National Agriculture and Food Research Organization

農業・食品産業技術総合研究機構

農研機構は食料・農業・農村に関する研究開発などを総合的に行う我が国最大の機関です

C A C UGU C GAC U AA AAAA U A AGC GGA GAAAC A U AA C AGCUU AAG AAC UAAUC GU C U GGAACUAA CU GUGGUUCC GGUU ACACCU CUCC GU GCAG AAGA AGA AGGCGG CUCGG GG GCUUCAG UCC CCGGG CUGGAGCGA C GGC AAGG GGC AGGG GUGG GCGA AGGAG CCGU AGAAA AGGGU U

CCUUGGUU GA CGCCAAGG CCGA UGUGGG GGGG CA CGUC UUCU UCU UUCGCC GAGCC CU CGAAGUC AGG GGCCC GGCUUCGCU G UCG UUCC CCG UCCC CACC CGUU UCCUU GGCG UCUUU UCCCA U U UUC UU AGC C U G AUC UU AA AACAA U AUCAAC CG C C CAGCU GCG CCUUU UCU CCU C

359または360塩基の一本鎖環状RNA特徴

トマト退緑萎縮ウイロイド

報告年次 検出国 検出植物 塩基数 DBBJa accession No.1999 カナダ トマト 360 AF1621312004 アメリカ トマト 360 AY3723992006 インド バーベナ 部分配列 DQ8468832007 アメリカ ペチュニア 359 DQ8590132008 日本 トマト 359 AB3296682008 イギリス ペチュニア 359 EF582392

359 EF5823932009 フィンランド ペチュニア - -2009 フランス トマト 360 EU729744 2009 チェコ ペチュニア - -2009 アメリカ トマト 360 AF1621312009 メキシコ トマト - -2010 オランダ Brugmansia sanguinea 356 EF626530

a DNA data bank of Japan (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)

表　トマト退緑萎縮ウイロイドの発生報告

Tomat chlorotic dwarf viroid (TCDVd)

図1 トマトにおけるTCDVdの病徴

本症状発生の経緯と対応

• 平成18年7月、広島県トマト栽培圃場

黄化症状数株を確認（66,000株栽培圃場）

• 平成18年10月、同圃場

黄化症状株、約1,000株に拡大

管理作業の方向と一致して発症株が増加

• 平成18年10月、中央農研

病原体診断依頼

• 平成18年11月、

発病株から本邦未発生ウイロイド（TCDVd）検出

• 平成18年12月、同圃場

黄化症状株、約3,000株超に拡大

（推定1,000万円以上の被害）

• 平成19年2月、広島県

病害虫発生予察情報特殊報第５号、発行

• 平成19年12月、千葉県

病害虫発生予察情報特殊報第4号、発行

図2 トマト果実におけるTCDVdの病徴

感染果実 健全果実

罹病トマトの施設圃場での病徴

果実の奇形

図１ 左）健全 右）TCDVd感染

TCDVdに感染したジャガイモ

図3 左）TCDVd感染 右）健全図2 地上部の病徴

出芽している成長中の塊茎

接種植物種 感染 病徴 接種植物種 感染 病徴キク科 オオセンナリ + -アゲラタム - Nicotiana benthamiana + -ゴボウ - N. clevelandii + -シュンギク + - N. debneyi +c -c

キク - N.　glutinosa + +ヒマワリ - N. occidentalis + -レタス - N. physaloides +c -c

ノースポール + - N. rustica + -キョウチクトウ科 タバコ ’サムスン’ + -ヒメツルニチニチソウ +a -a タバコ ’キサンチ’ + -クマツヅラ科 Physalis floridana + -バーベナ +b -b ペチュニア + -ナス科 ワルナスビ + -ピーマン + - ナス + -チョウセンアサガオ - ツノナス + -シロバナヨウシュチョウセンアサガオ + - イヌホウズキ + -トマト + +a　Singh et al. (2008), b Singh et al. (2006), c Singh et al. (1999)

表　TCDVdの宿主植物域

TCDVdに感染した N. glutinosa（右）における花の斑入り症状

その他の科（ハマミズナ科・ヒユ科・キョウチクトウ科・アカザ科・ウリ科・マメ科・リンドウ科・ゴマ科・ゴマノハグサ科・クマツヅラ科）での感染は認められなかった

ナス科と一部のキク科に感染が確認できたが、病徴が見られたのはトマトと N. glutinosa のみであった

TCDVdの宿主範囲の調査

塩基配列の相同性 85%～89%

侵入を危惧する ウイロイドとの比較

ジャガイモスピンドルチューバ-ウイロイドPotato spindle tuber viroid (PSTVd)

特定重要病害に指定

ジャガイモにおける重要病害→やせいも症状

EPPO0.1

TPMVd

MPVd

PSTVd

TCDVd

CLVd

PCVd

CEVd

TASVd

CSVd

IrVd

CVd

TPMVd (K00817)

MPVd (L78454)

PSTVd (V01465)

TCDVd (AF162131)

CLVd (X15663)

PCFVd (FJ409044)

CEVd (M34917)

TASVd (X06390)

CSVd (X16408)

IrVd (X95734)

