neoglaziovia variegata (arruda) mez
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DANIELA GARCIA SILVEIRA
MICROPROPAGAÇÃO E VARIABILIDADE GENÉTICA DE
POPULAÇÕES NATURAIS DE CAROÁ
[Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez].
FEIRA DE SANTANA – BAHIA
2009
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA
MICROPROPAGAÇÃO E VARIABILIDADE GENÉTICA DE
POPULAÇÕES NATURAIS DE CAROÁ
[Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez].
DANIELA GARCIA SILVEIRA
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Botânica da Universidade
Estadual de Feira de Santana como parte
dos requisitos para a obtenção do título de
Doutor em Ciências - Botânica.
ORIENTADOR: PROF. DR. José Raniere Ferreira de Santana (UEFS)
CO-ORIENTADOR: DRA. Fernanda Vidigal Duarte Souza (Embrapa)
FEIRA DE SANTANA – BA
2009
Ficha catalográfica: Biblioteca Central Julieta Carteado
Silveira, Daniela Garcia S587m Micropropagação e variabilidade genética de populações
naturais de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] / Daniela
Garcia Silveira. – Feira de Santana, Bahia, 2009.
172 f.: il.
Orientador: José Raniere Ferreira de Santana
Co-orientadora: Fernanda Vidigal Duarte Souza Tese (Doutorado em Botânica)– Programa de Pós – Graduação em
Botânica, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, 2009.
1. Bromeliaceae. 2. Cultura de tecidos. 3. Germinação de
sementes. 4. Extração de fibras. 5. Aclimatização. 6. Anatomia foliar. I. Santana, José Raniere Ferreira de. II. Souza, Fernanda Vidigal Duarte. III. Universidade Estadual de Feira de Santana. IV. Departamento de Ciências Biológicas. V. Título.
CDU: 582.564
Aos meus filhos, Mariana e Marcius, por tudo que representam
em minha vida: a alegria, a paz e a certeza de que a vida é especial.
A meu esposo e companheiro, Nininho,
por todos esses anos de carinho e incentivo;
Aos meus pais por tudo e sempre.
...”Leve na sua memória, para o resto da vida, as coisas boas que
surgiram nas dificuldades. Elas serão uma prova de sua capacidade e
lhe darão confiança diante de qualquer obstáculo”.
Chico Xavier
AGRADECIMENTOS
A elaboração de uma tese não é um trabalho que se pode fazer sozinho. Várias
pessoas contribuíram para que essa pesquisa chegasse ao fim. Por isso, aqui
deixo meus agradecimentos a todos que, direta ou indiretamente, colaboraram
comigo para a realização desse trabalho.
Em especial, quero lembrar alguns que estiveram ao meu lado em todos os
momentos, principalmente quando o caminho parecia mais árduo.
Em primeiro lugar agradeço a DEUS, cuja centelha divina habita em meu ser e
que, durante todo o tempo manteve acesa minha FÉ na realização desse
trabalho.
Ao Professor Dr. José Raniere Ferreira de Santana pela valiosa orientação,
atenção, colaboração e principalmente, pela confiança demonstrada durante
esses anos para a realização desse trabalho. Agradeço por participar
efetivamente de todas as etapas e decisões, dividindo as pequenas vitórias e
enfrentando os problemas. Obrigada pelas conversas e incentivo a minha vida
profissional, pela amizade e oportunidades!
A Pesquisadora Dra. Fernanda Vidigal Duarte Souza que me ajudou nesse
trabalho, desde a idealização até a sua finalização, participando efetivamente com
suas palavras de incentivo, compreensão e, principalmente, pelas observações e
orientações precisas para a realização dessa tese. Ao longo desses quatro anos
de doutorado, tive a oportunidade e o privilégio de renovar meus conhecimentos e
vivenciar novas situações, que se tornaram lições valiosas para minha vida.
Obrigada por ter sido durante todo o tempo minha orientadora, amiga e
principalmente, pelo exemplo de vida.
A Professora Dra. Claudineia Pelacani, pelos ensinamentos, amizade, confiança,
disponibilidade, sugestões e principalmente pela orientação, durante a primeira
etapa desse trabalho. Meu mais sincero obrigada.
Ao Pesquisador Dr. Antonio Souza pela transmissão de conhecimentos, atenção,
incentivo, apoio e amizade. Obrigada pelo exemplo de amor à pesquisa!
Ao Pesquisador Dr. Carlos Ledo pela ajuda inestimável nas análises estatísticas
dos dados. Obrigada também pela amizade.
Ao Pesquisador Dr. Edson Perito e a Professora Dra. Cláudia Carneiro pelas
sugestões, disponibilidade, colaboração e amizade.
A Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, pelo suporte técnico e possibilidade
de realizar este trabalho.
A Cooperativa Regional de Artesãs Fibras do Sertão (COOPERAFIS) pelo
excelente trabalho que vem desenvolvendo no Nordeste da Bahia, pelo incentivo
e apoio, essenciais para a realização deste trabalho. Obrigada pelo carinho e
confiança!
Ao BNB e a FAPESB, por terem apoiado o projeto que resultou nesse trabalho.
A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos durante o curso.
Ao Senhor José Elias (Seu Zé), proprietário do sítio em Valente (BA), que além de
conceder as plantas e frutos, me ajudou a conhecer mais o caroá, com sua rica
vivência na Caatinga. Obrigada pela amizade e pelo carinho!
Aos funcionários do Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa, Tânia,
Honorato, Osvaldo, Keuder e Fiuza, que me acompanharam desde minha
graduação até o doutorado, dando auxílio, apoio e carinho. Muito obrigada pela
nossa amizade!
Aos amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa, Ádila, Sandra,
Juracy, Hilo, Taliane, Mariane, Meire, Elaine, João Paulo, Paulo Vidal, Karine,
Kelly, Celma, Moema, Nagela, Leia, Fred, Helder e Mariana, pelo ótimo convívio,
ajuda e companheirismo. Obrigada pelas alegrias e confiança!!!
Aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa, Kátia, Vânia,
Epaminondas, Raimundão, Helison, Lívia, Paulinho, Welder, Marise, Gean
Capinan, Daniela, Juliana e Lourenço, que me receberam com carinho e me
deram todo o suporte para a realização do trabalho nesse laboratório.
Ao funcionário de campo da Embrapa, Benedito Conceição „Catacome‟, pela
ajuda, carinho e amizade.
A amiga Kátia Leão, que está sempre comigo, dando-me força, incentivo e apoio
em todos os momentos, alegres e tristes, da minha vida. Obrigada amiga por
tudo!
As amigas, Cristina Nepomuceno e Sandra Queiroz, pelo companherismo,
carinho e pelas boas e acolhedoras conversas.
Aos amigos, Selma Diamantino e Francisco Pinheiro, que me ajudaram na coleta
das plantas.
Aos Pesquisadores da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Janay Serejo,
Tatiana Junghans, José Renato Cabral, Sebastião de Oliveira, Paulo Ernesto
Meissner, Eduardo Chumbinho, Claudio Leone, pela atenção, convívio e amizade.
A equipe de professores, funcionários e estudantes dos laboratórios do Horto
Florestal da UEFS, pela convivência e colaboração ao longo desses quatro anos
de doutorado. Janilza, Solange, Alone, Ana Paula Rios, Cimile e Ivana, muito
obrigada!
Aos meus filhos e ao meu esposo que me entenderam e me ajudaram, cada um
do seu jeitinho, a realizar essa etapa da minha vida. EU AMO VOCÊS!!!
Aos meus pais e minhas irmãs, pelo carinho e apoio.
E a todos os meus familiares que estão presentes em todos os momentos da
minha vida.
MUITO OBRIGADA!!!
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
INTRODUÇÃO GERAL 1
Capítulo 1. 9
Resposta germinativa de sementes de caroá [Neoglaziovia
variegata (Arruda) Mez] à temperatura e estresse osmótico.
Capítulo 2. 27
Micropropagation and in vitro conservation of Neoglaziovia
variegata (Arruda) Mez, a fiber producing bromeliad from
Brazil.
Capítulo 3. 41
Development of micropropagated shoots and plants of caroá
[Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez)] in different
substrates.
Capítulo 4. 60
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas
micropropagadas de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda)
Mez].
Capítulo 5. 81
Anatomia foliar de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda)
Mez] sob diferentes condições de cultivo.
Capítulo 6. 105
Variabilidade genética de populações naturais de caroá por
meio de marcadores RAPD.
CONCLUSÕES GERAIS 128
RESUMO 130
ABSTRACT 132
ANEXOS 134
1
INTRODUÇÃO GERAL
A Caatinga é encontrada em cerca de 70% do Nordeste Brasileiro,
apresentando clima quente e precipitação média anual de 300 a 800 mm, com
época de estiagem que se estende, em média, por seis a sete meses. Essa
região é composta de árvores e arbustos baixos com características xerofíticas,
abrigando várias espécies da família Bromeliaceae, dentre as quais pode-se
destacar a Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez, conhecida vulgarmente como
caroá ou crauá (Figura 1 A) (Xavier, 1982). Essa espécie é nativa da Caatinga e
apresenta grande importância econômica para o Nordeste, pois sua fibra (Figura
1 B) se presta à industrialização (Bernades, 1999) e a produção de diversos
artesanatos.
Na primeira metade do século passado, entre os anos 30 a 50, as fibras de
caroá produziram um fino linho com padronagens belíssimas que foi bastante
usado pela sociedade da época, inclusive pelo então Presidente Getúlio Vargas.
Sua exploração, no entanto, foi abandonada no início da década de 50, com o
surgimento do nylon sintético importado dos Estados Unidos (Ribeiro, 2007).
Xavier (1982) e Ribeiro (2007) relataram que os estudos com essa espécie
iniciaram no século XIX, mais precisamente no ano de 1810, a pedido do Príncipe
Regente e do governador da Província da Paraíba, Fernando Delgado Freire de
Carvalho, ao naturalista paraibano Manoel de Arruda Câmara, que descreveu
botanicamente essa espécie. Vários estudos e incentivos do Governo Federal
daquela época à industrialização das fibras do caroá não obtiveram êxito, pois
não foi possível competir com a fibra sintética.
Atualmente, as fibras do caroá voltaram a ser uma das principais fontes de
emprego e renda para diversas famílias nordestinas com a fabricação de produtos
artesanais como chapéus, bolsas, tapetes, entre outros produtos, que são
vendidos em feiras e lojas da região (Figura 1 C, D e E). Contudo, a associação
de artesãs da Bahia (COOPERAFIS) vem divulgando os produtos do caroá em
eventos nacionais que são realizados em todo o Brasil, impulsionando assim a
importância econômica dessa espécie no Nordeste, principalmente na economia
baiana, destacando-se a geração de trabalho e renda com o artesanato.
2
Figura 1. Processo artesanal da fibra de caroá [N. variegata (Arruda) Mez]: planta
de caroá na Caatinga (A), fibras de caroá secando ao sol (B), trabalho manual
com a fibra (C) e produto final com a fibra de caroá (D, E).
O uso dessa fibra é feito desde o século passado de forma extrativista visto
que esta espécie ainda não apresenta nenhum sistema de cultivo. Ribeiro (2007)
relata que o caroá ocupava em 1942 uma área de 27 milhões de hectares,
segundo relatório do Ministério da Agricultura daquele ano, o que equivale a 1/3
das terras do Semi-Árido e que, com toda a devastação sofrida na Caatinga,
possivelmente ainda dispõe de 20% das reservas nativas do caroá, cerca de 5
milhões de hectares. Contudo, nas áreas em que há maior concentração de
artesãs, como exemplo nos municípios de Valente e Araci (BA) onde se localiza a
COOPERAFIS (Cooperativa Regional de Artesãs Fibras do Sertão), está
ocorrendo o desaparecimento dessa planta, obrigando as artesãs a irem cada vez
mais longe realizar a coleta. A causa pode ser devida tanto ao sistema de corte
adotado pelas artesãs nestas comunidades, como a própria devastação da
Caatinga pelas atividades agropecuárias na região, que entendem o caroá como
uma planta invasora e sem valor comercial.
A preocupação das artesãs da COOPERAFIS com o desaparecimento do
caroá nas suas comunidades serviu como ponto de partida para que a espécie
C D E
A B
3
voltasse a ser estudada, visando principalmente à geração de conhecimentos que
possam subsidiar o estabelecimento de um sistema de cultivo e produção. O
cultivo sistematizado do caroá evitará o extrativismo predatório, como também a
atividade produtiva das artesãs não será colocada em risco, além de se tornar
mais organizada e com capacidade de expansão e planejamento. No entanto, um
dos passos fundamentais no estabelecimento de um sistema de cultivo e
produção se constitui no desenvolvimento de um método de propagação eficiente
para obtenção de mudas sadias.
Apesar de o caroá ser uma espécie nativa e de uso econômico, as
tentativas de cultivo não obtiveram muito sucesso até agora, sendo um dos
principais problemas observados, a baixa taxa de propagação desta planta. O
caroá se reproduz tanto por sementes quanto pelo desenvolvimento de gemas e
rizomas laterais, porém sua propagação é prioritariamente assexuada. As plantas
apresentam folhas listradas (Figura 2 A e B) que chegam a medir de 2 a 3 metros
de comprimento, sendo envolvidas por uma cutícula impermeável que é protegida
por acúleos nas bordas (Ribeiro, 2007). As flores são protegidas por brácteas com
coloração viva (Figura 2 B e C) e frutos em bagas suculentas (Figura 2 D e E)
(Smith & Downs, 1979). Contudo, suas sementes são difíceis de serem
encontradas, pois animais e pássaros alimentam-se tanto das bagas verdes
quanto das maduras (Xavier, 1982), dificultando a coleta na época ideal da
maturação dos frutos.
Fráguas et al. (2002) relataram que a propagação sexuada das
bromeliáceas apresenta limitações, como a demora na maturação das sementes
somada ao baixo poder germinativo de algumas espécies. Por outro lado, é
preciso considerar que a propagação via sementes é de extrema importância para
a manutenção da variabilidade genética das populações naturais. Sendo assim,
os estudos sobre germinação e fisiologia de sementes tornam-se fundamentais
para a utilização e exploração de forma racional das espécies nativas (Perez et
al., 2001) e também para os objetivos conservacionistas.
4
Figura 2. Detalhe da planta de caroá [N. variegata (Arruda) Mez]: folha variegata
(A), visão da inflorescência (B, C), frutos imaturos na infrutescência (D) e frutos
imaturos e maduros na infrutescência (E).
O uso de técnicas de cultura de tecidos em Bromeliáceas para a
propagação de algumas espécies tem proporcionado resultados muito superiores,
em relação ao número de plantas obtido, quando comparados aos métodos
convencionais de produção de mudas (Pierik et al., 1984; Mercier & Kerbauy,
1995). Dessa forma, o desenvolvimento de protocolos de micropropagação para a
obtenção em larga escala de plantas sadias é passo importante para o cultivo
racional do caroá.
Por outro lado, alguns aspectos precisam ser considerados para a
propagação em larga escala de caroá: não existem variedades definidas e que
possam ser reconhecidas ou ligadas a diversos atributos para caracterizar
qualidade de fibra ou mesmo produtividade; a coleta das plantas para seu uso é
feita de forma indiscriminada e totalmente aleatória. Dessa forma a clonagem em
larga escala de determinados genótipos, sem conhecimentos adicionais sobre
A B
C D E
5
características de qualidade da fibra, além de causar erosão genética, pode
promover o uso de genótipos com fibras de baixa qualidade. Em vista disso, a
utilização de sementes como explantes se constitui em uma estratégia
interessante, tanto para propósitos de conservação, mantendo assim, a
variabilidade das populações naturais, onde cada semente será uma planta matriz
(Rech Filho et al., 2005), quanto para os sistemas de cultivo a serem
implementados.
Souza et al. (2006) relatam que apesar das técnicas de micropropagação
proporcionarem resultados muito superiores à propagação convencional,
principalmente em bromeliáceas, algumas limitações têm sido observadas, como
o longo tempo necessário para a aclimatização das plantas, onerando, dessa
forma todo o processo. Com isso, estudos envolvendo essa etapa são
necessários para a obtenção de um protocolo eficiente de produção de mudas.
Adicionalmente, o conhecimento da anatomia das plantas nas diferentes
condições de cultivo, in vitro, ex vitro (fase de aclimatização) e in vivo, é uma
ferramenta valiosa para o entendimento desse processo de adaptação da fase
heterotrófica para autotrófica, fornecendo subsídios que permitam melhorar a
aclimatização dessas plantas (Barboza et al., 2006) e baixar o custo das plantas
obtidas.
Finalmente, e considerado de relevada importância, estão os estudos que
permitem o conhecimento da estrutura e distribuição da variabilidade genética das
populações naturais dessa espécie. A redução drástica da ocorrência dessa
planta em todo o Nordeste demanda estudos urgentes que possam subsidiar a
elaboração de estratégias de conservação genética deste germoplasma e o
estabelecimento da exploração econômica de forma racional.
O uso de marcadores moleculares vem auxiliando estes estudos em
diversas espécies, proporcionando resultados interessantes. Dentre os diversos
tipos de marcadores atualmente disponíveis, a técnica de RAPD („Random
Amplified Polimorphic DNA‟), desenvolvida por Williams et al. (1990), mostra-se
como uma ferramenta poderosa para a análise da diversidade genética molecular
em populações naturais de plantas (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Cavallari,
2004). Essa técnica é considerada uma metodologia de fácil e rápida aplicação
em relação às outras técnicas moleculares, além de apresentar baixo custo e não
ser influenciada por condições ambientais (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
6
Em vista do que foi exposto e considerando a importância econômica desta
espécie, assim como os escassos estudos existentes, o objetivo desse trabalho
foi desenvolver um protocolo de produção de mudas micropropagadas a partir de
plântulas germinadas in vitro, envolvendo estudos sobre a germinação das
sementes in vivo e in vitro, aclimatização e anatomia foliar em diferentes
ambientes de cultivo, além de estudar a variabilidade genética em populações
naturais de caroá do Estado da Bahia.
7
REFERÊNCIAS BIBILOGRAFICAS
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PEREZ, S.C.J.G.A.; FANTI, S.C.; CASALI, C.A. Influência da luz na germinação
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PIERIK, R.L.M.; STEEGMANS, H.H.M.; HENDRIKS, J. Vegetative propagation of
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8
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Nucleic Acids Research, v.18, p.6531-6535, 1990.
9
CAPÍTULO 1
Resposta germinativa de sementes de caroá [Neoglaziovia variegata
(Arruda) Mez] à temperatura e estresse osmótico1
1 Artigo submetido para publicação no periódico Ciência e Agrotecnologia em setembro de 2008.
10
RESUMO
O caroá é uma Bromeliaceae nativa da Caatinga brasileira cujas fibras retiradas das folhas,
geram trabalho e renda para diversas famílias nordestinas com a fabricação de vários
produtos artesanais. A propagação ocorre por rizomas laterais e sementes, as quais essas
podem servir como alimento para muitos animais e pássaros. Diante de sua importância
econômica regional, a planta do caroá tem sido coletada na Caatinga de forma extrativista,
já tendo praticamente desaparecida em algumas regiões da Bahia. Esse trabalho foi
desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito da temperatura e da restrição de água na
germinação de sementes de caroá. A germinabilidade foi avaliada sob as temperaturas de
25, 30, 34 e 37 °C, sendo que a temperatura mais favorável à germinação foi utilizada no
ensaio seguinte, combinando com diferentes soluções-teste de PEG. A temperatura de
30°C foi a melhor e a germinação decresceu com a diminuição do potencial osmótico do
meio. As sementes de caroá germinaram até o potencial de -0,6 MPa.
