduction
of the R65 HA facilitates neurotropism.
All four R65-HATG05poly-infected birds exhibited larger and
more intensely stained clusters of infected cells within cerebellum,
cerebrum, and nasal mucosae; several birds displayed single
positive cells in lung, trachea, caecum, duodenum, kidney, and
pancreas. After infection with the recombinant HPAIV R65 [45],
the picture of infected cells appeared more intense (Table 3, Fig. 5).
These results demonstrate a broader organ tropism of R65-
HATG05poly-inoculated birds compared with TG05poly-inoculated
birds demonstrating the relevance of the other viral genes for
systemic spread.
On day 10 post inoculation, organs were removed from four
surviving birds each of the TG05, TG05poly and TG05-HAR65-
infected groups. No antigen was detectable in tissues of these birds,
except for a few positive neurons and glial cells in the cerebellum
from one TG05-HAR65-infected bird, and in the cerebrum from
Table 1. Generated viruses and their HA cleavage sites.
Abbreviation Description HA Cleavage Site
TG05 A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) recombinant, monobasic cleavage site GPRNVPQKET - - - - R/G
TG05poly Recombinant TG05 with polybasic cleavage site from A/Duck/Shanghai/13/01 (H5N1) GLRNTPQRERRRKKR/G
TG05-HAR65 Reassortant from TG05 with HA gene from A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) GLRNSPQGERRRKKR/G
R65-HATG05poly Reassortant from R65 with HA gene from TG05poly GLRNTPQRERRRKKR/G
doi:10.1371/journal.pone.0011826.t001
HPAIV Virulence Determinants
PLoS ONE | www.plosone.org 2 July 2010 | Volume 5 | Issue 7 | e11826
two surviving R65-HATG05poly-infected animals, as well as
inflammatory cells in the nasal mucosa from one of those birds,
demonstrating the recovery of the animals (Table S1).
Taken together, the presence of influenza virus antigen
corresponded to degeneration and necrosis of the affected tissues
accompanied by lymphocytic and histiocytic infiltration. Extent of
organ tropism and severity of lesions corroborate with the course
of disease. In HPAIV, viral neurotropism can be facilitated by the
HA gene solely and systemic spread is mediated also by the
internal protein genes.
Discussion
Influenza virus virulence is a polygenic trait which had been
established by generating reassortants neurovirulent for mice from
two apathogenic strains, and reassortants apathogenic in chicken
from two virulent strains [46,47]. Furthermore, reassortment
studies based on two H5N1 HPAIV strains revealed that the
exchange of the HA, NP, M2 or NS1 proteins resulted in
increased mortalities and expanded tissue tropism in chicken.
Moreover, replacement of the PB2 or PB1 proteins led to
decreased replication in tissues and, consequently, a decrease in
virulence [48]. These findings can be attributed to involvement of
these proteins in virulence or to constraints of gene segment
exchanges by reassortment in HPAIV. However, the prime
determinant of virulence is the polybasic HA cleavage site
[6,7,8] as its conversion into a monobasic motif invariably resulted
in loss of virulence [7]. On the other hand, introduction of such a
polybasic motif into the HA cleavage site of a low-pathogenic
H3N8 strain did not lead to transformation into an HPAIV
indicating the existence of additional virulence determinants in the
HA and/or the other viral proteins [42].
To shed more light on virulence determinants required for
evolution of HPAIV which, in nature, derive from low-pathogenic
precursors of subtypes H5 or H7 [4,9,10,11,12,13,14,15,16], we
addressed the question whether a low-pathogenic avian strain of
the H5N1 subtype would transform into a highly pathogenic strain
after introduction of a polybasic HA cleavage site. For that
purpose, we replaced the monobasic HA cleavage site from TG05
by a polybasic motif from the HPAIV A/Duck/Shanghai/13/01
(H5N1) resulting in the mutant TG05poly. Remarkably, attempts
to obtain a similar mutant with the HA cleavage site of HPAIV
R65 were not successful indicating structural incompatibilities with
the TG05 HA.
Although TG05poly was able to replicate in the absence of
trypsin in cell-culture, and, thus, exhibits the in-vitro phenotype of
Figure 1. Multicycle replication in-vitro. Plaque assays of TG05 in comparison with TG05poly, TG05-HAR65, and R65-HATG05poly on MDCK cells inthe presence and in the absence of trypsin.doi:10.1371/journal.pone.0011826.g001
Figure 2. Proteolytic HA activation. Western blots of DF-1 celllysates infected with TG05, TG05poly, TG05-HAR65 or R65-HATG05poly atmultiplicity of infection of 0.1 incubated in the presence (T) and in theabsence (-) of trypsin.doi:10.1371/journal.pone.0011826.g002
Figure 3. Growth kinetics. DF-1 cells were inoculated with TG05(blue), TG05poly (magenta), TG05-HAR65 (yellow), and R65-HATG05poly
(red) at multiplicity of infection 1023 in the presence (diamonds) and inthe absence (circles) of trypsin.doi:10.1371/journal.pone.0011826.g003
HPAIV Virulence Determinants
PLoS ONE | www.plosone.org 3 July 2010 | Volume 5 | Issue 7 | e11826
an HPAIV, this mutant caused only temporary mild disease in
chicken and, accordingly, could be detected only in isolated single
cells accompanied with minor lesions in affected organs. These
observations differ from those obtained by the H3N8 polybasic
cleavage site mutants generated from the LPAIV A/Duck/
Ukraine/1/1963 which caused considerably less symptoms in
chicken [42] compared with TG05poly indicating that the low-
pathogenic H5N1 strain already carried cryptic virulence
determinants. Correspondingly, repeated air sac inoculation of a
low-pathogenic H5N3 isolate in 1-day-old-chickens did not lead to
high virulence for 4-to-6-week-old chickens, whereas only two
further passages in brain yielded an HPAIV [49].
To demonstrate the existence of virulence determinants besides
the polybasic cleavage site in the HA or in other genes of H5N1
HPAIV, we generated two reassortants, TG05-HAR65 carrying
the HA from the HPAIV R65 plus the remaining seven genes
from TG05 and, in reverse gene constellation, R65-HATG05poly
composed of the mutated TG05 HA plus the other R65 genes.
Whereas TG05-HAR65 already had a lethality of 30%, R65-
HATG05poly caused a lethality of 80%, displaying the phenotype of
a ‘‘natural’’ HPAIV. These findings indicate that in H5N1 HPAIV
the HA gene alone provides for a certain level of virulence,
whereas the complete viral genetic background influences
pathogenicity to a major extent.
Compared with the very broad organ tropism of the HPAIV
R65 in chicken [50], the mutant TG05poly and the two
reassortants TG05-HAR65 and R65-HATG05poly displayed gener-
ally less viral spread in organs and less extensive lesions in
surrounding tissues. However, spread and lesions increased with
the two reassortants from which R65-HATG05poly exhibited the
phenotype of an authentic HPAIV. This finding again emphasizes
the relevance of HA and the other viral genes for virulence.
Moreover, all birds which had viral antigen detectable in inner
organs, i.e. those infected by TG05poly, TG05-HAR65 or R65-
HATG05poly also exhibited a neuronal infection. Thus, the presence
of the HPAIV R65 HA alone in a LPAIV background suffices for
viral neurotropism which is considered pivotal for the fatal course
of fowl plague [51,52,53].
Previous studies on HPAIV strains revealed that (1) removal of
the polybasic HA cleavage site results in a drastic decrease in
pathogenicity [7]; (2) virulence is a multigenic trait as reassortants
derived from HPAI strains can be attenuated [46], two LPAI
strains can reassort to a highly virulent virus [47] and reassortants
with exchanged HA, NP, M or NS, PB2 or PB1 gene have an
altered virulence [48]; (3) NA stalk deletion leads to a certain
increase in virulence in an LPAIV [40]; and (4) NS1 can increase
virulence of an HPAIV further [41]. Most of these studies started
from HPAIV and measured a decline in pathogenicity, which
demonstrates that the identified alterations were required for full
expression of virulence, or resulted from reassortment events
which are prone to incompatibilities. No study so far addressed the
question whether acquisition of a polybasic cleavage site is
sufficient to transform a LPAIV H5 precursor into a highly
pathogenic H5 virus. However, knowledge on this problem is most
relevant, since it is required for development of a science-based
assessment of the risk of HPAIV emergence from LPAIV field
strains. Therefore, we introduced a polybasic HA cleavage site into
the low-pathogenic H5N1 strain TG05, a potential HPAI
precursor virus, in order to model the early evolution of HPAIV.
This approach complements the current knowledge on the relative
importance of virulence determinants and HPAIV evolution from
the opposite point of view.
Taken together, acquisition of a polybasic HA cleavage site is
only one necessary step for evolution of H5N1 HPAIV from low-
pathogenic precursor strains, which may already have cryptic
virulence potential. Moreover, besides the polybasic HA cleavage
site, additional virulence determinants of HPAIV are located
within the HA itself and in the other viral proteins. Knowledge of
these virulence factors is crucial for an assessment of the risk of
transformation of any LPAIV to HPAIV which is highly relevant
for the control of notifiable LPAIV H5 or H7 infections in poultry.
Material and Methods
Ethics StatementThe animal experiments were evaluated by the responsible
ethics committee of the State Office for Agriculture, Food Safety
and Fishery in Mecklenburg-Western Pomerania (LALFF M-V)
and gained governmental approval (registration number LALLF
M-V/TSD/7221.3-1.1-018/07).
Cells and VirusesHuman embryonic kidney 293T [32] and Madin-Darby canine
kidney (MDCK) cells [32] were maintained in DMEM containing
10% fetal calf serum (FCS). Chicken fibroblast cells (DF-1) were
cultured in ISCOVES DMEM containing 10% FCS in the
absence of antibiotics. The low-pathogenic avian influenza A virus
A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) (TG05) was isolated
from a healthy green winged teal (Anas crecca) [43]. The sequences
of cloned viral genes have been submitted to Genbank (accession
numbers CY061882-9). A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1)
(R65) was isolated from a dead swan during the HPAIV outbreak
Figure 4. Virulence in chicken. Daily clinical score after oculonasalinoculation with 105 pfu of TG05 (blue), TG05poly (magenta), TG05-HAR65
(yellow) or R65-HATG05poly (red). The birds were observed for 10 days forclinical signs and classified as healthy (0), ill (1), severely ill (2), or dead(3); the daily clinical score was calculated from the sum of individualclinical scores from all birds divided by the number of animals pergroup (10 chickens).doi:10.1371/journal.pone.0011826.g004
Table 2. Virulence in chickens.
Virus Clinical Score Morbidity Mortality
TG05 0.0 0/10 0/10
TG05poly 0.5 10/10 0/10
TG05-HAR65 0.9 8/10 3/10
R65-HATG05poly 2.1 10/10 8/10
Clinical score, morbidity, and mortality after 10 days observation followingoculonasal infection.doi:10.1371/journal.pone.0011826.t002
HPAIV Virulence Determinants
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HPAIV Virulence Determinants
PLoS ONE | www.plosone.org 5 July 2010 | Volume 5 | Issue 7 | e11826
in Rugen, Germany, 2006 (Genbank accession numbers
DQ464354-DQ464361) [44]. Both native viruses were propagated
in 11-day-old embryonated chicken eggs.
Generation of recombinant virusesViral genes from TG05 were cloned into the plasmid
pHWSccdB as described in [45]. Site-directed mutagenesis of
the HA cleavage site region was performed by the QuikchangeTM
protocol (primer sequences available upon request). All recombi-
nant viruses were rescued essentially as described [32] with the
addition of plasmids expressing the polymerase proteins and the
nucleoprotein genes from A/PR/8/34 (H1N1) (a kind gift from
Peter Palese) except for R65-HATG05poly. The recombinant R65
[45] differs from the native isolate [44] by 4 nucleotide exchanges
in the PB2 gene (DQ464357): C1009T corresponding to the
amino acid replacement L329F, in the PB1 gene (DQ464361):
A1603G and G1604T corresponding to the amino acid replace-
ment S527V, and in the HA gene (DQ464354): C1737T in non-
coding region. TG05 was propagated in embryonated eggs, all
other recombinant viruses were grown on MDCK cells. Gene
composition and HA cleavage site of the generated viruses were
verified by sequencing of amplicons from reverse transcription-
PCR (data not shown). All viruses with polybasic HA cleavage site
were handled under BSL3+ conditions.
