naujŲ 4 tiazolidinonŲ, turinČiŲ sulfanilamido, alilamino ir … · parazitai, todėl medžiagos...

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

Augusta Ževžikovienė

NAUJŲ 4-TIAZOLIDINONŲ, TURINČIŲ

SULFANILAMIDO, ALILAMINO IR

NITROFURANO FARMAKOFORUS,

PRIEŠMIKROBINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai,

farmacija (08B)

Kaunas, 2012

2

Disertacija rengta 2003–2011 metais Lietuvos sveikatos mokslų

universitete, Medicinos akademijoje (Kauno medicinos universitete)

Moksliniai vadovai:

prof. habil. dr. Eduardas Tarasevičius (Lietuvos sveikatos mokslų uni-

versitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)

2008–2011 m.

prof. habil. dr. Paulius Vainauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universi-

tetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)

2004–2008 m.

doc. dr. Rimantas Klimas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medi-

cinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B) 2003–2004 m.

Konsultantai:

prof. habil. dr. Antanas Stankevičius (Kauno medicinos universitetas,

fiziniai mokslai, chemija – 03P)

prof. dr. (HP) Alvydas Pavilonis (Lietuvos sveikatos mokslų universite-

tas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

3

TURINYS

SANTRUMPOS ............................................................................................. 4

ĮVADAS......................................................................................................... 5

1. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................... 8

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ................................................. 22

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ................................................... 46

3.1. Naujų susintetintų 4-tiazolidinono darinių apibūdinimas .............. 46

3.2. Susintetintų junginių, kaip biologiškai aktyvių medžiagų,

vertės nustatymas in silico ............................................................. 59

3.3. Susintetintų junginių priešmikrobinio aktyvumo tyrimo

rezultatų įvertinimas ...................................................................... 63

3.3.1. Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in silico .............................. 63 3.3.2. Priešmikrobinio aktyvumo įvertinimas in vitro ............................ 67

3.4. Susintetintų junginių struktūros – aktyvumo ryšio įvertinimas ..... 75

3.5. Darbo rezultatų apibendrinimas ..................................................... 92

IŠVADOS .................................................................................................... 96

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ................................................................... 97

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ..... 114

4

SANTRUMPOS

1H BMR – protono branduolių magnetinis rezonansas

DMF – dimetilformamidas

DMSO – dimetilsulfoksidas

DMSO-d6 – dimetilsulfoksidas, turintis 6 deuterio atomus

s – singletas

d – dupletas

dd – dupletų dupletas

t – tripletas

m – multipletas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

IR – infraraudonoji spektroskopija

MSK – mažiausia slopinanti koncentracija

Pa – aktyvumo tikimybė

PASS – medžiagų aktyvumo prognozės programa (Prediction

of Activity Spectra for Substances)

ZAT – kodas, žymintis susintetintus junginius su

sulfanilamido ir alilamino farmakoforais

MA – kodas, žymintis susintetintus junginius su

sulfanilamido farmakoforu

LF, LCF – kodai, žymintys susintetintus junginius su nitrofurano

ir alilamino farmakoforais

LCD – kodas, žymintis susintetintus junginius su benzilamino

farmakoforu

L – kodas, žymintis susintetintus 3-aminorodanino

darinius

S. aureus – Staphylococcus aureus

E. faecalis – Enterococcus faecalis

E. coli – Escherichia coli

P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa

K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae

P. mirabilis – Proteus mirabilis

B. subtilis – Bacillus subtilis

C. albicans – Candida albicans

5

ĮVADAS

XIX a. viduryje Louis Pasteur įrodė, kad daugelį ligų sukelia mikrobai ir

parazitai, todėl medžiagos turi būti tiriamos su šiais mikroorganizmais, kad

būtų identifikuota molekulė padedanti įveikti ligą [90].

Priešmikrobinių medžiagų vartojimo pradžia klinikinėje praktikoje suma-

žino mirtingumą (nuo 70–90 proc. iki 10 proc.) nuo sunkių ir gyvybei pavo-

jingų ligų, kurias sukelia bakterijos [6, 34, 138, 199, 213]. Šiuo metu klini-

kinėje praktikoje infekcinėms ligoms gydyti vartojama daugiau kaip 200

priešmikrobinių medžiagų, nepaisant to, infekcinės ligos vis dar yra viena

dažniausių mirties priežasčių [78, 101, 158, 275].

Pastaruoju metu susirūpinimą kelia bakterijų atsparumo didėjimas [6, 37,

59, 74, 199]. Atsparūs mikroorganizmai plinta ne tik ligoninėse. Jų sukelia-

mos ligos yra sunkiai gydomos ir pavojingos visai žmonijai. Vis daugiau

mikroorganizmų tampa atsparūs priešmikrobiniams vaistams. Todėl, mažėja

vartojamų priešmikrobinių medžiagų efektyvumas ir pasirinkimo galimybės.

Būtina tęsti naujų veikliųjų medžiagų paiešką, nes atsparių bakterijų

sukeltos infekcijos ateityje gali tapti pavojingos epidemijos priežastimi [34,

51, 52, 190, 199, 200, 282].

Heterociklinės struktūros junginiai yra viena svarbiausių organinių

junginių klasė. Apie 50 proc. visų cheminių junginių, susintetintų iki antrojo

tūkstantmečio pabaigos, yra heterociklinės struktūros. Didelis dėmesys

skiriamas sierą ir azotą turintiems heterocikliniams junginiams dėl

sėkmingo jų pritaikymo įvairiose mokslo srityse [14, 81, 201]. Susidomė-

jimas tiazolo ir tiazolidino junginiais padidėjo, kai ši struktūra buvo

nustatyta plačiai vartojamuose junginiuose (pvz. tiazolidinas – peniciline)

[21, 140, 195]. Tiazolo dariniais, kaip potencialiais vaistais, imta domėtis

XX a. pradžioje.

Anksčiau susintetintų junginių struktūros analizė parodė, kad 4-

tiazolidinono dariniai, turintys sulfanilamido farmakoforą, yra aktyvesni nei

patys sulfanilamidai prieš bakterijas, be to jie pasižymi ir priešgrybeliniu

poveikiu [113, 127, 233]. Nitrofurano farmakoforą (5-nitrofurfurolo ar 5-

nitrofurilakroleino) turintys 4-tiazolidinono dariniai yra vieni aktyviausių

priešmikrobinių junginių [32, 36, 195, 249]. Alilaminai yra naujausia

priešgrybelinių vaistų grupė [10, 73], šį farmakoforą įjungus į molekulę

kartu su jau anksčiau žinomais farmakoforais – sulfanilamidais ir nitrofu-

ranais, tikėtąsi geresnio naujų junginių priešmikrobinio aktyvumo.

Remiantis sėkmingais ankstesniais mokslo darbų rezultatais [150, 193,

195, 249], nuspręsta susintetinti priešmikrobiniu aktyvumu pasižyminčius 4-

tiazolidinono darinius, panaudojant įvairių aminų ir aldehidų fragmentus.

6

Darbo tikslas: Nustatyti keleto farmakoforų poveikį naujų 4-tiazolidino-

no junginių priešmikrobiniam aktyvumui.

Uždaviniai: Susintetinti naujus biologiškai aktyvius 4-tiazolidinono

darinius su sulfanilamido, nitrofurano ir alilamino farmakoforų struktūri-

niais fragmentais, bei įvertinti šių fragmentų įtaką naujų junginių prieš-

mikrobiniam aktyvumui:

1. Nustatyti tinkamiausias metodikas kuriant naujus 4-tiazolidinono darinius su pasirinktais farmakoforų struktūriniais fragmentais.

2. Nustatyti susintetintų junginių fiziko-chemines savybes ir toksišku-mo riziką in silico.

3. Įvertinti susintetintų junginių priešbakterinį ir priešgrybelinį akty-vumą in silico ir in vitro.

4. Apibendrinti tyrimų rezultatus ir nustatyti didžiausiu priešbakteriniu ir priešmikrobiniu aktyvumu pasižyminčius junginius.

5. Įvertinti farmakoforų įtaką naujų junginių priešmikrobiniam aktyvu-mui.

Tyrimo hipotezė:

4-tiazolidinono dariniai su sulfanilamido, nitrofurano ir alilamino farma-

koforais pasižymi priešmikrobinėmis savybėmis prieš skirtingas bakterijų ir

grybelio kultūras.

Mokslinio darbo naujumas ir praktinė reikšmė: Atlikta kryptinga 4-

tiazolidinono darinių sintezė, susintetinti 37 nauji junginiai, struktūroje

turintys sulfanilamido, nitrofurano ar alilamino farmakoforus, įvertintos jų

priešmikrobinės savybės.

Priešmikrobinio aktyvumo (prieš S. aureus, E. faecalis, E. coli, P. aeru-

ginosa, K. pneumoniae, B. subtilis, P. mirabilis, C. albicans) tyrimo in vitro

rezultatai palyginti su prognozės rezultatais. Nustatyta, kad duomenys nesu-

tampa. Pvz., tyrimas in silico parodė, kad 7 junginiai aktyvūs prieš grybelius

ir bakterijas, 21 junginys neturi priešmikrobinio aktyvumo. Tyrimas in vitro

parodė, kad tokių junginių atitinkamai buvo 23 ir 14. O tyrimų in silico ir in

vitro rezultatų palyginimas rodo, kad prognozė gali padėti planuoti tyrimus,

tačiau duomenys turi būti tikrinami eksperimentiškai.

Priešmikrobinio aktyvumo tyrimo prieš kiekvieną bakteriją rezultatų

įvertinimas, parodė, kad tokios struktūros junginiai aktyviausiai slopina

bakterijų: S. aureus, E. faecalis ir E. coli, grybelio C. albicans augimą,

tačiau visiškai neveikia kapsules sudarančios bakterijos P. aeruginosa.

Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo junginiai struktūroje turintys nitrofurano

farmakoforą, mažiausiu – sulfanilamido farmakoforą.

Nustatytas priešmikrobinis aktyvumas prieš skirtingo tipo bakterijas

(gramteigiamą – S. aureus, gramneigiamą – E. colis, kapsules sudarančią–

K. pneumoniae, sporas sudarančią– B. subtilis, šliaužiančiąją – P. mirabilis),

7

bei farmakoforo įtaka susintetintų junginių aktyvumui. Ateityje šie duome-

nys papildys struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus bei kryptingą naujų

priešmikrobinių junginių sintezę.

Darbo rezultatų aprobavimas: Darbo rezultatai pristatyti 4 konferen-

cijose: Tarptautinė farmacijos mokslo ir farmacijos praktikos konferencija

skirta 225-osioms farmacijos mokslo Lietuvoje metinėms paminėti (Kaunas,

2010.10.15–16), IV nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija „Mokslas –

sveikatai“ (Kaunas, 2011.04.07), Mokslinė konferencija „Chemija ir chemi-

nė technologija“ (Kaunas, 2010.04.27), 5-oji tarptautinė konferencija „THE

VITAL NATURE SIGN“ (Kaunas, 2010.05.19-21).

Išspausdintas 1 mokslinis straipsnis (žurnale „Medicina“). Vienas moks-

linis straipsnis priimtas spausdinimui užsienio moksliniame žurnale (Acta

Poloniae Pharmaceutica). Išspausdintos 3 pranešimų tezės.

Darbo apimtis ir struktūra: Disertaciją sudaro: įvadas, literatūros

apžvalga, tyrimo objektas ir metodai, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išva-

dos, bibliografijos sąrašas (287 literatūros šaltiniai), disertacijos tema pa-

skelbtų darbų sąrašas. Pateikta 21 lentelė ir 62 paveikslai. Disertacijos

apimtis 114 puslapių.