CVd-Ⅳ (X14638) 0.1

TPMVd

MPVd

PSTVd

TCDVd

CLVd

PCVd

CEVd

TASVd

CSVd

IrVd

CVd

TPMVd (K00817)

MPVd (L78454)

PSTVd (V01465)

TCDVd (AF162131)

CLVd (X15663)

PCFVd (FJ409044)

CEVd (M34917)

TASVd (X06390)

CSVd (X16408)

IrVd (X95734)

CVd-Ⅳ (X14638)

図 ポスピウイロイドの系統樹Out group: CVd-Ⅳ

TCDVdとPSTVdとの間で異なる塩基

マルチプレックスRT-PCR用プライマー

Mp-R

MpTCDVd-F

MpPSTVd-F

プライマー名称 用途

各プライマーの位置

Tomato chlorotic dwarf viroid (359nt)359

1180

PCR産物サイズ

TCDVd: 191bpPSTVd: 281bp

Mp-RMpTCDVd-FMpPSTVd-F

リバースプライマーTCDVd検出用フォワードプライマーPSTVd検出用フォワードプライマー

しかし。。。PSTVdは160を超える変異体が報告されており、プライマーMpPSTVd-Fでは検出できないPSTVdの変異体がある可能性が考えられた

そこで、既報の全てのPSTVdを検出できるプライマーの作製を試みた

マルチプレックスRT-PCR用プライマー

MpPTA-f 126-CGGTGGGGAGTGCCTA -141

MpPTC-f 126-CGGTGGGGAGTGCCTC -141MpPCT-f 126-CGGTGGGGAGTGCCCT -141

プライマー名称 塩基配列 PCR産物サイズ

TCDVd 約191bp

PSTVd 約271bp

Mp-r 18-TCAGGTGTGAACCACAGGAA-37MpTCDVd-f 206-CTTCCTTTGCGCGCCACT-223

詳細は・・・・Development of a multiplex RT-PCR detection and identification system for Potato spindle tuber viroid and Tomato chlorotic dwarf viroid. European Journal of Plant Pathology 128 (2): 165-170, 2010.

用途

PSTVd検出用

TCDVd検出用

逆転写

PSTVd

TCDVd

新しいPSTVd検出用プライマーを用いたマルチプレックスRT-PCRによってPSTVd (271bp)およびTCDVd (191bp)を同時検出でき、同定することができた。

新しいマルチプレックスRT-PCRの実施

MPSTVdRNA

TCDVdRNA

PSTVd+TCDVdRNA

健全トマト

RNasefree水

PSTVd・TCDVdの対応について

農研機構はPSTVdおよびTCDVdの検定について検出方法の提供を行っております

PSTVdおよびTCDVdの宿主

のほとんどは無病徴感染である。

宿主植物であるペチュニアやバーベナは栄養繁殖であることから、これらの植物の海外からの侵入対策が急がれる。

M 1 2 3 4 5 PSV TCV H

福島県のトマトからPSTVdが検出された→ 全塩基配列の確認を行なった結果、

PSTVd (DDBJ accession no. EU862231 ) と100%一致した

サンプルM ：100bp Ladder markers1 ：トマト（広島県）2 ：トマト（千葉県）3 ：ペチュニア（千葉県）4 ：トマト（栃木県）5 ：トマト（福島県）PSV : PSTVdTCV : TCDVdH ：健全トマト

マルチプレックスRT-PCRを用いた疫学調査

国内未発生のPSTVdが始めて確認された

国内のトマトから検出されたPSTVdの病徴

非接種個体 接種個体

接種後１か月

PSTVdの病徴再現を確認

（トマトにおけるPSTVdの発生）▼福島県平成21年度病害虫発生予察情報 特殊報 第5号▼平成21年8月7日農林水産省プレスリリース「ポテトスピンドルチューバーウイロイドによるトマトの病気の調査結果と今後の対応について」

その後・・・（ダリアにおけるPSTVdの発生）▼山梨県平成22年度病害虫発生予察情報 特殊報 第1号▼平成22年2月5日農林水産省プレスリリース「ポテトスピンドルチューバ－ウイロイド（PSTVd）によるダリア苗の病気の発生と対応について」

今後はPSTVd等のポスピウイロイドの侵入警戒が必要

実用化に向けた課題

・種苗メーカーの自社検定業務への導入

・海外生産種苗の輸出入前検定の実施

・国内生産種苗の輸出前検定の必要性

・国際的な植物防疫行政での検査業務

企業への期待

・安心・安全な国内種苗生産の確保

・海外生産種苗の健全性確保

本技術に関する知的財産権

・発明の名称：ウイロイドＰＳＴＶｄ及びＴＣＤＶｄの同時検出方法

・出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５８８９４

・公開番号：ＷＯ／２０１０／１４０５１８

・出願人：農業・食品産業技術総合研究機構

・発明者：松下陽介、津田新哉

お問い合わせ先

問い合わせ窓口：（独）農業・食品産業技術総合研究機構

中央農業総合研究センター企画管理部研究調整役 山本 真也TEL：０２９-８３８-８５０９FAX：０２９-８３８-８５７４E-mail: crc-narc@naro.affrc.go.jp