Termos para indexação: Bromeliaceae, germinação, estresse abiótico, IVG.
11
Germinative response of Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez seeds
ABSTRACT
Caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] is a native Bromeliaceae of the Brazilian
savanna used as source of fiber, generating work and income for several Northeastern
families with the production of the craft products. The specie can be propagated from
lateral rhizomes and seeds, which these may serve as food for different animals. In
function of the economical importance, the plant of the caroá has been collected in the
savanna indiscriminately having disappeared practically in some areas of Bahia State,
Brazil. The objective of this research was to study the hydric restriction effect on the seed
germination of caroá, as proposal of establishing a cultivation system and more rational
production. The temperature tested were 25, 30, 34 e 37 °C. The best temperature was used
with different concentration of PEG. The temperature of 30 °C was the best for seed
germination. The seed did not germinate in osmotic potential above -0.6 MPa.
Index terms: Bromeliaceae, germination, abiotic stress, IVG.
12
INTRODUÇÃO
O caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] é uma Bromeliaceae nativa do
estrato baixo da Caatinga Brasileira. Apresenta folhas listradas e flores protegidas por
brácteas com coloração viva e frutos em bagas suculentas (SMITH & DOWNS, 1979).
Suas sementes são difíceis de serem encontradas, pois animais e pássaros alimentam-se das
bagas verdes e principalmente das maduras (XAVIER, 1982), dificultando a coleta na
época ideal da maturação dos frutos (SILVEIRA et al., 2009).
Na Região Nordeste do Brasil, principalmente no Estado da Bahia, as fibras
retiradas das folhas dessa espécie são geradoras de trabalho e renda para diversas famílias
com a fabricação de vários produtos artesanais. Contudo, plantas do caroá têm sido
coletadas diretamente na Caatinga de forma extrativista, sem nenhuma sistematização de
cultivo, estando praticamente escassas em algumas regiões da Bahia.
Essa bromeliácea ainda é pouca estudada, havendo necessidade de desenvolver um
método de propagação eficiente para obtenção de mudas sadias, constituindo-se assim o
primeiro passo para o estabelecimento de um sistema de cultivo e produção, a fim de se
evitar o extrativismo predatório (SILVEIRA et al., 2009). O uso de sementes é
fundamental para iniciar esses trabalhos de cultivo, como também é de suma importância
para a conservação de espécies ameaçadas. Segundo RECH FILHO et al. (2005) a
utilização de sementes mantem a variabilidade das populações naturais, onde cada semente
será uma planta matriz. Desse modo, tornam-se fundamentais os estudos sobre germinação
das sementes para a utilização e exploração de forma racional das espécies nativas (PEREZ
et al., 2001).
O processo germinativo se inicia com a absorção de água por embebição, porém, há
necessidade de que a semente alcance um nível adequado de hidratação, o qual permita a
reativação dos seus processos metabólicos (FONSECA & PEREZ, 2003). Contudo, as
condições ambientais tais como suprimento de água, temperatura, substrato, composição
de gases e luz para determinadas espécies, devem estar favoráveis (CARVALHO &
NAKAGAWA, 2000). O grau de exigência desses fatores é variável entre as espécies e
determinado pelo genótipo e pelas condições ambientais prevalecentes durante a
germinação das sementes (MAYER & POLJAKOFF-MAYBER, 1989).
A temperatura tem sido considerada como um dos principais fatores responsáveis
tanto pela porcentagem final de germinação como pelo Índice de Velocidade de
Germinação (IVG), por afetar especialmente a velocidade de absorção de água e a
13
reativação das reações metabólicas, fundamentais aos processos de mobilização de
reservas e a retomada de crescimento do embrião (BEWLEY & BLACK, 1994). As
sementes de diferentes espécies apresentam faixas distintas de temperatura para a
germinação. Dentro dessas faixas, a temperatura ótima propicia a mais alta porcentagem de
germinação dentro do menor espaço de tempo (MAYER & POLJAKOFF-MAYBER,
1989) e para a maioria das espécies essa temperatura está entre 20 a 30 ºC (MARCOS
FILHO, 1986).
A deficiência hídrica é o fator limitante de maior significância na sobrevivência e
crescimento inicial de plantas. Durante o processo germinativo a água atua como agente
estimulador promovendo o amolecimento do tegumento, facilitando a penetração do
oxigênio e aumentando o volume do embrião, além de estimular as atividades metabólicas
básicas, favorecendo o crescimento do eixo embrionário (MARCOS FILHO, 1986). Sob
condições de restrição hídrica, a embebição das sementes é bastante influenciada,
inviabilizando a seqüência dos eventos germinativos. Por outro lado, o excesso de umidade
no meio, em geral, provoca decréscimo na germinação, uma vez que impede a difusão do
oxigênio, reduzindo todo o processo metabólico resultante (BORGES & RENA, 1993).
Vários estudos estão sendo realizados envolvendo a resposta germinativa das sementes à
variação da disponibilidade hídrica no meio empregando-se solução de polietilenoglicol
(PEG) para simular os efeitos da deficiência hídrica nas plântulas (SILVA et al., 2005).
Este polímero não penetra nas células, não é degradado e não causa toxidez ao embrião,
devido ao seu alto peso molecular (HASEGAWA et al., 1984).
Este trabalho objetivou-se avaliar a resposta germinativa de sementes de caroá
[Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez], uma espécie endêmica do semi-árido, sob
diferentes temperaturas e condições de restrição hídrica no meio de cultivo.
14
MATERIAL E MÉTÓDOS
O trabalho experimental foi conduzido entre os meses de abril a junho de 2008, no
Laboratório de Germinação de Sementes da Unidade Experimental do Horto Florestal da
Universidade Estadual de Feira de Santana, BA. As sementes de caroá foram coletadas no
mês de fevereiro de 2008 oriundas de plantas cultivadas em telado na Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical, localizada no município de Cruz das Almas, BA.
Inicialmente, uma amostra de 100 sementes foi retirada ao acaso e utilizada para
obtenção de medidas biométricas e conteúdo de água (%). Considerou-se como
comprimento a medida entre a base e o ápice da semente; largura, a medida mais larga em
contraposição ao comprimento; e espessura, a medida mais larga em contraposição à
largura. O grau de umidade foi determinado em método estufa a 60 ºC, após as amostras
atingirem peso constante.
Antecedendo todos os ensaios de germinação, as sementes foram imersas em
solução de Fungicida Derosal a 0,1%, 1 minuto e, em seguida, imersas em hipoclorito de
sódio comercial a 1% por 10 minutos, sendo, por último, lavadas em água destilada.
Com a finalidade de obter uma temperatura onde a taxa máxima de germinação em
menor tempo médio fosse obtida, sementes assépticas de caroá foram distribuídas em
placas de Petri, contendo três folhas de papel Germitest, sendo duas usadas como base e
uma para cobrir as sementes, e umedecidas com água destilada na proporção de 2,5 vezes a
massa do papel. Este conjunto foi disposto em câmaras de germinação ajustadas nas
temperaturas constantes de 25, 30, 34 e 37 °C, fotoperíodo de 12 horas.
Diariamente foram realizadas observações quanto ao número de sementes
germinadas, usando como critério a emissão da radícula com 2,0 mm de comprimento. Ao
final do décimo sétimo dia após iniciado o ensaio, foram determinadas a porcentagem de
germinação (%G), tempo médio (dias), velocidade média (dias-1
) e o Índice de Velocidade
de Germinação (IVG).
Restrição hídrica na germinação de caroá
A capacidade das sementes de caroá em germinar sob condições de baixa
disponibilidade hídrica no meio foi avaliada mediante a exposição das sementes em
diferentes soluções-teste de polietilenoglicol (PEG 6000). As soluções-teste nos diferentes
potenciais osmóticos (0,0; -0,2; -0,4; -0,6; -0,8; -1,0; -1,2 e -1,4 MPa) foram preparadas de
acordo com VILELLA et al. (1991), sendo estabelecida a temperatura de 30 oC.
15
Para cada conjunto de placa de Petri + sementes foi adicionado um volume de 9 mL
de solução-teste por placa, e colocados em câmara de germinação à 30 ºC. A cada intervalo
de 48 horas, as sementes eram transferidas para outras placas contendo novas soluções-
teste para garantir níveis constantes dos potenciais osmóticos. As sementes ficaram
mantidas nestas condições durante um período de dez dias consecutivos, sendo as
avaliações realizadas diariamente. Foram determinadas todas as variáveis do ensaio
anterior.
Visando avaliar a influência das soluções osmóticas nas sementes, especialmente
pela exposição em potenciais mais negativos, sementes germinadas e não-germinadas, em
cada tratamento, foram transferidas para outras placas contendo água destilada e foram
mantidas nas mesmas condições de temperatura e fotoperíodo, por um período adicional de
dez dias. O número de sementes transferidas para água que conseguiu germinar foi
calculado ao final do ensaio e os dados expressos em porcentagem relativa.
Para as sementes germinadas e transferidas para a água destilada, foram
determinados: o número de plântulas normais (%), os comprimentos da parte aérea e da
raiz (cm) e a massa seca das plântulas normais como medidas indicativas do vigor.
Nos ensaios de germinação o delineamento foi inteiramente casualizado sendo a
unidade experimental composta por 25 sementes por placa, com três a quatro repetições
por tratamento. A porcentagem de sementes germinadas foi transformada (x + 0,5)0,5
, para
que seguissem uma distribuição normal (STEEL & TORRIE, 1980). As diferenças de
médias dos parâmetros foram analisadas pelo teste de Tukey, em nível de 5% de
significância e/ou regressão utilizando o programa estatístico SISVAR 4.3 (FERREIRA,
1999).
16
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As sementes de caroá (Neoglaziovia variegata) utilizadas nos ensaios
apresentaram conteúdo de água de 9,79%, comprimento médio de 0,36±0,01 mm, largura
de 0,28±0,02 mm e espessura média de 0,19 mm. Essas dimensões são importantes, pois,
antecipadamente, tem-se uma idéia de que para a confecção de lotes homogêneos há
necessidade de se fazer uma prévia classificação, uma vez que o tamanho da semente pode
influenciar no seu vigor.
Quanto à resposta germinativa das sementes, todas as temperaturas testadas
promoveram a germinação (Tabela 1). As temperaturas constantes de 30 a 37 ºC foram as
que promoveram as maiores porcentagens de sementes germinadas, diferindo
significativamente das mantidas a 25 oC (61,0%). Muitas espécies tropicais germinam
entre as temperaturas de 10 °C a 40 °C, embora algumas espécies apresentem germinação a
45 °C (BORGHETTI, 2005). Sementes de Aechmea distichantha Lemaire, uma bromélia
nativa da Mata Atlântica, apresentaram alta germinabilidade em temperaturas constantes
de 15 a 35 °C sob luz contínua (MERCIER & GUERREIRO FILHO 1990). Já as sementes
de Aechmea nudicaulis (L.) e Streptocalyx floribundus (Martius ex Schultes f.) Mez, duas
bromélias de restinga, germinaram na faixa ótima de temperatura entre 15 e 40 °C
(PINHEIRO & BORGHETTI, 2003). Essa mesma faixa foi obtida na germinação das
sementes de Dyckia tuberosa (Vell.) Beer, uma bromélia do cerrado, sendo as temperaturas
cardeais, a mínima situada entre 10 e 15 ºC e a máxima entre 40 e 45 ºC, determinadas pela
ausência de germinação a 10 e 45 °C, tanto na luz como no escuro (VIEIRA et al., 2007).
Trabalho realizado por SILVEIRA et al. (2009) com germinação in vitro de sementes de
Neoglaziovia variegata oriundas de frutos imaturos e maduros em sala de crescimento com
temperatura controlada (27 ± 1 °C), apresentaram taxas de germinação de até 100% na
presença da luz e de 60% na ausência da luz.
17
Tabela 1. Valores médios de germinação (G), tempo médio de germinação (TMG),
velocidade média de germinação (VMG) e índice de velocidade de germinação (IVG) de
sementes de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] submetidas a diferentes
temperaturas. Médias de quatro repetições.
Temperatura ºC G (%) TMG (dias) VMG (dias-1
) IVG
25 61,0 b* 12,0 c 0,08 c 1,3 c
30 99,0 a 8,4 a 0,12 a 3,0 a
34 96,0 a 9,8 b 0,10 b 2,6 b
37 98,0 a 9,9 b 0,10 b 2,6 b
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula dentro das colunas não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey a 5 % de probabilidade
A germinação de sementes está condicionada às condições climáticas e também ao
local de origem das espécies. Assim, espécies encontradas no bioma Caatinga, como N.
variegata, geralmente produzem sementes que requerem altas temperaturas para
germinarem. Entretanto, quando extremamente elevadas, as temperaturas podem ser
prejudiciais à germinação de algumas espécies provavelmente por causarem desnaturação
de proteínas essenciais ao processo germinativo (DOUSSEAU et al., 2008). Contudo, para
as sementes de caroá as temperaturas até 37 °C não influenciaram negativamente na
porcentagem de germinação e nos parâmetros cinéticos deste processo. Segundo
BORGHETTI (2000), o requerimento de temperaturas elevadas para as sementes
germinarem parece estar envolvido diretamente com a atividade das enzimas relacionadas
com esse processo. Esta relação pode ser verificada não apenas pela germinabilidade da
espécie, mas também por outras variáveis cinéticas, tais como, tempo e velocidade média
de germinação e o IVG, em cada temperatura de incubação.
O maior tempo médio de germinação das sementes de caroá foi observado quando a
temperatura de incubação foi mais baixa (25 oC), requerendo 12 dias para que o processo
ocorresse. O aumento da temperatura do meio de incubação proporcionou uma maior
velocidade do processo germinativo, consequentemente a protrusão da radícula ocorreu
num menor tempo médio. A temperatura de 30 oC foi a que proporcionou as melhores
condições (temperatura ótima) para que a germinação das sementes de caroá atingisse
taxas elevadas (99,0%) num período de tempo mais curto (8,4 dias) (Tabela 1). Resultados
semelhantes foram encontrados por VIEIRA et al. (2007) que obtiveram as maiores
velocidades de germinação para Dyckia tuberosa (Vell.) Beer nas temperaturas entre 30 e
18
35 °C com o menor tempo médio de germinação. Já PINHEIRO & BORGHETTI (2003)
encontraram para A. nudicaulis e S. floribundus temperaturas ótimas no intervalo entre 20
e 30 °C.
Efeito da restrição hídrica na germinação de sementes
Observou-se que a germinação das sementes foi influenciada negativamente pela
disponibilidade de água no meio de incubação. A taxa de germinação e o IVG atingiram os
maiores valores quando as sementes eram mantidas em água destilada (controle),
decrescendo até o potencial de -0,6 MPa (Figura 1 A e 1D). A partir de -0,8 MPa houve
restrição total da absorção de água pelas sementes de caroá, inibindo completamente a
germinação. Estes resultados corroboram com SILVA et al. (2005) trabalhando com
sementes de faveleira (Cnidosculus juercifolius) em diferentes potenciais osmóticos (0,0 a
-1,3 MPa) com PEG 6000, observaram uma resposta germinativa até -0,7 MPa, indicando
que o limite de tolerância desta espécie se situa entre -0,7 e -0,9 MPa. Este comportamento
pode ser explicado porque quando há restrições na disponibilidade hídrica, a absorção de
água pela semente se torna lenta (STEFANELLO et al., 2006). A semente inicia a
germinação e, não havendo água suficiente para a sua continuidade, pode haver o
impedimento da emissão da raiz primária ou até a morte do embrião, conseqüentemente,
reduzindo a percentagem de germinação final (STEFANELLO et al., 2006), uma vez que o
PEG 6000 não produz efeitos tóxicos no metabolismo celular (HASEGAWA et al., 1984).
A restrição hídrica para as sementes de caroá afetou negativamente o tempo médio
de germinação (0,0 a -0,6 MPa). Verificou-se um aumento de dias requerido para que o
processo germinativo ocorresse à proporção que o potencial osmótico diminuía (Figura 1
B). Para a velocidade média de germinação, praticamente, não houve alterações entre os
diferentes potenciais testados (Figura 1 C). Contudo, essa velocidade foi menos afetada
pela baixa disponibilidade hídrica no meio de incubação do que a capacidade germinativa
das sementes de caroá, uma vez que não se observou redução significativa nos potenciais
em que ocorreram à germinação. BEWLEY & BLACK (1994) relataram que a restrição
hídrica do meio provoca atraso na germinação das sementes e, como estas são bastante
heterogêneas em suas respostas, a germinação pode ser distribuída no tempo e no espaço
permitindo que, em condições naturais, esse processo ocorra somente quando as plântulas
encontrarem condições ambientais adequadas ao seu estabelecimento e desenvolvimento.
Verificou-se que ocorreu recuperação da germinação das sementes para todos os
potenciais testados, principalmente naqueles em que não havia sido detectado nenhuma
19
protrusão da radícula (-0,8 a -1,4 MPa) (Figura 1A). A resposta germinativa das sementes
depois de transferidas para água foi significativamente influenciada pelo potencial
osmótico da solução de PEG inicial. A taxa de germinação relativa variou de 90,0 a 49,0%
para as sementes não germinadas, sendo esses valores encontrados para as soluções de -0,4
e -1,4 MPa, respectivamente (Tabela 2). A sensibilidade das sementes ao estresse hídrico
pode ser influenciada por diferentes fatores ambientais, como luz, temperatura, teor de
oxigênio, etc., que variam durante o processo de embebição. Além disso, sob condições de
estresse, muitas espécies possuem a habilidade de entrar em dormência secundária (PEREZ
et al., 2001). Assim, a dormência assume importância ecofisiológica por ser uma estratégia
que permite às sementes manterem o vigor e a viabilidade por um período prolongado de
tempo para germinarem quando as condições do ambiente se tornarem mais favoráveis
(BEWLEY & BLACK, 1994).
Figura 1. Porcentagem de germinação (A), tempo médio (B), velocidade média (C) e
índice de velocidade de germinação – IVG (D) de sementes de caroá [Neoglaziovia
variegata (Arruda) Mez] submetidas a diferentes soluções de polietilenoglicol (PEG 6000).
Média de três repetições.
A B
C D
20
Tabela 2. Número de sementes transferidas e taxa germinação (%) relativa de sementes de
caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] após transferência para água destilada.