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

Priešmikrobinių medžiagų vartojimo klinikinėje praktikoje pradžia yra

vienas svarbiausių modernios medicinos žingsnių. Pirmųjų priešmikrobinių

medžiagų vartojimas sumažino mirtingumą (nuo 70–90 proc. iki 10 proc.)

nuo sunkių ir gyvybei pavojingų ligų, kurias sukelia bakterijos [6, 34, 138,

199, 213]. Per 30 metų nuo sulfanilamidų ir penicilino vartojimo pradžios

klinikinėje praktikoje, buvo sukurta daugybė priešmikrobinių vaistų, kurie

sėkmingai vartojami įvairių infekcinių ligų gydymui. Naujų medžiagų

kūrimui naudoti Vokietijos ir Šveicarijos mokslininkų metodai, pasiūlyti

XIX a. tyrinėjant natūralias medžiagas. Dauguma šių dienų priešbakterinių

junginių grupių sukurtos 1935–1962 m.: sulfanilamidai, β-laktamai, amino-

glikozidai, chloramfenikolis, tetraciklinai, makrolidai, glikopeptidai, chino-

lonai [45, 72, 134, 156, 199, 271]. Daugelis naujų medžiagų sukurtos modi-

fikuojant jau žinomus priešmikrobinius junginius [34, 199]. Šiuo metu

klinikinėje praktikoje infekcinėms ligoms gydyti vartojama daugiau kaip

200 priešmikrobinių medžiagų. Nepaisant to, infekcinės ligos vis dar yra

viena dažniausių mirties priežasčių [78, 101, 158, 275] ir naujų priešmikro-

binių vaistų poreikis nemažėja. Tai lemia pastaruoju metu vis didėjantis

pacientų skaičius, kurių susilpnėjęs imunitetas. Tokie pacientai dažniau

serga įvairiomis infekcinėmis ligomis. Nauji priešmikrobiniai preparatai

sumažina klinikinio gydymo trukmę ir/ar dozavimą, yra mažiau toksiški,

juos vartojant pasireiškia mažiau šalutinių poveikių (rečiau sukelia vėmimą,

viduriavimą, alergines reakcijas) [52]. Viena iš priežasčių, skatinanti kurti

naujas medžiagas, pasižyminčias priešmikrobinėmis savybėmis – atsparumo

antibiotikams problema [6, 20, 22, 34, 50, 52, 100, 102, 143, 180, 200, 224,

278]. Atsparūs mikroorganizmai plinta ne tik ligoninėse. Jų sukeliamos

ligos yra sunkiai gydomos ir pavojingos visai žmonijai [72, 180, 253]. Kai

kurie mokslininkai mano, kad atsparių mikroorganizmų sukeltas infekcijas

galima gydyti derinant keletą priešmikrobinių vaistų ir naujų kurti nereikia

[34, 52, 153, 199, 200]. Manoma, kad dėl tokio požiūrio yra sumažėjęs

verslo interesas. Dauguma didžiųjų farmacijos kompanijų nusprendė, kad

vaistai lėtinių ligų gydymui yra pelningesni nei priešbakterinės medžiagos,

todėl labai sumažino arba visiškai atsisakė vaistų nuo infekcijų kūrimo ir

tyrimų. Viena iš galimų tokio sprendimo priežasčių – mažas tinkamais

vaistais negydomų infekcinių ligų skaičius ir plati jomis sergančiųjų

geografija. Tai apsunkina klinikinių tyrimų administravimą ir kompanijoms

tampa nepatrauklu kurti naujus vaistus nuo infekcijų [20, 34, 52, 57, 77,

143, 157, 161, 199, 200, 203, 242].

9

Antibiotikams atsparių bakterijų skaičius vis auga, o naujo, saugaus ir

efektyvaus vaisto kūrimas užtrunka daugiau nei 10 metų. Dėl minėtų

priežasčių būtina tęsti naujų veikliųjų medžiagų paiešką, nes atsparių bak-

terijų sukeltos infekcijos ateityje gali tapti pavojingos epidemijos prie-

žastimi [34, 52, 58, 74, 99, 190, 199, 200, 282].

Dėl šių priežasčių, tampa akivaizdu, kad dabartinė priešmikrobinių vaistų

paieška yra nepakankama ir neatitinka visuomenės poreikių.

Heterociklinės struktūros junginiai yra viena svarbiausių organinių

junginių klasė, naudojama įvairiose mokslo srityse [14, 201]. Šių junginių

stuktūra nustatyta ir biologiškai aktyvių medžiagų struktūroje. Šių junginių

tarpe didelę reikšmę turi tiazolo dariniai, kuriais, kaip potencialiais vaistais,

imta domėtis XX a. pradžioje, tiazolo ir tiazolidino dariniais susidomėjimas

padidėjo, kai ši struktūra buvo nustatyta plačiai vartojamuose junginiuose

(pvz. tiazolidinas – peniciline) [21, 195, 255].

Tiazolidinono dariniai taikomi medicinos praktikoje, kaip: onkologiniai

[2, 21, 43, 89, 103, 188, 207, 251], prieuždegiminiai [2, 83, 132, 189, 234,

244, 248], priešgrybeliniai [39, 240], malšinantys skausmą [21, 248],

mažinantys karščiavimą [21], priešmikrobiniai [2, 7, 21, 26, 53, 61, 94, 108,

125, 130, 160, 192, 232, 251, 261, 264, 266], prieštraukuliniai [2, 149, 260],

antihistamininiai [21, 58], antivirusiniai [2, 15, 17, 18, 19, 21, 124, 210,

211, 212, 214, 215, 216, 251], prieštuberkulioziniai vaistai [117, 251],

folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) receptorių agonistai [2, 276].

Neseniai buvo nustatytas 4-tiazolidinonų aktyvumas prieš bakterijų fermen-

tą Mur B, kuris yra peptidoglikano biosintezės pirmtakas [9].

4-tiazolidinonai – tai yra tiazolidino dariniai, ketvirtoje žiedo padėtyje

turintys karbonilo grupę [2, 140, 235, 236] (1.1 pav.).

S

NH

O

X1 2

34

5

1.1 pav. Bendra 4-tiazolidinonų formulė

Pastaruoju metu susidomėjimą kelia ir kiti panašios struktūros junginiai:

2,4-tiazolidindionas (X = O) ir 2-tiokso-4-tiazolidinonas (rodaninas, X = S).

Šių struktūrų pagrindu kuriami antidiabetiniai vaistai [140]. 4 padėtyje

esanti karbonilo grupė yra neaktyvi, nors literatūroje yra aprašyta atitinkamų

tiodarinių, kurie gaunami reakcijoje su Lawesson reagentu (2,4-bis(4-

metoksifenil)-1,3,2,4-ditiodifosfoetan-2,4-disulfidu) [2, 114].

10

4-tiazolidinono žiedas sintetinamas keliomis sintezės kryptimis: ciklokon-

densacija, sintezė iš panašių heterociklinių junginių, heterociklinių junginių

transformacija. Vienas dažniausiai naudojamų metodų yra ciklokondensacija.

Šiuo metodu dažniausiai sintetinami 2,4-tiazolidindionas ir 2-tiokso-4-

tiazolidinonas. α-halogenkarboksirūgštys naudojamos kaip dielektrofiliniai

reagentai [C2]2+

reakcijose su N,S-nukleofilais (1.2 pav.) [2, 116, 124, 140,

165, 235, 236, 264].

S

N

O

X

R

R NH2

CXSRNHCXS X = O,S

Cl

OHO

1.2 pav. Klasikinis 4-tiazolidinono ciklo sintezės metodas

Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų 2-imino-4-tiazolidinono gavi-

mui yra įvairių tiokarbamidų ir tiosemikarbazidų reakcijos su α-halogen-

karboksirūgštimis (1.3 pav.) [60, 83, 91, 92, 130, 140, 236, 252, 284].

RNH NH

2

S

N

S

RO

NH

N

SNHR

O

ClCH2

O

OH

1.3 pav. 2-imino-4-tiazolidinono gavimo iš įvairių tiokarbamidų reakcija

Taip pat galimi būdai: tiokarbamidą veikiant monochloracto rūgšties

natrio druska [2, 165], tiocianatą arba alkilizotiocianatą veikiant hidrazidu

(acetamidu), esant etilbromacetatui ir natrio acetatui [2, 41, 129].

Sintetinant 4-tiazolidinono darinius, pakaitai dažniausiai įvedami į 2, 3

arba 5 padėtį [2, 140, 235, 236]. 5-je padėtyje esanti metileno grupė yra

ypač aktyvi, todėl dažniausiai 4-tiazolidinono dariniai gaunami modifikuo-

jant šią padėtį [64, 65, 121, 140]. Biologiškai aktyvūs junginiai gaunami į

5-tą padėtį įvedant karbonilinių junginių fragmentus aldolinės kondensacijos

metu (1.4 pav.) [129, 130, 195, 267].

11

N

S

RO

XO

R

R

X = O, S, NH, NR

X

N

S

RO

R

R

1.4. pav. Karbonilinių junginių fragmentų įjungimas į 4-tiazolidinono žiedą

Verta paminėti, kad 5-toje 4-tiazolidinono ciklo padėtyje esančios meti-

leno (-CH2-) grupės reakcijos su oksojunginiais yra efektyviausias būdas

sintetinti biologiškai aktyvius 5-ariliden-4-tiazolidinono darinius. Šie jungi-

niai yra tiriami kaip potencialūs priešmikrobiniai, priešvirusiniai, priešvėži-

niai vaistai [140, 195]. Reakcija gali būti katalizuojama natrio šarmu, natrio

acetato ir acto rūgšties ar jos anhidrido mišiniu, amonio hidroksidu, amonio

hidroksido ir amonio chlorido mišiniu, metilamino ir acto rūgšties mišiniu ir

kt. katalizatoriais [76, 140, 144, 145, 148, 178, 217, 259]. Atlikus reakcijas

su įvairiais aromatiniais aldehidais pagal Knoevenagel‘io metodiką,

nustatyta ir BMR spektrine analize patvirtinta, kad nepriklausomai nuo

naudojamo aldehido visada gaunamas trans-izomeras [23, 174, 202].

Literatūroje yra aprašyta ir tiesioginių, vieno etapo, 5-pakeistų 4-tiazoli-

dinonų sintezės metodų, naudojant 3 komponentus. Pvz., aldehidą, tiokarba-

midą ir chloroformą [2, 16, 24, 76, 97, 118, 165] (1.5 pav.).

CHO

NH2

NH2

S

CHCl3

NH

NH

S

O

1.5 pav. 5-pakeistų 4-tiazolidinonų sintezė

2-tiokso-4-tiazolidinono dariniams būdinga tautomerija [66, 180].

Judriam vandenilio atomui esant prie tioksogrupės, susidaro merkapto

grupė, kurią alkilinant galima gauti 2-alkiltio-4-tiazolidinonus. 2-alkiltio-4-

tiazolidinonams reaguojant su aminais, reakcijos vyksta lengviau nei su

rodaninu, gaunamos didesnės išeigos bei grynesni reakcijos produktai. 2-

alkilrodaninai gaunami veikiant rodanino darinius alkilhalogenais esant

bazėms (NaOH, KOH, NaH, EtN3) [140]. 2-alkiltio-4-oksotiazolinai reaguo-

12

ja su aromatiniais aminais, susidarant 2-imino-4-oksotiazolidino dariniams

(1.6 pav.) [184, 195, 246].

NH

SS

O

RHal

N

SSHal

O

NH2

- HSRN

SNH

O

1.6 pav. 4-tiazolidinonų darinių sintezė iš 2-tiokso-4-tiazolidinono

Šiuo metu 4-tiazolidinono struktūra yra daugelio medžiagų, pasižyminčių

skirtingomis farmakologinėmis savybėmis pagrindas. Dažniausiai jie

naudojami kaip antidiabetiniai vaistai. Pirmasis vaistinis preparatas, kurio

pagrindas 4-tiazolidinono struktūra buvo rosiglitazonas (1.7 pav.).