Figure 5. Viral organ tropism in chicken. Immunohistochemical detection of influenza A virus nucleoprotein (brown) in lung and cerebellumfrom chickens sacrificed on day 4 post inoculation with 105 pfu of TG05 or R65-HATG05poly, and from moribund chickens sacrificed on day 2 postinoculation with 106 TCID50 R65.doi:10.1371/journal.pone.0011826.g005
HPAIV Virulence Determinants
PLoS ONE | www.plosone.org 6 July 2010 | Volume 5 | Issue 7 | e11826
Plaque assay and growth curvesPlaque assays were performed on MDCK cells as described
previously [54] with 400 ml inoculum either in the presence of
2 mg/ml N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-
treated trypsin (Sigma, Taufkirchen, Germany), or in the absence
of trypsin. For determination of growth curves, DF-1 cells were
inoculated at a multiplicity of infection of 1023 in the presence of
1 mg/ml TPCK-treated trypsin or in the absence of any exogenous
protease. From two independent experiments, supernatants were
harvested at 0, 8, 24, 48, and 72 h post inoculation and resulting
infectious virus was titrated by plaque assay on MDCK cells in the
presence of trypsin.
Western blotsDF-1 cells were infected at a multiplicity of infection of 0.1 in
the presence of either 1.0 mg/ml TPCK-treated trypsin or no
exogenous protease in ISCOVES DMEM and 0.2% bovine serum
albumin (BSA) (MP Medicals, Heidelberg) until a cytopathic effect
appeared (48 h for TG05, TG05-HAR65, and R65-HATG05poly;
7 d for TG05poly). Cells were lysed with 46Laemmli buffer [55]
containing 4% sodium dodecyl sulfate (SDS) and were inactivated
by heating at 95uC for 5 min. Lysates were separated on a 10%-
SDS polyacrylamid gel and electrotransferred to a nitrocellulose
membrane. For detection of HA, a polyclonal rabbit antibody to
the HA protein from A/Chicken/Vietnam/P41/2005 (H5N1),
expressed by a vaccinia virus vector [56], (1:20,000; incubated 1 h
at room temperature) and as secondary antibody a rabbit-specific
goat immunoglobulin G fragment conjugated with horseradish
peroxidase (1:10,000; 1 h at room temperature, Biovision, USA)
were used. Antibody binding was visualized by chemiluminescence
(Supersignal West Pico Chemiluminescence Kit from Pierce,
Bonn).
Animal experimentsTen 2-week-old White Leghorn specific-pathogen-free chickens
per group were infected oculonasally with 105 PFU per animal.
Each bird was observed daily for 10 days for clinical signs and
classified as healthy (0), ill (1) (exhibiting one of the following:
respiratory symptoms, depression, diarrhea, cyanosis, edema, or
central nervous symptoms), severely ill (2) (severe or more than one
of the previously mentioned symptoms), or dead (3) as described
previously [57]. When birds are too sick to eat or drink, they are
killed humanely and scored as dead to the next observation day
[57].
Histopathology and immunohistochemistrySamples from cerebellum, cerebrum, lung, nose, trachea,
caecum, duodenum, kidney, and pancreas of additionally infected
chicken were taken on day 4 and 10 post infection, formalin-fixed
and processed for paraffin-wax-embedding according to standard-
ized procedures. Immunohistochemical detection of influenza A
virus nucleoprotein (NP) and hematoxylin eosin staining was
performed as described [58].
For R65 [45], samples from cerebellum and lung were taken on
day 2 from two 3-week old chickens infected oculonasally with 106
TCID50/animal.
Supporting Information
Table S1 Organ tropism and tissue lesions on day 10.
Immunohistochemical detection (IHC) of influenza virus nucleo-
protein antigen and HE staining of organs from chickens after
intranasal inoculation.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0011826.s001 (0.04 MB
DOC)
Acknowledgments
We thank E. Hoffmann and R. G. Webster for the pHW2000 plasmid and
Peter Palese for the pCAGGS(PR8)-PB2, -PB1, -PA, and -NP expression
plasmids. We are very grateful to A. Globig and T. Harder for providing us
with influenza A virus A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1), to
Mikhail Matrosovich for the gift of MDCK cells and to Cindy Meinke,
Kathrin Muller, Anne Brandenburg, Thorsten Arnold, Georg Bauer, and
Gerda Busch for very skillful technical assistance.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: JV OS TM JS. Performed the
experiments: JB JV SG JH AB. Analyzed the data: JB JV AB JT TM JS.
Contributed reagents/materials/analysis tools: JB SG JH OS JS. Wrote the
paper: JB AB JT TM JS.
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HPAIV Virulence Determinants
PLoS ONE | www.plosone.org 8 July 2010 | Volume 5 | Issue 7 | e11826
76
VI AMINO ACIDS ADJACENT TO THE HAEMAGGLUTININ CLEAVAGE SITE ARE
RELEVANT FOR VIRULENCE OF AVIAN INFLUENZA VIRUSES OF SUBTYPE H5
Amino acids adjacent to the haemagglutinincleavage site are relevant for virulence of avianinfluenza viruses of subtype H5
Sandra Gohrbandt,1 Jutta Veits,1 Jana Hundt,1 Jessica Bogs,1
Angele Breithaupt,2 Jens P. Teifke,2 Siegfried Weber,1
Thomas C. Mettenleiter1 and Jurgen Stech1
Correspondence
Jurgen Stech
Received 24 May 2010
Accepted 22 September 2010
1Friedrich-Loeffler-Institut, Institute of Molecular Biology, Greifswald-Insel Riems, Germany
2Friedrich-Loeffler-Institut, Institute of Infectology, Greifswald-Insel Riems, Germany
The prime virulence determinant of highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIVs) is the
polybasic haemagglutinin (HA) cleavage site. However, engineering of a polybasic cleavage site
into an avian influenza virus of low pathogenicity does not result in transformation into an HPAIV,
indicating the importance of other adaptations. Here, the influence of amino acids adjacent to the
HA cleavage site on virulence was studied. Most HPAIVs of subtype H5 carry serine or threonine
at position 346 (corresponding to position 323 according to H3 numbering), whereas almost all
low-pathogenic H5 viruses have valine. Moreover, all H5 low-pathogenic strains carry threonine at
position 351 (corresponding to position 328 according to H3 numbering), suggesting that
acquisition of a polybasic cleavage site involves several steps. This study generated a virus mutant
derived from HPAIV A/Swan/Germany/R65/06 H5N1 (R65) with a monobasic cleavage site,
R65mono-S-ER, and the following additional mutants: R65mono-V-ER with serine changed to valine
at position 346, and R65mono-S-ETR and R65mono-V-ETR with threonine inserted at position 351.
Moreover, in the R65 HA, serine was replaced with valine at position 346 (R65-V). Infection of
chickens with R65mono-S-ETR or R65mono-S-ER led to slight transient respiratory symptoms,
whereas R65-infected animals died within 2 days. However, chickens infected with R65-V
survived longer than R65-infected animals, indicating that serine 346 in R65 HA contributes to
virulence. These data suggest that evolution of H5 HPAIVs from low-pathogenic precursors,
besides acquisition of a polybasic cleavage site, involves adaptation of neighbouring regions.
INTRODUCTION
Highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIVs),which cause devastating losses in gallinaceous birds,invariably specify haemagglutinin (HA) subtypes H5 orH7 with a polybasic cleavage site (Garten & Klenk, 2008;Neumann & Kawaoka, 2006). At this site, the precursorHA0 has to be cleaved into the HA1 and HA2 subunits tomediate fusion between virion and endosomal membranes(Huang et al., 1980; Maeda & Ohnishi, 1980; White et al.,1981, 1982). The polybasic cleavage site of HPAIVs issusceptible to the ubiquitous protease furin (Stieneke-Grober et al., 1992), facilitating systemic spread and lethaldisease in galliformes. In contrast, low-pathogenic avianinfluenza viruses (LPAIVs) have an HA cleavage site withonly one basic arginine or lysine residue (Bosch et al., 1979;Garten et al., 1981; Gunther et al., 1993; Kawaoka et al.,1990) that can be cleaved only by proteases with monobasicspecificity. Accordingly, LPAIV infection in birds isconfined to the digestive or respiratory tracts and leadsto milder illness or no disease. Therefore, the polybasic HA
cleavage site is considered the prime virulence determinantof influenza viruses (Bosch et al., 1979; Garten et al., 1981,1982; Horimoto & Kawaoka, 1994; Senne et al., 1996).
HPAIVs are known to evolve from LPAIVs (Garcia et al.,1996; Garten & Klenk, 2008; Horimoto et al., 1995b;Kawaoka & Webster, 1985; Perdue et al., 1997; Rohm et al.,1995) by insertion mutations at the cleavage site region.Several highly pathogenic strains have acquired fragmentsfrom the 28S rRNA sequence (Khatchikian et al., 1989) or agene segment derived from the same or a different virusstrain (Morsy et al., 1994; Pasick et al., 2005; Suarez et al.,2004) leading to elongation of the cleavage site region.Polybasic HA cleavage sites may also be generated bypolymerase slippage (Garcia et al., 1996; Perdue et al.,1997). However, whereas transformation of the polybasiccleavage site to a monobasic motif results in a drasticreduction in virulence (Horimoto & Kawaoka, 1994),conversion of the monobasic HA cleavage site of LPAIVs toa polybasic motif may or may not lead to HPAIVs (Bogset al., 2010; Munster et al., 2010; Stech et al., 2009). Thus,
Journal of General Virology (2011), 92, 51–59 DOI 10.1099/vir.0.023887-0
023887 G 2011 SGM Printed in Great Britain 51
evolution from LPAIVs to HPAIVs appears to require, inaddition to the acquisition of a polybasic motif, additionaladaptations within and/or outside the HA gene. In thisstudy, we analysed the immediate vicinity of the HAcleavage site for its contribution to viral virulence. Byreverse genetics, we generated different mutants fromHPAIV A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) (Weberet al., 2007) with a monobasic cleavage site but alteredneighbouring regions, and investigated their in vitroproperties and pathogenicity in chickens.
RESULTS
Generation of recombinant viruses
Comprehensive comparison of HA cleavage sites and theiradjacent regions have revealed that H5 HPAIVs carry, atposition 346 (corresponding position 323 according to H3numbering; Ha et al., 2001; Nobusawa et al., 1991), eitherserine or threonine, with the exception of few strains. Incontrast, almost all LPAIVs strains possess valine at thisposition. Furthermore, H5 LPAIVs, except for a few strains,carry the cleavage site motif ETRQG. This observationsuggests that acquisition of a polybasic cleavage site mightalso involve the loss of the threonine residue at the P2position of the cleavage site. Therefore, we analysedwhether the serine residue at position 346 is involved invirulence and whether the ETRQG motif is essential forLPAIVs.
First, we changed the polybasic stretch in the HA cleavagesite of R65 (aa 351–355) to a single basic residue resultingin the cleavage site ERQG. However, among the LPAIVswith subtype H5, we found such a motif in none of thesurveyed H5 sequences available in GenBank (Bao et al.,2008); almost all other HAs carried the site ETRQG, withonly a very few specifying XTRQG. Accordingly, wegenerated a second mutant with threonine inserted atposition 351 (Table 1). As we observed that the majority ofH5 HPAIVs carried a serine or threonine at position 346,whereas almost all LPAIVs have valine at the correspondingposition, we replaced serine 346 with valine in the R65 HAand in the two monobasic HA variants ER and ETR (Table1). By co-transfection of the appropriate HA plasmids with
plasmids encoding the other seven R65 gene segments(PB2, PB1, PA, NP, NA, M and NS genes) (Stech et al.,2008), we rescued the parent virus R65 and its mutantsR65-V, R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ERand R65mono-V-ER.