Em relação ao vigor das plântulas obtidas de caroá, observou-se que o número de
plântulas normais, o comprimento da parte aérea e da raiz principal, assim como a massa
seca total foram influenciados negativamente pela exposição prévia das sementes a
diferentes soluções osmóticas (PEG 6000). As maiores reduções no número de plântulas
normais e da massa seca total das plântulas de N. variegata ocorreram após exposição nos
potenciais mais negativos (-1,0 a -1,4 MPa) (Figura 2A e 2D). Os comprimentos da parte
aérea e da raiz mostraram-se mais sensitivos à redução da disponibilidade hídrica no meio,
devido principalmente, ao efeito imediato da água em proporcionar o crescimento das
plântulas. Dentre os diversos fatores ambientais capazes de influenciar o processo
germinativo de sementes, a (in) disponibilidade de água é um dos mais importantes. Esta
condição é vista como um fator limitante ao início da germinação de sementes, assim como
está envolvida, direta ou indiretamente em todas as demais etapas do metabolismo
subseqüente, seguindo a ativação do ciclo celular e conseqüentemente crescimento
(ROCHA, 1996, DE CASTRO et al., 2000). Para muitos autores este estádio inicial de
desenvolvimento é o mais crítico.
Potencial osmótico
(MPa)
Nº Sementes e Germinação (%)
após transferência para água
0 5 (87,0)
-0,2 5 (80,0)
-0,4 10 (90,0)
-0,6 18 (91,0)
-0,8 23 (92,0)
-1,0 23 (92,0)
-1,2 19 (76,0)
-1,4 12 (49,0)
21
Figura 2. Número de plântulas normais (A), comprimento da parte aérea (B), comprimento
da raiz (C) e massa seca das plântulas normais (D) de Neoglaziovia variegata, após
transferência para água.
A B
C D
22
CONCLUSÕES
1. A temperatura de 30 oC foi a que proporcionou as melhores respostas de
germinação das sementes de caroá.
2. A germinação das sementes de caroá foi responsiva à redução dos potenciais
osmóticos do meio de incubação, apresentando o limite máximo de tolerância a -0,6 MPa.
3. A viabilidade das sementes foi mantida após a recuperação das sementes em
água, mesmo sob potenciais mais negativos.
23
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27
Capítulo 2
Micropropagation and in vitro conservation of Neoglaziovia variegata
(Arruda) Mez, a fiber producing bromeliad from Brazil1
1 Artigo aceito para publicação no periódico Brazilian Archives of Biology and Technology em julho
de 2007.
28
RESUMO
Neoglaziovia variegata é uma espécie de Bromeliaceae nativa da caatinga,
utilizada para extração de fibras e uma das matérias-primas mais utilizadas para o
trabalho artesanal da Região Nordeste da Bahia. Esta planta tem sido coletada de
forma extrativista, sem nenhuma sistematização de cultivo, gerando intensa
pressão antrópica e colocando esta espécie entre as ameaçadas. Essa espécie
se reproduz tanto por sementes quanto pelo desenvolvimento de gemas e
rizomas laterais. As sementes do caroá, no entanto, são difíceis de serem
encontradas, pois animais e pássaros alimentam-se das bagas verdes e
principalmente das maduras, dificultando a coleta na época ideal da maturação
dos frutos. Adicionalmente as taxas de multiplicação na natureza são baixas,
produzindo poucas mudas por planta matriz. Em vista disso, o desenvolvimento
de um método de propagação eficiente, que permita a obtenção de mudas sadias
a serem plantadas, se constitui no primeiro passo para o estabelecimento de um
sistema de cultivo e produção, a fim de se evitar o extrativismo predatório. A
micropropagação por meio da cultura de tecidos é uma ferramenta valiosa na
produção de plantas em larga escala. Vale destacar ainda que a utilização de
sementes como explantes para dar início á micropropagação se constitui em uma
estratégia a ser considerada para propósitos de conservação, mantendo assim, a
variabilidade das populações naturais, onde cada semente será uma planta
matriz. Essa é uma estratégia interessante em espécies onde ainda não existe um
sistema de cultivo, pois mantém a variabilidade genética natural, evitando dessa
forma a intensificação da erosão genética causada pelo extrativismo acelerado ou
pela seleção de poucos genótipos. Em vista do exposto, o objetivo desse trabalho
foi avaliar a germinação in vitro de sementes de caroá e estabelecer um protocolo
de micropropagação com vistas a produção de plantas em larga escala e à
conservação in vitro dessa espécie. Utilizou-se sementes de frutos maduros e
imaturos, que foram cultivadas em meio de cultura MS na presença e ausência de
luz, ambas em salas de crescimento com temperatura controlada (27 ± 1°C). As
plântulas germinadas in vitro foram multiplicadas em meio MS suplementado com
as combinações de 0,05 e 0,50 µM de ANA e 2,2 e 4,4 µM de BAP e de CIN,
constituindo oito tratamentos e um controle, no qual as plântulas foram cultivadas
no mesmo meio sem a presença dos reguladores de crescimento. Realizou-se a
29
aclimatização direta dos brotos originados do tratamento ANA (0,5 µM) + BAP
(4,4 µM) e das plantas do tratamento ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM) em sete
substratos [areia lavada (T1); Ecoterra® (T2); fibra de coco (T3); fibra de coco +
Plantmax® (T4); Plantmax® (T5); vermiculita (T6); vermiculita + Plantmax® (T7)].
Para a conservação in vitro dessa espécie, foram coletadas inflorescências de
três diferentes localidades no município de Valente (BA). As sementes
permaneceram por 60 dias em meio MS sob fotoperíodo de 16 horas com
densidade de fluxo de fótons de 22 E.m-2.s-1 e temperatura de 27 1 ºC. Após
esse período, dez plântulas provenientes de cada inflorescência dos três locais
coletados foram subcultivadas e depois mantidas nas condições in vitro de
conservação do Banco de Germoplasma de Abacaxi e Bromélias da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical (fotoperíodo de 12 horas, com densidade de
fluxo de fótons de 22 E.m-2.s-1 e temperatura 22 1 ºC). As melhores
porcentagens de germinação aos 60 dias, foram obtidas com sementes incubadas
em presença de luz, resultando em taxas de germinação de 100% e 80% para
sementes oriundas de frutos maduros e imaturos, respectivamente. Após cinco
subcultivos, a maior taxa de multiplicação foi obtida no tratamento ANA (0,5 µM) +
BAP (4,4 µM) com a produção de 60,58 brotos/explante. Para o número de raízes,
o meio suplementado com ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM) apresentou uma média
de 37,03, valor significativamente superior aos demais tratamentos. A
aclimatização das plantas apresentou resultados diferenciados em relação aos
substratos testados. Plantmax® (T5) favoreceu o maior desenvolvimento dos
brotos (35,59%) oriundos do meio enriquecido com BAP, enquanto o substrato
Ecoterra® (T2) promoveu maior crescimento nas plantas oriundas do meio com
CIN (37,72%) que apresentavam raízes. A conservação dessa espécie sob
temperatura de 22°C possibilitou a redução do crescimento, quando comparada
às condições normais de cultivo in vitro.
30
Micropropagation and in vitro conservation of Neoglaziovia variegata
(Arruda) Mez, a fiber producing bromeliad from Brazil12
1 Part of Thesis of the first author 2 Capítulo aceito para publicação na revista Brazilian Archives of Biology and Technology ** Author for correspondence
Daniela Garcia Silveira1; Fernanda Vidigal Duarte Souza
2**; Claudinéia Regina Pelacani
3; Antonio da
Silva Souza2; Carlos Alberto da Silva Ledo
2, José Raniere Ferreira de Santana
3
1Doctorate Student in Botany by the State University of Feira de Santana, 44031-460, Feira de Santana, BA,
Brazil, 2Embrapa Cassava and Tropical Fruits, 44380-000, Cruz das Almas, BA, Brazil, 3Plant Tissue
Culture Laboratory at the Botanical Garden Experimental Unit, State University of Feira de Santana,
44055-000, Feira de Santana, BA, Brazil
ABSTRACT
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez is a Bromeliaceae native to the Caatinga, used for fiber extraction in the Northeast Region of Brazil. The antropic activity has place this species among the
threatened ones. The objective of the work was to establish an in vitro propagation and
conservation of caroá. Seeds were cultivated in MS medium in the presence or absence of light. In vitro germinated seedlings were multiplied in MS medium supplemented with the combinations
0.05 and 0.50 µM NAA and 2.2 and 4.4 µM BAP and KIN. The best percentages of germination
were obtained with the seeds incubated in the presence of light. The highest multiplication ratio
was obtained for the NAA (0,5 µM) + BAP (4,4 µM) treatment and the number of roots, with NAA (0.5 µM) + KIN (2.2 µM). Plant acclimatization presented differentiated results regarding the
substrates tested. The conservation was established.
Key words: Acclimatization, Bromeliaceae, Fiber extraction, In vitro preservation, Seedling production.
INTRODUCTION
The Bromeliaceae family is composed by 51
genus and more than 3500 species (Coffani Nunes 2002), all native from the tropical and
subtropical zones of the American continent,
except for the Pitcairnia feliciana species,
found in Africa (Padilha 1978; Reitz 1983). Brazil detains the largest genetic variability
of this family, which vegetates in very humid
places, such as the Mata Atlântica ecosystem (Reitz 1983) and even in very arid regions
such as the Caatinga (Andrade-Lima 1981;
Xavier 1982).
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez is a species which belongs to this family and is
native to the lower stratum of the Brazilian
Caatinga. It has striped leaves, flowers protected by bracts with bright coloration and
fruits as juicy berries (Smith and Downs
1979; Plantas do Nordeste 2004). This species is known in the Northeast Region of
Brazil as caroá and constitutes one of the
most used raw material for use in
craftsmanship in the region, generating jobs
and income for many families. Its leaves are used in fiber extraction which is used for
manufacturing string, hats, purses, rugs,
hammocks, fishing nets and fabrics. The caroá plant, however, has been collected
directly in the Caatinga in extrativism
manner, without any systematization of
cultivation, having practically disappeared in some regions. This can be explained by the
cutting system of the leaves adopted by the
craftswomen and especially by the devastation of the Caatinga for the
development of agriculture and cattle raising
activities in the region, where caroá is
considered a weed and without any commercial value.
Although this species reproduces by seeds, its
propagation is mainly asexual by the development of buds and lateral rhizomes.
The caroá seeds are hard to be found because
animals and birds feed on the green and especially mature berries (Xavier 1982),
hindering the collection of the fruits at the
ideal maturation period. In addition, the
sexual propagation of bromeliads, generally
31
present limitations such as the long period of
seed maturation and the low germination
rates of some species (Fráguas et al. 2002).
Seed germination and in vitro multiplication of bromeliads from tissue culture techniques
are in general, much superior, when
compared to conventional methods (Pierik et al. 1984; Mercier and Kerbauy 1995). The
use of seeds as explants is an interesting
strategy for the conservation purposes, maintaining therefore, the variability of
natural populations, whereas each will
constitute a mother plant (Rech Filho et al.
2005). In species where a cultivation system does not yet exist, maintaining the natural
genetic variability, avoiding the
intensification of genetic erosion caused by accelerated extrativism or by the selection of
few genotypes, is very important. For such,
the development of micropropagation protocols from seeds is an alternative for
conservation of these species in vitro
germplasm banks. Additionally, it can be
used for the production at commercial level, contributing for the production of a high
number of plantlets with better agronomic
performance due to the quality of the plants obtained by this technique. The development
of an efficient propagation method, which
enables the obtainment of healthy plantlets to
be planted, constitutes the first step towards the establishment of a cultivation and
production system avoiding predatory
extrativism. The objectives of the present work were to evaluate the in vitro
germination of caroá seeds and establish a
micropropagation protocol aiming large scale production of plants and in vitro
conservation.
MATERIAL AND METHODS
The work was carried out at the Plant Tissue
Culture Laboratory and greenhouse at
Embrapa Cassava and Tropical Fruits, located in Cruz das Almas, Bahia, Brazil.
In vitro germination The seeds used in this study were taken from
the mature and immature fruits from
inflorescences collected in Valente county, a
semi-arid region of Caatinga in Bahia state, where caroá plants occurs naturally. The
seeds were washed in a water and detergent
solution and rinsed three times in distilled
water. The desinfestation procedure was
carried out under aseptic conditions, in sterile
laminar flow hood, with a solution of 70 %
ethanol for five minutes and later in a 1:1 solution of commercial bleach (2% of active
chlorine) with deionized water for 20
minutes. After each treatment, three successive washes with autoclaved distilled
water were carried out.
For the seed inoculation, test tubes (25 x 150 mm) containing 15 mL of MS (Murashige
and Skoog, 1962) medium supplemented
with 30 g/L of sucrose, solidified with 2 g/L
Phytagel , pH adjusted at 5.8 and autoclaved at 121°C for 20 minutes, were used. The seeds remained for 60 days under a
photoperiod of 16 h with photon flow density
of 22 E.m-2.s
-1 and in the absence of light,
both in growth chamber with controlled
temperature (27 ± 1 °C). During this period, the beginning of seed germination from the
rootlet was observed and after 60 days the
cumulative germination and the ratio of germination (%) of all treatments were
evaluated.
The experimental design was in random
blocks in factorial scheme 2 (presence and absence of light) x 2 (stages of maturation of
fruits), with 25 repetitions per treatment.
Micropropagation of adventitious shoots
and plant development
Plantlets obtained with medium average of 4 cm
in the previous experiment were used as explants for the establishment of this
experiment and distributed in a complete
random design, in factorial scheme 2 [α-
naphthaleneacetic acid (NAA) concentrations]
x 4 [cytokinins: 6-benzylaminopurine (BAP) and kinetin (KIN) in two concentrations] + 1
(additional treatment – control), with eight
repetitions per treatment. All the combinations between the
concentrations of NAA (0.05 µM and 0.5)
with 2.2 and 4.4 µM of BAP and KIN in MS
culture medium supplemented with 30 g/L of sucrose, solidified with 2 g/L of Phytagel
®,
pH 5,8 and sterilized at 121°C, were
analyzed. The additional treatment served as the control group, since the plantlets were
cultivated in the same medium in the absence
of growth regulators. The multiplication was carried out in five sub
cultivations of buds and shoots, and the
longitudinal subdivision of shoots was
32
conducted whenever possible. Sub
cultivations were carried out in intervals of
35 days and the plants maintained under
temperature conditions of 27 1 ºC, 16 h of
photoperiod and light intensity of 22 E.m-
2.s
-1.
For each sub cultivation, the number of shoots and roots of the nine treatments were
evaluated. In order to correct the deviations
in the normal distribution, log (x + 10) was applied for the data obtained from the
variables evaluated in the five sub
cultivations.
Acclimatization of micropropagated plants
Shoots and caroá plants originated from the
fifth sub cultivation in MS medium with NAA (0.5 µM) + BAP (4.4 µM) and NAA
(0.5 µM) + KIN (2.2 µM) were used as
explants for the acclimatization trials. Material originated from the BAP treatment
were considered as shoots, since there was no
root formation, and those originated from the KIN treatment, which developed a root
system, were considered as plants.
The number of leaves (NL) and height of
plant surface (PS), before transferring to test tubes (5 x 20 cm) (initial evaluation) and
after 150 days of acclimatization in
greenhouse (final evaluation), and the survival ratio (SR), were evaluated. For the
NL variable, in order to correct the deviations
in the normal distribution, the transformation
log (x + 10), was applied. The experimental design was in complete blocks in subdivided
plot scheme with 20 repetitions. The plots
contained the following treatments: shoots originated from the NAA (0.5 µM) + BAP
(4.4 µM) treatment and plants from the NAA
(0.5 µM) + KIN (2.2 µM) treatment and by the substrates [washed sand (T1); Ecoterra
®
(T2); coconut fiber (T3); coconut fiber +
Plantmax® (T4); Plantmax
® (T5); vermiculite
(T6); vermiculite + Plantmax® (T7)]. The sub
plots were formed by both periods of
evaluation.
The substrate averages were compared by the Scott-Knott test at 5% probability and the
explants averages and evaluations were
calculated by the Tukey test at 5% probability. The geometric growth ratio (r)
between both periods of evaluation was
calculated for both variables given by the
expression r = tf iV / V 1 100 , in
percentage; whereas Vf refers to the
evaluation in the final period, Vi refers to the
evaluation in the initial period and t refers to
the period, in months, between the evaluations.
In vitro conservation In order to establish an in vitro conservation
protocol for this species, inflorescences from
three different places in Valente county (BA) were collected. For the seed inoculation, test
tubes (25 x 150 mm) containing 15 mL of
MS medium supplemented with 30 g/L of
sucrose, solidified with 2 g/L of Phytagel , pH adjusted at 5.8 and autoclaved at 120 °C for 20 minutes, were used.
The seeds were maintained in this medium
for 60 days under a photoperiod of 16 h and
photon flow density of 22 E.m-2
.s-1 and
temperature of 27 1 ºC. After this period, ten plantlets originated from each
inflorescence from the three locations were sub cultivated in fresh medium and
inoculated in test tubes (25 x 150 mm)
containing 20 mL of culture medium. Each 10 plants of one location made up the
repetitions of one access in the Pineapple and
Bromeliad in vitro Germplasm Bank at Embrapa Cassava and Tropical Fruits,
following all the basic premises for the
introduction of new access in the collections
(Norms SIBRAGEN).
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro germination
The seeds from the mature fruits began to emit the first rootlets between the 10
th and
17th day and finalized between the 30
th and
40th day in the presence and absence of light,
respectively (Figure 1). Seeds originated from immature fruits required a larger period
of time in order to germinate, which occurred
between the 15th and 40
th days after seed
inoculation in the presence of light. However,
in the absence of light, the germination began
on the 20th
day, extending until the 45th
day.
These results indicated that the presence of light accelerated the beginning of seed
germination, regardless of the stage of seed
maturation. In a work reported for Neoregelia bahiana (Ule) L. B. Sm. (Bromeliaceae)
seeds, the germination was obtained between
the sixth day of establishment, extending
33
until the 22nd
day in the presence of light with
a photoperiod of 16 h (Bellintani et al. 2005).
Droste et al. (2005) working with Vriesea
gigantea Gaudich. and V. philippocoburgii Wawra seeds, obtained germination
responses after eight days after inoculation
under the same photoperiod. In fact, seed germination of Bromeliaceae took into
consideration not only the environamental
conditions but also the species. The interaction of both the factors
(luminosity and stage of fruit maturation) in
the in vitro germination capacity of caroá
seeds can be observed in Figure 1. The best germination percentages were obtained with
incubated seeds in the presence of light
resulting in germination rates of 100 and 80% for the seeds originated from mature and
immature fruits, respectively. In the absence
of light, the germination of seeds was reduced, reaching a ratio of 60 and 48%, for
the seeds originated from mature and
immature fruits, respectively.
Regardless of the stage of seed maturation, light requirement for germination
stimuliation in caroá seeds seemed to be a
preponderant factor for this species. The phytochrome present in the seed is
responsible for the absorption of light. In the
presence of the light treatment, it rapidly
reacts from the inactive to the active form;
however, this reaction is slower in the dark, decreasing seed germination (Zaidan and
Barbedo 2004). According to Socolowski &
Takaki (2004) seeds with phytochrome A can germinate under light and darkness
conditions and if just phytochrome B is
present the seeds germinate only in presence of light.