N NH

S O

OON

1.7. pav. Rosiglitazonas

4-tiazolidinonų veikimo mechanizmo nustatymas, išskyrė juos į atskirą

antidiabetinių vaistų klasę. Vėlesni tyrimai atskleidė, kad 4-tiazolidinonų

dariniai gali būti naudojami įvairiose medicinos srityse (onkologijoje,

infektologijoje ir kt.) kaip potencialūs vaistai. Įvairios 4-tiazolidinono žiedo

modifikacijos, siekiant susintetinti biologiškai aktyvius junginius yra svar-

biausia priežastis, dėl kurios ši heterociklinių junginių klasė yra įdomi įvai-

rių sričių tyrėjams [120, 140, 263].

Tiokarbamido dariniai. Tiokarbamidai yra organinių junginių klasė.

Dažniausiai jie naudojami, kaip reagentai organinėje sintezėje [44, 128, 230,

281]. Tiokarbamidai gali egzistuoti dviejuose tautomerinėse formose (1.8 pav.).

NH2

S

NH2

NH2

SH

NH

1.8 pav. Tiokarbamidų tautomerija

Tiokarbamidų ir tiosemikarbazidų reakcijos su α-halogenkarboksirūgš-

timis yra vienas iš dažniausiai naudojamų metodų 2-imino-4-tiazolidinono

gavimui [67, 69, 83, 91, 92, 116, 130, 140, 252, 284]. Tiosemikarbazidų

13

dariniai pasižymi skirtingu biologiniu aktyvumu, pvz., priešmikrobinių

junginių struktūroje yra 1,2,4-triazolo fragmentas [110, 119, 122, 185, 208,

225], prieštraukulinių - 1,3,4-tiadiazol-2-amidino fragmentas [71, 86, 122].

Paprasčiausias tiokarbamido darinių gavimo metodas yra izotiocianatų

reakcija su aminais, vykstanti pagal nukleofilinio prijungimo mechanizmą.

(1.9 pav.) [230].

+ NH2RR

N S R N NH2

S

R

-

+ RN NH

SH

R

RNH NH

S

R

1.9 pav. Tiokarbamido darinių gavimo iš izotiocianatų reakcija

Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų, tiosemikarbazidų sintezei yra

izotiocianatų ir hidrazinų sąveika (1.10 pav.) [122].

+ NH2NH2R N SR

NH NH

S

NH2

1.10 pav. Tiosemikarbazidų gavimo reakcija

Reakcijos su aminais dažniausiai vykdomos etanolyje, tačiau galima jas

atlikti ir kituose tirpikliuose, pvz.: metanolyje, acetone, toluene, chlorofor-

me, piridine, dimetilformamide, benzene. Reakcija vykdoma imant ekviva-

lenčius reaguojančių medžiagų kiekius. Literatūroje yra aprašyta atvejų, kai

buvo imamas izotiocianato perteklius [284].

Nesimetrinių tiokarbamido darinių kondensacijos su monochloracto

rūgštimi metu, į antrą padėtį įjungiami elektrofiliniai pakaitai. Pagal 2-je

padėtyje pakeisto 4-tiazolidinono susidarymo galimybę, pakaitai išdėstomi

elektrofiliškumo didėjimo tvarka: vandenilis – alkilas – arilas – piridilas

[284]. Kondensuojant aliltiokarbamidus, alilo radikalas elgiasi kaip alkilas.

Simetrinių tiokarbamido darinių sintezėje naudojamas anglies disulfidas

[147]. Šiuo metodu sintezė vykdoma ne tiesiogiai (kaip sintezėje su izotio-

cianatu), bet sudarant tarpinį junginį. Metodo privalumas – gaunami simetri-

niai ir nesimetriniai (1.11 pav.).

14

NH

R

R+CS2+ NaOH

R'-NH2

NR

R

NH

R'S

1.11 pav. Simetrinių tiokarbamidų gavimo reakcija

Sulfanilamidotiokarbamido dariniai. Dėl panašaus farmakologinio po-

veikio (p-aminobenzoinės rūgšties inaktyvavimo), karbamidas ir sulfani-

lamidai XX a. pradžioje kartu vartoti klinikinėje praktikoje. Ankstesniuose

mokslo darbuose (1940–1950 m.) kelti uždaviniai sujungti šias dvi medžia-

gas į vieną molekulę ir ištirti jų priešbakterinį aktyvumą. 1940 m. Northey

aprašė dešimt sulfanilamidokarbamido ir sulfanilamidotiokarbamido dari-

nių. Junginiai gauti modifikuojant tik aromatinę amino grupę (N4 pakeisti

sulfanilamidai). Mokslininkai Roth ir Degering sintetino sulfanilamido-

karbamido ir sulfanilamidotiokarbamido darinius, modifikuodami aromatinę

amino grupę (N4 pakeisti sulfanilamidai) bei sulfogrupės amidogrupę (N

1

pakeisti sulfanilamidai), taip pat lygino šių junginių priešbakterinį aktyvumą.

N4 pakeisti sulfanilamidai susintetinti sujungiant sulfanilamidą su atitin-

kamu izocianatu (sulfanilamidokarbamido dariniams) arba izotiocianatu

(sulfanilamidotiokarbamido dariniams) (1.12 pav.) [228, 229].

NH2SNH2

O

ORN S NH

SNH2

O

O

S

NHR

1.12 pav. Bendra sulfaniltiokarbamidų gavimo reakcija

N1 pakeisti sulfanilamidai susintetinti sujungiant p-acetilaminobenzen-

sulfonilchloridą su semikarbazidu / tiosemikarbazidu arba acetilsufanilhidra-

ziną su izocianatu / izotiocianatu. Semikarbazidas ir izocianatas naudoti,

siekiant gauti sulfanilamidokarbamido darinius, o tiosemikarbazidas ir

izotiocianatas – sulfanilamidotiokarbamido darinius (1.13–1.14 pav.) [228,

229].

S

O

O

NH

CH3

O

Cl

NH2

NH NH2

S

NH

CH3

O

SNH

O

O

NH

S

NH2

1.13 pav. Sulfaniltiokarbamidų gavimo iš tiosemikarbazido reakcija

15

RN S

NH

CH3

OS

NHO

O

NH

S

NHRS NH

O

O

NH2

NH

CH3

O

1.14. pav. Sulfaniltiokarbamidų gavimo iš izotiocianato reakcija

Panašius junginius sintetino ir Niemiec (1944–1950 m.). Skirtingai nuo

Roth ir Degering ji papildomai atliko savo susintetintų junginių deaceti-

linimą, naudojant rūgštinę hidrolizę, aprašė šių junginių priešmikrobines

savybes. Ji įrodė, kad sulfanilamidotiokarbamido dariniai pasižymi 1–10

kartų didesniu aktyvumu prieš Streptococcus viridans nei sulfatiazolas.

Sulfanilamidai – sintetinės priešmikrobinės medžiagos, kurių struktūros

pagrindą sudaro sulfanilamido (-NH-C6H4-SO2-NH-) grupė [4, 13, 79].

Sulfanilamidai – pirmieji priešmikrobiniai vaistai, davę pradžią antibiotikų

revoliucijai medicinoje [38, 93, 123, 137, 270]. Cheminiu požiūriu sulfanil-

amidai yra sulfanilo rūgšties amido (streptocido), kuris gali būti vertinamas

kaip priešbakterinio veikimo farmakoforas, dariniai (1.15 pav.).

NH S

O

O

NH XX

1.15 pav. Bendra sulfanilamidų formulė

Tai bekvapės, baltos spalvos medžiagos, mažai tirpios vandenyje (0,1–5

g/l) ir organiniuose tirpikliuose [107].

Nauji sulfanilamidų dariniai kuriami pakeičiant X įvairių junginių

fragmentais (streptocidas X=H). 4 padėtyje esanti amino grupė yra

atsakinga už priešmikrobinį veikimą, todėl jos vandeniliai nėra keičiami,

išskyrus atvejus, kai organizme radikalas atskyla ir amino grupė

išlaisvinama (pvz. ftalazolis). Papildomų radikalų įvedimas į benzeno žiedą

– sumažina sulfanilamidų aktyvumą [38, 75, 107, 209, 265, 268, 269, 286].

Sulfanilamidų veikimo veikimo spektras labai platus (veikia daugelį

mikroorganizmų, silpniau chlamidijas, grybelius ir pirmuonis), tačiau per

daugelį metų atsirado nemažai jiems atsparių mikrobų padermių [4, 8, 25,

28, 30, 38, 75, 95, 107, 111, 152, 155, 179, 227, 237, 247, 250, 277, 286].

Taip pat sulfanilamidų vartojimas maždaug 3 proc. bendros populiacijos ir

60 proc. pacientų su žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV), gydomų sulfani-

lamidais, sukelia gana daug pašalinių reiškinių. Dažniausiai pasireiškia

padidėjusio jautrumo (alerginės) reakcijos, virškinimo sutrikimai, galvos

16

skausmas [31, 40, 48, 238, 254]. Literatūroje aprašomi tyrimai, kad ilgalai-

kis sulfanilamidų (ypač sulfamerazino ar sulfadimetoksino) vartojimas gali

sukelti onkologinius susirgimus (epitelinio audinio piktybinius navikus)

[105, 135, 163].

Dėl išvardintų priežasčių ir sukurtų aktyvesnių priešmikrobinių vaistų

sulfanilamidų vartojimas mažėja [5, 56, 133, 286]. Tačiau, jie vis dar aktua-

lūs žemės ūkyje ir veterinarijoje – bakterijų sukeltų ligų gydymui, augimo

skatinimui, pašarų kokybės gerinimui ir kt. [27, 46, 47, 79, 141, 151, 231,

243, 256, 283].

Progresuojant priešbakterinių vaistų tyrimams, sukuriama vis daugiau ir

skirtingos cheminės struktūros junginių. Tačiau, peržiūrėjus priešbakterinių

vaistų vartojimo istoriją, negalima nepastebėti, kad sulfanilamidai užėmė

gana svarbią vietą infekcijų gydyme gana ilgą laiką. Tobulėjant biotechno-

logijoms nustatyta, kad sulfanilamidų toksiškumas ir selektyvumas labai

priklauso nuo galimybės konkuruoti su folio rūgštimi [173]. Taigi, viena iš

sulfanilamidų grįžimo į klinikinę praktiką galimybių – toksiškumo mažini-

mas. Naujausiuose moksliniuose darbuose [142, 168, 218, 245], aprašomos

įvairios sintezės reakcijos panaudojant sulfanilamidų fragmentus. Žinant,

kad dėl panašumo į 4-aminobenzoinę rūgštį sulfanilamidai organizme rea-

guoja su folio rūgštimi sudarydami neveiklius junginius, buvo iškelta hipo-

tezė, kad sulfanilamidus sujungus su organizme lengvai metabolizuojamais

junginiais, pvz. aminorūgštimis ar jų acilintais dariniais bus sumažintas jų

toksiškumas ir tuo pačiu, jie išliks svarbiais folio rūgšties antagonistais

(1.16 pav.) [131, 196, 245].

NH2

S

O

O

NH R +N

OR'

NO2

NH

S

O

O

NH R

OR'

NH

O

NO2

1.16 pav. Mažiau toksiškų sulfanilamidų sintezės metodas

Įvertinus šiuo būdu susintetintų junginių toksiškumą, nustatyta, kad

hipotezė, jog sulfanilamidus sujungus su organizme lengvai metabolizuo-

jamais junginiais, sumažės jų toksiškumas, bet išliks priešmikrobinės

savybės pasitvirtino. Gauti junginiai mažai toksiški LD50 = 5,8–6,8 g/kg

kūno svorio. Taip pat ištyrus jų priešmikrobinį aktyvumą, nustatyta, kad

17

susintetinti junginiai yra aktyvūs mažesnėmis nei 5 mg koncentracijomis,

kai tuo tarpu patys sulfanilamidai buvo neaktyvūs.