In vitro properties
To investigate replication of the viruses in vitro, weperformed plaque assays in the presence or absence oftrypsin. R65 and R65-V, which both carry polybasic HAcleavage sites, were able to form plaques in the absence ofany exogenous protease (Fig. 1a). However, the monobasicmutants R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ERand R65mono-V-ER showed plaque formation only afteraddition of trypsin (Fig. 1a and data not shown), thusdisplaying the phenotype of a LPAIV.
To study cleavage of the HA precursor (HA0) directly,infected MDCK-H cells were subjected to Western blotanalysis. After infection with the monobasic cleavage sitemutants R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ERand R65mono-V-ER, the HA subunits HA1 and HA2 weredetected only after addition of trypsin to the medium (Fig.1b), whereas HA0 of R65 and R65-V was cleavedindependently of trypsin, as expected.
In multicycle growth kinetics, all viruses reached similartitres in the presence of trypsin. In the absence of anyexogenous protease, replication of R65 and R65-V wasunaffected, whereas the monobasic cleavage site mutantsR65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER andR65mono-V-ER reached comparable titres at 8 h butstagnated from then on at levels 4–5 orders of magnitudelower (Fig. 1c). These different kinetics suggested that theywere able to complete only one replication cycle in theabsence of exogenous protease. However, final titresdiffered to some extent, with R65mono-S-ETR as the mostand R65mono-V-ER as the least efficiently growing virus,with R65mono-V-ETR and R65mono-S-ER having inter-mediate titres. Taken together, these data demonstratedthat removal of the polybasic HA cleavage site in R65resulted in the in vitro phenotype of a LPAIV and suggestthat threonine 351 and serine 346 may facilitate replicationof the monobasic cleavage site mutants.
Table 1. Recombinant viruses with their HA cleavage site regions
Name Description HA cleavage site
R65 A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1), polybasic cleavage site,
serine at position 346
NSPQGERRRKKRQG
R65-V R65, serine replaced with valine at position 346 NVPQGERRRKKRQG
R65mono-S-ETR R65, monobasic cleavage site, threonine inserted at position 351 NSPQGET——RQG
R65mono-V-ETR R65, monobasic cleavage site, threonine inserted at
position 351 and valine at position 346
NVPQGET——RQG
R65mono-S-ER R65, monobasic cleavage site NSPQGE———RQG
R65mono-V-ER R65, monobasic cleavage site, valine at position 346 NVPQGE———RQG
S. Gohrbandt and others
52 Journal of General Virology 92
Pathogenicity in chicken
To study virulence in the natural host, we inoculatedchickens via the oculo-nasal route with 106 TCID50 R65 orR65-V. All R65-infected chickens died on day 2 post-inoculation (p.i.); eight of the ten animals displayedsignificant symptoms by day 1 p.i. In contrast, in theR65-V-infected group, only five animals exhibited symp-toms at day 1 p.i., whilst five animals died on day 2 p.i. andthe other five died on day 3 p.i. (Fig. 2a).
In a second experiment, chickens were infected oculo-nasally with 106 TCID50 of the monobasic cleavage sitemutants R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER,and R65mono-V-ER. Over a period of 10 days, R65mono-S-ETR-infected and, to a lesser extent, R65mono-S-ER-infected chickens developed very mild sporadic respiratorysymptoms, whereas R65mono-V-ETR- and R65mono-V-ER-infected animals did not develop any clinical signs (Fig.
2b). Five chickens infected with R65mono-V-ETR werechallenged on day 16 p.i. with a lethal dose of 106 EID50
native R65 and observed for 7 days. All animals survivedwithout any sign of illness.
Taken together, these minor differences in virulencesuggested that serine 346 might facilitate replication ofthe low-pathogenic monobasic cleavage site mutants andthe high-pathogenic parental virus R65 in chicken.
Virus shedding
To investigate the extent of virus shedding, oral and cloacalswabs were subjected to virus titration and quantitativereal-time RT-PCR. One R65-infected, moribund animalsampled on day 2 p.i. exhibited 104.9 TCID50 ml21 in theoral swab and 104.3 TCID50 ml21 in the cloacal swab. Fromthe R65-V-infected animals, we analysed five animals onday 2 p.i., yielding oral swab titres between 103.4 and 105.3
Fig. 1. In vitro replication properties of the engineered mutant viruses. (a) Plaque assays of the monobasic cleavage sitemutants R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER and R65mono-V-ER in MDCK cells in the presence and absence oftrypsin compared with wild-type HPAIV R65. (b) Western blots of MDCK-H cells infected with R65, R65-V, R65mono-S-ETR,R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER or R65mono-V-ER at an m.o.i. of 0.1 in the presence (T) or absence (”) of trypsin. (c) Growthcurves from MDCK-H cells inoculated with R65 (red), R65-V (magenta), R65mono-S-ETR (green), R65mono-V-ETR (blue),R65mono-S-ER (light blue) or R65mono-V-ER (light green) at an m.o.i. of 10”3 in the presence (filled squares) or absence (opensquares) of trypsin. Viral titres in the supernatant were determined at the indicated times by plaque assay on MDCK-H cells inthe presence of trypsin.
Influence of the HA cleavage site vicinity on virulence
http://vir.sgmjournals.org 53
TCID50 ml21 and cloacal swab titres between 103.1 and104.5 TCID50 ml21. No virus was detected from either oralor cloacal swabs taken on day 4 p.i. from animals infectedwith the monobasic cleavage site mutants R65mono-S-ETR,R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER or R65mono-V-ER.Furthermore, no virus could be detected on days 2, 5 or7 in the oral and cloacal swabs from any of the fiveR65mono-V-ETR-infected animals after challenge with R65.
RNA quantification by real-time RT-PCR corresponded tothe TCID50 titres from oral and cloacal swabs. High RNAcopy numbers were found in the swabs of R65- and R65-V-infected animals on day 2 p.i. in the range of 109–1010
copies ml21. Animals infected with the monobasic cleavagesite mutants showed considerably lower RNA copynumbers on day 2 p.i., with approximately 105 copiesml21 in oral swabs and 104 copies ml21 in cloacal swabs.After challenge with R65, RNA could be detected only inthe cloacal swab of one animal on day 7 with 103 copiesml21, a level close to the published detection limit(Spackman et al., 2002). From all other animals sampledon days 2, 5 and 7 p.i., no RNA was detected.
Infection with R65 and R65-V resulted in shedding ofsimilar amounts of infectious virus and viral genomecopies, indicating that virus shedding from moribundchickens does not reflect the observed differences in thecourse of the disease. Although successful immunizationagainst R65 challenge demonstrated efficient inoculation ofbirds, shedding of the live monobasic cleavage site mutantscould not be demonstrated, indicating severely restrictedreplication in vivo due to removal of the polybasic HAcleavage site.
Organ tropism and tissue lesions in chicken
The brain, trachea, lung, heart, kidney, spleen, pancreas,caecum and duodenum were sampled after euthanasia ofmoribund chickens infected with R65 (three animals, day 2p.i.) or R65-V (four animals, days 2 and 3 p.i.). Infectedbirds from both groups displayed wide-spread organtropism accompanied by notable intralesional influenzavirus antigen distribution (Table 2, Fig. 3). However, inorgans of birds infected with the R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER or R65mono-V-ER mutants, eutha-nized on day 4 (two animals), neither histological lesionsnor influenza virus antigen could be observed. Takentogether, in the animals that were already moribund on day2 p.i., the extent of organ tropism and the severity oflesions were not affected by the valine at position 346 in theR65 HA.
DISCUSSION
HPAIVs evolve from low-pathogenic precursors byacquisition of a polybasic HA cleavage site (Garcia et al.,1996; Garten & Klenk, 2008; Horimoto et al., 1995b;Kawaoka & Webster, 1985; Pasick et al., 2005; Perdue et al.,1997; Suarez et al., 2004). Whereas back-conversion of thispolybasic cleavage site to the initial monobasic motifresults in a drastic reduction in virulence (Horimoto &Kawaoka, 1994), the contrary mutation by insertion of apolybasic stretch into the HA cleavage site of a LPAIV mayor may not lead to a HPAIV (Bogs et al., 2010; Munsteret al., 2010; Stech et al., 2009). These different findingssuggest that, along with acquisition of a polybasic cleavagesite, its vicinity requires adaptation. Sequence surveys (Baoet al., 2008) have revealed that most HPAIV H5 strainscarry either serine or threonine at position 346 in theirHA (corresponding to position 323 according to H3numbering; Ha et al., 2001; Nobusawa et al., 1991),whereas almost all low-pathogenic H5 isolates have a valineat this position. Moreover, H5 LPAIVs, except for a fewstrains, specify a threonine at P2 of their HA cleavage sites.These observations led us to analyse whether thesealterations have an impact on virulence.
In this study, we generated monobasic cleavage sitemutants from HPAIV R65 (Weber et al., 2007) withdifferent amino acid exchanges in the vicinity of thecleavage site. In vitro, these variants were trypsin dependent
Fig. 2. Virulence in chickens. Survival and disease after oculo-nasal inoculation with 106 TCID50 R65 or R65-V (a) or 106 TCID50
R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER or R65mono-V-ER (b). The birds were observed for 10 days for clinical signs andclassified as healthy (0), slightly ill (0.5), ill (1), severely ill (2) ordead (3); the daily clinical (DCl) score was calculated from the sumof individual clinical scores from all birds divided by the number ofanimals per group (ten chickens).
S. Gohrbandt and others
54 Journal of General Virology 92
Table 2. Organ tropism and tissue lesions
Organs were taken from R65-infected chickens on day 2 p.i. and R65-V-infected chickens on days 2 and 3 p.i., and from animals infected with R65mono-S-ETR, R65mono-V-ETR, R65mono-S-ER or
R65mono-V-ER on day 4 p.i. The tissue samples were subjected to immunohistochemical (IHC) detection of influenza virus nucleoprotein antigen and haematoxylin–eosin staining, with the results
shown as 2, negative; +, focal; ++, multifocal; +++, multifocal coalescent or diffuse. BALT, Bronchial-associated lymphoid tissue; PNS, peripheral nervous system.