Some native bromeliads that occur in the
Restinga ecosystems produce seeds that
require light for germination (Pinheiro and Borghetti 2003). The percentage of
germination obtained in caroá was, however,
similar to the results obtained with Ananas ananassoides (Baker L. B. Sm) (91.2%), in
the presence of light with a 12 h photoperiod
(Figueiredo et al. 2003) and with V. gigantea (93,9%), with a 16 h photoperiod (Droste et
al. 2005).
The germination of caroá seeds demonstrated
to be efficient since it generated whole plantlets in a period of two months, resulting
a large number of independent plants in the
fruit maturation stage (Figure 3a and 3b).
Figure 1. In vitro cumulative germination of N. variegata (Arruda) Mez seeds originated from mature (MF) and immature fruits (IMF) in the absence and presence of light.
Micropropagation of adventitious shoots
and plant development
The multiplication of the shoots occurred in
all the treatments, whereas the NAA and BAP combination in the medium provided a
higher shoot production compared to the association of NAA and KIN (Table 1). The
maximum multiplication ratio was observed
for the NAA (0.5 µM) + BAP (4.4 µM) treatment, with an average of 60.58
34
adventitious shoots per explant after five sub
cultivations (Figure 2). Similar results were
obtained with other bromeliads such as those
reported by Barboza et al. (2004) that obtained greater amount of buds from
„Smooth Cayene‟ pineapple in culture
medium containing NAA + BAP in comparison to medium supplemented with
NAA + KIN. Other pineapple
micropropagation works reported greater ratios of proliferation using BAP and
cytokinin in concentrations which varied
from 4.4 to 9.9 µM in combination with
NAA (Hirimburegama and Wijesinghe 1992; Macêdo et al. 2003). For the
micropropagation of Cryptanthus sinuosus
(L.B. Smith), an extinct endemic Bromeliaceae from Brazil, the best results
were obtained in MS medium without plant
regulators, or whenever 2.2 µM of BAP and 0.05 µM of NAA was added (Arrabal et al.
2002), whereas other combinations seemed
inhibitory for the shoot development.
Although the addition of NAA and BAP might seem to favor shoot formation in
bromeliads, it should be pointed out that,
depending on the endogenous levels of these regulators in the explants, the responses
obtained could be undesirable indicating the
need for optimization and protocol
adjustment for each target species (Mercier
and Kerbauy 1997; Hirimburegama and Wijesinghe 1992; Karp 1995).
The effect of different combinations of the
phytoregulators, NAA, BAP and KIN, in the number of roots of micropropagated caroá
shoots after five sub cultivations can be
observed in Table 1. The media supplemented with 0.5 NAA presented the
best results in the formation of roots during
the multiplication phase, except for the
medium with 2.2 µM of BAP. The largest number of roots was obtained with the NAA
(0.5 µM) + KIN (2.2 µM) treatment, which
provided an average of 37.03 roots per plant; a significantly superior value compared to the
other combinations (Table 1 and Figure 2).
Kukulczanka and Czastka (1989), propagating various species from the
Bromeliaceae family, in vitro, in RM
medium, obtained rooted shoots using NAA
+ KIN, while the combination NAA + BAP promoted the formation of a greater number
of adventitious shoots; a result similar to the
one obtained in this work.
Table 1. Number of adventitious shoots and of roots in the micropropagation of caroá [N. variegata (Arruda) Mez] after five sub cultivations carried out every 35 days.
Number of shoots
NAA (µM)
BAP (µM) Kinetin (µM)
2.2 4.4 2.2 4.4
0.05 15.825 aA* 18.975 bA 6.257 Bb 10.725 bAB 0.5 11.729 bC 60.575 aA 28.525 Ab 21.375 aB
Control 5.902
Number of roots
NAA (µM)
BAP (µM) Kinetin (µM) 2,2 4,4 2,2 4,4
0.05 4.075 aB 1.400 bB 8.971 Ba 13.050 bA
0.5 3.000 aC 4.200 aC 37.025 aA 17.500 aB
Control 6.536 *Averages followed by the same lower case letters in the column and capital letters in the lanes do not differ
statistically among themselves by the Tukey test at 5% probability.
As far as the morphology of the shoots was
concerned, all the treatments provided normal shoots, without any apparent
abnormality. However, the presence of BAP,
although provided a greater ratio of multiplication, induced the formation of
small shoots and few roots, making the
separation difficult during the transplantation
(Figure 3). On the other hand, the presence of
kinetin provided the formation of well
defined shoots with roots. In many reports regarding Bromeliaceae micropropagation,
this problem was observed in combinations
of BAP with dosages greater than or equal to 4.4 µM and NAA with dosages superior or
equal to 2.5 µM (Macêdo et al. 2003;
Barboza et al. 2004). In order to evaluate the
real efficiency of a micropropagation
35
protocol for a determined species or variety,
the system should be evaluated as a whole,
not observing only the multiplication ratios,
but also the time needed to obtain the entire plant, as well as the effect of the composition
of the culture medium used in the period of
acclimatization.
Acclimatization
The percentage of shoot survival and plants varied from 70 to 100%, whereas the ones
originated from MS medium containing NAA
(0.5 µM) + KIN (2.2 µM), presented higher
ratios in almost all treatments (Figure 2). The
smallest ratio of survival was detected in the substrate containing coconut fiber and
Plantmax®, regardless of the origin of the
plants (culture medium).
Figure 2. Survival of micropropagated shoots of caroá [N. variegata (Arruda) Mez] 150 days of acclimatization in different substrates: washed sand (T1); Ecoterra
® (T2); coconut fiber (T3);
coconut fiber + Plantmax®
(T4); Plantmax® (T5); vermiculite (T6); vermiculite + Plantmax
® (T7).
At 150 days of acclimatization, there was a
significant increase in the number of leaves
of the shoots developed in the Ecoterra®
(T2), Plantmax® (T5) and vermiculita +
Plantmax®
(T7) substrates in comparison to
the other treatments, regardless of the origin
of the plants (culture medium). However, the largest growth ratio of this variable was
observed in the T7 substrate (9,81%),
opposite of what was registered for the
substrates in T3, T4 and T6 (Table 2). The report of a negative growth, such as the one
observed in these treatments, occurred due to
the presence of dry leaves in the shoots and the lack of emission of new leaves, since the
leaves considered in the evaluation of the
variable were green ones. The presence of coconut fiber in two of these treatments
indicated a negative effect of this component
in this result which could be explained by the
high C/N ratio of this substrate, demanding,
therefore, the enrichment with N for better
initial development of the plants (Carrijo et
al. 2004). It would be worth mentioning that the substrate that registered the higest
mortality of plants in the initial phase of
acclimatization contained coconut fiber.The growth ratio regarding the height of the plant
surface, considering the in vitro culture
medium in which these plants were produced
is shown in Table 3. It was noticed that Plantmax
® favored better development of
shoots (35.59%) originated from the medium
enriched with BAP (T5), whereas Ecoterra®
substrate (T2) promoted better growth in the
plants originated from the medium with KIN
(37,72%) that presented roots (Figure 3). Ecoterra
® was a substrate with high organic
matter content, which could have favored the
adherence and better root development, not
0 20 40 60 80 100
Survivel (%)
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
Su
bst
rate
s
NAA (0,5 µM) + BAP (4,4 µM) NAA (0,5 µM) + KIN (2,2 µM)
36
always functional, when taken from
laboratory conditions. Plantmax®, however,
presented the most adequate properties for
the acclimatization of shoots without roots, probably due to its capacity of water
absorption and retention, good aeration and
draining, avoiding the accumulation of humidity and shoot base rot. Substrate is the
factor that mostly affects the rooting and
plays an important role, especially in the species of difficult rooting. According to
Couvillon (1998), an ideal substrate retains
enough water to avoid the dryness of the base
of the stake and once saturated, has adequate porous space to facilitate the rooting and
avoid the development of the diseases. On
the other hand, the adequate substrate should
be available in good quantity and be easy to
handle and cheap (Faria et al. 2001).
These results showed significant differences between the growth ratios observed in the
best treatments, regardless of the presence or
absence of roots, and demonstrated the possibility to acclimatize caroá shoots
without the need of an in vitro stage of
rooting. This implied in the reduction of work and cost in the process as a whole,
considering that the in vitro multiplication
ratio in the NAA (0.5 µM) + BAP (4.4 µM)
medium were much superior than those registered in the medium enriched with KIN.
Table 2. Number of leaves from micropropagated caroá [N. variegata (Arruda) Mez] shoots from
the initial period (0 days) and final (150 days) from acclimatization and growth ratio in different substrates.
Substrate Inicial (1st day) Final (150 days) Growth rate (%)
T1 7.575 aA* 8.000 bA 1.84
T2 7.750 aB 9.703 aA 7.78
T3 7.375 aA 6.543 cB -3.91
T4 6.750 aA 6.571 cA -0.89
T5 7.325 aB 8.897 aA 6.70
T6 6.975 aA 5.842 cB -5.74
T7 7.175 aB 9.500 aA 9.81 *Averages followed by the same lower case letters in the columns and capital letters in the lanes do not differ
statistically among themselves by the Scott-Knott and Tukey test, respectively, at 5% probability. T1 =
washed sand, T2 = Ecoterra®, T3 = coconut fiber, T4 = coconut fiber + Plantmax®, T5 = Plantmax®, T6 =
vermiculite, T7 = vermiculite + Plantmax®.
Table 3. Height (cm) of plant surface of micropropagated caroá shoots [N. variegata (Arruda)
Mez] originally multiplied in the presence of NAA (0.5 µM) + BAP (4.4 µM) and NAA (0.5 µM) +
KIN (2.2 µM) during the initial period (0 days) and final (150 days) of acclimatization and growth
ratio in different substrates.
Substrate NAA + BAP NAA + KIN
Initial
(0 days)
Final
(150 days)
Growth
rate (%)
Initial
(0 days)
Final
(150 days)
Growth
rate (%)
T1 1.950 aB* 2.795 bA 12.75 2.360 aB 3.371 bA 12.62
T2 2.465 aB 3.956 aA 17.08 2.045 aB 5.342 aA 37.72
T3 1.815 aA 1.775 cA -0.74 2.310 aA 2.621 cA 4.30
T4 1.735 aB 2.207 cA 8.35 2.615 aA 2.728 cA 1.42
T5 1.725 aB 4.300 aA 35.59 2.030 aB 3.840 bA 23.67
T6 1.460 aB 2.789 bA 24.08 2.240 aB 3.380 bA 14,70
T7 2.065 aB 4.010 aA 24.76 1.945 aB 3.525 bA 21.92 *Averages followed by the same lower case letters in the columns and capital letters in the lanes do not differ
statistically among themselves by the Scott-Knott and Tukey tests, respectively, at 5% probability. T1 = washed sand, T2 = Ecoterra®, T3 = coconut fiber, T4 = coconut fiber + Plantmax®, T5 = Plantmax®, T6 =
vermiculite, T7 = vermiculite + Plantmax®.
37
Figure 3. Stages of germination, micropropagation and acclimatization of caroá [N. variegata
(Arruda) Mez]: (a) fruits during inflorescence; (b) plantlet after 60 days of inoculation in culture medium; (c) sub cultivated plantlet in culture medium; (d) adventitious shoots originated from
media with and without regulators; (e) small shoots without roots originated from
micropropagation medium with NAA (0.5 µM) + BAP (4.4 µM); (f) developed plants from the medium supplemented with NAA (0.5 µM) + KIN (2.2 µM); (g) plants at 150 days of
acclimatization originated from culture media mentioned earlier in the coconut fiber substrate and
(h) Ecoterra®.
e
g h
d NAA+ BAP NAA+ KIN
Contro
l
c
f
a b
38
In vitro conservation
Plants were maintained in vitro conservation
conditions to the Pineapple and Bromeliad
Germplasm Bank (temperature of 22 1 ºC, photoperiod of 12 h and light intensity of 22
E.m-2
.s-1
). Decrease in the growth ratios was
monitored with the use of controls cultivated under the incubation conditions in the growth
chambers (temperature of 27 1 ºC, photoperiod of 16 h and light intensity of 22
E.m-2
.s-1
). Incubated caroá plants in lower temperatures presented a rate of growth inferior
to the controls, demonstrating the effect of the temperature on the growth. This result was
similar to the in vitro conservation of
pineapple, another plant from the Bromeliaceae family (Souza et al. 2006a). Despite the
differences in response regarding time and in
vitro conservation of different bromeliads,
some varieties were being preserved for a period of one or two years (Souza et al. 2006b).
ACKNOWLEDGEMENTS
We wish to thank CAPES for the doctorate scholarship and BNB and FAPESB for the
financial support.
RESUMO
Neoglaziovia variegata é uma Bromeliaceae nativa da Caatinga, usada para
extração de fibras na Região Nordeste do
Brasil. A atividade antrópica coloca esta
espécie entre as ameaçadas. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma propagação e
conservação in vitro de caroá. Foram cultivadas
sementes em meio MS na presença ou ausência de luz. Plântulas germinadas in vitro foram
multiplicadas em meio MS suplementado com
as combinações de 0,05 e 0.50 µM de NAA e 2.2 e 4.4 µM de BAP e KIN. Foram obtidas as
melhores porcentagens de germinação com
sementes incubadas na presença de luz. A taxa
de multiplicação mais alta foi obtida no tratamento NAA (0,5 µM) + BAP (4,4 µM) e, o
número de raízes, com NAA (0.5 µM) + KIN
(2.2 µM). Aclimatização das plantas apresentou resultados diferenciados em relação aos
substratos testados. A conservação dessa
espécie sob temperatura de 22°C possibilitou a redução do crescimento quando comparada às
condições normais de cultivo in vitro.
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41
CAPÍTULO 3
Development of micropropagated shoots and plants of caroá [Neoglaziovia
variegata (Arruda) Mez)] in different substrates1
1 Artigo submetido para publicação no periódico Acta Horticulturae em dezembro de 2008.
42
RESUMO
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez é uma Bromeliaceae nativa da
Caatinga Nordestina e cuja fibra é usada para confecção de produtos artesanais,
como bolsas, tapetes e chapéus, dentre outros. Entretanto, o extrativismo
predatório e a atividade antrópica têm colocado esta espécie entre as ameaçadas
de extinção demandando estratégias que possam minimizar esse risco. A
produção de mudas em larga escala reduziria o extrativismo indiscriminado e
poderia subsidiar o cultivo racional dessa espécie. As técnicas de cultura de
tecidos como a germinação de sementes imaturas e a multiplicação in vitro se
constituem em ferramentas interessantes para a produção de plantas em nível
comercial, propiciando a produção de um número elevado de mudas sadias, em
qualquer época do ano. No entanto, dentre as etapas da micropropagação a
aclimatização pode se constituir em uma limitação e tornar-se crítica para o êxito
do processo. Em bromeliáceas, de uma forma geral, essa etapa tem sido longa,
onerando o processo e dificultando a compra desse tipo de muda (Rodrigues et
al., 2004; Ferreira et al., 2007). Vários fatores podem influenciar o comportamento
das plantas micropropagadas durante a aclimatização, desde condições
estabelecidas no processo in vitro, ou seja, na fase de produção das plantas,
assim como o tipo de substrato usado para a adaptação das microplantas à
condição autotrófica. Considerando que o sistema radicular adventício produzido
in vitro é, em geral, pouco ramificado, quebradiço e isento de pêlos radiculares,
com raízes pouco funcionais na absorção de água e nutrientes durante a
aclimatização, a eliminação dessa etapa seria desejável sob o ponto de vista
econômico, já que quanto maior a permanência da planta na sala de cultura,
maiores serão os gastos com energia e mão-de-obra. Em vista do exposto, o
objetivo desse trabalho foi determinar um substrato adequado para o
desenvolvimento de brotos e plantas de caroá micropropagadas sem terem
passado pela etapa de enraizamento in vitro. Foram aclimatizados brotos sem
raízes e plantas com raízes (oriundas da fase de multiplicação) provenientes de
dois meios de cultura: Meio 1: MS + 0,5 µM de ANA (ácido naftalenoacético) + 4,4
µM de BAP (6-benzilaminopurina) e Meio 2: MS + 0,5 µM de ANA + 2,2 µM de
CIN (cinetina). O meio 1 deu origem a brotos sem a presença de raízes, enquanto
o meio 2 deu origem a plantas que durante o processo de multiplicação formaram
43
raízes. Esses dois produtos, brotos (ausência de raizes) e plantas (presença de
raízes) foram os explantes de partida para o experimento realizado. O
delineamento experimental foi inteiramente casualizado no esquema de parcela
subdividida no tempo, com 20 repetições. As parcelas foram constituídas pelos
tratamentos: brotos (Meio 1) e plantas (Meio 2) aclimatizados nos seguintes
substratos: [areia lavada (T1); Ecoterra® (T2); fibra de coco (T3); fibra de coco +
Plantmax® (1:2) (T4); Plantmax® (T5); vermiculita (T6); vermiculita + Plantmax®
(1:2) (T7)]. As subparcelas foram formadas por três períodos de avaliação:
período 1 (antes da transferência dos explantes para tubetes), período 2 (aos 150
dias de aclimatização) e período 3 (após 210 dias de aclimatização). Avaliou-se o
número de folhas e altura da parte aérea nos três períodos. A taxa de
sobrevivência, número de raízes, comprimento da maior raiz, a massa seca da
parte aérea e da raiz foram avaliados no período 3. A sobrevivência dos brotos e
plantas durante os 210 dias de aclimatização variou de 65% a 100%, sendo que
as plantas (Meio 2), apresentaram as taxas mais altas em quase todos os
tratamentos, provavelmente devido à presença das raízes. Por outro lado, os
substratos Plantmax® (T5), vermiculita + Plantmax® (T7) e areia (T1) foram os que
apresentaram as maiores taxas de sobrevivência (95% a 100%) para ambos,
plantas ou brotos, tendo favorecido principalmente, a aclimatização dos brotos
sem raiz. Aos 150 dias de aclimatização houve aumento significativo do número
de folhas nos substratos Ecoterra® (T2), Plantmax® (T5) e vermiculita + Plantmax®
(T7), enquanto aos 210 dias o melhor substrato foi o Ecoterra® (T2) comparando-
se com os demais tratamentos, independentemente da origem do que foi
aclimatizado, brotos ou plantas. O desenvolvimento dos brotos foi favorecido pelo
cultivo nos substratos Ecoterra® (T2), Plantmax® (T5) e vermiculita + Plantmax®
(T7), enquanto que para as plantas, o substrato que promoveu o melhor resultado
para altura da parte aérea foi o Ecoterra® (T2). Na variável massa seca da parte
aérea, as plantas (Meio 2) apresentaram maiores médias em relação aos brotos
(Meio 1), proporcionadas pelo uso do substrato Ecoterra® (T2). Para os brotos,
entretanto, não houve diferença estatística desse substrato em relação ao
Plantmax® (T5) ou à vermiculita + Plantmax® (T7). A maior média para o número
de raízes foi observada no substrato fibra de coco (T3) com as plantas que já
apresentavam raízes (CIN), enquanto que para os brotos (BAP) os melhores
resultados foram obtidos nos substratos Plantmax® (T5), vermiculita (T6) e
44
vermiculita + Plantmax® (T7). Contudo, no que se refere ao comprimento da maior
raiz e da massa seca da raiz, independente do tipo de explante, o maior
comprimento de raiz foi obtido no substrato Ecoterra® (T2), que não diferiu
estatisticamente do tratamento Plantmax® (T5). Os resultados obtidos evidenciam
que independente das duas fontes de citocininas utilizadas no meio de cultura
para a micropropagação dessa espécie, é possível sua aclimatização nos
substratos Ecoterra® e Plantmax® sem a necessidade de uma etapa de
enraizamento in vitro, ainda que as plantas que foram multiplicadas no meio de
cultura com CIN, já apresentassem raízes quando foram aclimatizadas. Isso
implica na redução de trabalho e custo do processo como um todo, considerando-
se que as taxas de multiplicação in vitro no meio ANA-BAP foram muito
superiores às registradas no meio enriquecido com CIN. No entanto, o tempo de
aclimatização dessas plantas, 210 dias, ainda é considerado longo, problema que
também ocorre com o abacaxi e outras bromeliaceaes, ressaltando, dessa forma
a necessidade de otimizar essa etapa.