Dar viena galimybė sulfanilamidams yra jų fragmentų įjungimas į naujų

potencialių priešmikrobinių vaistų struktūrą. Vieni iš tokių yra azoto

heteroatomą turintys heterociklai – pirimidino ir pirazolo dariniai.

Nustačius, kad pirolo, pirazolo ir pirimidino dariniai pasižymi naudingomis

biologinėmis savybėmis [3, 11, 54, 62, 63, 98, 171, 175, 176, 223],

nuspręsta jų fragmentus sujungti su sulfanilamidais, tokiu būdu tikintis

didesnio naujų junginių aktyvumo [82]. Sulfanilamido molekulės amido

grupė sujungiama su tiazolo, chinoksalino ir pirimidino pakaitais, o

aromatinė amino grupė transformuojama į įvairius azoto heteroatomą

turinčius heterociklus (1.17 pav.).

NH2

S OO

NH

R

CH

2

O

Br

NH

S OO

NH

R

O

NN

EtOH NaOEt

N

S OO

NH

R

NH2

CN

N

NH

N

S OO

NH

R

O

HCOOH

1.17 pav. Sulfanilamidų aromatinės amino grupėtokie junginiai pasižymi

geresnėmis priešmikrobinėmis savybėmis nei pradiniai sulfanilamidai.

Taip pat naujausiose publikacijose nagrinėjama galimybė – sulfanilamidų

fragmentų naudojimas, siekiant priešgrybelinio aktyvumo [113, 127, 233].

Tuo tikslu sulfanilamido fragmentas jungiamas su chitozanu [280] - nusta-

tyta, kad priešgrybelinis aktyvumas didėja, didėjant junginio molekulinei

masei; 1,2,3-triazolu [272] – nustatyta, kad gauti junginiai pasižymėjo

priešmikrobinėmis ir priešgrybelinėmis savybėmis, tačiau visiškai neveikė

C. albicans.

Nitrofuranai – sintetinės chemoterapinės medžiagos, kurių struktūros

pagrindą sudaro furano žiedas (1.18 pav.).

ONO

2X

1.18 pav. Bendra nitrofuranų formulė

18

Nitro grupė yra penktoje furano žiedo padėtyje, o antroje padėtyje

prisijungiami įvairūs radikalai. Tai gali būti vinilideno grupė (furaginas),

azometino grupė (nitrofurantoinas, furazolidonas, nitrofuralis) [32, 258].

Nitrofurano dariniai pasižymi priešmikrobiniu aktyvumu, vartojami bakte-

rijų, grybelių ir pirmuonių sukeltoms ligoms gydyti, taip pat kaip antiseptinė

priemonė. Tai plataus spektro preparatai, aktyviai veikiantys prieš gamtei-

giamas ir gramneigiamas bakterijas Escherichia coli, Klebsiella pneumo-

niae, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigela, Campylobacter, Heli-

cobacter, kai kurias Proteus padermes, Enterococcus faecalis, Staphyloco-

ccus aureus, Staphylococcus epidermidis ir k., įskaitant ir salmoneles,

dažnai yra aktyvūs prieš sulfanilamidams ir kitiems antibiotikams atsparias

bakterijų formas [32, 104, 197, 257].

Farmakologinis nitrofuranų aktyvumas priklauso ir nuo jų cheminės

struktūros. Vieni jų daugiau pasižymi kaip priešgrybeliniai, kiti – kaip anti-

protozojiniai, treti – kaip priešbakteriniai preparatai. Pvz., furazolidonas

(šoninėje grandinėje turi oksazolidono fragmentą) veikia gramneigiamus

mikroorganizmus, o nitrofurantoinas (šoninėje grandinėje turi aminohidan-

tiono fragmentą) – šlapimtakių infekcijas (1.19 pav.) [12, 32, 42 68, 84, 87,

88, 136, 159, 239, 262, 279].

O

N

OO

2N N

O

NHN

OO

2N N

O

O

nitrofurantoinasfurazolidonas

1.19 pav. Nitrofuranų atstovai

Žinoma, kad dauguma medicinoje ir veterinarijoje vartojamų nitrofuranų

turi nitrofurilideno fragmentą. Norint gauti biologiškai aktyvų nitrofurano

darinį, nitrofurano žiedas turi būti sujungtas su mažo bazingumo azoto

atomu per etileno grupę [32]. 1944 m. Dodd ir Stillman in vitro tirdami

furanų aktyvumą nustatė, kad priešmikrobiniam veikimui yra būtina nitro

grupė. Redukavus arba pašalinus nitro grupę priešmikrobinis aktyvumas

prarandamas [206]. Lyginant 5-nitrofurano darinių priešbakterinį aktyvumą,

nustatyta, kad junginių turinčių dvigubą jungtį anglis-anglis šoninėje furano

žiedo grandinėje, priešmikrobinis aktyvumas yra didesnis [42, 162, 164,

194]. Taip pat buvo pastebėta, kad į junginių, nepasižyminčių

priešbakterinėmis savybėmis, struktūrą įjungus 5-nitro-2-furil- fragmentą,

19

buvo gaunamas naujas junginys pasižymintis priešmikrobiniu aktyvumu

[32, 42].

Svarbu paminėti, kad rezistentiškumas nitrofuranams vystosi lėtai [32,

262], tačiau literatūroje yra duomenų, kad kai kurios gramneigiamos bak-

terijos, kaip Pseudomonas, Serratia, Enterobacter ir Proteus, taip pat ir

mieliniai grybeliai yra atsparūs nitrofurano dariniams [112]. Iš kitų prieš-

bakterinių preparatų išsiskiria tuo, kad neslopina imuniteto, o jį sustiprina,

didindami fagocitozę ir komplemento titrą [32, 219, 226, 257, 262].

Priežastis dėl kurios daugelis nitrofuranų darinių prarado savo populia-

rumą ir šiandien nebevartojami, yra jų mutageniškumas ir karcinogenišku-

mas [204, 205].

Nepaisant to, pastaruoju metu išaugo susidomėjimas šiais nitrohetero-

cikliniais junginiais, tiriami nauji jų dariniai [33, 49, 80, 274].

Alilaminai ir benzilaminai – naujausios sintetinių priešgrybelinių vaistų

grupės. Šios grupės junginiai yra skiriami vietinėms grybelių, ypač derma-

tofitų, sukeltoms infekcijoms gydyti [10, 50, 73, 274]. Alilaminų ir benzila-

minų grupės vaistai veikia selektyviai slopindami ergosterolio sintezėje

dalyvaujantį fermentą – skvaleno epoksidazę [1, 220, 221, 222]. Skirtingai

nuo azolų, jie neveikia citochromo P450 [10, 73, 85, 100]. Alilaminų, kaip

biologiškai aktyvių junginių, paieška prasidėjo nuo struktūros aktyvumo

ryšio analizės. Modifikuojant pirmojo alillamino – naftifino molekulę (daž-

niausiai keičiant šoninę grandinę), buvo sukurtas antrasis šiuo metu naudo-

jamas alilaminų grupės atstovas – terbinafinas (1.20 pav.) [181].

N

N

Terbinafinas Naftifinas

1.20 pav. Alilaminų atstovai

Tiriant šių junginių aktyvumą prieš mieles, nustatyta, kad aktyvumas

padidinamas į naftaleno žiedą įjungiant halogeno pakaitus (5-chlor, 5-fluor,

5,7,-difluor) arba vietoje naftaleno žiedo įjungiant 3-halogen-7-benzo[b]tio-

20

feną [182]. Intensyviai keičiant šoninę grandinę buvo sukurtos dvi naujos

vaistų grupės: benzilaminai ir homopropargilaminai. Analizuojant strutūros

aktyvumo ryšio tyrimų rezultatus, sukurtas bendras farmakoforinis modelis

visoms paminėtoms junginių grupėms, apibrėžiamas erdve tarp dviejų

lipofilinių fragmentų (L1 ir L2) tam tikru atstumu nutolusių nuo polinio

centro (X) (1.21 pav.) [181].

X

L1 L2

N

1.21 pav. Farmakoforinis alilaminų modelis

Pirminiai struktūros aktyvumo ryšio tyrimai parodė, kad alilamino gru-

pėje esantis azoto atomas nėra būtinas fermento – skvaleno epoksidazės,

inaktyvavimui, tačiau padeda junginiui patekti į grybelio ląstelę. Tuo tikslu

alilamino grupėje esantis azoto atomas buvo pakeistas deguonies, anglies

atomu arba vietoje tretinio amino panaudotas antrinis aminas. Tyrimo rezul-

tatai parodė, kad šie junginiai buvo aktyvesni nei terbinafinas ir naftifinas

[70, 183]. Šiuo metu siekiama nustatyti, ar polinis centras privalo būti tarp

dviejų lipofilinių fragmentų, ar gali būti viename iš jų. Analizuojant įvairių

polinių grupių įtaką, nustatyta, kad norint išlaikyti priešgrybelinį aktyvumą,

nesumažinant patekimo į ląstelę galimybės, pakaitai (išskyrus fluorą) gali

būti įvesti tik į 5-ą naftaleno ciklo padėtį. [181]

Apžvelgus literatūros šaltinius, nusprendėme sintezuoti 4-tiazolidinono

darinius, jų struktūrą papildant šiuo metu naudojamų priešmikrobinių

medžiagų fragmentais:

sulfanilamidai – šie junginiai vis mažiau vartojami dėl jų toksiškumo ir išsivysčiusių atsparių bakterijų padermių bei pašalinių reakcijų [8].

Tačiau įjungus sulfanilamidų fragmentus į naujų potencialių prieš-

21

mikrobinių vaistų struktūrą, pastebimas didesnis jų priemikrobnis

aktyvumas lyginant su pradiniais sulfanilamidais, taip pat išryškėja

priešgrybelinis poveikis [113, 127, 233];

nitrofuranai – šių fragmentų įjungimo į 5-tiazolidinono ciklo padėtį racionalumas įrodytas ankstesniuose moksliniuose darbuose. Taip

pat yra žinoma, kad 7 proc. priešgrybelinėmis savybėmis

pasižyminčių junginių struktūroje turi furano ar nitrofurano ciklą

[32, 126, 195, 242];

alilaminai ir benzilaminai – naujausios priešgrybelinių vaistų grupės, todėl buvo įdomu, šiuo farmakoforus įjungti į molekulę, kartu su jau

anksčiau naudojamų, priešmikrobinėmis savybėmis pasižyminčių,

junginių fragmentais [10, 50, 73, 195].

22

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

Tyrimų objektas – susintetinti nauji 4-tiazolidinono dariniai, turintys

sulfanilamido, alilamino ar nitrofurano farmakoforus.