Virus Test Brain Trachea Lung Heart Kidney Spleen Pancreas Caecum Duodenum
R65 IHC (n53) ++/++/++ ++/+/++ ++/+++/
++
++/+++/+ ++/++/
++
+++/++/
+++
++/++/
++
++/++/
++
++/++/
++
IHC-positive
cell types
Neurons, glial
cells,
endothelium
Epithelium,
muscle cells,
endothelium,
mononuclear
cells
Pneumocytes I
and II,
mononuclear
cells,
endothelium,
parabronchial
epithelium
Cardiac
myocytes,
endothelium
Tubular and
glomerular
epithelium
Mononuclear
cells,
endothelium
Acinar cells,
endothelium
Endothelium,
epithelium,
mononuclear
cells, intramural
ganglia
Endothelium,
mononuclear
cells,
epithelium,
spindle-
shaped cells
Histopathology
(H&E)
Neuronal
necrosis, glial
cell
proliferation,
malacia
None Pneumonia:
heterophilic
with fibrin,
histiocytosis,
congestion,
oedema; single
pneumocyte
necrosis,
intralesional
rod-like bacteria
Cardiac
myocyte
degeneration
Tubular
degeneration
Lymphocyte
and
macrophage
degeneration
and necrosis,
histiocytosis
Acinar
necrosis
BALT:
lymphocyte
necrosis and
degeneration,
histiocytosis
BALT:
lymphocyte
necrosis,
degeneration
of intramural
ganglia
R65-V IHC (n54) ++/++/
++/++
++/+/+/+ ++/+++/
++/++
++/++/
++/++
++/++/
++/++
++/++/
++/++
+++/+++/
++/++
++/++/
+/+
++/++/
++/+
IHC-positive
cell types
Neurons, glial
cells, ependymal
cells,
endothelium
Neurons (PNS),
endothelium,
smooth muscle
cells,
mononuclear
cells
Pneumocytes I
and II,
mononuclear
cells,
endothelium
Cardiac
myocytes,
neurons (PNS),
endothelium
Tubular and
glomerular
epithelium
Endothelium,
mononuclear
cells
Acinar cells,
endothelium
Endothelium,
mononuclear
cells, spindle-
shaped cells,
intramural
ganglia
Endothelium,
mononuclear
cells,
epithelium,
spindle-
shaped cells,
intramural
ganglia
Histopathology
(H&E)
Neuronal
necrosis, glial
cell
proliferation,
malacia
None Pneumonia,
heterophilic
with fibrin and
histiocytosis,
congestion,
oedema, single
pneumocyte
necrosis
Myocardial
degeneration
and necrosis
Tubular
degeneration
and necrosis,
heterophilic
nephritis
Depletion,
lymphocyte and
macrophage
necrosis,
histiocytosis
Acinar necrosis,
focal lympho-
histiocytic
pancreatitis
BALT:
lymphocyte
depletion,
necrosis and
degeneration,
histiocytosis
BALT:
lymphocyte
and
macrophage
necrosis,
epithelial cell
necrosis,
histiocytosis
Influenceof
theH
Acleavag
esite
vicinityon
virulence
http://vir.sgm
journals.org5
5
and thus displayed the phenotype of a LPAIV. Serine atposition 346 in the R65 HA appeared to be beneficial at theearly stages of replication, as R65mono-S-ETR replicatedmore efficiently than R65mono-V-ETR, and R65mono-S-ERwas superior to R65mono-V-ER, which was most apparentin the absence of exogenous protease. As R65mono-V-ERhad the lowest titre, the cleavage site motif ERQG may bedetrimental compared with ETRQG as commonly foundin H5 LPAIVs. This disadvantage could be overcome by theexchange of valine to serine at position 346, as shown withR65mono-S-ER; its titre equalled that of R65mono-V-ETRafter 8 h but was higher than that of R65mono-V-ER.Therefore, a serine at position 346 may facilitate replicationof the monobasic HA cleavage site mutants independentlyof cleavage efficiency in vitro. In chicken, all these mutantsexhibited low pathogenicity. However, it is likely that theremoval of the polybasic cleavage site led to masking ofadditional virulence determinants, as only the two serinemutants R65mono-S-ETR and R65mono-S-ER caused mildsporadic respiratory symptoms and no monobasic cleavagesite mutants could be reisolated from swabs. Furthermore,replacement of serine 346 with valine in R65-V led toprolonged survival to a minor degree compared with R65-infected animals. Both viruses were still high pathogenic, asthere were no significant differences in virus shedding ororgan tropism. However, the possible explanation that theanimals had not received exactly the same amount of virusstands in contrast to our previous finding that R65 had100 % lethality over a range of decreasing inoculationdosages from 106 to 104 EID50 (unpublished data). Overall,these observations suggest that serine 346 in the R65 HAmight contribute to virulence in chicken.
Furthermore, our data suggest that threonine at positionP2 may facilitate replication efficiency corresponding to thepredominance of this amino acid in HA sequences of H5LPAIVs. Remarkably, there are some H5 HPAIVs that havepolybasic HA cleavage motifs with threonine at P2 (Garciaet al., 1996; Garten & Klenk, 2008; Horimoto et al., 1995a;Pasick et al., 2005; Perdue et al., 1996, 1997; Saito et al.,1994; Suarez et al., 2004; Wood et al., 1993). Theseexamples indicate that threonine at P2 does not impair thevirulence of HPAIVs. Therefore, loss of P2 threonine, asoften observed during evolution from LPAIVs intoHPAIVs, is not required for the highly virulent phenotype,but could result from different molecular mechanisms ofpolybasic cleavage site acquisition (Garcia et al., 1996;Perdue et al., 1996, 1997).
Taken together, the theoretical considerations and experi-mental observations suggested that serine or threonine atposition 346 may facilitate replication of both LPAIVs andHPAIVs, whereas threonine at P2 is beneficial for theefficient replication of H5 LPAIVs only. We thereforepropose that evolution from low-pathogenic precursors toHPAIVs requires not only acquisition of a polybasic HAcleavage site but also adaptive changes in neighbouringregions.T
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S. Gohrbandt and others
56 Journal of General Virology 92
METHODS
Ethical statement. Animal experiments were evaluated by the
responsible ethics committee of the State Office for Agriculture, Food
Safety and Fishery in Mecklenburg-Western Pomerania (LALFF M-V)
and gained governmental approval (registration number LALLF M-V/
TSD/7221.3-1.1-018/07).
Cells and viruses. Human embryonic kidney (HEK293T), Madin–
Darby canine kidney (MDCK) and Madin–Darby canine kidney H
cells (MDCK-H; Matrosovich et al., 2003) were cultured in minimal
essential medium containing 10 % FBS. Native A/Swan/Germany/
R65/06 (H5N1) virus (R65) (Weber et al., 2007) was propagated in
embryonated chicken eggs.
Generation of recombinant viruses. Recombinant viruses were
rescued as described elsewhere (Gabriel et al., 2005; Hoffmann et al.,
2000) using plasmids encoding the eight viral gene segments of R65
(H5N1) (Stech et al., 2008). Modifications of the HA cleavage site
region of R65 (GenBank accession no. DQ464354) were performed bysite-directed QuikChange mutagenesis (primer sequences available onrequest). Rescued viruses were propagated in 11-day-old embryo-nated chicken eggs (monobasic HA cleavage site mutants) or inMDCK cells (R65 and R65V). The presence of the introduced changesand the absence of unwanted mutations in the HA gene as well as thegene composition of the generated viruses were verified by sequencingof RT-PCR amplicons obtained from viral RNA (data not shown). Allviruses with polybasic cleavage sites were handled under BiosafetyLevel 3+ conditions.
Plaque assays and growth curves. Plaque assays were performedon MDCK and MDCK-H cells either in the presence of trypsin thathad been treated with N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone(TPCK, 2 mg ml21; Sigma) or in the absence of any exogenousprotease. Multicycle replication was assessed after infection ofMDCK-H cells in the presence (2 mg ml21) or absence of TPCK-treated trypsin at an m.o.i. of 1023 (four independent experiments).Virus titres in the supernatant were determined by plaque assay on
Fig. 3. Virus organ tropism. Immunohisto-chemical detection of influenza A virus nucleo-protein (brown) distribution in the lung,cerebrum, heart and duodenum of moribundchickens euthanized on day 2 after infectionwith 106 TCID50 R65 and from chickenseuthanized on day 4 after infection with 106
TCID50 R65mono-S-ETR.
Influence of the HA cleavage site vicinity on virulence
http://vir.sgmjournals.org 57
MDCK cells in the presence of 2 mg TPCK-treated trypsin ml21 at 0,8, 24, 48, 72 and 96 h p.i.
Western blots. MDCK-H cells were infected at an m.o.i. of 0.1 in thepresence of 2 mg TCPK-treated trypsin ml21 or in the absence of anyexogenous protease. After 24 h, cells were lysed, and proteins wereseparated by 10 % SDS-PAGE and electrotransferred to nitrocellulosemembranes. HA was detected using a polyclonal rabbit anti-H5serum (Pavlova et al., 2009) (diluted 1 : 20 000, incubated overnight)and a secondary HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody(BioVision) (diluted 1 : 10 000 and incubated for 1 h at roomtemperature), followed by chemiluminescence (Supersignal WestPico Chemiluminescent Substrate kit; Pierce).
Animal experiments. Sixteen 2-week-old specific-pathogen-freeWhite Leghorn chickens (Lohmann) were infected oculo-nasally with106 TCID50 per animal. The birds were observed daily for clinicalsymptoms and classified according to Office International desEpizooties guidelines as healthy (0), sick (1), severely sick (2) ordead (3) (Alexander, 2008). Birds with mild respiratory symptomswere scored as 0.5. When birds were too sick to eat or drink, they wereeuthanized and scored as dead on the next observation day(Alexander, 2008).
Virus shedding. Virus shedding was analysed from oral and cloacalswabs by determining TCID50 and by real-time RT-PCR. TCID50
(Kalthoff et al., 2008) was established on MDCK cells with theaddition of 2 mg TPCK-treated trypsin ml21. The starting dilution fortitration was 1021. Viral RNA from swab samples was quantified byreal-time RT-PCR of the M gene with a detection limit of 103 copiesml21, as described previously (Spackman et al., 2002; Veits et al.,2006).
Histopathology and immunohistochemistry. Samples from brain,trachea, lung, heart, kidney, spleen, pancreas, caecum and duodenumwere formalin fixed and processed for paraffin wax embeddingaccording to standard procedures. Immunohistochemistry fordetection of influenza A virus nucleoprotein (NP) and haematox-ylin–eosin staining was performed as described previously (Kalthoffet al., 2008).
ACKNOWLEDGEMENTS
We are very grateful to T. Harder for providing us with the A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) virus, M. Matrosovich for the MDCK-Hcells and G. Strebelow for sequencing. We also thank T. Arnold, E.Geißler and G. Busch for their skilful technical assistance. This workwas supported by the Forschungssofortprogramm Influenza of theGerman government (FSI 2.44) and by the European Commission[SSPE-CT-2006-44372 (Innflu)].
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Influence of the HA cleavage site vicinity on virulence
http://vir.sgmjournals.org 59
86
VII REVERSION OF PB2 627E TO 627K DURING REPLICATION OF AN H5N1 CLADE
2.2 VIRUS IN MAMMALIAN HOSTS DEPENDS ON ORIGIN OF THE
NUCLEOPROTEIN
JOURNAL OF VIROLOGY, Oct. 2011, p. 10691–10698 Vol. 85, No. 200022-538X/11/$12.00 doi:10.1128/JVI.00786-11Copyright © 2011, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Reversion of PB2-627E to -627K during Replication of an H5N1 Clade2.2 Virus in Mammalian Hosts Depends on the Origin of
the Nucleoprotein�
Jessica Bogs,1 Donata Kalthoff,2 Jutta Veits,1 Sophia Pavlova,1† Martin Schwemmle,3 Benjamin Manz,3Thomas C. Mettenleiter,1 and Jurgen Stech1*
Institutes of Molecular Biology1 and Diagnostic Virology2 of Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health,Sudufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems, Germany, and Department of Virology, University of Freiburg,
Germany, Hermann-Herder Str. 11, 70104 Freiburg, Germany3
Received 19 April 2011/Accepted 2 August 2011
H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) of clade 2.2 spread from Southeast Asia to Europe.Intriguingly, in contrast to all common avian strains specifying glutamic acid at position 627 of the PB2 protein(PB2-627E), they carry a lysine at this position (PB2-627K), which is normally found only in human strains.To analyze the impact of this mutation on the host range of HPAIV H5N1, we altered PB2-627K to PB2-627Ein the European isolate A/Swan/Germany/R65/2006 (R65). In contrast to the parental R65, multicycle growthand polymerase activity of the resulting mutant R65-PB2K627E were considerably impaired in mammalian butnot in avian cells. Correspondingly, the 50% lethal dose (LD50) in mice was increased by three orders ofmagnitude, whereas virulence in chicken remained unchanged, resulting in 100% lethality, as was found for theparental R65. Strikingly, R65-PB2K627E reverted to PB2-627K after only one passage in mice but did not revertin chickens. To investigate whether additional R65 genes influence reversion, we passaged R65-PB2K627Ereassortants containing genes from A/Hong Kong/156/97 (H5N1) (carrying PB2-627E), in avian and mamma-lian cells. Reversion to PB2-627K in mammalian cells required the presence of the R65 nucleoprotein (NP).This finding corresponds to results of others that during replication of avian strains in mammalian cells,PB2-627K restores an impaired PB2-NP association. Since this mutation is apparently not detrimental forvirus prevalence in birds, it has not been eliminated. However, the prompt reversion to PB2-627K in MDCKcells and mice suggests that the clade 2.2 H5N1 HPAIV may have had a history of intermediate mammalianhosts.
Highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) causeoutbreaks in poultry with high mortality leading to enormouseconomic losses and shortages in food supply. Since HPAIVoutbreaks have largely been regionally limited in the past, therecent panzootic of HPAIV H5N1 is exceptional. In 1997, thefirst 18 human cases of HPAIV H5N1 infection have beenidentified in Hong Kong, resulting in six deaths (7, 55) whichdemonstrated a prominent zoonotic potential of these viruses.Humans continue to become infected with HPAIV H5N1 withcase/fatality rates exceeding 50% (22), prompting the concernthat an H5N1 HPAIV could initiate a devastating pandemic inwhich a virulent strain with novel antigenic properties wouldsweep through an immunologically naive human population.