45
ABSTRACT
Caroá (Neoglaziovia variegata) is a native Bromeliaceae of Caatinga used for fiber
extraction in the Northeast region of Brazil. The anthropic activity put this species among
the threatened ones. The work aimed to determine a substrate adapted for an efficient
development of shoots and plants of caroá produced in vitro that were not submitted to the
in vitro rooting stage. Shoots without roots and rooting plants (during the multiplication
phase) were obtained from two culture media: MS with 0.5 µM of NAA (naphtaleneacetic
acid) and 4.4 µM of BAP (6-benzylaminopurine) and MS supplemented with 0.5 µM of
NAA and 2.2 µM of KIN (kinetin). These shoots and plants were acclimatizated in the
following substrates: washed sand, Ecoterra®, coconut fiber, coconut fiber + Plantmax
®,
Plantmax®, vermiculite and vermiculite + Plantmax
®. The best results for direct
acclimatization of shoots and plants of caroá were obtained with Ecoterra® and Plantmax
®
substrates. On the other hand, the results showed the necessity to make a study on
production cost of these in vitro plants, considering the different situations presented in this
work.
keywords: Bromeliaceae, acclimatization, tissue culture, fiber extraction.
46
INTRODUCTION
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez is a native ground-dwelling bromeliad of the
Caatinga (dry-land) region of Brazil that is commonly known as caroá. Its leaves supply
fibers that are widely used in making twine and handcrafts such as hats, sacks, rugs,
hammocks, fishing nets, and clothes, thus generating work and income for many families
in that region. The caroá plant is harvested directly from nature in the caatinga, without
any systematized replanting, and, consequently, has practically disappeared from a number
of regions, leaving this species threatened with extinction.
The first step in establishing a system of cultivation and production to avoid the
predatory harvesting of wild plants is to develop an efficient method of generating healthy
planting stock. A micropropagation protocol for producing planting stocks of caroá has
been successfully developed, but the subsequent growth of the plants during
acclimatization is very slow, and a considerable amount of time is required until the plant
is finally ready to be cultivated (Silveira et al., 2009).
Acclimatization is one of most important (and limiting) phases in the entire process
of micropropagation - and one of the most critical factors involved in plant hardening is in
vitro rooting. Adventitious root systems produced in vitro are generally poorly branched,
fragile, and do not have root hairs - thus being only minimally functional in the absorption
of water and nutrients during acclimatization (Hoffmann et al., 2001). The success of
acclimatization depends on having plants that developed heterotrophically under
conditions of high humidity make a successful transition to autotrophy under conditions of
moderate to low humidity (Zimmerman, 1988).
Bromeliads, in general, require a long period of acclimatization, which drives up
the production costs of the planting stock and makes their commercialization much more
difficult (Souza Junior et al., 2001). This difficulty has generated a series of research
programs involving species of this family that sought to elucidate the factors that influence
the acclimatization period and to find solutions that can minimize this long developmental
phase (Rodrigues et al., 2004; Silva et al., 2006).
The substrate is a fundamental factor in the growth and development of
micropropagated plants, and it is determinant in the acclimatization of these plants. One of
the greatest difficulties encountered by producers has been to find an adequate substrate for
the development of micropropagated bromeliads (Rodrigues et al., 2004).
47
The present work therefore evaluated the acclimatization of shoots and plantlets of
caroá in different substrates to determine the most efficient conditions for producing
micropropagated planting stocks for this species.
48
MATERIAL AND METHODS
The shoots and plantlets used here were derived from micropropagation
experiments with caroá that evaluated different media culture (Silveira et al., 2009). The
results of these experiments indicated that two media culture provided the best in vitro
multiplication rates: Medium 1 - MS (Murashige and Skoog, 1962) + 0.5 µM NAA
(naphthalene acetic acid) + 4.4 µM BAP (6-benzylaminopurine); and Medium 2 - MS +
0.5 µM NAA + 2.2 µM KIN (kinetin). Medium 1 produced shoots without roots, while
Medium 2 produced plantlets with roots during the multiplication phase (without the
necessity of a distinct rooting phase). In order to facilitate the explanation of the results,
shoots are defined as the plant material originating from M1 (without root formation),
while plantlets are defined as the planting stock produced in M2 (with roots).
The experimental design involved all possible combinations of the two different
explants with seven substrates, with 20 repetitions each, using sprouts originating from the
NAA-BAP treatment (Medium 1) and plantlets from the NAA-KIN treatment (Medium 2)
in the following substrates: washed sand (T1); Ecoterra®
(T2); coconut fiber (T3); coconut
fiber + Plantmax® (1:2) (T4); Plantmax
® (T5); vermiculite (T6); and vermiculite +
Plantmax® (1:2) (T7). Three evaluation periods were performed: period 1 - (0 day, before
transferring the explants to the acclimatization), period 2 - (after 150 days of
acclimatization), and period 3 - (after 210 days of acclimatization). All cultivation was
undertaken in misting greenhouse beds.
The numbers of leaves (NL) and height of the aerial portion of the plant (HAP)
were evaluated at each period (0, 150, and 210 days), while the final survival rate (FSR),
the number of roots (NR), the length of the largest root (LLR), the dry weight of the aerial
portion (DWAP), and the dry weight of the root (DWR) were evaluated only at the end of
period 3. The variables HAP, DWAP, and DWR were square root transformed in order to
correct for deviations in the normal distribution of the data.
The averages related to the substrates were grouped using the Scott-Knott test at a
5% probability level, and the averages of the shoots and plantlets and of the other variables
evaluated were compared by the Tukey test at a 5% probability of error. It was calculated
the geometric growth rates (r) for the evaluation periods of 0 to 150 days, 0 to 210 days,
and 150 to 210 days for the variable APA, using the expression r = tf iV / V 1 100 ,
49
where Vf refers to the final evaluation period, Vi to the initial evaluation period (in
percentages), and t to the period in months between the evaluations.
50
RESULTS AND DISCUSSION
The survival of the shoots and plantlets during the 210 days of acclimatization
varied from 65% to 100%, with the plantlets originated in Medium 2 demonstrating the
highest survival rates in almost all of the substrates. The lowest survival rate was seen in
the substrate composed of coconut fiber + Plantmax® with both shoots (without roots) and
plantlets (with roots) (Figure 1). On the other hand, the substrates Plantmax® (T5),
vermiculite + Plantmax® (T7), and sand (T1) produced the highest survival rates (95% to
100%) for both plantlets and shoots, indicating that the lack of roots is not a limiting factor
for the survival of these explants. Plantmax® has a high absorption capacity and can hold a
great deal of water, and it has good aeration and drainage that avoid the accumulation of
excess humidity and rotting at the base of the sprout - very important factors in the initial
phase of hardening of these micropropagated plants. Vermiculite is an inert material that
does not deteriorate and has good aeration and water retention capacity (Gonçalves, 1992).
The 100% survival rate in sand, independent of the presence or not of roots, was an
unexpected result. In spite of the fact that sand has aeration and drainage propertied
favorable to root development, our results did not coincide with those reported by Souza
Junior et al. (2001). These researchers acclimatizated plantlets of pineapple (another type
of bromeliad) on a sand substrate and observed a seriously depressed survival rate (35%),
especially when compared with Plantmax® (100% survival). The results reported here with
caroá suggest that aeration and sufficient watering (humidity) are determinant factors for
the survival of this species during acclimatization.
51
Fig. 1. Survival of micropropagated shoots and plantlets of caroá [N. variegata (Arruda)
Mez] after 210 days of acclimatization in different substrates: washed sand (T1); Ecoterra®
(T2); coconut fibers (T3); coconut fibers + Plantmax®
(T4); Plantmax® (T5); vermiculite
(T6); vermiculite + Plantmax® (T7).
In terms of the numbers of leaves, significant differences in relation to the
substrates were only noted during the course of the temporal evaluations: after 150 days of
acclimatization there were significant increases in the numbers of leaves on both shoots
and plantlets growing in the substrates Ecoterra® (T2), Plantmax
® (T5), and vermiculite +
Plantmax®
(T7); while at 210 days, only the Ecoterra®
(T2) maintained an increase in the
numbers of leaves in comparison with the other treatments (Table 1). This latter substrate
was the only one that demonstrated growing averages in terms of the number of leaves
during the three evaluation periods. The inert substrates, such as sand (T1), coconut fiber
(T3), and vermiculite (T6), did not produce significant leaf growth (actually demonstrating
leaf loss during the evaluation periods) - indicating the importance of the presence and
availability of nutrients during the formation of the aerial portion in the acclimatization
period.
Although Plantmax®
(T5) has adequate concentration of N (present in its
component organic material), and high available P (1.311 mg.L-1
), K (1.870 mg.L-1
), and
Ca + Mg levels (31.43 ME -100cc
) (Couto et al., 2003), Ecoterra (T2) demonstrated a better
performance in terms of leaf growth. Ferreira et al. (2007), studying the effects of different
substrates on the development of the bromeliad Neorogelia cruenta (R. Graham) L. B.
Smith during 300 days, observed that Plantmax® produced the largest numbers of leaves in
52
comparison with the other substrates tested (soil+sand and soil+sand+rice hulls) after 120
days of acclimatization. Moreira et al (2006), however, found that after 90 days of
acclimatization, micropropagated pineapple plants (cv. Pérola) grown in Plantmax®
showed unexceptional results when compared with organic compost, soil + manure, or soil
+ manure + Plantmax®.
Table 1. Average numbers of leaves on micropropagated shoots and plantlets of caroá [N.
variegata (Arruda) Mez] after three acclimatization periods in different substrates.
Substrate Period 1
(0 day)
Period 2
(150 days)
Period 3
(210 days)
T1 7.575 aAB* 8.000 bA 7.225 cB
T2 7.750 aC 9.703 aB 10.486 aA
T3 7.375 aA 6.543 cB 6.400 dB
T4 6.750 aA 6.571 cA 6.428 dA
T5 7.325 aB 8.897 aA 7.949 cB
T6 6.975 aA 5.842 cB 5.921 dB
T7 7.175 aC 9.500 aA 8.725 bB
*Averages followed by the same lower case letter in the same column belong to the same group by the Scott-
Knott test at a 5% probability level; averages followed by the same upper case letter in the same line do not
differ statistically by the Tukey test at a 5 % probability level. T1 = washed sand, T2 = Ecoterra®, T3 =
coconut fiber, T4 = coconut fiber + Plantmax®, T5 = Plantmax®, T6 = vermiculite, T7 = vermiculite + Plantmax®.
Table 2 presents the data referring to the heights of the shoots and plantlets during
the three evaluation periods. Shoot development was favored by cultivation in Ecoterra®
(T2), Plantmax® (T5), and vermiculite + Plantmax
® (T7), while the aerial portion of the
plantlets grew best in Ecoterra® (T2). To facilitate the understanding of these results, the
data is presented in the form of geometric increases in the height of the aerial portions of
the plants during the intervals of 0 to 150 days and 0 to 210 days (Table 3) - which allows
the expression of their real growth during these evaluation periods. It can be seen that the
Plantmax®
substrate promoted the highest growth rate and total growth for the shoots (0 to
210 days), while the best result for plantlets was obtained with Ecoterra®. Ferreira et al.
(2007) reported that Plantmax®
provided the greatest gains in height for micropropagated
plantlets of Neorogelia cruenta (R. Graham) L. B. Smith) during 300 days of
acclimatization. On the other hand, the acclimatization of micropropagated plants of
pineapple using Plantmax®
did not result in significant height gains (Moreira et al., 2006).
Souza Junior et al. (2001) reported that plant height is usually a determinant
variable in defining the suitability of transplanting young plant stock to the field. However,
this variable is not sufficient in itself, as the numbers and the sizes of the leaves also
provide extremely important information about the readiness of the plants - as these organs
53
determine the photosynthetic capacity of the stock and are fundamental to their survival
and full development (Moreira et al., 2006).
Table 2. Average heights (cm) of the aerial portions of micropropagated shoots and
plantlets of caroá [N. variegata (Arruda) Mez] during the three periods of acclimatization
on different substrates.
Substrate SHOOTS PLANTLETS
Period 1
(0 day)
Period 2
(150 days)
Period 3
(210 days)
Period 1
(0 day)
Period 2
(150 days)
Period 3
(210 days)
T1 1.950 bC* 2.795 bB 3.325 bA 2.360 aC 3.735 bB 4.340 bA
T2 2.465 aC 3.955 aB 5.933 aA 2.045 aC 5.342 aB 7.494 aA
T3 1.815 bB 1.775 cB 2.731 cA 2.310 aB 2.621 cAB 3.152 dA
T4 1.735 bC 2.207 cB 3.264 bA 2.615 aB 2.728 cB 3.714 cA
T5 1.725 bC 4.300 aB 5.484 aA 2.030 aC 3.840 bB 4.685 bA T6 1.460 bC 2.789 bB 3.811 bA 2.240 aC 3.380 bB 4.390 bA
T7 2.065 aC 4.010 aB 5.050 aA 1.945 aC 3.525 bB 4.420 bA
*Averages followed by the same lower case letter in the same column belong to the same group by the Scott-
Knott test at a 5% probability level; averages followed by the same upper case letter in the same line do not
differ statistically by the Tukey test at a 5 % probability level. T1 = washed sand, T2 = Ecoterra®, T3 =
coconut fiber, T4 = coconut fiber + Plantmax®, T5 = Plantmax®, T6 = vermiculite, T7 = vermiculite +
Plantmax®.
Table 3. Geometric growth rate (%) of the aerial portion of micropropagated sprouts and
plantlets of caroá [N. variegata (Arruda) Mez] growing in different substrates.
Substrate SHOOTS PLANTLETS
0 to 150
days
150 to 210
days
0 to 210
days
0 to 150
days
150 to 210
days
0 to 210
days
T1 7.08 10.06 7.92 9.62 7.80 9.09
T2 9.92 22.48 13.37 21.17 18.44 20.39
T3 -0.44 24.04 6.01 2.56 9.66 4.54
T4 4.93 21.61 9.45 0.85 16.68 5.14
T5 20.04 12.93 17.97 13.60 10.46 12.69 T6 13.82 16.89 14.69 8.58 13.97 10.09
T7 14.19 12.22 13.63 12.63 11.98 12.44
Substrates: T1 = washed sand, T2 = Ecoterra®, T3 = coconut fiber, T4 = coconut fiber + Plantmax®, T5 =
Plantmax®, T6 = vermiculite, T7 = vermiculite + Plantmax®.
Evaluations performed after 210 days of acclimatization (Table 4) indicated that the
numbers of roots (NR) and the dry weight of the aerial portions of the plantlets (DWAP)
varied among the different substrates and according to the type of explant. The largest
average number of roots was observed using the coconut fiber substrate (T3) with plantlets
that had produced some roots before being transplanted (KIN), while Plantmax® (T5),
54
vermiculite (T6), and vermiculite + Plantmax®
(T7) gave the best results with the originally
rootless sprouts (BAP).
In relation to the dry weight of the aerial portion (DWAP), plantlets demonstrated
better results in almost all of the treatments as compared to shoots, with the best overall
result being seen with Ecoterra®. The DWAP value obtained with this substrate (0.898g)
was greatly superior to the others, for both the plantlets and the shoots.
The fact that plantlets demonstrated not only the largest number of roots, but the
largest dry mass (thus the greatest overall growth of roots), is most probably due to the pre-
established root system brought with them from the multiplication phase in the medium
with KIN. Although roots generated in vitro tends to function poorly, the subsequent
growth once rhizogenesis has been initiated in vitro will favor the growth of the plantlets in
the acclimatization phase. Shoots, the other hand, need to develop the entire root system
during their ex vitro acclimatization; this demands more time, and results in less overall
development as compared to the plantlets.
The largest principal root lengths were observed with the Ecoterra® (T2) substrate
for both types of explants, with statistically similar results being seen with Plantmax® (T5)
(Table 5). To the dry weight of the root (DWR) the best results were obtained with
Ecoterra® (T2), Plantmax
® (T5) and vermiculite+Plantmax
® (T7) for both types of explants
(Table 5). The planting substrate greatly influences the architecture of the root system and
this is of overwhelming importance in the aeration and adherence of these plant organs
(Hoffmann et al., 2001). An adequate substrate must have good water retention capacity,
optimal pore volumes occupied by gases, and an adequate diffusion rate for oxygen
(Hartmann and Kester, 1990). Nunes (2000) reported that coconut powder is an excellent
organic material for substrate mixtures due to its ability to retain humidity and to aerate the
culture medium, in addition to its growth stimulating properties. The results reported here,
however, were not very positive for pure coconut fiber if the development of the whole
plant was considered, and not just the root system.
55
Table 4. Averages of the numbers of roots (NR) and the dry weight of the aerial portion
(DWAP) of micropropagated shoots and plantlets of caroá [N. variegata (Arruda) Mez]
grown in NAA (0.5 µM) + BAP (4.4 µM) or in NAA (0.5 µM) + KIN (2.2 µM) after 210
days of acclimatization in different substrates.
Substrate NR DWAP (g)
SHOOTS PLANTLETS SHOOTS PLANTLETS
T1 4.100 bA* 5.000 bA 0.114 bA 0.163 cA
T2 3.900 bB 6.500 bA 0.371 aB 0.898 aA
T3 3.000 bB 8.500 aA 0.059 bB 0.172 cA
T4 3.000 bB 5.800 bA 0.079 bA 0.133 cA
T5 5.400 aA 6.400 bA 0.229 aA 0.272 bA
T6 4.700 aA 5.200 bA 0.119 bB 0.237 bA
T7 5.800 aA 6.500 bA 0.274 aA 0.270 bA
*Averages followed by the same lower case letter in the same column belong to the same group by the Scott-
Knott test at a 5% probability level; averages followed by the same upper case letter in the same line do not
differ statistically by the Tukey test at a 5 % probability level. T1 = washed sand, T2 = Ecoterra®, T3 =
coconut fiber, T4 = coconut fiber + Plantmax®, T5 = Plantmax®, T6 = vermiculite, T7 = vermiculite +
Plantmax®.