Tyrimo metodika

Naudotos medžiagos ir tirpikliai

2,6-dichlorbenzaldehidas (99 proc.), 2-fluorbenzaldehidas (97 proc.), 2-

hidroksi-5-nitrobenzaldehidas (98 proc.), 2-hidroksibenzaldehidas (≥98 proc.),

4-(dimetilamino)benzaldehidas (99 proc.), 4-brombenzaldehidas (99 proc.),

4-chlorbenzaldehidas (97 proc.), 4-fluorbenzaldehidas (98 proc.), 4-hidrok-

sibenzaldehidas (98 proc.), 4-nitrobenzaldehidas (98 proc.), 5-nitrofurfuro-

las (99 proc.), furfurolas (99 proc.), 5-nitrofurilakrpleinas (99 proc.), 3-

aminorodaninas (99 proc.), benzilaminas (99 proc.), aktyvuota anglis, kalio

acetatas (≥99 proc.), bromacto rūgšties metilo esteris (97 proc.),

alilizotiocianatas (95 proc.), amonio acetatas (≥98 proc.), hidrazino hidratas

(78–82 proc.), jodmetanas (≥99 proc.), monochloracto rūgštis (≥99 proc.),

rodaninas (97 proc.), sulfametizolis (≥99 proc.), sulfanilamidas (≥99 proc.),

sulfisomidinas (≥99 proc.), 2-propanolis (99,5 proc.), acetonitrilas

(≥99,9 proc.), acetonas (≥99,8 proc.), benzenas, butanolis (99,8 proc.),

dioksanas (99,8 proc.), DMF, dimetilsulfoksidas (≥99,5 proc.),

dimetilsulfoksidas-d6, anglies tetrachloridas ( ≥99,5 proc.), dietilo eteris

(≥99 proc.), heksanas (95 proc.), ledinė acto rūgštis (≥99,7 proc.), metanolis

(≥99.9 proc.), n-butanolis (≥99,9 proc.), n-propanolis (99,7 proc.) įsigyti iš

„Sigma-Aldrich GmbH“ (Buchs, Šveicarija), sulfadimidinas, sulfafurazolas,

sulfametoksipiridazinas, sulfamoksolis, sulfapiridinas (≥99 proc.),

sulfatiazolas (≥98 proc.) iš „Fluka Chemie“ (Buchs, Šveicarija), etanolis

(96,3 proc.) iš „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva). Visi naudoti tirpikliai yra

ESC analitinio švarumo. Ultragrynas vanduo ruošiamas „Millipore“ (JAV)

vandens valymo sistema.

Naujų junginių sintezės metodika. Junginiai susintetinti Lietuvos

sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Vaistų chemijos kated-

roje.

1) Nauji 4-tiazolidinono dariniai su sulfanilamido ir alilamino far-

makoforais susintetinti ciklokondensacijos metodu, paremtu α-halo-

genkarboksirūgščių sąveika su N,S-nukleofilais [2, 29, 55, 139, 140,

169, 172, 228, 229].

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=281549|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC

23

1-{4-[(4,6-dimetilpirimidin-2-il)sulfamoil]fenil}-3-(2-propen-1-il)tiokar-

bamidas (ZAT-1-1), 3-(2-propen-1-il)-1-{4-[(1,3-tiazol-2-il)sulfamoil]fe-

nil}tiokarbamidas (ZAT-1-2), 3-(2-propen-1-il)-1-(4-sulfamoilfenil)tiokar-

bamidas (ZAT-1-3), 1-{4-[(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)sulfamoil]fenil}-3-

(2-propen-1-il)tiokarbamidas (ZAT-1-4) (2.1 pav.).

0,01 mol atitinkamo sulfanilamido (sulfadimidino, sulfatiazolo, sulfanila-

mido, sulfametizolio) sumaišomas su 0,02 mol alilizotiocianato ir 10 ml

(ZAT-1-1, ZAT-1-2) arba 20 ml etanolio (ZAT-1-3, ZAT-1-4). Mišinys

kaitinamas glicerolio vonioje su grįžtamu šaldytuvu, 80 °C temperatūroje,

3–5 val. Reakcijos mišinys vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę

balti kristalai brandinami 15–20 min kambario temperatūroje, filtruojami,

plaunami etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario temperatūroje. Gautas

produktas perkristalinamas: ZAT-1-1 iš 2-propanolio, ZAT-1-2 - iš etanolio

ir DMF mišinio (1:1), ZAT-1-3 – etanolio, ZAT-1-4 - ledinės acto rūgšties.

ZAT-1-1 R=

S

N

N N

S

ZAT-1-2 R=

ZAT-1-3 R= -H

ZAT-1-4 R=

NC

S

R S

O

O

NH NH2

NH S

O

O

NH RNH

S

N

N

2.1 pav. Tarpinių (1-alil-3-sulfanilamidotiokarbamido darinių)

junginių sintezė

N-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-4-{[4-okso-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-

2-iliden]amino}benzen-1-sulfonamidas (ZAT-2-1), 4-{[4-okso-3-(2-propen-

1-il)-1,3-tiazolidin-2-iliden]amino}-N-(1,3-tiazol-2-il)benzen-1-

sulfonamidas (ZAT-2-2), 4-{[4-okso-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-2-iliden]-

amino}benzen-1-sulfonamidas (ZAT-2-3), N-(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-

4-{[4-okso-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-2-iliden]amino}benzen-1-sulfona-

midas (ZAT-2-4) (2.2 pav.).

24

2,5 ml ledinės acto rūgšties ištirpinamas 0,01 mol atitinkamo 1-alil-3-

sulfanilamidotiokarbamido darinio, maišant pridedamas 0,01 mol mono-

chloracto rūgšties ir 0,01 mol amonio acetato. Mišinys kaitinamas glicerolio

vonioje su grįžtamu šaldytuvu, 78–80 °C temperatūroje, 2,5–3 val. Karštas

tirpalas filtruojamas ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros. Susi-

darę kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami

kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš ledinės acto

rūgšties.

Cl

O

OH

ZAT-2-1 R=

N

N

S

N

N N

S

CH3COONH4 ZAT-2-2 R=

ZAT-2-3 R= -H

ZAT-2-4 R=

N

S

O

N S

O

O

NH R

NH S

O

O

NH RNH

S

2.2 pav. Naujų 4-tiazolidinono darinių su sulfanilamido

ir alilamino farmakoforais sintezė

2) Nauji 5-pakeisti 4-tiazolidinono dariniai su sulfanilamido farma-

koforu sintetinti Knoevenagel‘io metodu, paremtu oksojunginių

sąveika su 5-je 4-tiazolidinono ciklo padėtyje esančia metileno

grupe, katalizuojant natrio acetatui, esant acto rūgščiai [76, 140, 148,

259]. Pradiniu junginiu reakcijoje naudotas – 2-metilrodaninas

susintetintas pagal Tarasevičiaus metodiką [249]. Sulfanilamido

fragmentas įjungtas amininimo reakcijos metu [195, 241, 249].

2-metilrodanino sintezė. 1 mol kalio susmulkinamas ir mažais kiekiais

dedamas į maišomą ir šaldomą metanolį, gaunant kalio metilatą. 1 mol

rodanino sumaišomas su 2 litrais eterio ir maišant į jį lašinamas kalio

metilatas. Sulašinus, mišinys dar maišomas apie 30 min., kol pastebimas

spalvos pasikeitimas iš geltonos į rusvai gelsvą. Nuosėdos filtruojamos,

plaunamos vandeniu ir metanoliu. Acetono ir trichlormetano mišinyje (1:1)

25

šildant ištirpinami 0,25 mol rodanino kalio druskos. Mišinys atvėsinamas iki

3 °C vonelėje su ledu ir lėtai sulašinami 0,35 mol jodmetano. Mišinio

temperatūra pakyla iki 7 °C, maišoma dar apie 50–60 min, po to įberiama 20

g aktyvuotos anglies miltelių (reakcijos skilimo produktų absorbcijai),

100 ml chloroformo ir intensyviai maišoma 5 min. Nufiltruojama naudojant

vakuuminį filtrą. Gautas filtratas yra raudonai rusvos spalvos. Naudojant

vakuuminio distiliavimo aparatūrą, nudistiliuojamas acetonas, chloroformas

ir jodmetano perteklius. Distiliacija atliekama 60 °C temperatūroje. Po

distiliavimo gaunamas aliejaus konsistencijos tamsiai raudonos spalvos

tirpalas, kuris vėliau išsikristalina. Ant kristalų užpilama 50 ml atšaldyto

etanolio ir gauta suspensija filtruojama per stiklinį filtrą, praplaunama 30 ml

etanolio, 50 ml anglies tetrachlorido. Gauti kristalai perkeliami į Petri

lėkštelę ir džiovinami kambario temperatūroje. Gautas 2-metilrodaninas

perkristalinamas iš anglies tetrachlorido santykiu 1:10 (2.3 pav.).

+ CH3I+ KI

rodanino kalio druska 2-metilrodaninas

N

SSK

ON

SS

O

2.3 pav. 2-metilrodanino sintezė

5-pakeisti-2-metilrodanino dariniai. 0,04 mol 2-metilrodanino, 0,05 mol

atitinkamo aldehido (4-fluorbenzaldehido, 2-fluorbenzaldehido, 4-hidroksi-

benzaldehido, 4-chlorbenzaldehido, 4-brombenzaldehido, 4-nitrobenzalde-

hido, 2,6-dichlorbenzaldehido, 5-nitrofurfurolo), 0,005 mol amonio acetato

ištirpinami 30 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje

5-20 min, susidariusios nuosėdos filtruojamos, plaunamos vandeniu,

etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario temperatūroje. Gauti produktai

perkristalinami iš acetono (2.4 pav.).

26

MZ-18TIP-201

MZ-28MZ-20

MZ-21

MZ-27

MZ-24MZ-25

F

N

S

O

S

OH

N

S

O

S

Cl

N

S

O

S

2-metilrodaninas

O

NO2

OH

O2N

O

H

O

H

Cl

Cl

Br

O

H

Cl

O

H

O

H

OH

F

O

H

O

H

F

N

SS

O

Br

N

S

O

S

ClCl

N

S

O

S

F

N

SS

O

O

N

S

O

O2N

S

NO2

N

S

O

S

2.4 pav. 5-pakeistų-2-metilrodaninų sintezė

N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)-4-{[5-[(2-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-di-

hidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (MA-2), 4-{[5-[(2-fluor-

fenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(piridin-2-

il)benzen-1-sulfonamidas (MA-4), 4-{[5-[(2-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-

dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(6-metoksipiridazin-3-il)benzen-1-sulfona-

midas (MA-7), N-(2,6-dimetilpirimidin-4-il)-4-{[5-[(2-fluorofenil)metiliden]-

4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (MA-8) (2.5

pav.).

0,003 mol MZ-28, 0,004–0,005 mol atitinkamo sulfanilamido (sulfamok-

solio, sulfapiridino, sulfametoksipiridazino, sulfisomidino), ištirpinami 10–

40 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 3 val (MA-

8) arba 6 val (MA-2, MA-4) arba 24 val (MA-7), susidariusios nuosėdos

filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario

temperatūroje. Gauti produktai perkristalinami iš ledinės acto rūgšties.

27

MZ-28

MA-2

MA-4

MA-7

MA-8

N

O

N

S

O

NH

SNH

O

O

F

NN

S

O

NH

SNH

O

O

F

N

N

N

S

O

NH

SNH

O

O

F

NN

N

S

O

NH

SNH

O

O

F

O

S

N

S

O

F

N

O

NH2

S

O

O

NH

N

NH2

S

O

O

NH

N N O

NH2

S

O

O

NH

N

N

NH2

S

O

NH

2.5 pav. Junginių MA-2, MA-4, MA-7, MA-8 sintezė

4-{[5-[(2,6-dichlorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]ami-

no}-N-(piridin-2-il)benzen-1-sulfonamidas (2.6 pav.).

0,003 mol MZ-20, 0,005 mol sulfapiridino, ištirpinami 10 ml ledinės

acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 4 val, susidariusios nuo-

sėdos filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos


rūgšties.

MZ-20

N

NH2

S

O

ONH

MA-17

NN

S

O

NH

SNH

O

O

Cl

Cl

S

N

S

O

Cl

Cl

2.6 pav. Junginio MA-17 sintezė

N-(dimeti-1,2-oksazol-5-il)-4-{[5-[(4-hidroxifenil)metiliden]-4-okso-4,5-

dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (2.7 pav.).

0,003 mol MZ-25, 0,004 mol sulfafurazolo, ištirpinami 30 ml ledinės

acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 3 val, susidariusios nuosė-

dos filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos

28


rūgšties.