In late 2003, H5N1 HPAIV emerged in Southeast Asia againand have spread since then in an unprecedented manner tomore than 60 countries on three continents paralleled by rapidvirus evolution and further divergence into clades and sub-clades (63, 64). Clade 2.2 H5N1 viruses had first been identi-fied in May 2005 in dead bar-headed geese (Anser indicus) at
the Qinghai Lake in China (6, 31, 67) followed by inter- andtranscontinental transmission to Mongolia, the Middle East,Africa, and Europe (5, 10, 44, 48, 60). These strains inducedlethal disease in several mammalian species, including tigers(Pantherus tigris) and leopards (Pantherus pardus) at zoos inThailand (25, 58), domestic cats (Felis catus) in Cambodia,Iraq, Indonesia, and Germany (9, 26, 61), masked palm civets(Paguma larvata) in Vietnam (42), a dog (Canis familiaris) inThailand (3, 49), and a stone marten (Martes foina) in Ger-many (26, 61).
The recently isolated Qinghai Lake strains and their prede-cessors, the clade 2.2 viruses, have been unusual in that theycarry a lysine residue at position 627 of the PB2 polymerasesubunit (PB2-627K) (4, 30, 63) which is present in humanisolates like seasonal strains (54), the 1918 pandemic viruses(57), one H7N7 isolate (12), and some H5N1 isolates (15, 20,24) except for the novel pandemic 2009 H1N1 strains (65). Incontrast, the avian strains carry a glutamic acid residue (E) atthis position (PB2-627E), making PB2-627K a strong mamma-lian host range marker (54). In different HPAIV, the presenceof PB2-627K leads to high levels of virulence in experimentallyinfected mice, guinea pigs, and ferrets (15, 19, 20, 32, 43, 45,53) and has led to fatal outcomes of several zoonotic infectionsin humans (8, 12). In early 2006, these clade 2.2 viruses even-tually emerged in Western Europe (14, 35, 44, 61, 63). Aparticularly large outbreak in swans (Cygnus sp.) occurred on
* Corresponding author. Mailing address: Friedrich-Loeffler-Insti-tut, Federal Research Institute for Animal Health, Sudufer 10, 17493Greifswald-Insel Riems, Germany. Phone: 49 3835171237. Fax: 493835171275. E-mail: [email protected].
† Present address: German Cancer Research Center, Im Neuen-heimer Feld 242, 69120 Heidelberg, Germany.
� Published ahead of print on 17 August 2011.
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the German island of Rugen, accompanied with high mortality(50, 61). Represented by the prototypic isolate A/Swan/Ger-many/R65/06 (H5N1) (R65) (61), this virus transmitted to 20different free-living bird species, including mute (Cygnus olor)and whooper swans (Cygnus cygnus), Canada geese (Ansercanadensis), and tufted ducks (Aythya fuligula) (17), to a blackswan in a zoo (Cygnus atratus) (50), and to poultry (chicken,turkeys) (23). In addition, infection of three stray cats and onestone marten (26, 61) demonstrated the ability of these virusesto infect mammalian species as well. Phylogenetic analysis clas-sified R65 as belonging to subclade 2.2.2 (Northern type ofQinghai-like-viruses from 2006) (50) carrying PB2-627K.
To analyze the importance of PB2-627K for the broad hostrange of H5N1 HPAIV involving several avian and mammalianspecies, we generated a mutant virus from R65 which carriesthe avian-specific PB2-627E. Remarkably, during initial rescueexperiments in mammalian cells, this mutant reverted to PB2-627K promptly. This observation led us to study the reversionin avian and mammalian cells and in chickens and mice. Fur-thermore, we elucidated which R65 genes play a role in thereversion to PB2-627K in mammalian cells.
MATERIALS AND METHODS
Cells and viruses. Madin-Darby canine kidney cells (MDCK), human embry-onic kidney cells (HEK-293T), Vero cells, and human basal lung epithelial cells(A549) were maintained in minimal essential medium supplemented with 10%fetal calf serum (FCS). Chicken fibroblast (DF-1) and quail fibroblast (QT-6)cells were grown in Iscove’s modified Dulbecco’s medium containing 10% FCS.Virus strains A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) and A/Hong Kong/156/97(H5N1) (Hk156) were propagated in embryonated chicken eggs prior to cloningof viral genes for reverse genetics (2, 18, 51). All experiments with R65 or Hk156were performed under biosafety level 3� conditions.
Recombinant viruses. The generation of recombinant R65 has been described(2, 18, 51) (R65). The amino acid substitution PB2-K627E was introduced intoR65 PB2 by site-directed mutagenesis using the Quikchange protocol (primersequences available upon request). Recombinant viruses except R65 wererescued by cotransfecting the eight R65-specific plasmids together with ex-pression plasmids pCAGGS-PR8-PB2, pCAGGS-PR8-PB1, pCAGGS-PR8-PA, and pCAGGS-PR8-NP (a kind gift of P. Palese) into HEK-293T cells. Virusstocks were propagated in MDCK cells (R65) or embryonated chicken eggs(R65-PB2K627E). After cotransfection into HEK-293T cells, the R65-PB2K627E
supernatant (500 �l) was subjected to one subsequent passage in DF1 cells (T25flask, 6.5 ml). This master stock was used to propagate the working stock inembryonated chicken eggs (inoculum, 200 �l; dilution, 1:10�5). Presence of theintroduced mutations and absence of unwanted alterations were verified bysequencing. All eight segments of Hk156 were cloned into plasmid pHWSccdBas described previously (51). R65/Hk156 reassortant viruses were rescued aftertransfection of HEK-293T cells and subsequent infection of DF-1 cells withHEK-293T supernatants 2 days posttransfection. Virus titers were determined byplaque assay as described previously (52).
Growth kinetics. Vero, A549, DF-1, and QT-6 cells were inoculated at amultiplicity of infection of 10�3 for 1 h at 37°C, washed once with phosphate-buffered saline (PBS), once with citrate-buffered saline (CBS), and again twicewith PBS, and then incubated in the appropriate medium supplemented with0.2% bovine serum albumin (BSA) at 37°C. Virus titers at 0, 8, 24, 48, and 72 hpostinfection (p.i.) were determined by plaque assay on MDCK cells after onefreeze-thaw cycle (three independent infection experiments).
Luciferase assay. We cotransfected the pHWSccdB plasmid constructs en-coding the polymerase proteins PB2, PB1, PA, and NP together with theluciferase reporter plasmids pPolI-Luc-RT in HEK-293T cells (16) andpPRC-PolI-Luc-RT (kindly provided by Daniel Mayer) in DF-1 cells usingLipofectamine 2000 (Invitrogen). For normalization of transfection efficiency, weincluded the plasmid pIE-Renilla-Luc (a kind gift from G. Keil). The appropriatemedium containing 0.2% bovine serum albumin (BSA) was replaced 6 h post-transfection. Expression of firefly and renilla luciferases was measured after celllysis 24 h posttransfection according to the manufacturer’s protocol (Dual Glowluciferase assay; Promega), using a Sirius Luminometer (Berthold, Pforzheim,
Germany). Each luciferase value represents the average of results of five inde-pendent experiments.
Ethics statement. The animal experiments with chickens and mice were eval-uated by the responsible ethics committee of the State Office for Agriculture,Food Safety and Fishery in Mecklenburg-Western Pomerania (LALFF M-V)and gained governmental approval.
Chicken experiments. Eight-week-old White Leghorn specific-pathogen-freechickens were infected oculonasally with virus. Each bird was observed daily forclinical signs and classified as healthy (0), ill (1) (exhibiting one of the following:respiratory symptoms, depression, diarrhea, cyanosis, edema, or central nervoussystem [CNS] symptoms), severely ill (2) (severe or more than one of theaforementioned symptoms), or dead (3) according to OIE guidelines (1). Brains,lungs, pancreas, and spleens from infected birds were homogenized using aTissueLyzer (Qiagen), and DF-1 cells were inoculated with homogenates. Su-pernatants were sequenced after extraction of RNA (RNeasy minikit; Qiagen)and one-step reverse transcriptase PCR (RT-PCR) (Qiagen) (primer sequencesavailable on request).
Mouse experiments. Four-week-old female BALB/c mice (Charles River, Sul-zfeld, Germany) were housed in an ISOcage (Tecniplast). For determination ofthe 50% lethal dose (LD50), they were anesthetized by inhalation of isofluraneand subsequently intranasally inoculated with 50 �l of virus serially diluted inPBS or mock-inoculated with an equal volume of PBS. The animals were ob-served daily for body weight, clinical symptoms, or death over a period of 14 days.The LD50 was calculated by the method of Reed and Muench (40). Virus titersfrom lungs, hearts, and brains were determined by plaque assay from entireorgan homogenates.
RESULTS
Generation of recombinant viruses. Recombinant parentalvirus A/Swan/Germany/R65/06 (R65) was generated as de-scribed previously (2). R65 PB2-627K was replaced by R65PB2-627E using site-directed mutagenesis to obtain the mutantvirus R65-PB2K627E by cotransfecting the mutated PB2 and theother seven R65 gene segments. Intriguingly, the first rescueattempts using the standard set of eight plasmids (51) werenot successful, but additional cotransfection of plasmidspCAGGS-PR8-PB2, pCAGGS-PR8-PB1, pCAGGS-PR8-PA,and pCAGGS-PR8-NP expressing the PB2, PB1, PA, and NPproteins, respectively, from strain A/Puerto Rico/8/34 (PR8)enabled rescue of the mutant virus R65-PB2K627E. Full-lengthsequencing of the PB2, PB1, PA, and NP genes of R65-PB2K627E demonstrated the absence of recombination with thePR8 gene fragments (data not shown). Remarkably, subse-quent infection of MDCK cells with R65-PB2K627E resulted inrapid reversion of PB2-627E to PB2-627K (data not shown).The same reversion was observed in another rescue experi-ment in which a modified HA with a monobasic instead of thepolybasic cleavage site (18) was used for virus rescue. Repro-ducibly, replication of R65-PB2K627E in MDCK cells after sev-eral independent rescue experiments led to rapid reversion toPB2-627K. However, no reversion of R65-PB2K627E occurredduring propagation in the avian cell line DF-1 or in embryo-nated hen eggs (data not shown).
Growth kinetics on avian and mammalian cells. To investi-gate multicycle growth properties of R65 and R65-PB2K627E
depending on the origin of cells, we infected avian DF-1 andQT-6 as well as mammalian Vero and A549 cells. Both virusesreplicated to high titers in DF-1 and QT-6 cells with no or onlyminor differences, respectively (Fig. 1A and B). However, inVero and A549 cells, R65-PB2K627E replicated with delay andreached final titers two to three orders of magnitude lowerthan that of the parental R65 (Fig. 1C and D). These datademonstrate that substitution of PB2-627K by PB2-627E re-
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sulted in considerably impaired replication in mammalian butnot in avian cells.
Differences in polymerase activities. To analyze whether theimpaired replication of R65-PB2K627E in mammalian cells re-sulted from a decrease in polymerase activity, we cotransfectedplasmids expressing wild-type PB2-627K or mutant PB2-627Ewith PB1, PA, and NP expression plasmids, including the lucifer-ase reporter plasmid pPolI-Luc-RT or pPRC-PolI-Luc-RT intomammalian 293T or avian DF-1 cells, respectively. Compared toPB2-627K, the mutant plasmid PB2-627E resulted in a 95%decrease in luciferase activity in 293T cells, whereas in DF-1cells the reporter induction was only reduced by half (Fig. 2).
Therefore, the substitution PB2-K627E in R65 led to a con-siderable reduction of polymerase activity in mammalian cellsand an only moderate decline in avian cells, suggesting thatPB2-627K elevates the polymerase activity of HPAIV irrespec-tive of the host species but most strikingly in mammalian cells.