Table 5. Average lengths of the largest root (LLR) and dry weight of the roots (DWR) of
micropropagated shoots and plantlets of caroá [N. variegata (Arruda) Mez] after 210 days
of acclimatization in different substrates.
Substrate LLR (cm) DWR (g)
T1 5.360 c* 0.067 b
T2 10.785 a 0.129 a
T3 2.885 d 0.017 c
T4 4.390 c 0.017 c
T5 10.330 a 0.111 a
T6 7.770 b 0.047 b
T7 8.900 b 0.112 a
*Averages followed by the same lower case letter in the same column belong to the same group by the Scott-
Knott test at a 5% probability level. T1 = washed sand, T2 = Ecoterra®, T3 = coconut fiber, T4 = coconut fiber + Plantmax®, T5 = Plantmax®, T6 = vermiculite, T7 = vermiculite + Plantmax®.
Considering all of the variables analyzed in the present work, it can be seen that of
the seven substrates utilized, T2 (Ecoterra®
), T5 (Plantmax®), and T7
(vermiculite+Plantmax®) favored the greatest overall growth of the shoots and promoted ex
vitro root growth. With plantlets, however, which already had a certain degree of root
system development before initiating acclimatization, the best growth results were
obtained using Ecoterra® and Plantmax
®. These latter two substrates gave good results for
both shoots and plantlets, probably due to their high nutrient content and good aeration
qualities. According to Couvillon (1998), an ideal substrate is one that retains sufficient
water to avoid desiccation of the base of the explant, but which also has adequate pore
56
spaces that facilitate rooting and avoid diseases. Hartmann and Kester (1990) noted that the
principal effects of any substrate will be manifested by the plant roots, but will also be
reflected in the growth of the aerial portion. Commercial substrates help guarantee the
repeatability of research results and the commercial production of plantlets due to
uniformity in their chemical compositions and physical properties (Hoffmann et al., 2001).
Studies undertaken by Skrebsky et al. (2006) verified that Plantmax® demonstrated
favorable values for density, water retention, total porosity, aeration space, water
availability, and easily available water. Neto et al. (1999) noted, however, that although
Plantmax® demonstrated excellent physical characteristics, it was still necessary to
complement it with additional nutrients in order to obtain high-quality stock plants.
Even though our results indicated that it is possible to stimulate ex vitro rooting in
shoots obtained through micropropagation, the presence of a pre-formed root system
greatly favors development of plantlets within the same time frame. Interestingly, while
Medium 2 (NAA-KIN) promoted root formation in vitro (without the necessity of a rooting
phase) and generated plantlets that demonstrated the best development during
acclimatization, it had a multiplication rate significantly lower than that of Medium 1
(NAA-BAP) (which produced sprouts without roots). As such, it will be necessary to
closely evaluate the real overall costs of generating explants in vitro all the way through to
final field planting in order to be able to determine which process is most economically
efficient: rooting during the in vitro phase of multiplication, establishing a specific phase
for in vitro rooting, or direct acclimatization of sprouts without roots.
57
CONCLUSIONS
1. Plantlets originating from Medium 2 (NAA-KIN) demonstrated better development than
shoots produced in Medium 1 (NAA-BAP) that were acclimated prior to root formation.
2. The substrates Ecoterra and Plantmax®
promoted the greatest growth and development
for both kind of explants during the acclimatization phase.
3. The time required for full acclimatization of the plantlets (210 days) is still very long,
indicating the need for developing new techniques and undertaking more detailed studies
of production costs.
58
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60
CAPÍTULO 4
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas micropropagadas de caroá
(Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez)1
1 Artigo submetido para publicação no periódico Plant Cell Culture & Micropropagation em janeiro
de 2009.
61
RESUMO
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez pertence à família das Bromeliáceas e é largamente
usada para a extração de fibras na Região Nordeste do Brasil, constituindo-se em atividade
econômica importante para famílias da Região pela confecção de produtos artesanais.
Atividades antrópicas têm causado perdas severas na espécie. Para otimizar a produção de
plantas in vitro avaliou-se o efeito da interação entre ANA (0,0 µM; 0,5 µM e 5,3 µM) e
CIN (0,0 µM, 2,2 µM e 4,4 µM) no meio de cultura MS, visando estabelecer um protocolo
para enraizamento in vitro e, posteriormente, a aclimatização ex vitro das plantas no
substrato Plantmax®. Verificou-se que a presença de ANA no meio de cultura MS é de
fundamental importância na aceleração do processo de enraizamento in vitro de caroá e
que a aclimatização das mudas originados dos meios com a presença da ANA foram os que
apresentaram os melhores resultados para as variáveis analisadas.
Termos para indexação: Bromeliaceae, cultura de tecidos, fibras vegetais.
62
In vitro rooting and aclimatization of micropropagated plants from caroá
(Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez)
ABSTRACT
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez belongs to Bromeliacea family and is wide used for
fiber extraction in the Northeast Region of Brazil constituting a very important economical activity
for several Northeastern families with the manufacturing of artisanal products. Anthropic
activity has been caused important losses in this species demanding strategies to plant
production. To optimize the in vitro production of plants from Caroá the effect of
interaction between NAA (0,0 µM; 0,5 µM e 5,3 µM) and KIN (0,0 µM, 2,2 µM e 4,4 µM)
in MS media with the aim to established a rooting protocol was evaluated. The
acclimatization on in vitro plants was carried out in Plantmax®. The evaluations showed
that the NAA in media culture is fundamental to in vitro rooting of caroá plants and
promoted the best results in evaluated parameters.
Index terms: Bromeliaceae, tissue culture, fibers plants.
63
INTRODUÇÃO
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez é uma espécie de Bromeliaceae, nativa do
estrato baixo da Caatinga e conhecida na Região Nordeste do Brasil como caroá. Suas
fibras já foram usadas para produção de linho no século passado e atualmente são usadas
na confecção de produtos artesanais, gerando empregos e renda para famílias da Região
Nordeste (Barros, 1941; Ribeiro, 2007).
A coleta predatória e a falta de um sistema de produção organizado têm causado
perdas significativas na espécie e em algumas regiões o caroá já pode ser considerado
como espécie ameaçada de extinção. Planta de propagação prioritariamente vegetativa,
ainda que possa ocorrer de forma sexuada, possui taxa de multiplicação baixa, o que se
constitui em uma limitação para a produção de mudas e, conseqüentemente para o
estabelecimento de cultivos racionais.
Desde 2005 estudos vêm sendo realizados com vistas ao desenvolvimento de um
protocolo de propagação de caroá que permita a obtenção de mudas sadias, constituindo-se
no primeiro passo para o estabelecimento de um sistema de cultivo e produção, a fim de se
evitar o extrativismo predatório. A micropropagação do caroá mostrou-se possível, quando
a partir de plântulas germinadas in vitro, milhares de plantas foram produzidas (Silveira et
al., 2009a). No entanto, dentre as etapas dessa técnica, o enraizamento in vitro e posterior
transferência dos brotos enraizados para condições ambientais são as mais críticas. Nesse
momento, ocorre a transição do heterotrofismo para o autotrofismo, em condições ex vitro
(Sciutti & Morini, 1993), havendo um número expressivo de espécies vegetais
micropropagadas que não sobrevive nesse período (Hararika, 2003), devido ao sistema
radicular adventício produzido in vitro ser, em geral, pouco ramificado, quebradiço e
isento de pêlos radiculares, com raízes pouco funcionais na absorção de água e nutrientes
durante a aclimatização (Hoffmann et al., 2001).
64
Na fase de enraizamento in vitro, diversas auxinas, isoladamente ou em
combinação, podem ser utilizadas para a maioria das espécies (Bosa et al., 2003),
principalmente em espécies ornamentais, pois as características de interesse comercial são
mantidas (Tagliacozzo, 1998). Contudo, diversas espécies, principalmente as herbáceas,
enraízam facilmente in vitro, em meio básico sem reguladores de crescimento ou com
baixa concentração de auxinas (Anderson, 1984). Além disso, Gupta (1986) e Barboza et
al. (2004) referem-se à adição de citocinina como favorável ao enraizamento. Nesse
contexto, Hartmann & Kester (1990) apontam a necessidade de estudos para determinar o
melhor regulador e a concentração ideal, visto que as espécies respondem de forma
diferenciada.
O caroá, à semelhança de outras plantas da família Bromeliaceae, necessita de um
longo período de aclimatização, demandando estudos que possam melhorar o desempenho
das plantas nesta etapa e tornar o processo mais eficiente. A indução da rizogênese in vitro
pode auxiliar na melhoria desse processo.
Em vista do exposto e visando otimizar a produção de mudas de caroá, objetivou-se
avaliar o efeito de reguladores de crescimento que pudessem favorecer o enraizamento in
vitro e, posteriormente, a aclimatização de plantas de caroá.
65
MATERIAL E MÉTODOS
Para a avaliação do enraizamento in vitro, utilizou-se como explantes brotos e
plantas de caroá provenientes do quinto subcultivo em meio de cultura MS (Murashige &
Skoog, 1962) com 0,5 µM de ANA (ácido naftalenoacético) + 4,4 µM de BAP (6-
benzilaminopurina), MS com 0,5 µM de ANA + 2,2 µM de CIN (cinetina) e MS com 0,5
µM de ANA + 4,4 µM de CIN (Silveira et al., 2009a). Considerou-se como broto o
explante oriundo do tratamento com BAP, pois não havia presença de raízes e, como
plantas, o que foi originado do tratamento com CIN, que apresentavam um sistema
radicular desenvolvido durante a etapa de multiplicação. Contudo, essas raízes foram
eliminadas, limpando-se a base das plantas antes de serem introduzidas nos diferentes
meios de cultura.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial
3x3x3 (meios de multiplicação x concentrações de ANA x concentrações de CIN) com 25
repetições por tratamento. Foram analisadas todas as combinações entre concentrações de
ANA (0,0 µM; 0,5 µM e 5,3 µM) e CIN (0,0 µM, 2,2 µM e 4,4 µM) em meio de cultura
MS suplementado com 30 g/L de sacarose, solidificado com 2 g/L de Phytagel®
, pH 5,8 e
esterilizado a 120 °C.
Os explantes foram incubados sob condições de temperatura de 27 1 ºC,
fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons de 22 E.m-2
.s-1
. Após 60 dias de
cultivo, avaliou-se a taxa de enraizamento (TE), o número de folhas (NF), altura da parte
aérea (APA), o número de raízes (NR) e o comprimento da maior raiz (CMR). Nas
variáveis NF, APA e CMR aplicou-se a transformação raiz quadrada e na variável NR
utilizou-se log (x + 10) a fim de se corrigir desvios na distribuição normal dos dados.
66
Para a etapa de aclimatização as mudas obtidas do experimento de enraizamento in
vitro foram transplantadas em tubetes contendo o substrato Plantmax®
e mantidas em
estufa sob nebulização durante 210 dias.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema de parcela
subdividida no tempo, com 25 repetições. As parcelas foram constituídas pelos tratamentos
do experimento anterior e as subparcelas foram formadas por três períodos de avaliação:
período 1 (antes da transferência dos explantes para tubetes), período 2 (aos 90 dias de
aclimatização) e período 3 (após 210 dias de aclimatização). Essas avaliações foram
realizadas nesses períodos visando obter uma melhor distribuição das leituras para
observar o desenvolvimento das mudas.
Nos três períodos avaliou-se o número de folhas (NF) e altura da parte aérea
(APA). As variáveis taxa de sobrevivência (TS), comprimento da maior raiz (CMR), massa
seca da parte aérea (MSPA) e massa seca da raiz (MSR) só foram estudadas no período 3.
A variável número de raízes (NR) foi avaliado nos períodos 1 e 3. Nas variáveis APA,
MSPA e MSR aplicaram-se a transformação raiz quadrada a fim de se corrigir desvios na
distribuição normal dos dados.
As médias referentes aos tipos de meios foram camparadas pelo teste de Scott-
Knott a 5% de probabilidade e as médias dos explantes e das variáveis avaliadas foram
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.
67
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A resposta rizogênese variou de 80% a 100%, sendo que as plantas oriundas do
meio MS com ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 e 4,4 µM) apresentaram taxas de enraizamento
mais altas em todos os tratamentos (Figura 1). As menores taxas de enraizamento (84%,
88% e 80%) foram registradas com os brotos nos tratamentos 1, 2 e 3, respectivamente, os
quais só continham a cinetina no meio de cultura, com exceção do tratamento 1 que foi
usado como testemunha, não contendo nenhum regulador de crescimento. Estudos com
enraizamento in vitro de brotos de abacaxi provenientes do meio com ANA + BAP
realizado por Barboza et al. (2004) obtiveram 12% de enraizamento in vitro quando
cultivados no meio com a presença de cinetina.
FIGURA 1. Enraizamento in vitro de brotos e plantas micropropagados de caroá [N.
variegata (Arruda) Mez] após 60 dias cultivados em meio MS com as diferentes
combinações de ANA e Cinetina: ANA (0,0 µM) + CIN (0,0 µM) (T1); ANA (0,0 µM) +
CIN (2,2 µM) (T2); ANA (0,0 µM) + CIN (4,4 µM) (T3); ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM)
(T4); ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM) (T5); ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM) (T6); ANA
(5,3 µM) + CIN (0,0 µM) (T7); ANA (5,3 µM) + CIN (2,2 µM) (T8); ANA (5,3 µM) +
CIN (4,4 µM) (T9).
68
Esses resultados evidenciam a necessidade da presença da auxina no meio de
cultura para obtenção de taxas mais elevadas no enraizamento in vitro dos brotos de caroá,
corroborando com os resultados que foram encontrados no enraizamento in vitro de
explantes de Vriesea cacuminis L.B.Smith (Bromeliaceae) proveniente de meios de cultura
com BAP ou GA3 (Mendes et al., 2007).
A maior formação de folhas foi observada nos brotos de caroá em relação às plantas
oriundas do meio MS com ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 e 4,4 µM) (Tabela 1). O maior
número de folhas dos brotos (15,88) foi obtido no meio com ANA (5,3 µM) + CIN (2,2
µM), apesar deste valor não diferir estatisticamente quando este explante foi cultivado no
meio com a mesma concentração de ANA sem a presença da cinetina (14,92). As plantas
também apresentaram comportamento semelhante nessa variável, pois as maiores médias
foram obtidas na ausência de cinetina no meio de cultura.
Na Tabela 1 observa-se que o meio com a maior concentração de ANA (5,3 µM)
sem a presença de cinetina foi o mais eficiente para as variáveis altura da parte aérea e
número de raízes. Contudo, a altura mais expressiva (4,16cm) foi verificada nas plantas
provenientes do meio de multiplicação ANA + CIN (2,2 µM) e para o número de raízes os
brotos oriundos do meio ANA + BAP (4,4 µM) apresentaram a maior quantidade de raízes
(8,80).
Com relação ao comprimento da maior raiz (Tabela 1) o meio sem reguladores de
crescimento proporcionou a melhor resposta para brotos e plantas, exceto para as plantas
provenientes do meio de multiplicação ANA + CIN (4,4 µM) que apresentaram o maior
comprimento na presença de 0,5 µM de ANA. Entretanto, esse tratamento não diferiu
estatisticamente do meio de cultura sem reguladores (Testemunha).
Em geral observou-se que houve uma diminuição do comprimento das raízes
conforme o aumento da concentração de ANA no meio de cultura (Tabela 1). Silva et al.
69
(2007) obtiveram resultados semelhantes utilizando a auxina, ácido idol-butírico (IBA), no
enraizamento in vitro de Aloe vera L. Salisbury & Roos (1991) relataram que existe
necessidade da presença de auxina na fase de indução do sistema radicular, porém o
aumento da concentração de ANA ou IBA no meio pode ocasionar a inibição completa do
crescimento radicular.
TABELA 1. Valores médios do número de folhas (NF), altura (cm) da parte aérea (APA),
número de raízes (NR) e comprimento da maior raiz (CMR) das plantas de caroá
[Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] após 60 dias de enraizamento in vitro.
NF
Meio de Multiplicação
ANA + BAP (4,4 µM) ANA + CIN (2,2 µM) ANA + CIN (4,4 µM)
CIN
(µM)
ANA (µM)
0 0,5 5,3 0 0,5 5,3 0 0,5 5,3
0 9,32aC* 11,20aB 14,92aA 10,75aA 10,16aA 10,56aA 9,12aB 9,76aB 10,24aA
2,2 7,92bB 8,36bB 15,88aA 9,16bA 8,72bA 9,28aA 7,68bB 7,68bB 9,52abA
4,4 8,00bB 9,52bA 9,84bA 6,38cB 7,60bA 7,72bA 7,60bA 8,40bA 8,60bA
APA
Meio de Multiplicação
ANA + BAP (4,4 µM) ANA + CIN (2,2 µM) ANA + CIN (4,4 µM)
CIN
(µM)
ANA (µM)
0 0,5 5,3 0 0,5 5,3 0 0,5 5,3
0 2,78aA 3,08aA 3,08aA 3,26aB 3,50aB 4,16aA 3,34aA 3,34aA 3,71aA
2,2 1,96bA 2,29abA 2,12bA 3,14aA 2,60bA 3,16bA 1,99bB 2,01bB 3,52bA
4,4 2,32abAB 1,94aB 2,66abA 2,01bB 2,34bAB 2,81bA 1,96bA 2,15bA 2,42bA
NR
Meio de Multiplicação
ANA + BAP (4,4 µM) ANA + CIN (2,2 µM) ANA + CIN (4,4 µM)
CIN (µM)
ANA (µM) 0 0,5 5,3 0 0,5 5,3 0 0,5 5,3
0 4,52aB 4,96aB 8,80aA 4,04aB 3,36aB 7,95aA 4,08aB 4,52aB 7,52aA
2,2 2,28bB 3,60abB 7,80aA 3,40aB 3,08aB 5,96aA 4,00abA 3,48aB 6,64aA
4,4 1,84bB 2,84bB 7,84aA 3,24aA 3,60aA 4,15bA 2,56bA 2,95aAB 4,32bA
CMR
Meio de Multiplicação
ANA + BAP (4,4 µM) ANA + CIN (2,2 µM) ANA + CIN (4,4 µM)
CIN
(µM)
ANA (µM)
0 0,5 5,3 0 0,5 5,3 0 0,5 5,3
0 5,01aA 4,75abA 2,63abB 4,53aA 3,61aB 2,30aC 3,37aA 3,78aA 1,86aB
2,2 3,27bB 4,80aA 2,09bC 3,43bA 3,41aA 2,54aB 2,74abA 2,15bAB 1,83aB
4,4 2,87bB 3,93bA 3,32aAB 2,52cA 3,65aB 2,33aA 2,48bA 2,69bA 1,99aA
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula dentro das colunas e maiúscula nas linhas em cada tipo de
explante não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
70
Com base nesses resultados verifica-se que a presença de ANA no meio de cultura
MS é de fundamental importância na aceleração do processo de enraizamento in vitro de
caroá, tanto para os explantes provenientes dos meios com BAP e cinetina. Muitos autores
em estudos com outras espécies de Bromeliaceaes observaram resultados similares com o
uso de ANA no meio (Pierik, 1984; Mercier & Kerbauy, 1992, 1993; Barboza et al., 2004;
Mendes et al., 2007). Em geral, o aumento na concentração de auxinas adicionadas ao
meio de cultura, com o propósito de induzir enraizamento, é favorável até uma
determinada concentração, a partir do qual o efeito pode se tornar contrário, sendo
influenciada pela espécie, pelo tipo de explante e da concentração de auxina endógena que
o tecido utilizado possui (Mendes et al., 2007). Sendo assim, a formação de raízes dos
explantes de caroá cultivados em meio sem reguladores de crescimento, provavelmente
ocorreu devido ao acúmulo de auxinas endógenas provenientes das folhas e principalmente
das gemas. Segundo Coll et al. (1988) a parte aérea da planta é fonte de intensa produção
de auxina que, ao ser translocada para base, estimula a rizogênese.