MZ-25

NO

NH2

S

O

ONH

MA-30

OH

NO

N

S

O

NH

SNH

O

O

OH

S

N

S

O


4-({5-[(4-chlorfenil)metil]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il}amino)-N-

(dimetil-1,3-oksazol-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-32), 4-{[5-[(4-chlor-

fenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(dimetil-1,3-

oksazol-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-37) (2.8 pav.)

0,003 mol MZ-24, 0,004 mol sulfamoksolio (MA-32) arba sulfame-

toksipiridazino (MA-37), ištirpinami 10 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys

šildomas glicerolio vonioje 3 val, susidariusios nuosėdos filtruojamos, plau-

namos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario temperatūroje.

Gautas produktas perkristalinamas iš ledinės acto rūgšties.

MZ-24

MA-32MA-37

N N

NH2 S

O

ONH

O

N

O

NH2

S

O

ONH

N

S

O

SCl

Cl

N N

O

N

S

O

NH

SNH

O

O

Cl

N

O

N

S

O

NH

SNH

O

O

2.8 pav. Junginių MA-32 ir MA-37 sintezė

N-(6-metoksipiridazin-3-il)-4-{[5-[(4-nitrofenil)metiliden]-4-okso-4,5-

dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (2.9 pav.)

29

0,003 mol MZ-18, 0,005 mol sulfametoksipiridazino, ištirpinami 30 ml

dioksano. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 3 val, susidariusios nuosėdos

filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario

temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš dioksano.

N N

NH2

S

O

ONH

O

MA-45

NO2

N

SS

O N N

ONH

SNH

O

O

NO2

N

S

O

MZ-18


4-{[5-[(4-bromfenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino} -

N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-50), 4-{[5-[(4-brom-

fenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-thiazol-2-il]amino}-N-(2,6-dimetil-

pirimidin-4-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-52), 4-{[5-[(4-bromofenil)me-

tiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(pyridin-2-il)benzen-1-

sulfonamidas (MA-56) (2.10 pav.).

0,003 mol MZ-21, 0,0045 mol atitinkamo sulfanilamido (sulfamoksolio,

sulfisomidino, sulfapiridino), ištirpinami 10–15 ml ledinės acto rūgšties.

Mišinys šildomas glicerolio vonioje 4 val, susidariusios nuosėdos filtruoja-

mos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario tempe-

ratūroje. Gauti produktai perkristalinami iš ledinės acto rūgšties.

30

MZ-21

MA-50

MA-52

MA-56

BrS

N

S

O

Br

N

N

NH

SNH

O

ON

S

O

N

O

NH2

S

O

O

NH

N

NH2

S

O

O NH

N

N

NH2

SO O

NH

Br

N

NH

SNH

O

ON

S

O

Br

N

ONH

S

NHO

ON

S

O

2.10 pav. Junginių MA-50, MA-52, MA-56 sintezė

N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)-4-{[5-[(4-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-

dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (MA-58), N-(2,6-dimetil-

pirimidin-4-il)-4-{[5-[(4-fluorofenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-

il]amino}benzen-1-sulfonamidas (MA-60), 4-{[5-[(4-fluorfenil) metiliden]-4-

okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(6-metoksipridazin-3-il)benzen-1-

sulfonamidas (MA-63), 4-{[5-[(4-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-

tiazol-2-il]amino}-N-(pyridin-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-64) (2.11 pav.).

0,003 mol MZ-27, 0,003–0,0045 mol atitinkamo sulfanilamido (sulfa-

moksolio, sulfisomidino, sulfametoksipiridazino, sulfapiridino), ištirpinami

10–40 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 4 val,

susidariusios nuosėdos filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir

džiovinamos kambario temperatūroje. Gauti produktai perkristalinami iš

ledinės acto rūgšties.

31

MZ-27

MA-58

MA-60

MA-63

MA-64

N

NH2

S

O

ONH

N N

NH2

S

O

O

NHO

N

N

NH2

S

O

O

NH

O

N

NH2

S

O

O

NH

F

N

N

NH

SNH

O

ON

S

O

F

N

NH

SNH

O

ON

S

O

F

N N

NH

SNH

O

ON

S

O

O

F

N

ONH

SNH

O

ON

S

O

F

N

S

O

S

2.11 pav. Junginių MA-58, MA-60, MA-63, MA-64 sintezė

N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)-4-{[5-[(5-Nitro-2-furil)metiliden]-4-okso-

4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (2.12 pav.)

0,003 mol TIP-201, 0,004 mol sulfamoksolio, ištirpinami 25 ml ledinės

acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 4 val, susidariusios nuo-

sėdos filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos


rūgšties.

TIP-201

N

ONH

2S

O

ONH

MA-66

S

N

S

O

O

NO2

O

NO2

O

N

NH

SNH

O

ON

S

O


32

3) Nauji 5-pakeisti 4-tiazolidinono dariniai su benzilamino

farmakoforu susintetinti vieno etapo metodu, paremtu aldehido,

tiokarbamido ir α-halogenkarboksirūgšties druskos sąveika [2, 16,

24, 139, 165, 169, 172]

2-(benzilimino)-5-{[4-(dimetilamino)fenil]metiliden}-3-(2-propen-1-il)-1,3-

tiazolidin-4-onas (LCD-1-4), 2-(benzilimino)-5-[(2-hidroksifenil) metiliden]-3-

(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (LCD-1-6), 2-(benzilimino)-5-[(2-hidrok-

si-5-nitrofenil)metiliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (LCD-1-13)

(2.13 pav.).

5 ml ledinės acto rūgšties ištirpinamas 0,01 mol 1-alil-3-benziltiokar-

bamido, 0,02 mol monochloracto rūgšties, 0,03 mol bevandenio kalio

acetato ir 0,01 mol 4-(dimetilamino)benzaldehido (LCD-1-4) arba 0,01 mol

2-hidroksibenzaldehido (LCD-1-6) arba 0,01 mol 2-hidroksi-5-nitrobenzal-

dehido (LCD-1-13). Mišinys kaitinamas glicerolio vonioje su grįžtamuoju

šaldytuvu, 78–80 °C temperatūroje, 1,5–2 val. Karštas tirpalas filtruojamas

ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę geltoni kristalai

filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario

temperatūroje. Gauti produktai perkristalinami iš ledinės acto rūgšties.

Cl

O

OH

LCD-1-4 R=

CH3COOK LCD-1-6 R=

LCD-1-13 R=

NH

S

NH

R-CO

H

N

OH

OH

NO2

RN

N

S

O

2.13 pav. 5-pakeistų 4-tiazolidinono darinių, turinčių farmakoforu sintezė

33

4) Nauji 4-tiazolidinono dariniai su nitrofurano ir alilamino far-

makoforais sintetinti ciklokondensacijos metodu, paremtu α-halo-

genkarboksirūgščių sąveika su tiosemikarbazidais [2, 140, 165].

4-aliltiosemikarbazido sintezė. Į 2 mol hidrazino hidrato tirpalo 200 ml

etanolio, kuris šaldomas ir maišomas su mechanine maišykle iš lėto

sulašinami 2 mol alilizotiocianato sumaišyto su 100 ml etanolio. Reakcijos

temperatūra 0–5 °C. Po kurio laiko susidaro baltos spalvos suspensija ir

pradeda kristi gausios baltos spalvos nuosėdos, kurios filtruojamos,

plaunamos etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario temperatūroje. Gautas

produktas perkristalinamas iš etanolio (2.14 pav.).

NS + NH2 NH2 NH NH

NH2

S

2.14 pav. 4-aliltiosemikarbazido sintezė

1-[(2-furilmetiliden)amino]-3-(2-propen-1-il)tiokarbamidas (LF-1), 1-[[(5-

nitro-2-furil)metiliden]amino]-3-(2-propen-1-il)tiokarbamidas (LF-2), 1-[[3-

(5-nitro-2-furil)-2-propen-1-iliden]amino]-3-(2-propen-1-il)tiokarbamidas

(LF-3) (2.15 pav.).

0,01 mol 4-aliltiosemikarbazido šildant ir maišant su magnetine maišykle

ištirpinamas 50 ml etanolio. Į šį tirpalą lėtai sulašinama 0,11 mol šviežiai

distiliuoto furfurolo (LF-1) arba 0,125 mol 5-nitro-furfurolo, ištirpinto 100 ml

verdančio etanolio (LF-2) arba 0,125 mol 5-nitrofurilakroleino (LF-3). Spalva

palaipsnui pereina į rausvą, o vėliau į raudoną. Virinama apie 30 min. ir

paliekama ataušti. Vėstant išsikristalina geltonos (LF-1 ir LF-2) arba tamsiai

raudonos (LF-3) spalvos kristalai. Filtruojama, plaunama eteriu ir džiovinama.

NH NH

NH2

S

LF-1

LF-2

LF-3

O O

H

O O

H

O2N

OO

2N O

ON

NH NH

S

O2N

ON

NH NH

S

NNH NH

OO

2N

2.15 pav. Semikarbazonų sintezė

34

2-[2-(2-furilmetyliden)hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-

4-nas (2.16 pav.).

0,01 mol LF-1, 0,02 mol bromacto rūgšties metilo esterio ir 0,03 mol

bevandenio kalio acetato ištirpinti 5 ml metanolio. Mišinys virinamas su

grįžtamuoju šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5–2 val. Karštas tirpalas filt-

ruojamas ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę geltoni

kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami kam-

bario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš heksano, gaunant

gelsvus kristalus.

5-(2-furilmetiliden)-2-[2-(2-furilmetiliden)hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-

1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (2.16 pav.)

0,01 mol LF-1, 0,02 mol monochloracto rūgšties, 0,03 mol bevandenio

kalio acetato ištirpinami 10 ml metanolio. Mišinys virinamas su grįžtamuoju

šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5-2 val, kol tirpalo spalva tampa rausva.

Tuomet įpilama 0,01 mol šviežiai distiliuoto furfurolo ir virinama dar 1-1,5

val., kol tirpalo spalva pakinta į geltoną, o vėliau į rausvą. Karštas tirpalas

filtruojamas ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę

geltoni kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovi-

nami kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš heksa-

no, gaunant geltonus kristalus.

2-[2(2-furilmetiliden)hidrazin-1-iliden]-5-[(5-nitro-2-furil)metiliden]-3-(2-

propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (LCF-1-3), 2-[2-(2-furilmetiliden)hidra-

zin-1-iliden]-5-[3-(5-nitro2-furil)-2-propen-1-iliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-

tiazolidin-4-onas (LCF-1-4) (Pav.2.16)

0,01 mol LF-1, 0,02 mol bromacto rūgšties metilo esterio, 0,03 mol

bevandenio kalio acetato ištirpinami 5 ml metanolio. Mišinys virinamas su

grįžtamuoju šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5–2 val, kol tirpalo spalva tampa

rausva. Tuomet įpilama 0,02 mol 5-nitrofurfurolo (LCF-1-3) arba 5-

nitrofurilakroleino (LCF-1-4). Tirpalas akimirksniu pradeda ruduoti ir

tampa juodos spalvos. Mišinys dar kaitinamas 15 min 55–65 °C tempe-

ratūroje. Karštas tirpalas filtruojamas ir filtratas vėsinamas iki kambario

temperatūros, susidarę rudi kristalai filtruojami, plaunami vandeniu,

etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario temperatūroje. Gautas produktas

perkristalinamas iš 2-propanolio, gaunant rudus kristalus.

35

LF-1

O O

H

O2N

OO

2N O

BrCH2COOCH3CH3COOK

CH3OH

ClCH2COOH

CH3COOK

CH3OH

LCF-1-1

O O

H

LCF-1-3 LCF-1-4

ON

NH NH

S

O

N

S

O

NN

O

N

S

O

NN

LCF-1-1

O O

N

S

O

NN

LCF-1-2

O O

N

S

O

NN

O2N OO

2N

O

N

S

O

NN

2.16 pav. Junginių LCF-1-1 – LCF-1-4 sintezė

2-[2-[(5-nitro-2-furil)metiliden]hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-

tiazolidin-4-onas (2.17 pav.).