Virulence in chickens. Since the polymerase activity of R65-PB2K627E was also decreased in avian cells, we investigated thevirulence of this mutant in chickens. To this end, 10 8-week-oldWhite Leghorn chickens per group were inoculated oculona-sally with 104 PFU of either R65 or R65-PB2K627E and mon-itored for progression of disease as described previously (1).The two viruses caused the same clinical symptoms like de-pression, ruffled feathers, and diarrhea after 2 days postinfec-tion (d.p.i.) and caused death in all infected animals within3 d.p.i. (Fig. 3) resulting in identical clinical scores of 2.6.Macroscopic observation of organs revealed the same severealterations, such as necrosis of comb and wattles, conjunctivi-tis, pancreatitis, and pneumonia. Hence, the substitution PB2-K627E did not alter the virulence of R65 in chickens.
Virulence and replication efficiency in mice. To study theimpact of the PB2-K627E substitution in a mammalian host,we inoculated groups of five mice each intranasally with virusat doses ranging from 104 to 10 PFU. Overall, with increasingvirus doses, the disease progressed faster. R65-infected micedeveloped symptoms like anorexia (body weight loss), ruffledfur, hunched posture, shivering, apathy, conjunctivitis, andneurological failure (spinning when holding it at the tail, pa-ralysis) from day 3 to day 9 and died between days 6 and 10 p.i.From five mice infected with 10 PFU, only one animal sur-vived, indicating an LD50 of R65 below 10 PFU. All R65-PB2K627E-infected mice which had received the highest dosesof 106 and 105 PFU died within 4 and 9 days, respectively. Incontrast, infection with 104 PFU led to death in only two of fivemice and 103 PFU killed one of five mice, whereas all animalssurvived the infection with 102 or 10 PFU without noticeableweight loss, indicating an LD50 of R65-PB2K627E of approxi-mately 104 PFU (Fig. 4, Table 1). Taken together, the resultsshow that the mutation PB2-K627E considerably increased theLD50 in mice.
Next, we investigated whether the decreased virulence ofR65-PB2K627E in mice is paralleled by reduced replication
FIG. 1. Viral replication on avian and mammalian cells. (A) DF-1,(B) QT-6, (C) Vero, and (D) A549 cells were inoculated with R65(black diamonds) or R65-PB2K627E (white circles) at a multiplicity ofinfection of 10�3. Viral titers in the supernatant were determined byplaque assay at the indicated time points. Values are averages ofresults from three independent experiments.
FIG. 2. Polymerase activities. Luciferase reporter activities in ly-sates of human 293T or avian DF-1 cells were determined aftercotransfection of PB2, PB1, PA, and NP plasmids and a firefly lucif-erase minigene plasmid containing either an avian or human promoter(pPolI-Luc-RT or pPRC-PolI-Luc-RT, respectively) (five independentexperiments). R65 PB2-627K (black bars) was set to 100% in compar-ison to the mutated PB2K627E (white bars).
FIG. 3. Virulence in chickens. Ten 8-week-old chickens were in-fected oculonasally with 104 PFU of R65 (black diamonds) or R65-PB2K627E (white circles) and scored daily for clinical symptoms. Thebirds were observed for 10 days for clinical signs and scored as healthy(0), ill (1), severely ill (2), or dead (3); the daily clinical score wascalculated from the sum of individual clinical scores from all birdsdivided by the number of animals per group.
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efficiency in organs. We infected three mice intranasally with104 PFU of either R65 or R65-PB2K627E and removed lungs,hearts, and brains at day 3 p.i. In contrast to R65-infectedmice, the virus titers in the lungs of the animals infected byR65-PB2K627E were reduced by two orders of magnitude andno virus was detected in the brains (Table 1), indicating im-paired replication of R65-PB2K627E. Overall, the decreasedviral loads in lungs and the absence of virus in brains corre-spond to the considerably reduced virulence of R65-PB2K627E
in mice.Reversion of PB2-K627E in mice but not in chickens. To
follow the stability of the PB2-K627E mutation in a mamma-lian host, we infected mice with 104 or 105 PFU of R65-PB2K627E and removed lungs and brains from two animalseach on days 1, 3, and 5 p.i. Whole RNA was extracted forRT-PCR to determine the PB2 sequences. In addition, weincluded the organs from two animals from the previous ex-periment which had died on day 9 p.i. Remarkably, the pres-ence of revertant virus was detected in the virus populationalready on day 3 p.i. in lungs (Fig. 5A), at a time when no virushad been isolated from the brains (Table 1). Revertant virusbecame predominant in lungs and brains at days 5 and 9 p.i.(Fig. 5A). To reveal whether reversion occurs also in an avianhost, we examined likewise the lungs, brains, kidneys, andpancreas from chickens infected with R65-PB2K627E (two an-
imals) or R65 (one animal). None of the PB2 sequences fromRT-PCR amplicons indicated the presence of any revertants(Fig. 5B). Taken together, these data demonstrate that rever-sion of PB2-627E to PB2-627K occurred in mice but not inchickens. Thus, selection for the PB2-627K virulence marker inR65 is enforced only during replication in a mammalian host.
NP of R65 is required for reversion of R65-PB2K627E in mam-malian cells. After having demonstrated reversion of PB2-627Eto PB2-627K in mammalian cells and in mice, we addressedthe question whether the genetic background of R65 deter-mines reversion. To this end, we generated reassortants ofR65-PB2K627E by replacing one or more R65 gene segmentswith those from HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1)(Hk156), a strain that carries PB2-627E. The resulting re-assortants were designated according to their R65 genesegments: Hk156/R65:PB2K627E, Hk156/R65:PB2K627E�PB1,Hk156/R65:PB2K627E�PA, Hk156/R65:PB2K627E�NP, andHk156/R65:PB2K627E�PB1�PA�NP. To investigate whethera PB2-627E from a different virus strain would also revert toPB2-627K in the R65 background, we generated the reas-sortant R65/Hk156:PB2, composed of the Hk156 PB2 geneencoding PB2-627E and the remaining R65 genes. All reas-sortant viruses and the homologous mutant R65-PB2K627E
were passaged five times in DF-1 or MDCK cells. After RT-PCR from isolated supernatant RNA, we sequenced the PB2gene region encompassing amino acid position 627. In DF-1cells, R65-PB2K627E remained stable, whereas in MDCK cells,revertants emerged at the second passage and became pre-dominant during subsequent passages (Fig. 6). In contrast, noreversion was observed in reassortant R65/Hk156:PB2 and itsreciprocal counterpart Hk156/R65:PB2K627E, indicating thatR65 PB2 requires other R65 proteins to select for PB2-627K inmammalian cells. Finally, revertants were found only afterinfection with the reassortants Hk156/R65:PB2K627E�NP and
FIG. 4. Virulence in mice. Survival (animal numbers) and body weight (average and standard deviation) of 4-week-old female BALB/c miceinoculated intranasally with PBS (white triangles), R65 (black diamonds), or R65-PB2K627E (white circles) at doses of 104 PFU (A and B) or 102
PFU (C and D). Animals with weight losses of 25% or more were euthanized (B).
TABLE 1. Virulence in mice: organ titers and LD50
Virus
Average virus titer per organ (log10 PFU) � SD(no. of virus-positive organs/total no. of organs) LD50
(PFU)Lung Heart Brain
R65 6.6 � 0.1 (3/3) 2.6 � 2.6 (2/3) 2.7 � 0.3 (2/3) �10R65-PB2K627E 4.6 � 0.4 (3/3) 3.0 (1/3) 0 (0/3) �104
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Hk156/R65:PB2K627E�PB1�PA�NP, which carry the R65NP gene (Fig. 6). However, they did not become predominant,in contrast to the revertant of the homologous R65-PB2K627E.Thus, the presence of the R65 NP protein is the minimumprerequisite for reversion of R65-PB2K627E in mammaliancells.
DISCUSSION
HPAIV, and in particular those of the H5N1 subtype, havea wide host range and cause zoonotic infections in humans(22, 23, 36, 63). Whereas in the past, HPAIV outbreaks wereshort and localized events, since 2005 they are unprecedented intheir duration and transcontinental spread from Southeast Asiato Europe and Africa. Some markers in HPAIV facilitating zoo-notic transmission to humans have been identified, includingamino acid residues like PB2-701N and NP-319K (8). Whereasthose changes were found mainly in various avian-like mam-malian strains and zoonotic HPAIV (13), the only markerdiscriminating human from avian strains (54) is PB2-627K. Allcommon avian strains and the novel pandemic H1N1 strainscarry PB2-627E. However, on several occasions, PB2-627K wasrecognized in H5N1 and H7N7 HPAIV to result in enhancedreplication efficiency, leading to high pathogenicity in mam-mals (15, 19, 20, 32, 43, 45, 53), including humans (8, 12), butthose transmissions to mammals were considered dead-endevents. Remarkably, the 2005–2006 clade 2.2 strains retained
PB2-627K during their transcontinental journey (63). This ob-servation led us to analyze the importance of this mutation forthe broad host range of those viruses. For that, we generated amutant of the Western European clade 2.2.2 strain R65 inwhich PB2-627K was replaced by E: R65-PB2K627E. First at-tempts to generate and maintain this mutant in mammaliancells led to immediate reversion to the parental virus. Thisobservation could be reproduced in three independent exper-iments in different facilities (FLI Insel Riems and Departmentof Virology, University of Freiburg). Since the detection limitof mutants by Sanger sequencing of PCR products lies above10% (29), notable amounts of revertants have accumulatedwithin the viral population. However, R65-PB2E627K was stablymaintained in avian cells and embryonated chicken eggs, indi-cating an effect of avian versus mammalian hosts on the sta-bility of this mutation. Therefore, we further studied the PB2-K627E mutation in avian and mammalian cells and in chickenand mice. Subsequently, we investigated whether other R65genes determine reversion to PB2-627K in mammalian cells.
We found that the PB2-627E substitution in the R65 geneticbackground resulted in (i) decreased replication in mammalianbut not avian cells, (ii) severely decreased polymerase activityin mammalian cells but only slightly reduced polymerase ac-tivity in avian cells, and (iii) considerably decreased virulenceaccompanied with reduced replication efficiency in mice, but itdid not affect virulence in chickens. Above all, whereas PB2-627E remained stable in avian cells and in chickens, it re-
FIG. 5. Reversion of R65-PB2K627E in mice but not in chickens. (A) Mouse passages of R65-PB2K627E. Lungs and brains were taken on days1, 3, 5, or 9 from mice infected intranasally with 105 (1, 5, or 9 days p. i.) or 104 (3 days p. i.) PFU virus. From organ homogenates, viral RNA wasisolated, and the PB2 segment was amplified by RT-PCR and sequenced to monitor the presence of PB2-627E. Red arrows on electropherogramsindicate emergence of revertants carrying PB2-G27K. (B) Chicken passage of R65-PB2K627E. Brains, lungs, pancreas, and spleens from twoR65-PB2K627E-infected and one R65-infected animal (104 PFU oculonasally) were homogenized, and the virus was propagated in avian DF-1 cells.From supernatants, viral RNA was isolated, and the PB2 segment was amplified by RT-PCR and sequenced to monitor the presence of PB2-627E.
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verted to PB2-627K in mammalian cells and mice. Passagingof R65-PB2K627E reassortants carrying Hk156 gene seg-ments in MDCK cells revealed that the presence of R65-PB2and NP was crucial for reversion.
The PB2 K627E mutation led in the mammalian cells to aseverely reduced activity of reconstituted RNP of 5%, corre-sponding to a notably decreased viral replication: viral growthdecreased by two magnitudes, and LD50 in mice increased bythree magnitudes. However, the 50% reduction of RNP activ-ity in avian cells is not accompanied by measurable decreasedviral replication efficiency indicated by equivalent virus prop-agation in DF1 cells and virulence in chickens. This lowerimpact of PB2-627K on virus replication in avian cells may beattributed to the absence of a dominant inhibitory activity,whereas in mammalian cells, this mutation enables optimizedreplication in the presence of a postulated human cofactor(33).