Na aclimatização das mudas enraizadas in vitro com o substrato Plantmax®
observou-se que após 210 dias de aclimatização a taxa de sobrevivência variou de 72 a
100% para as mudas multiplicadas em meio ANA + BAP (4,4 µM), sendo que as menores
taxas foram obtidas nos tratamentos em que a cinetina estava presente no meio de
enraizamento, exceto no tratamento 2. Já para as mudas multiplicadas dos meios ANA +
CIN (2,2 e 4,4 µM) a taxa de sobrevivência foi de 80 a 100%, apresentando as maiores
taxas nas plantas que foram cultivadas sem ANA e com a menor concentração de cinetina
(Figura 2).
71
FIGURA 2. Sobrevivência das mudas de caroá [N. variegata (Arruda) Mez] originadas de
diferentes meios de multiplicação e enraizadas in vitro em diferentes tratamentos após 210
dias de aclimatização. T1: ANA (0,0 µM) + CIN (0,0 µM); T2: ANA (0,0 µM) + CIN (2,2
µM); T3: ANA (0,0 µM) + CIN (4,4 µM); T4: ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM); T5: ANA
(0,5 µM) + CIN (2,2 µM); T6: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM); T7: ANA (5,3 µM) + CIN
(0,0 µM); T8: ANA (5,3 µM) + CIN (2,2 µM); T9: ANA (5,3 µM) + CIN (4,4 µM).
Na Tabela 2 pode-se observar que as maiores médias do número de folhas foram
obtidas nos períodos 1 e 2 para todos os tratamentos dos três tipos de explantes
provenientes do meio de multiplicação (brotos e plantas), ocorrendo uma diminuição dessa
variável no período 3. Contudo, as mudas enraizadas no meio ANA (0,5 µM) + CIN (0,0
µM) (T4) foram as que apresentaram as maiores médias para todos os explantes após os
210 dias de aclimatização. Essa diminuição do número de folhas também foi observada na
aclimatização direta dos brotos de caroá utilizando o substrato Plantmax®, isso pode ser
devido a uma deficiência na disponibilidade e aporte de nutrientes, precisando assim uma
adubação foliar para ajudar no desenvolvimento das mudas (Silveira et al., 2009b).
A altura da parte aérea (APA) das mudas de caroá apresentou resultados
semelhantes para os três tipos de explantes provenientes dos diferentes meio de
72
multiplicação (Tabela 2). Aos 210 dias de aclimatização obteve-se as maiores médias para
essa variável, sendo que as mudas enraizadas no tratamento 4 foram as que mais se
destacaram independentemente do meio de multiplicação utlizado. Apesar que as mudas
originadas dos meios ANA + CIN (2,2 e 4,4 µM) apresentaram a maior média nos
tratamentos 7 e 8 respectivamente, porém não diferiram estatisticamente da média do
tratamento 4.
TABELA 2. Valores médios do número de folhas (NF) e altura (cm) da parte aérea (APA)
de mudas de caroá [N. variegata (Arruda) Mez] originadas de diferentes meios de cultura e
enraizadas in vitro em diferentes tratamentos em três períodos da aclimatização.
NF
Meio de Multiplicação
Tratamento
ANA+BAP (4,4 µM) ANA+CIN (2,2 µM) ANA+CIN (4,4 µM) Períodos de avaliação (dias)
0 90 210 0 90 210 0 90 210 T1 9,32cB* 10,61aA 6,83bC 10,75aA 11,33aA 7,60bB 9,12aA 9,68bA 7,08bB
T2 7,92dA 8,00bA 6,50bB 9,16bB 10,24bA 7,36bC 7,68bB 8,88cA 6,24bC
T3 8,00dAB 8,60bA 7,54aB 6,38dB 7,65dA 6,00cB 7,60bA 8,25cA 6,39bB
T4 11,20bA 10,08aB 8,20aC 10,16aA 11,13aA 8,80aB 9,76aB 11,30aA 8,00aC
T5 8,36dB 10,04aA 7,24aB 8,72bA 9,60cA 5,95cB 7,68bB 8,95cA 6,66bB
T6 9,52cA 8,12bB 6,29bC 7,60cB 9,35cA 6,35cC 8,40bB 9,95bA 6,73bC
T7 14,92aA 8,96bB 6,28bC 10,56aA 10,00bA 7,13bB 10,24aA 9,31bA 7,59aB
T8 15,88aA 8,75bB 5,60bC 9,28bA 9,28cA 6,72cB 9,52aB 10,83aA 7,37aC
T9 9,84cA 10,15aA 6,70bB 7,72cB 9,29cA 6,79cB 8,60bA 9,40bA 6,92bB
APA
Meio de Multiplicação
Tratamento
ANA+BAP (4,4 µM) ANA+CIN (2,2 µM) ANA+CIN (4,4 µM) Períodos de avaliação (dias)
0 90 210 0 90 210 0 90 210 T1 2,78aB 3,27aB 5,43bA 3,26bB 2,75bB 5,88aA 3,34aA 2,56aB 3,92bA
T2 1,96bC 2,83aB 4,62cA 3,14cB 2,63bB 5,24bA 2,00bB 1,96bB 3,55cA
T3 2,32bB 2,46bB 5,11bA 2,01dB 2,11bB 4,45bA 1,96bB 1,57bB 3,18cA
T4 3,08aB 3,06aB 6,16aA 3,50bB 2,91bA 6,35aA 3,34aB 2,97aB 5,47aA
T5 2,29bC 3,03aB 5,69aA 2,60cB 2,64bB 4,53bA 2,01bB 2,01bB 3,72cA
T6 1,94bB 2,14bB 4,55cA 2,34dB 2,69bB 4,50bA 2,15bB 1,97bB 4,35bA
T7 3,08aC 2,36bB 5,25bA 4,16aB 4,13aB 6,92aA 3,71aB 2,71aC 5,29aA
T8 2,12bB 1,75cB 3,72dA 3,16bB 2,60bC 4,82bA 3,52aB 3,03aB 6,20aA
T9 2,66aB 2,93aB 6,04aA 2,81cB 2,62bB 4,57bA 2,42bB 2,26aB 4,17bA
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas pertencem ao mesmo grupo pelo teste de Scott-
Knott a 5% de probabilidade e pela mesma letra maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si
pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. T1: ANA (0,0 µM) + CIN (0,0 µM); T2: ANA (0,0 µM) + CIN
(2,2 µM); T3: ANA (0,0 µM) + CIN (4,4 µM); T4: ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM); T5: ANA (0,5 µM) +
CIN (2,2 µM); T6: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM); T7: ANA (5,3 µM) + CIN (0,0 µM); T8: ANA (5,3 µM)
+ CIN (2,2 µM); T9: ANA (5,3 µM) + CIN (4,4 µM).
73
Na variável número de raízes as mudas originadas dos meios de multiplicação
apresentaram respostas similares, sendo que no período 1 as maiores médias foram obtidas
no meio de enraizamento T7 (Tabela 3). Contudo, aos 210 dias observou-se aumento dessa
variável nos tratamentos 1 a 6 e uma diminuição nos tratamentos 7 a 9. O maior número de
raízes (8,00) foi observado no tratamento 1 para os explantes originados do meio com
ANA-BAP, contudo esse valor não diferiu estatisticamente dos demais tratamentos. Para
as mudas provenientes do meio de multplicação ANA + CIN (2,2 µM) a maior média foi
no tratamento 4 (6,20), não tendo diferença também entre os tratamentos. Já as mudas do
explante 3 apresentaram os melhores resultados nos tratamentos 4 e 8 com os valores de
5,60 e 6,50, respectivamente. Coll et al. (1988) relataram que o crescimento acelerado das
raízes pode retardar o desenvolvimento da parte aérea, devido o crescimento ativo do
sistema radicular necessitar de substâncias orgânicas translocadas da parte aérea para a
base, comprometendo, assim, o desenvolvimento do caule e das folhas.
TABELA 3. Valores médios do número de raízes de mudas de caroá [N. variegata
(Arruda) Mez] originadas de diferentes meios de cultura e enraizadas in vitro em diferentes
tratamentos em dois períodos da aclimatização.
Meio de Multiplicação
Tratamento
ANA+BAP (4,4 µM) ANA+CIN (2,2 µM) ANA+CIN (4,4 µM) Períodos de avaliação (dias)
0 210 0 210 0 210 T1 4,52bB* 8,00aA 4,34cA 5,60aA 4,08bA 2,90bA
T2 2,28cB 6,70aA 3,40cA 5,00aA 4,00bA 3,30bA
T3 1,84cB 5,80aA 3,23cA 4,50aA 2,56cB 4,30bA
T4 4,96bA 6,10aA 3,36cB 6,20aA 4,52bA 5,60aA
T5 3,60bA 5,00aA 3,08cB 5,30aA 3,48cA 3,80bA
T6 2,84cB 4,90aA 4,15cB 4,00aA 2,95cA 4,60bA
T7 8,80aA 5,60aB 7,95aA 4,80aB 7,52aA 4,30bA
T8 7,80aA 5,70aB 5,96bA 4,40aA 6,64aA 6,50aA
T9 7,84aA 6,50aA 3,60cA 3,80aA 4,32bA 4,20bA *Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas pertencem ao mesmo grupo pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade e pela mesma letra maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. T1: ANA (0,0 µM) + CIN (0,0 µM); T2: ANA (0,0 µM) + CIN (2,2 µM); T3: ANA (0,0 µM) + CIN (4,4
µM); T4: ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM); T5: ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM); T6: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM); T7: ANA (5,3 µM) + CIN (0,0 µM); T8: ANA (5,3 µM) + CIN (2,2 µM); T9: ANA (5,3 µM) + CIN (4,4 µM).
74
As variáveis que só foram analisadas no terceiro período da avaliação apresentaram
diferenças entre os tratamentos e as mudas provenientes dos diferentes meios de
multiplicação (Tabela 4). A maior média para o comprimento da maior raiz foi observada
nas mudas do meio ANA + CIN (4,4 µM) (14,470 cm) no meio de enraizamento T4,
porém nesse tratamento as mudas não diferiram estatisticamente entre si. No que se refere
a massa seca da parte aérea, o melhor resultado foi obtido no meio de enraizamento sem a
presença dos reguladores (T1) para as mudas provenientes de ANA-BAP, sendo que esse
tratamento não foi diferente estatisticamente do tratamento com a presença de 0,5 µM de
ANA na ausência da cinetina (T4). Para a massa seca da raiz as mudas provenientes do
meio ANA + CIN (2,2 µM) foram as que apresentaram o maior valor no meio de
enraizamento T4 não diferindo dos tratamentos 1 e 7, todos sem a presença de cinetina.
Com esses resultados observa-se que as mudas provenientes dos diferentes meios
de multiplicação apresentaram resposta diferenciada na aclimatização com o substrato
Plantmax®, apesar que a aclimatização dos explantes originados dos meios de
enraizamento com a presença de ANA foram os que apresentaram os melhores resultados
para as variáveis analisadas neste trabalho.
75
TABELA 4. Médias de comprimento da maior raiz (CMR) e massa seca da parte aérea (MSPA) e da raiz (MSR) de mudas micropropagadas
de caroá [N. variegata (Arruda) Mez] enraizadas in vitro em diferentes tratamentos e aclimatizadas em substrato após 210 dias.
Tratamento
CMR MSPA MSR
Meio de Multiplicação
ANA+BAP
(2,2 µM)
ANA+CIN
(2,2 µM)
ANA+CIN
(4,4 µM)
ANA+BA
P (2,2 µM)
ANA+CIN
(2,2 µM)
ANA+CIN
(4,4 µM)
ANA+BA
P (2,2 µM)
ANA+CIN
(2,2 µM)
ANA+CIN
(4,4 µM)
T1 13,030aA* 12,710aA 6,570cB 1,345aA 0,471bB 0,234cB 0,159aA 0,136aA 0,023bB
T2 12,050aA 10,880aAB 7,080cB 0,560bA 0,502bA 0,186cB 0,092bA 0,120bA 0,017bB
T3 10,840bA 9,260bA 6,980cB 0,717bA 0,354bAB 0,156cB 0,056bA 0,081bA 0,056bA
T4 12,390aA 13,770aA 14,470aA 1,101aA 0,876aAB 0,516bB 0,083bB 0,202aA 0,122aAB
T5 12,040aA 11,690aA 6,640cB 0,735bA 0,328bB 0,222cB 0,083bA 0,083bA 0,026bB
T6 9,620bA 11,690aA 7,180cB 0,368cA 0,361bA 0,320cA 0,057bA 0,073ba 0,043bA
T7 13,230aA 13,330aA 8,840cB 0,971bA 0,763aA 0,500bA 0,142aAB 0,148aA 0,078bB
T8 8,300bAB 6,780bB 10,940bA 0,156cC 0,446bB 0,865aA 0,059bB 0,042bB 0,137aA
T9 12,410aA 7,900bB 9,310cAB 0,789bA 0,422bA 0,387cA 0,187aA 0,081bB 0,074bB
*Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas pertencem ao mesmo grupo pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade e pela mesma letra maiúscula nas
linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. T1: ANA (0,0 µM) + CIN (0,0 µM); T2: ANA (0,0 µM) + CIN (2,2 µM); T3: ANA
(0,0 µM) + CIN (4,4 µM); T4: ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM); T5: ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM); T6: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM); T7: ANA (5,3 µM) + CIN (0,0
µM); T8: ANA (5,3 µM) + CIN (2,2 µM); T9: ANA (5,3 µM) + CIN (4,4 µM).
76
CONCLUSÕES
1. Para o enraizamento in vitro de caroá, a presença da auxina aumenta a taxa de
enraizamento.
2. A presença de cinetina influencia de forma negativa no alongamento das plantas
e no número de raízes.
3. As mudas enraizadas in vitro independentes da origem do explante apresentam
sucesso na aclimatização quando se utiliza o substrato Plantmax®.
77
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81
CAPÍTULO 5
Anatomia foliar de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] sob
diferentes condições de cultivo1
1 Artigo submetido para publicação no periódico Pesquisa Agropecuária Brasileira em dezembro
de 2008.
82
RESUMO
O caroá é uma espécie nativa da região nordeste do Brasil, largamente explorada pelo valor
comercial de suas fibras. No entanto, a coleta é realizada de forma extrativista levando a
espécie ao risco de extinção. A necessidade de sistematização do cultivo tem estimulado
uma série de estudos com essa espécie, incluindo a propagação de plantas in vitro para a
propagação massal, porém algumas limitações são observadas, principalmente na etapa de
aclimatização. O objetivo deste estudo foi analisar aspectos anatômicos de folhas de caroá
oriundas de plantas cultivadas em diferentes condições ambientais (in vivo, in vitro e
durante a fase de aclimatização). Para a análise comparativa foram usadas folhas de plantas
cultivadas in vivo (coletadas diretamente na Caatinga), in vitro e na fase de aclimatização
(3 a 6 meses depois da aclimatização), as quais foram seccionadas transversalmente e
analisadas em microscópio óptico. A análise de estômatos e escamas foi realizada através
de microscopia eletrônica de varredura. Folhas oriundas de plantas in vitro e aclimatizadas
apresentaram estruturas básicas, como hipoderme, parênquima aqüífero, parênquima
clorofilado e fibras, às das plantas coletadas em seu ambiente natural, porém com
variações no tamanho, número e morfologia de algumas delas. As variações estruturais,
espessura da cutícula, formato dos tricomas e formato das células do parênquima aqüífero,
foram relacionadas às condições especiais às quais as plantas foram submetidas, devido às
diferentes condições ambientais que determinam o seu desenvolvimento.
Termos para indexação: Bromeliaceae, micropropagação, aclimatização, Caatinga.
83
Leaf anatomy of Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez under different conditions of
culture
ABSTRACT
Caroá is a native species from the Northeast Region of Brazil, widely explored due to the
commercial value of its fibers. However, plants are collected in extractive way, leaving this
species at risk of extintion. The need of an affective production system for this culture has
stimulated a number of studies with this species including the definition of an efficient
migropropagation system for large-scale production of plants. But limitations has been
observed, mainly in acclimatization The aim of this study was analyse the anatomical
aspects of caroá leaves collected from plants cultured under different environmental
conditions (in vivo, in vitro or during acclimatization stage). For a comparative analysis
were used leaves of plants grown in vivo (collected directly in the Caatinga), in vitro and
in the process of acclimatization (3 to 6 months after acclimatization), which were
sectioned transversely and examined under optical microscope. Condition visualization of
structures as scales and stomats a scanning electronic microscope was used. Leaves from in
vitro and the acclimatizated plants showed similar structures as hypodermis, aquiferous
parenchyma, photosynthetic parenchyma e fíbers with the plants from the field condition,
even so with variations in the size, number and format of some structures. The structural
variations detected as the cuticle thickness, format of the trichomes and of the aquiferous
parenchyma cells were due to the environmental conditions from each one determining the
development of certain structures.
Index terms: Bromeliaceae, micropropagation, acclimatization, Caatinga.
84
Introdução
O caroá, Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez, é uma planta pertencente à família
Bromeliaceae de ocorrência na Região Nordeste do Brasil e largamente explorada pelo
valor comercial de sua fibra (Bernades, 1999). No entanto, essa exploração não se baseia
num sistema de cultivo estabelecido e sim em atividade extrativista que, ao longo dos anos,
certamente contribuiu para esta espécie diminuir em algumas regiões do Nordeste da Bahia
(Ribeiro, 2007). Sua fibra é utilizada na manufatura de barbantes, chapéus, bolsas, tapetes,
redes de pesca e tecidos, gerando renda e emprego para famílias de baixa renda. Desta
forma, é importante o desenvolvimento de estudos que subsidiem a definição de sistemas
de cultivo e uso sustáveis para o caroá, garantindo sua sobrevivência como espécie e como
fonte de trabalho e renda de muitas famílias na Caatinga Nordestina.
O caroá se reproduz tanto por sementes quanto pelo desenvolvimento de gemas e
rizomas laterais (Xavier, 1982), porém seu desenvolvimento vegetativo é lento,
necessitando de um longo tempo para a obtenção de um grande número de plantas. A
necessidade de sistematizar o cultivo de caroá tem impulsionado uma série de estudos,
dentre os quais o estabelecimento de sistemas eficientes de produção de mudas por meio da
multiplicação in vitro (Silveira et al., 2009).