0,01 mol LF-2 sumaišoma su 0,03 mol bevandenio kalio acetato ir

šildant ištirpinama 30 ml n-propanolio, vėliau sulašinama 0,02 mol bro-

macto rūgšties metilo esterio ir mišinys virinamas su grįžtamuoju šaldytuvu

glicerolio vonioje 1,5–2 val Karštas tirpalas filtruojamas ir filtratas vėsina-

mas iki kambario temperatūros, susidarę rudi kristalai filtruojami, plaunami

vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario temperatūroje. Gautas

produktas perkristalinamas iš n-propanolio arba ledinės acto rūgšties,

gaunant tamsiai raudonus kristalus.

5-(2-furilmetiliden)-2-[2-[(5-nitro-2-furil)metiliden] hidrazin-1-iliden]-3-(2-

propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (2.17 pav.)

0,01 mol LF-2, 0,02 mol bromacto rūgšties metilo esterio, 0,03 mol

bevandenio kalio acetato ištirpinami 30 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys

virinamas su grįžtamuoju šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5-2 val, kol tirpalo

spalva tampa rausva. Tuomet įpilama 0,02 mol furfurolo ir virinama dar 1-

1,5 val, kol tirpalo spalva pakinta į tamsiai rudą. Karštas tirpalas filtruo-

36

jamas ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę geltoni

kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami kam-

bario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš n-propanolio,

gaunant geltonus kristalus.

LF-2BrCH2COOCH3CH3COOK

C3H7OH

LCF-2-1

O O

H

LCF-2-2

LCF-2-1

BrCH2COOCH3CH3COOK

CH3COOH

ON

NH NH

S

O2N

O

N

S

O

NN

NO2

O

N

S

O

NN

NO2

OO

N

S

O

NN

NO2

2.17 pav. Junginių LCF-2-1 – LCF-2-2 sintezė

2-[2-[3-(5-nitro-2-furil)-2-propen-1-iliden]hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-

1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (2.18 pav.).

0,01 mol LF-3, 0,02 mol monochloracto rūgšties ir 0,03 mol bevandenio

kalio acetato ištirpinti 30 ml n-butanolio. Mišinys virinamas su grįžtamuoju

šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5–2 val Karštas tirpalas filtruojamas ir filtra-

tas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę rudi kristalai filtruojami,

plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario temperatūroje.

Gautas produktas perkristalinamas iš n-propanolio, gaunant rudai rausvus

kristalus.

37

ClCH2COOH

CH3COOK

C4H9OH

LCF-3-1LF-3

NNH NH

SOO

2N

ONO

2

N

S

O

NN

2.18 pav. Junginio LCF-3-1 sintezė

5) Nauji 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono (3-aminorodanino)

dariniai sintetinti aldolinės kondensacijos metodu, paremtu

oksojunginių sąveika su pirmine amino grupe [61, 76, 140, 148,

259].

3-[[(4-fluorfenil)metiliden]amino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas

(L-1), 3-[[(2-fluorfenil)metiliden]amino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas

(L-2) (2.19 pav.).

0,01 mol 3-aminorodanino ištirpinamas 75 ml metanolio. Į tirpalą šildant

glicerolio vonioje su grįžtamuoju šaldytuvu, 78–80 °C temperatūroje pa-

laipsniui sulašinama 0,011 mol 4-fluorbenzaldehido (L-1) arba 2-fluorben-

zaldehido (L-2). Tirpalo spalvai patamsėjus, mišinys šildomas dar keletą

minučių ir paliekamas atvėsti iki kambario temperatūros. Susidarę geltoni

kristalai filtruojami, plaunami etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario

temperatūroje. Gauti produktai perkristalinami iš etanolio.

S

N

S

O NH2

F

O

H

O

H

F

S

N

S

O N F

S

N

S

O N

F

3-aminorodaninas

L-1

L-2

2.19 pav. 3-aminorodanino darinių, turinčių fluorbenzeno fragmentą sintezė

38

Susintetintų junginių elementinės sudėties ir lydymosi temperatūros

nustatymas.

1) Elementinės sudėties nustatymas. Įvertinant junginių elementinę sudėtį, nustatytas azoto ir sieros kiekis junginyje procentais. Šis kiekis

palygintas su teoriškai apskaičiuotu kiekiu. Dėl rezultatų patikimumo

bandymai kartoti 3 kartus ir išvestas aritmetinis vidurkis.

Elementinė azoto analizė atlikta Kjeldalio metodu panaudojant

analizatorių Gerhardt Vapodest 20 (Gerhardt Fabrik und Lager chemischer

Apparate GmbH & Co. KG, Vokietija).

Grūstuvėje sutrinta 1 katalitinė tabletė (5,3 g), sumaišyta su 100 mg

tiksliai pasvertos analizuojamos medžiagos ir mineralizacijos kolboje su-

maišyta su 7 ml koncentruotos sieros rūgšties. Pradžioje atliekamas 15 mi-

nučių džiovinimas 250 °C temperatūroje, vėliau 1 val trukmės minera-

lizacija 410 °C temperatūroje. Mineralizatą atšaldžius iki kambario tempe-

ratūros, įpilama 70 ml 40 proc. natrio šarmo tirpalo ir distiliuojama vandens

garais. Distiliatas surenkamas į atskirą indą su 50 ml 3 proc. boro rūgšties

tirpalu, įlašinami 3 lašai indikatoriaus Kongo rauda ir titruojama 0,1 N

sieros rūgštimi, kol tirpalo spalva pakinta į violetinę. Apskaičiuojamas

procentinis azoto kiekis:

Elementinė sieros analizė atlikta Šionigerio metodu.

Pirmiausia pagaminamas bario chlorato tirpalas. Analitinėmis svarstyk-

lėmis atsveriama 0,9868 g bario karbonato, išdžiovinto 105 °C ir supilama į

1l matavimo kolbą. Į kolbą įlašinami 1,3 ml 57 proc. perchlorato rūgšties

(ρ = 1,500 g/ml) ir įpilama 20 ml distiliuoto vandens. Kolbos turinys maišo-

mas, kol ištirpsta bario karbonatas. Įlašinami dar 5 lašai perchlorato rūgšties,

įpilama 80 ml distiliuoto vandens, ir tirpalas praskiedžiamas etanoliu iki 1 l

žymės. Tirpalo pH~ 3.

Toliau atliekamas sieros kiekio nustatymas. Ant specialios formos

bepelenio filtro analitinėmis svarstyklėmis pasveriamas tikslus kiekis

analizuojamos medžiagos (apie 0,003–0,005 g). Filtras su tiriama medžiaga

sulankstomas ir sudeginamas ant platininės vielos deguonies pripildytoje

kolboje. Kolbos turinys (4 ml distiliuoto vandens ir 4 lašai perhidrolio)

plakamas apie 20–30 min, kol išsisklaido kolboje susidaręs rūkas. Kolbos

sienelės ir platinos vielos tinklelis praplaunami 16 ml acetono. Tirpalas

titruojamas 0,005 M bario chlorato tirpalu, įlašinus 3 lašus 0,2 proc. vande-

ninio torino tirpalo ir 2 lašus 0,0125 proc. vandeninio metileno mėlio tirpa-

39

lo. Titruojama, kol tirpalo spalva iš žalios pasikeičia į rožinę. Apskaičiuo-

jamas procentinis sieros kiekis:

Kur n – sieros atomų skaičius junginio molekulėje, M – bario chlorato

molinė koncentracija, V – titravimui sunaudotas bario chlorato tirpalo kiekis

(ml), F – faktorius (nustatomas bario chloratu titruojant 1 ml 0,02 N sieros

rūgšties sumaišytą su 1 ml vandens ir 8 ml acetono, pridėjus 3 lašus 0,2

proc. vandeninio torino tirpalo ir 2 lašus 0,0125 proc. vandeninio metileno

mėlio tirpalo), a – atsvertas tiriamojo junginio kiekis (mg).

2) Lydymosi temperatūros nustatymas atliktas Koflerio lydymosi tem-peratūros nustatymo aparatu su mikroskopu (Reichert-Jung Optische

Werke Ag, Austrija) ir yra nekoreguotos. Nedidelis kiekis medžiagos

uždedamas ant objektyvinio stiklelio, kuris prieš tai nuvalomas ace-

tonu ir išdžiovinamas. Ant jo dedamas kitas nuvalytas ir išdžiovintas

stiklelis. Stikleliai suspaudžiami ir medžiaga sutrinama, kad neliktų

stambių kristalų. Mėginys patalpinamas ant objektyvinio stalelio,

kuris yra šildomas kaitinimo elementu. Į objektyvinį stalelį įstatomas

termometras, kuriuo fiksuojama temperatūra. Medžiagos pokyčiai

stebimi pro okuliarą. Lydymosi pradžia fiksuojama tuomet, kai pasi-

rodo pirmasis apskritas lašas, o pabaiga – kai išsilydo visi kristaliu-

kai. Dėl rezultatų patikimumo bandymas kartojamas 3 kartus ir išve-

damas aritmetinis vidurkis. Bandymo paklaida negali viršyti ± 0,5 °C.

Susintetintų junginių struktūros įrodymas spektriniais analizės

metodais.

1HBMR spektrai užrašyti Vilniaus universiteto Organinės chemijos

katedroje, 300 MHz dažnio spektrometru Varian Unity Inova (Agilent

technologies, JAV). Pavyzdžiai ruošiami, tirpinant analizuojamą medžiagą

(0,01–0,02 g) DMSO-d6. Tirpalas įpilamas į ploną (5×150 mm) cilindro

formos ampulę, kuri dedama į stiprų magnetinį lauką. Spektras registruo-

jamas apie 1 min. Nustatytos cheminių poslinkių reikšmės pateikiamos

skalėje [167].

IR spektrai užrašyti UAB „Aconitum“, spektrometru Spektrum 100 FT-

IR („PerkinElmer“, JAV). Bandomoji medžiaga preso pagalba suspau-

džiama ir užrašomas spektras. Nustatomi absorbcijos juostų bangos skaičiai

būdingi tam tikroms atomų grupėms [167].

40

Susintetintų junginių grynumo įvertinimas. Junginių grynumas įver-

tintas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos

Analizinės ir toksikologinės chemijos ir Vaistų chemijos katedrose.

Plonasluoksnės chromatografijos metodu [166, 287]. Chromatografija

atlikta kylančiuoju metodu, stiklinėje kameroje, kurios matmenys 10×20×20

cm, panaudojant silikageliu dengtas chromatografines plokšteles „Merck-

254“ (Merck, JAV), kurių matmenys 20×20 cm2. Naudotos tirpiklių sistemos:

A. chloroformas : ledinė acto rūgštis = 19 : 1

B. chloroformas : ledinė acto rūgštis = 9 : 1

C. butanolis : etanolis : vanduo : amoniakas = 20 : 10 : 10 : 3

D. benzenas : ledinė acto rūgštis = 15 : 1

E. benzenas : etanolis = 15 : 1

F. acetonas : dioksanas = 6 : 2

G. acetonas : dioksanas : benzenas = 20 : 10 : 20

Tirpiklių sistemos parinktos remiantis literatūros šaltiniais [170, 285].

Ryškinimui naudota metalinio jodo garais prisotinta kamera, 5 proc. vario

sulfato vandeninis tirpalas, UV spindulių lempa. Tiriamoji medžiaga tirpinta

acetone, etanolyje arba etanolio ir acetono mišinyje.