The polymerase activity of avian viruses was shown to bereduced in mammalian cells due to inefficient association ofPB2 with NP, a defect which can be repaired by PB2-627K (34,37, 39). Furthermore, a yet unknown cellular factor, X, wassupposed to stabilize the PB2-NP interaction, thereby enhanc-ing viral replication (28). This postulated PB2-X interactionmay be impaired in human cells if PB2 originates from an avianstrain and carries the avian signature PB2-627E. On the PB2surface, PB2-627K resides in a patch of basic amino acid res-
idues which is thought to mediate interaction with cellular hostfactors. Disruption of this basic patch by PB2-627E in avianstrains might interfere with those interactions (56). Our findingthat both the R65 PB2 and NP are necessary for positiveselection for PB2-627K in mammalian cells indicates that com-pensation of the impaired PB2-NP interaction by PB2-627K isessential for the high replication efficiency in clade 2.2 HPAIVin mammals. It appears that enhanced polymerase activity ofHPAIV might compensate insufficient adaptation to the mam-malian host. In mouse lung (at 37°C), the virus replication inthe presence of PB2-627E is impaired by several magnitudesbut is still detectable (reference 21 and our data); however, inthe nasal turbinates (at 33°C), virus was undetectable (21).Therefore, these observations support the notion that the re-version to PB2-627K occurred in the lungs first, allowing thevirus then to outreach the upper respiratory tract.
Many recent H5N1 isolates of clade 2.2 and genotype Z (5,19, 25, 38), as well as the Dutch H7N7 HPAIV from 2003which led to the death of a veterinarian (12), carry PB2-627K,suggesting that this mutation arises early after transmissionfrom birds to mammals, including humans. Correspondingly,we observed a rapid reversion of PB2-K627E to K within onemouse passage corresponding to the results of others (32).PB2-627K is known to increase the replication efficiency inmice but not to affect the cell tropism (45). Furthermore, inour experiments, virus became detectable in the brain only on
FIG. 6. R65 NP enforces reversion of R65-PB2K627E in mammalian cells. Reassortant viruses containing the gene segments of R65-PB2K627E(red; mutation PB2-627E represented by a diamond) and Hk156 (black) were passaged in avian DF-1 or mammalian MDCK cells. From infectioussupernatants, viral RNA was isolated, and the PB2 segment was amplified by RT-PCR and sequenced to monitor the presence of PB2-627E. Redarrows on electropherograms indicate emergence of revertants carrying PB2-627K.
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day 5 p.i., whereas the appearance of revertants in the lung wasobserved already on day 3 p.i. Therefore, CNS infection maybe a consequence of the selection of revertants during primaryinfection in the lung.
Since their emergence in 2005 at Qinghai Lake, clade 2.2viruses were detected in many wild bird species and domesticpoultry in Europe, Africa, and Asia (11, 46, 61). They were alsoisolated from wild pikas at the Qinghai Lake area (66). Free-ranging wild pikas (Ochotona curzoniae), which serve as foodsource for raptorial birds and carnivorous mammals (47), are amammalian host infected by H5N1 HPAIV in the naturalenvironment of Qinghai Lake (66). Pikas might be infected atthe common weed-foraging sites of wild birds such as bar-headedgeese and then transmit the viruses to predators spreading themto poultry farms. Furthermore, because of successful transmis-sion of clade 2.2 H5N1 viruses from poultry to felids andbetween felids, it had been suggested that felids may serve asintermediate hosts and further transmit the virus to humans(62). Accordingly, cats were shown to be infected both byhorizontal transmission and by consumption of virus-infectedbirds resulting in severe pneumonia accompanied with exten-sive virus spread to brain, liver, kidney, and heart (41) andexcretion via the respiratory, urinary, or rectal tracts (27, 59).Thus, cats or other felids may serve as intermediate hosts foravian influenza viruses during their adaptation to mammals.
In summary, we conclude that clade 2.2 H5N1 HPAIV mayhave acquired the PB2-627K mutation rapidly facilitated by aunique constellation of PB2 and NP and that this mutationmight compensate for insufficient adaptation to mammalianhosts. However, in avian hosts, the PB2-627K mutation hasbeen maintained with no apparent disadvantages and, there-fore, it has not been eliminated. The prompt reversion ofR65-PB2K627E to PB2-627K in a mammalian host suggests thatthe clade 2.2 H5N1 HPAIV may have had a history of mam-malian intermediate hosts like felids. Overall, the broad hostrange due to the acquisition and maintenance of PB2-627Kmight have supported the unprecedented duration and panzo-otic spread of the clade 2.2 HPAIV.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank A. Brandenburg, C. Meinke, M. Schmidt, M. Graber, M.Grawe, and the animal care workers for their excellent technicalassistance. Furthermore, we are very grateful to A. Osterhaus forproviding the A/Hong Kong/156/97 (H5N1) virus, P. Palese forthe expression plasmids pCAGGS-PR8-PB2, pCAGGS-PR8-PB1,pCAGGS-PR8-PA, and pCAGGS-PR8-NP, G. Keil for the renillaexpression plasmid pIE-Renilla-Luc, and D. Mayer for providing theplasmid pPRC-PolI-Luc-RT.
This study was supported by the European Commission (FP6-2005-SSP-5B INFLUENZA [Flupol]), the Forschungssofortprogramm In-fluenza of the German government (FSI 2.44), and the Bundesminis-terium fur Bildung und Forschung (BMBF, FluResearchNet).
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10698 BOGS ET AL. J. VIROL.
95
IIX Zusammenfassung der Dissertation zum Thema:
„Molekulare Untersuchungen zur Virulenz und Wirtsadaptation von Influenza-A-Viren
vom Subtyp H5N1 an Geflügel und Säuger“
vorgelegt von
Jessica Bogs
Influenza-A-Viren sind wichtige Pathogene von Mensch und Tier. Als Erreger der klassischen
Geflügelpest führen hoch-pathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) weltweit zu hohen
Verlusten in der Geflügelindustrie. Des Weiteren stellen der zoonotische Charakter und das
pandemische Potential, vor allem von Stämmen des Subtyps H5N1, eine ernste
gesundheitliche Bedrohung für die Bevölkerung dar. Zur Risikobewertung dieser Viren ist es
daher notwendig, genetische Marker zu ermitteln, welche die Virulenz und das
Wirtsspektrum beeinflussen. Für die Identifizierung dieser Virulenzdeterminanten sind
Pathogenese-Studien in verschiedenen Tiermodellen wie Hühnern und Mäusen essenziell.
Bisher wurde gezeigt, dass HPAIV aus niedrig-virulenten Vorläufern durch den Erwerb eines
polybasischen Spaltmotives im Hämagglutinin (HA) im Zuge der Adaptation an terrestrisches
Geflügel hervorgehen. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher die Fähigkeit eines niedrig-
pathogenen aviären Influenzavirus (LPAIV) vom Subtyp H5N1 zur Ausbildung eines HPAIV-
Phänotyps untersucht werden. Dazu wurde das revers-genetische System für das Isolat
A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) etabliert und das Virus TG05 generiert. In-vitro konnte
die Trypsin-Abhängigkeit als Merkmal von LPAIV bestätigt werden. Im Huhn verhielt sich
dieses Virus avirulent. Durch zielgerichtete Mutagenese wurde die HA-Spaltstelle in ein
polybasisches Motiv mutiert und das Virus TG05poly generiert. Das Virus war wie ein HPAIV
zur in-vitro-Replikation ohne Trypsin-Zusatz fähig, löste aber nach der Infektion von Hühnern
nur eine zeitlich begrenzte Erkrankung aus. Des Weiteren wurde die HA-Reassortante
TG05-HAR65 generiert, deren Genom aus dem HA-Gen des HPAIV-Isolates
A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) und den anderen sieben Gensegmenten von TG05
besteht. Dieses Virus konnte in-vitro ebenfalls Trypsin-unabhängig replizieren, führte aber zu
einer Letalität von 30%. Eine weitere Reassortante, R65-HATG05poly, enthielt die umgekehrte
Genkonstellation: das mutierte TG05-HA und die anderen Gensegmente des R65. An der
Infektion verstarben acht von zehn Hühnern, was der Letalität von „natürlichen“ HPAIV
entspricht. Der Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle ist daher ein notwendiger, aber
nicht hinreichender Schritt in der Evolution von LPAIV zu HPAIV. So kann nicht jeder H5-
oder H7-LPAIV-Stamm als unmittelbarer HPAIV-Vorläufer dienen. Zusätzlich zur HA-
96
Spaltstelle sind weitere Virulenz-Determinanten im HA selbst, aber auch in den anderen
viralen Proteinen, vorhanden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher auch der Einfluss der Aminosäuren der
unmittelbaren Spaltstellen-Umgebung untersucht. Dazu wurden verschiedene Virus-
Mutanten des R65 mit Aminosäure-Substitutionen in der HA-Spaltstelle selbst (Motive ETR
und ER) und in ihrer direkten Umgebung (HA-S346V) generiert und hinsichtlich der in-vitro-
Replikation und der Virulenz im Huhn untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass HA-
346S einen Vorteil für die Replikation von LPAIV und HPAIV vermittelt. T an Position 2 der
Spaltstelle unterstützt die Replikation von LPAIV. Bei Erwerb der polybasischen Spaltstelle
während der Evolution von LPAIV zu HPAIV müssen also auch die benachbarten Regionen
im HA angepasst werden.
Die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 verbreiteten sich über infizierte Vögel von Südostasien nach
Europa, infizierten aber auch eine Vielzahl von Säugerspezies. Normalerweise weisen aviäre
Influenzaviren PB2-627E auf; im Gegensatz dazu besitzen die Clade 2.2-Viren PB2-627K,
was sonst in humanen Stämmen zu finden ist. Um im dritten Teil dieser Arbeit den Einfluss
dieser Mutation auf das breite Wirtspektrum der Clade 2.2-Viren zu untersuchen, wurde im
HPAIV-Isolat R65 PB2-627K durch E ersetzt und die Virusmutante R65-PB2K627E generiert.
Im Vergleich zu R65 war die Replikation von R65-PB2K627E in Säugerzellen drastisch
reduziert, in Vogelzellen replizierten beide Viren jedoch gleich. Des Weiteren führte die
Substitution zu einer extrem verringerten Polymerase-Aktivität auf 5% in Säugerzellen, aber
nur zu einer vergleichsweise wenig verringerten Aktivität in Vogelzellen. Während die
Virulenz im Huhn durch die Mutation nicht verändert wurde, konnte bei der Bestimmung der
LD50 in der Maus eine drastische Attenuierung gezeigt werden. Interessanterweise
revertierte bereits nach einer Mauspassage PB2-K627E zurück zu K, im Huhn erfolgte diese
Reversion aber nicht. Um zu untersuchen, ob andere virale Proteine für diese Reversion
notwendig sind, wurden Reassortanten generiert, welche R65-PB2-K627E und ein oder
mehrere Gensegmente des R65 im Hintergrund des HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1)
tragen, welches natürlicherweise PB2-627E besitzt. Mittels Zellkultur-Passagen dieser
Reassortanten konnte gezeigt werden, dass die Reversion zu PB2-627K nur in Säugerzellen
auftritt, und dass dazu das Nukleoprotein des R65 notwendig ist. Die schnelle Reversion zu
PB2-627K in Säugerzellen und in Mäusen zeigt, dass die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 in ihrer
Evolution möglicherweise mehrere Wirte gehabt haben, zu denen wahrscheinlich auch
Säuger gehörten.
97
IX SUMMARY
Influenza A viruses are important pathogens of humans and animals. As the causative agent
of fowl plaque, highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) lead to devastating losses
in the poultry industry world-wide. Furthermore, their zoonotic character and pandemic
potential, especially of strains with subtype H5N1, represents a serious threat to human
health. The identification of genetic markers determining virulence and host range is
important for risk assessment of new emerging strains. Studying virus pathogenesis in
different animal models like chickens and mice is crucial to elucidate these virulence
determinants.
HPAIV evolve from precursors of low virulence by the acquisition of a polybasic cleavage site
motif within the hemagglutinin (HA) during the adaptation to terrestrial poultry. Therefore, the
ability of a low pathogenic avian influenza virus (LPAIV) of subtype H5N1 to transform into an
HPAIV was investigated in the first part of this work. To this end, the reverse genetic system
was established for the LPAIV A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) to generate TG05. In in-
vitro studies, this virus was dependent on trypsin and proved to be avirulent in chicken. Its
HA cleavage site was modified by site-directed mutagenesis to a polybasic motif resulting in
the virus TG05-HApoly. This mutant was able to replicate in the absence of trypsin, but led
only to transient disease in chicken. Furthermore, the reassortant virus TG05/HAR65 was
generated, whose genome consists of the HA gene from the HPAIV isolate
A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) and the other seven gene segments from TG05.
This virus also replicated independently of trypsin but caused a lethality of 30%. However,
another reassortant virus, R65/HATG05poly, with reverse genome constellation: the modified
TG05 HA and the other gene segments of R65, caused death in eight of ten infected
chickens, reminiscent of the lethality of `natural´ HPAIV. Therefore, acquisition of a polybasic
motif at the HA cleavage site is a necessary, but not sufficient step in the evolution of LPAIV
into HPAIV. Furthermore, not every H5 or H7 LPAIV strain may serve as a precursor for
HPAIV. In addition to the polybasic HA cleavage site, other virulence determinants reside in
the HA itself, but also in the other viral proteins.
In the second part of this work, the involvement of amino acids adjacent to the HA cleavage
site was investigated. Therefore, different mutants of R65 with amino acid substitutions in the
HA cleavage site itself (motifs ETR and ER) and in the proximate vicinity (HA-S346V) were
generated and compared in regard to in-vitro replication and virulence. It was shown that HA-
346S facilitates replication of LPAIV and HPAIV and T at position 2 of the cleavage site is
98
beneficial to LPAIV. Thus, acquisition of a polybasic motif at the HA cleavage site during the
evolution of LPAIV to HPAIV involves the accompanying adaptation of adjacent regions.
H5N1 HPAIV of clade 2.2 have spread from Southeast Asia to Europe by infected birds, but
also infected several mammalian species. Avian influenza viruses normally possess PB2-
627E, but the clade 2.2 viruses harbor PB2-627K which is usually found in human strains.
The third part of this work was therefore to elucidate the relevance of the PB2-627K mutation
for the broad host range of the HPAIV H5N1 clade 2.2 strains. K was changed to E in R65,
resulting in the mutant virus R65-PB2K627E. Compared to R65, multicycle growth of R65-
PB2K627E was considerably impaired in mammalian, but not in avian cells. Furthermore, the
substitution severely decreased polymerase activity in mammalian cells to 5%, but reduced
activity only moderately in avian cells. Whereas virulence in chickens remained unaffected,
the LD50 in mice was increased by three orders of magnitude. Strikingly, R65-PB2-K627E
reverted to PB2-627K after one passage in mice, however not in chickens. To elucidate
whether other viral proteins are required for this reversion, reassortant viruses were
generated carrying R65-PB2-K627E and one or more gene segments of R65 in the
background of HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1), which naturally possesses PB2-627E.
Passage of these reassortants revealed that reversion to PB2-627K occurred only in
mammalian cells in the presence of R65-NP. Overall, fast reversion to PB2-627K in
mammalian cells and in mice suggests that the clade 2.2 H5N1 HPAIV could have a history
of several, perhaps mammalian hosts.
99
X ANHANG
Publikationen (1) Bogs, J., Veits, J., Gohrbandt,S., Hundt, J., Stech, O., Breithaupt,A., Teifke, J.P.,
Mettenleiter, T.C., Stech, J., 2010. Highly pathogenic H5N1 influenza viruses carry
virulence determinants beyond the polybasic hemagglutinin cleavage site.
PLoS One 5, e11826
doi: 10.1371/journal.pone.0011826
(2) Gohrband, S., Veits, J., Hundt, J., Bogs, J., Breithaupt, A., Teifke, J.P., Weber,
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cleavage site are relevant for virulence of avian influenza viruses of subtype H5.
J Gen Virol 92, 51-59
doi: 10.1099/vir.0.023887-0
(3) Bogs, J., Kalthoff, D., Veits, J., Pavlova, S., Schwemmle, M., Mänz, B.,
Mettenleiter, T.C., Stech, J., 2011. Reversion of PB2 627E to 627K during
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nucleoprotein.
J Virol, 85, 10691-10698
doi: 10.1128/JVI.00786-11
Eigenanteil der Publikationen
zu (1) Für diesen Teil der Arbeit wurde das revers-genetische System für
A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) von mir etabliert; das System für
A/Swan/Germany/R65/06 wurde von Dr. S. Gohrbandt und Dr. J. Hundt kloniert. Ich
habe die zielgerichteten Mutagenesen vorgenommen, alle Viren generiert und
genotypisiert. Alle in-vitro-Untersuchungen (Plaque-Assays, Wachstumskinetiken,
Western-Blot) habe ich selbst durchgeführt. Des Weiteren habe ich Dr. J. Veits bei
der Infektion der Hühner assistiert. Die histopathologische Untersuchung wurde von
Dr. A. Breithaupt vorgenommen. Bei der Verfassung des Manuskriptes zur
Veröffentlichung habe ich ebenfalls mitgewirkt.
100
zu (2) Dieser Teil der Arbeit war Bestandteil von der Promotion von Dr. S. Gohrbandt
(„Virulenzpotential des Hämagglutinins verschiedener Serotypen aviärer Influenza-
Viren“). Ich habe dabei die Wachstumskinetiken durchgeführt.
zu (3) Für diesen Teil der Arbeit habe ich die zielgerichtete Mutagenese des R65
durchgeführt, das Virus generiert und genotypisiert. Des Weiteren wurde das revers
genetische System für A/Hong Kong/156/97 (H5N1) von mir etabliert, die
Reassortanten generiert und ebenfalls genotypisiert. Ich habe außerdem die in-vitro-
Charakterisierung (Wachstumskinetiken, Luciferase-Assays) durchgeführt. Ich habe
Dr. J. Veits und Dr. S.P. Pavlova bei der Infektion, der Beurteilung sowie der Sektion
der Hühner assistiert. Zur Infektion und Sektion der Mäuse wurde ich von Dr. D.
Kalthoff angeleitet. Ich habe die Organe selbst entnommen, die Organtiter bestimmt
sowie die Aufarbeitung und Sequenzierung der Organe infizierter Hühner und Mäuse
durchgeführt. Auch die Zellkultur-Passagen der Reassortanten sowie deren
Aufarbeitung und Sequenzierung wurde von mir vorgenommen. Außerdem habe ich
bei der Verfassung des Manuskriptes zur Veröffentlichung mitgewirkt.
Obige Angaben werden bestätigt: ………………………………………………..
Unterschrift Dr. Jürgen Stech
101
Konferenzbeiträge
Functional studies of polymerase proteins and NP from H5N1 viruses.
Bogs, J.; Stech, J. (oral presentation)
1st Joint Bird Flu Meeting, 2. – 4. Februar 2009, Barcelona, Spanien
Die Virulenzdeterminanten der H5N1-HPAIV befinden sich sowohl im HA als auch in
den anderen viralen Proteinen und liegen schon in niedrigpathogenen H5N1-Stämmen
in verdeckter Form vor.
Bogs, J.; Veits, J.; Gohrbandt, S.; Hundt, J.; Stech, O.; Breithaupt, A.; Teifke, J.P.;
Mettenleiter, T.C.; Stech, J. (oral presentation)
Nationales Symposium für Influenzaforschung in Deutschland, 22. – 24. November 2009,
Berlin, Deutschland
Highly pathogenic H5N1 influenza viruses carry virulence determinants beyond the
polybasic hemagglutinin cleavage site.
Bogs, J.; Veits, J.; Gohrbandt, S.; Hundt, J.; Stech, O.; Breithaupt, A.; Teifke, J.P.;
Mettenleiter, T.C.; Stech, J. (poster presentation)
4th European Congress of Virology, 7. – 11. April 2010, Como, Italien
Polymerase-enhancing NP and PA mutations in the fatal human A/Hong Kong/156/97
H5N1 isolate may provide minor increment to virulence.
Bogs, J.; Kalthoff, D.; Veits, J.; Mettenleiter, T.C.; Stech, J. (poster presentation)
2nd International Influenza Meeting, 12. – 14. September 2010, Münster, Deutschland
Replication of an H5N1 clade 2.2 virus in a mammalian host forces reversion to PB2
627K in presence of its nucleoprotein.
Bogs, J.; Kalthoff, D.; Veits, J.; Mänz, B.; Schwemmle, M.; Pavlova, S.; Mettenleiter, T.C.;
Stech, J. (poster presentation)
21. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Virologie, 23. – 26. März 2011, Freiburg,
Deutschland
102
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit von mir weder an der Mathematisch-
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer
anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin
angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne
Kennzeichnung übernommen habe.
………………………………………………..
Unterschrift Jessica Bogs
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Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Jessica Bogs
Anschrift Riemser Weg 21b, 17498 Mesekenhagen/Gristow
Geburtsdatum 26.02.1982
Geburtsort Brandenburg an der Havel
Schulische Ausbildung
1988 – 1994 Grundschule in Brandenburg an der Havel
1994 – 2001 Bertolt-Brecht-Gymnasium in Brandenburg an der Havel,
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium
2001 – 2003 Grundstudium Diplom-Biologie an der Universität Potsdam
2003 – 2007 Hauptstudium Diplom-Biologie an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald, Abschluss: Diplom-Biologin
Diplomarbeit: Bedeutung des Mediator-Komplexes der Hefe Saccharomyces
cerevisiae für die Aktivierung von Strukturgenen der Phospholipidbiosynthese.
07-08/2005 6-wöchiges Berufspraktikum an der Technischen Universität Berlin,
Fachbereich Umweltmikrobiologie, Abteilung Genetik
02-03/2006 4-wöchiges fakultatives Praktikum im Institut für Humangenetik an der Ernst-
Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Promotion
2008 - 2010 Wissenschaftliche Mitarbeiterin, Labor für Pathogenese und Ökologie der
Influenza-Viren, Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut
seit 01/2011 Wissenschaftliche Mitarbeiterin, Labor für Infektionsimmunologie, Institut für
Infektionsmedizin, Friedrich-Loeffler-Institut
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Danksagung
Ich möchte mich herzlich bei allen bedanken, die mich auf meinem bisherigen Weg
unterstützt und mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. Mettenleiter für die
Überlassung des Themas und die Unterstützung während der Bearbeitung. Herrn Dr. Stech
danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, die wissenschaftlichen Diskussionen sowie der
Hilfestellung bei der Veröffentlichung der erhaltenen Ergebnisse. Dr. Siegfried Weber danke
ich für die Aufnahme in seinem Labor und seine hilfreich Unterstützung in theoretischen und
praktischen Fragen.
Weiterhin danke ich den ehemaligen und aktuellen Labormitgliedern Dr. Olga Stech, Cindy
Meinke, Nadine Müller, Anne Brandenburg, Kathrin Müller, Mandy Schmidt, Sayed Abdel-
Whab, Constanze Steglich und Marcus Gräber für die freundliche Zusammenarbeit. Dr. Jana
Hundt, Dr. Sandra Gohrbandt, Anne Kreibich, Dr. Sophia P. Pavlova, Dr. Angele Breithaupt
und Dr. Michael Eschbaumer danke ich für die vielen wertvollen Diskussionen, wichtigen
Hilfestellungen bei experimentellen Untersuchungen sowie die privaten Unternehmungen.
Ein herzliches Dankeschön geht außerdem an Dr. Jutta Veits für die Durchführung der
Hühnerversuche, Dr. Donata Kalthoff für die Unterstützung bei den Mausversuchen sowie
Mareen Lange für die Einweisung in die kleine Welt des L3+-Bereiches. Auch den
Tierpflegern möchte ich für ihre Hilfestellungen danken. Ich möchte mich außerdem bei allen
Mitarbeitern des Instituts für Molekularbiologie für die Zusammenarbeit und die zahlreichen
kritischen Diskussionen bedanken.
Der größte Dank gilt neben meinen Großeltern vor allem meinen Eltern für ihre finanzielle
und ideelle Unterstützung, offene Ohren und lieben Worte. Danke dass ihr immer an mich
glaubt.
All meinen Freunden bin ich für ihre moralische Unterstützung von Herzen dankbar und weiß
ihre Hilfe sehr zu schätzen. Andreas danke ich für die Rückendeckung und Kraft, die er mir
während der schwierigen Zeit geben konnte.