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [166, 170, 273]. Analizei

atlikti naudotas chromatografas Waters 2695 (Waters, JAV) su fotodiodų

detektorium Waters 996 PDA. Analitės skirstomos C18 Hypersil („Thermo

Scientific“, JAV) analitine kolonėle (5 μm, 250×4,6 mm) su prieškolonėle.

Injekuota 10 μl tiriamosios medžiagos tirpalo acetonitrile. Detekcija atlikta

prie 200–400 nm bangos ilgio. Tėkmės greitis – 1 ml/min. Eliuavimas –

izokratinis. Eliuentas: 55 dalys metanolio ir 45 dalys išgryninto vandens.

Kolonėlė laikyta kambario temperatūroje. Junginių grynumas įvertintas

apskaičiuojant procentinį tiriamosios medžiagos kiekį pagal smailių plotą.

Susintetintų junginių, kaip biologiškai aktyvių medžiagų,

vertės nustatymas in silico.

Susintetintų junginių, kaip biologiškai aktyvių medžiagų, vertė nustatyta,

panaudojant „OSIRIS Property Explorer“ programą [186]. Analizuojant

cheminę struktūrą, įvertinamos šios fiziko-cheminės savybės:

Hidrofiliškumas (cLogP). Dydis cLogP yra junginio neutralios formos

pasiskirstymo koeficiento oktanolis/vanduo logaritmas. Šis dydis naudojamas

junginio hidrofiliškumui įvertinti. Junginiai, kurių cLogP reikšmė yra didelė

(cLogP > 5,0), pasižymi nedidele absorbcija ar praeinamumu. Įrodyta, kad

lengvai besiabsorbuojančių junginių cLogP reikšmė yra ne didesnė nei 5,0

[186].

41

Tirpumas (logS). Junginio tirpumas vandenyje svarbi absorbcijos ir pasi-

skirstymo charakteristika. Paprastai mažas tirpumas pasireiškia bloga absorb-

cija. Dydis LogS yra tirpalo koncentracijos, išreikštos mol/l dešimtainis

logaritmas. Daugiau kaip 80 proc. šiuo metu naudojamų veikliųjų medžiagų

logS > –4 [186].

Molekulinė masė. Pastebėta, kad junginių biologinis aktyvumas didėja,

didėjant jų molekulinei masei, tačiau žinoma, kad didesnės molekulinės

masės junginiai sunkiai absorbuojami organizme. Todėl, kiekvieno moksli-

ninko, kuriančio veikliąsias medžiagas, tikslas – sintetinti kuo mažesnės

molekulinės masės junginius. Daugiau kaip 80 proc. šiuo metu naudojamų

veikliųjų medžiagų molekulinė masė yra tarp 200 ir 450 [186].

Molekulės fragmentų įvertinimas, atsižvelgiant į įvairias šiuo metu

naudojamų veikliųjų medžiagų struktūras apskaičiuojamas lygtimi:

n

vd

i

kur vi – fragmentų, kurie yra tiriamojoje struktūroje, verčių suma, n – frag-

mentų, kurie yra tiriamojoje struktūroje, skaičius [186].

Fragmentų sąrašas sukurtas išanalizavus 3300 šiuo metu naudojamų

veikliųjų medžiagų bei 15000 cheminių reagentų struktūros fragmentus

[186]. Nustatyta, kad veikliųjų medžiagų molekulių fragmentų vertė yra

teigiamas skaičius (d > 0).

Junginio, kaip biologiškai aktyvios medžiagos, vertė apskaičiuojama lyg-

timi, kuri sujungia fiziko-cheminių savybių įverčius (cLogP, logS, molekulinę

masę, molekulių fragmentų įvertinimą) ir toksiškumo rizikos įvertinimą:

ii tsds2

1

2

1,

kur ds – junginio, kaip biologiškai aktyvios medžiagos, vertė, si – reikšmė,

apskaičiuojama iš cLogP, logS, molekulinės masės, molekulių fragmentų

įvertinimo, ti – 4 rizikos tipų reikšmė: 1,0 (maža rizika), 0,8 (vidutinė

rizika), 0,6 (didelė rizika) [186].

bapes

1

1,

a ir b – LogP (1, –5), logS (1, 5), molekulinės masės (0,012, –6) ir

molekulių fragmentų įvertinimąo (1, 0) intervalai.

Apskaičiuotas dydis ds yra tiriamo junginio, kaip biologiškai aktyvios

medžiagos, vertė.

42

Susintetintų junginių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimas.

Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in silico. Biologinio junginių akty-

vumo prognozė atlikta, panaudojant PASS (Prediction of Activity for

Substances) programą [191, 198]. Ši programa pagrįsta jau žinomos biolo-

giškai aktyvios medžiagos struktūros ir naujo junginio struktūros palygi-

nimu, tikintis, kad panašios struktūros junginiai pasižymi panašiu aktyvumu.

Kompiuterinė struktūros ir aktyvumo ryšio analizė ir molekulių modelia-

vimas plačiai taikomi ieškant naujų vaistų. PASS programa vienu metu

nuspėja keleto šimtų tipų biologinį aktyvumą iš skirtingų cheminių klasių.

PASS programa buvo naudojama nuspėti priešgrybelinį ir priešbakterinį

junginių aktyvumą, kuris programoje nuspėjamas su atitinkamai 9 proc. ir 7

proc. paklaida. Bendras dabartinės versijos PASS aktyvumo rūšių sąrašas

yra pateiktas internetiniame tinklalapyje [191].

PASS programa pateikia aktyvumų pavadinimų sąrašą ir kiekvieno

aktyvumo tikimybės (Pa) reikšmę. Pa reikšmės gali būti interpretuojamos

taip:

1. Pa > 0,7. Junginio aktyvumą patvirtinti eksperimentiškai yra didelė

tikimybė, tačiau daugeliu atvejų junginio struktūra yra labai panaši į

žinomų farmacinių preparatų struktūrą.

2. 0,5 < Pa < 0,7. Tikimybė, kad junginys pasižymi sistemos nurodytu

biologiniu aktyvumu, yra mažesnė, tačiau tiriamo junginio struktūra

nėra labai panaši į žinomų farmacinių preparatų struktūrą.

3. Pa < 0,5. Šiuo atveju tikimybė eksperimentiškai nustatyti programos

spėjamą junginio farmakologinį aktyvumą yra dar mažesnė, junginys

tik nežymiai panašus į junginius iš sistemoje sukauptos duomenų

bazės.

Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in vitro. Junginių priešmikrobinis

aktyvumas įvertintas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos

akademijos Mikrobiologijos katedroje.

Junginių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimui naudotos 7 skirtingos

bakterijų ir 1 grybelių kultūra:

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Bacillus subtilis ATCC 6633

Proteus mirabilis ATCC 12453

Candida albicans ATCC 60193

43

Bakterijų pasirinkimą lėmė jų struktūriniai ir funkciniai ypatumai,

siekiant ištirti, kaip susintetinti junginiai veikia šiuos mikrobus: S. aureus

(gramteigiama), E. coli (gramneigiama), B. subtilis (sudaranti sporas),

K. pneumoniae (sudaranti kapsulę), P. mirabilis (šliaužianti), P. aeruginosa

(atspari daugeliui priešmikrobinių vaistų), E. faecalis (vienas dažniausių

hospitalinių infekcijų sukėlėjų), C. albicans – vienas dažniausių grybelinių

infekcijų sukėlėjų. Minėtos bakterijų ir grybelio kultūros dažnai naudojamos

kaip standartiniai mikrobai, tiriant junginių priešmikrobinį aktyvumą.

Bakterijų ir grybelių kultūros auginamos ant nuožulnaus triptozės sojos

agaro 5 ml talpos mėgintuvėliuose ir laikomos šaldytuve, 2–8° temperatū-

roje. Kas savaitę kultūros persėjamos į šviežią triptozės sojos agarą.

Tiriant priešmikrobinį aktyvumą serijinio skiedimo būdu standžioje ter-

pėje (Mueller-Hinton II Agar, JAV) nustatytos minimalios slopinančios jun-

ginių koncentracijos (MSK).

Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas.

Nesporinės bakterijos: kultūros auginamos 20–24 val. 37 °C tempera-

tūroje ant Miulerio-Hintono agaro.

Sporinės bakterijos: kultūros auginamos 1 savaitę 37 °C temperatūroje

ant Miulerio-Hintono agaro. Užaugusios bakterijų kultūros nuplaunamos

nuo agaro steriliu fiziologiniu tirpalu ir gauta suspensija kaitinama 70 °C

temperatūroje 0,5 val. Suspensiją praskiedus (sporų koncentracija (107–10

8

ląstelių/ml) fiziologiniu tirpalu, ji gali būti laikoma žemesnėje nei 4 °C tem-

peratūroje.

Grybelis: kultūros auginamos 20–24 val. 25 °C temperatūroje ant Miule-

rio-Hintono agaro.

Bakterijų ir grybelio suspensijos gaminamos iš išaugintų mikrobų kultūrų

fiziologiniame natrio chlorido tirpale, standartizuojama McFarland standar-

tiniu indikatoriumi, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos

drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus

reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1,5×108

mikrobų ląstelių).

Tiriamųjų junginių paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Pagrindiniai

susintetintų junginių tirpalai (20000 μg/ml) paruošti junginius tirpinant

dimetilsulfokside, kadangi dauguma naujų junginių yra blogai tirpūs kituose

tirpikliuose. DMSO ir pats turi priešmikrobinį veikimą, todėl lygiagrečiai

buvo atliekamas kontrolinis bandymas ir nustatyta koncentracija, kurioje jau

nepasireiškia jo priešmikrobinis veikimas. Skiedžiant pagrindinį tiriamojo

junginio tirpalą, buvo pagaminti mažesnių koncentracijų tirpalai (10000;

1000; 100; 10 µg/ml) (2.20 pav.).

44

M0 = 20 mg/ml

1000µg/ml

900µg/ml

700µg/ml

600µg/ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

800µg/ml

10 ml

200µg/ml

250µg/ml

400µg/ml

500µg/ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

300µg/ml

10 ml

M1 = 10 mg/ml

0,45 ml

0,4 ml

0,5 ml

0,35 ml

0,3 ml 0,25 ml

0,2 ml

0,15 ml

0,125 ml

0,1 ml

150µg/ml

10 ml

1 ml M0 + 1 ml DMSO

M2 = 1 mg/ml

0,2 ml M1 + 1,8 ml DMSO

0,1 ml0,15 ml

100µg/ml

10 ml

I

M3 = 0,1 mg/ml

0,2 ml M2 + 1,8 ml DMSO

10 ml

2,5µg/ml

0,25 ml

M4 = 0,01 mg/ml

0,2 ml M3 + 1,8 ml DMSO

50µg/ml

10 ml 0,5 ml 0,25 ml

25µg/ml

10 ml

5µg/ml

10 ml 0,5 ml 0,1 ml

1µg/ml

10 ml

0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

0,5µg/ml

10 ml

0,25µg/ml

10 ml

0,1µg/ml

10 ml

2.20 pav. Tiriamųjų junginių tirpalų paruošimas

Pastaba: M0 - pagrindinis susintetinto junginio tirpalas (20mg/ml), M1-M4 – darbiniai

tirpalai, gaunami skiedžiant pagrindinį tirpalą (M0)

45

Mažiausios slopinančios koncentracijos nustatymas. Atitinkamas kiekis

praskiesto pagrindinio tiriamojo junginio tirpalo aseptinėmis sąlygomis

sterilia pipete perkeliamas į sterilų matavimo cilindrą, jame sumaišomas su

išlydyta standžia Miulerio–Hintono terpe ir perkeliamas į Petri lėkštelę.

Standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos atskiruose sunumeruotose

segmentuose kilpele po 0,1 ml sėjamos ant sustingusios standžios terpės su

naujŲ 4 tiazolidinonŲ, turinČiŲ sulfanilamido, alilamino ir … · parazitai, todėl medžiagos...

Documents