Ainda que as técnicas de micropropagação proporcionem resultados muito
superiores à propagação convencional, principalmente em bromeliáceas, algumas
limitações têm sido observadas, como o longo tempo necessário para a aclimatização das
plantas (Souza et al., 2006). O conhecimento da anatomia das plantas nas diferentes
condições de cultivo, in vitro, ex vitro (fase de aclimatização) e in vivo, é uma ferramenta
valiosa para o entendimento desse processo de adaptação da fase heterotrófica para
85
autotrófica, fornecendo subsídios que permitam melhorar a aclimatização dessas plantas
(Barboza et al., 2006).
Estudos comparativos da anatomia foliar entre ambientes heterotróficos (in vitro) e
autotróficos (fase de aclimatização) foram realizados em Ananas comosus (L.) Merril
(Barboza et al., 2006) e em Fragaria x ananassa Duch. (Calvete et al., 2002) verificando-
se diferenças para algumas estruturas, como a espessura da cutícula, no ambiente in vitro e
ex vitro. Nesse contexto, Calvete et al. (2002) relataram que na maioria das plantas
cultivadas in vitro a expessura da cutícula é reduzida devido às condições de alta umidade
relativa (90 a 100%).
As plantas micropropagadas precisam de um período de aclimatização para
adaptarem-se às condições de cultivo em campo, devido à dificuldade de transição do
mecanismo heterotrófico para autotrófico (Barboza et al., 2006). Mudanças fenotípicas
podem também se expressar morfologicamente, sendo, portanto, passíveis de serem
estudadas através da anatomia foliar, tendo como base as condições ambientais (Reeve &
Sherman, 1993).
Em ensaios preliminares, observou-se que a aclimatização do caroá, semelhante ao
que ocorre com outras bromeliáceas, é bastante lenta, ao redor de 210 dias (D.G. Silveira,
dados não publicados). Como não há relatos sobre a anatomia foliar dessa espécie, e
visando verificar a existência de diferenças anatômicas entre as condições ambientais, o
objetivo desse trabalho foi identificar diferenças estruturais entre plantas oriundas de
diferentes condições ambientais com a caracterização anatômica de folhas de caroá
cultivadas in vivo, in vitro e durante a fase de aclimatização.
86
Material e Métodos
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micromorfologia Vegetal da
Universidade Estadual de Feira de Santana. O cultivo in vitro e a aclimatização das plantas
foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical.
Plântulas de caroá provenientes da germinação das sementes in vitro em meio MS
(Murashige & Skoog, 1962) (Figura 1A) foram utilizadas como material inicial a
multiplicação in vitro (Silveira et al., 2009). Após o período de estabelecimento, efetuou-se
o primeiro subcultivo para o meio de multiplicação MS com 0,5 µM de ácido
naftalenoacético (ANA) + 4,4 µM de 6-benzilaminopurina (BAP) suplementado com 30
g.L-1
de sacarose e solidificado com 2 g.L-1
de Phytagel®. As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura controlada (27 ± 1 °C) sob fotoperíodo de 16 horas
com densidade de fluxo de fótons de 22 E.m-2
.s-1
, sendo realizados cinco subcultivos em
intervalos de 30 dias. Para a aclimatização, as plantas foram transferidas do meio de
cultivo para tubetes com substrato Plantmax®, onde permaneceram durante seis meses em
estufa sob nebulização.
Para a análise comparativa das características anatômicas através da microscopia
ótica, foram coletadas folhas em porções inferiores das plantas desenvolvidas durante a
fase do cultivo in vitro (folhas retiradas da planta ainda no meio de cultivo), durante a
aclimatização ex vitro (com três e seis meses de crescimento em estufa) e in vivo (plantas
coletadas em seu ambiente natural no município de Valente, BA). As folhas foram fixadas
em FAA 50 (formaldeído ácido acético glacial) e posteriormente transferidas para etanol a
50%. Cortes transversais foram obtidos à mão livre, com auxílio de lâmina de barbear, a
partir da região mediana e do bordo das folhas, sendo em seguida corados em solução
87
aquosa de safranina a 0,1% e azul de astra a 0,1% (Bukatsch, 1972). Lâminas
semipermanentes foram preparadas usando-se glicerina 50% cobrindo-se com lamínula. As
fotomicrografias foram realizadas com câmera digital Olympus acoplada em microscópio
de luz transmitida, Zeiss Axioskop 2.
Para observações ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), porções da região
mediana de folhas de plantas cultivadas in vitro e in vivo foram fixadas em FAA e
desidratadas em série etílica crescente, sendo em seguida secas ao ponto crítico através de
CO2 líquido (Horridge & Tamm, 1969). As amostras (faces abaxial e adaxial) foram então
afixadas em suporte metálico e submetidas à metalização com ouro, em metalizador Baltec
modelo FCD050 e CPD030, sendo então, examinadas e eletromicrografadas em
microscópio eletrônico de varredura, modelo LEO, 1430 VP.
88
Resultados e Discussão
As folhas de caroá apresentaram variação na espessura da cutícula, conforme o
ambiente de cultivo ao qual foram submetidas. A cutícula das folhas de plantas cultivadas
em condições de ambiente natural (in vivo) apresentou-se bastante desenvolvida nas duas
faces da epiderme (Figura 4 A, D, E e G), quando comparadas com as folhas oriundas das
outras condições de cultivo. Nas folhas in vitro observou-se uma fina camada de cutícula
sobre a epiderme uniestratificada das faces adaxial e abaxial (Figura 1 B e D). Nas plantas
com três e seis meses, já durante o período de aclimatização, as folhas apresentaram
epiderme recoberta pela cutícula, sendo que houve um crescente aumento da espessura da
cutícula em relação ao período de aclimatização para ambas as faces (Figura 2 A e C e
Figura 3 A e C, respectivamente).
As folhas das plantas cultivadas in vitro apresentaram cutícula mais fina, pois seu
espessamento não foi estimulado pela elevada umidade contida no recipiente. Com a
diminuição da disponibilidade de água e o aumento crescente da intensidade da luz nas
plantas aclimatizadas (três e seis meses), a necessidade de evitar perdas de água e manter a
integridade da planta proporcionou o desenvolvimento gradativo de uma camada mais
espessa de cutícula. Nas plantas que se desenvolveram desde o inicio em seu ambiente
natural, observou-se visualmente que a cutícula era mais espessa, devido, principalmente,
às condições de rusticidade em que as plantas de caroá ocorrem na natureza, considerando
os longos períodos de estiagem da Caatinga. Segundo Juniper & Jeffree (1983), Mauseth
(1988) e Santiago et al. (2001) o aumento da espessura da cutícula é uma das respostas das
plantas a ambientes secos afetada pela intensidade da luz e pela disponibilidade da água.
Oliveira et al. (2008) observaram em plantas de curauá, uma bromélia produtora de fibras,
89
que o espessamento da parede epidérmica foi mais espesso quando cultivados a 100% de
radiação fotossinteticamente ativa (RFA) quando comparados a outras RFA.
Tricomas foram detectados por toda a extensão de revestimento nas duas faces da
folha dos três ambientes analisados (Figura 1 B, C e F, Figura 2 A e C, Figura 3 A, Figura
4 E e Figura 5 A, B e C). Observou-se também tricomas com formas diferenciadas em
folhas da plantas in vitro e in vivo. Em folhas de plantas cultivadas in vivo há presença de
tricomas escamiformes distribuídos em ambas as faces foliares (Figura 5 B e C)
apresentando pedículos inseridos em pequenas depressões (Figura 5 C e D) e na folha do
caroá in vitro foram observados tricomas peltados (Figura 5 A). Segundo Silva et al.
(2005) a morfologia dos tricomas pode variar de acordo com as condições oferecidas às
plantas. As escamas são estruturas geralmente achatadas e multicelulares que têm a
capacidade de absorver água e sais da atmosfera (Alquini et al., 2003), sendo que estas só
foram encontradas nas plantas in vivo, podendo estar relacionadas às variações
macroclimáticas, onde se tem um ambiente com maior exposição à luz solar e pouca
disponibilidade de água. Aoyama & Sajo (2003), Proença & Sajo (2004) e Sousa et al.
(2005) em estudos realizados em bromeliáceas também observaram a presença de escamas
nas folhas das plantas cultivados in vivo.
90
Figura 1. A: Plântula micropropagada de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez]. B-
F. Secções transversais da folha in vitro. B: Aspecto geral do mesófilo diferenciado na
região do eixo central; C: Face abaxial da folha; D: Detalhe da epiderme abaxial; E:
Mesofilo dorsiventral no eixo central da folha, F: Bordo foliar. (hi=hipoderme; ponta de
seta=cutícula; seta=tricoma; pa=parênquima aqüífero; pc=parênquima clorofiliano;
fv=feixe vascular; fi=fibras; es=estômato; cl=cloroplastos).
91
Figura 2. Secções transversais em folha de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez]
após três meses de aclimatização. A: Visão geral do mesofilo diferenciado na região
central e no bordo foliar; B: Detalhe da epiderme abaxial; C: Detalhe do parênquima
clorofiliano; D: Visão do mesofilo dorsiventral no eixo central da folha mostrando a
distribuição dos feixes vasculares e fibras no parênquima clorofiliano; E: Detalhe do feixe
vascular. (Ponta de seta=cutícula; seta=tricoma; pa=parênquima aqüífero; pc=parênquima
clorofiliano; fv=feixe vascular; fi=fibras; hi=hipoderme; es=estômato; cl=cloroplastos).
92
Figura 3. Secções transversais em folha de caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez]
aos seis meses de aclimatização. A: Aspecto geral do mesofilo foliar; B: Detalhe dos
parênquimas aqüífero e clorofiliano; C: Visão do mesofilo diferenciado na região do eixo
central; D: Visão da distribuição dos feixes vasculares e das fibras no parênquima
clorofiliano; E: Detalhe do feixe vascular. (Ponta de seta=cutícula; seta=tricomas;
pa=parênquima aqüífero; pc=parênquima clorofiliano; fv=feixe vascular; fi=fibras;
es=estômato; cse=câmara subestomática; hi=hipoderme; cl=cloroplastos).
93
Figura 4. Secções transversais em folha de caroá in vivo [Neoglaziovia variegata (Arruda)
Mez]. A: Visão do mesofilo foliar mostrando a distribuição dos feixes vasculares e das
fibras; B: Detalhe do feixe vascular na região do eixo central; C: Detalhe da fibra na região
do eixo central; D: Visão da face adaxial mostrando a hipoderme e as células do
parênquima aqüífero; E: Visão da face abaxial mostrando o detalhe do estômato e da
câmara subestomática; F: Detalhe do parênquima clorofiliano com os cloroplastos e as
fibras; G: Visão do eixo central mostrando os parênquimas aqüífero e clorofiliano. (ponta
de seta=cutícula; pa=parênquima aqüífero; pc=parênquima clorofiliano; fv=feixe vascular;
fi=fibras; hi=hipoderme; es=estômato; cse=câmara subestomática; seta=tricomas =;
cl=cloroplastos).
94
Figura 5. Eletromicrografias de folhas de plantas de caroá [Neoglaziovia variegata
(Arruda) Mez] cultivadas in vitro e in vivo. A: Visão geral dos tricomas peltados
escamiformes na face adaxial da folha in vitro; B: Vista geral dos tricomas escamiformes da
face abaxial da folha in vivo; C: Detalhe dos tricomas escamiformes (te) e suas cavidades de
inserção (ponta de seta) na face adaxial da folha in vivo; D: Face abaxial da folha in vitro,
mostrando distribuição dos estômatos (seta), detalhes dos tricomas peltado (tp) e cavidades
de inserções dos tricomas (ponta de seta) na epiderme; E: Detalhe do estômato na face
abaxial da folha in vitro; F: Estômato em depressão na face abaxial da folha in vivo.
95
As folhas do caroá são hipoestomáticas, independentemente do ambiente de cultivo.
Os estômatos estão distribuídos em fileiras paralelas longitudinais (Figura 5 D),
apresentando câmara subestomática (Figura 2 B, Figura 3 D e Figura 4 E). Os estômatos
estão situados em depressões (criptas estomáticas) nas plantas in vivo (Figura 5 F), sendo
esta uma característica xeromórfica, porém essas depressões são pouco acentuadas nas
plantas in vitro (Figura 5 E). Esses resultados estão de acordo com Barboza et al. (2006)
que observaram em folhas de abacaxizeiro a presença de estômatos somente na face
abaxial, independentemente dos ambientes estudados (in vitro e em casa de vegetação) com
a presença de câmara subestomática. Parkhust (1978) relata que estômatos restritos à
superfície abaxial configura uma característica comum em plantas de regiões úmidas, mas
nas bromeliáceas, essa característica não parece estar relacionada a aspectos ecológicos,
pois os diferentes representantes da família ocupam habitats diversos e estão sujeitos a
condições distintas de umidade, temperatura e luminosidade (Proença & Sajo, 2004).
A hipoderme está presente em ambas as faces da folha. Nas plantas cultivadas in
vivo e sob condições de aclimatização verificou-se que a hipoderme é constituída por mais
de uma camada de células (Figura 4 D e Figura 2 B, respectivamente), enquanto que nas
condições in vitro observou-se uma hipoderme simples, com uma única camada de células
(Figura 1 B e C). Madison (1977) relatou que a hipoderme tem a função de armazenar
água, exercendo papel importante na economia de calor, especialmente nas plantas
epifíticas com metabolismo ácido crassuláceo. Além disso, a presença de hipoderme dupla
nas folhas das plantas in vivo de caroá pode ser atribuída à maior exposição à luz estando
de acordo com as observações feitas por Espírito Santo & Pugialli (1998). Entretanto, a
presença da hipoderme nas folhas in vitro de caroá não poderia ser relacionada a nenhum
desses fatores, pois essas plantas estão submetidas a condições de baixa luminosidade e
alta umidade. Contudo, como as plantas nesses ambientes estão em desenvolvimento foliar
96
pode estar ocorrendo um padrão diferenciado para a proliferação e
crescimento/diferenciação da região subdérmica.
Nas plantas in vivo, o mesofilo é do tipo dorsiventral, sendo verificada uma
diminuição do número de camadas de células do parênquima aquífero nos bordos foliares
(Figura 4 A e F). As células dessa hipoderme são verticalmente alongadas e maiores do
que as do parênquima clorofiliano, com paredes delgadas (Figura 4 D). Nessas plantas
também se observa um parênquima bem desenvolvido em relação às outras condições de
cultivo (in vitro e aclimatização) podendo estar relacionado com o estado hídrico da planta,
pois, na primeira condição a disponibilidade de água é relativamente menor. Py (1969)
relatou que as células desse tecido, quando em condições de deficiência hídrica, suprem as
necessidades de água da planta, contraindo-se e recuperando-se posteriormente, quando em
condições adequadas de suprimento de água. De acordo com Brighigna et al. (1984), a
água absorvida pelas escamas é armazenada no parênquima aqüífero, que protege a região
clorofiliana contra a intensa luminosidade, favorecendo a fotossíntese e evitando a perda
de água através dos canais de aeração.
Nas folhas em condições in vitro e aclimatizadas, foi observado mesofilo
dorsiventral no eixo central e homogêneo na região do bordo foliar (Figura 1 A, E e F,
Figura 2 A e Figura 3 A). Nas condições in vitro (Figura 1 B, E e F) e com três meses de
aclimatização (Figura 2 A e D), a lâmina foliar é constituída por células de formato
arredondado com paredes anticlinais delgadas com leves ondulações nos parênquimas
aqüífero e clorofiliano, sendo que as células do parênquima aqüífero apresentam-se com
maior tamanho. Já nas plantas com seis meses de aclimatização, as células do parênquima
aqüífero apresentaram formato alongado com paredes anticlinais delgadas e retas (Figura 3
B e C). Nas duas condições de cultivo observou-se a ocorrência da redução do tamanho e
do número de camadas de células do parênquima aqüífero desde a região central da folha
97
até a região do bordo foliar (Figura 1 A, Figura 2 A e Figura 3 A), onde se encontra um
parênquima clorofiliano homogêneo. Cloroplastos encontram-se distribuídos em todas as
células do parênquima clorofiliano nos três ambientes de cultivo (Figura 1 C, Figura 2 E,
Figura 3 E e Figura 4 F).
Os feixes vasculares são colaterais e dispostos em uma única série, apresentando
tamanho variado, com grande quantidade de fibras junto ao floema e xilema nas três
condições de cultivo (Figura 2 A e D, Figura 3 B e D e Figura 4 A e G), sendo distribuídos
no parênquima clorofiliano na região do eixo central da folha e bordo foliar. Os feixes
vasculares de maior calibre são envolvidos por bainha de células esclerificadas de
tamanhos diferenciados que aparecem entre o xilema e o floema (Figura 1 C, Figura 2 E e
Figura 3 E), entretanto, observou-se na folha in vivo uma camada de células
parenquimáticas, menores do que as células do parênquima clorofiliano, que circundam
essas células (Figura 4 B). Grupos de fibras, não associados aos feixes vasculares, foram
encontrados em folhas nos três ambientes, sendo que foi observado um número crescente
de fibras comparando-se as folhas das plantas cultivadas in vitro, aclimatizada e in vivo,
respectivamente (Figura 2 C e D, Figura 3 B e D e Figura 4 A e G).
Os feixes vasculares de maior calibre das folhas in vivo apresentam-se
completamente circundados pela bainha de células esclerificadas que, segundo Sajo et al.
(1998), corresponde à endoderme. Van der Merwe et al. (1994) afirmaram que as
extensões dessa bainha nos feixes vasculares desempenham importante papel na
distribuição de água no mesofilo, além de oferecer sustentação e proteção aos tecidos
vasculares.
A maior quantidade de fibras nas folhas in vivo pode estar relacionada às condições
ambientais dessa planta, pois Pyykkõ (1966) relatou que a presença de fibras no mesofilo
está relacionada à exposição das plantas a uma luminosidade intensa e a ambientes secos.
98
As fibras aparecem na região abaxial do parênquima clorofiliano como observado em
algumas espécies brasileiras de Aechmea (Souza et al., 2005), em posição nivelada ou
abaixo dos feixes vasculares. Segundo Py (1969), os cordões de fibras são típicos de
algumas espécies da família das bromeliáceas, como foi observado por Barboza et al.
(2006) em plantas de abacaxi. Além disso, os feixes de fibras das plantas in vivo são
circundados pela bainha parenquimática (endoderme) como foi observado nos feixes
vasculares no presente trabalho.
As folhas das plantas in vitro são geralmente finas, tenras e fotossinteticamente
pouco ativas, não necessitando de estruturas anatômicas eficientes. Já na fase de
aclimatização, observou-se que a planta foi se adaptando com o aumento do tempo (três e
seis meses de aclimatização) a essa condição ambiental, exigindo o melhor funcionamento
das suas estruturas, e assim, pode-se afirmar que as folhas mais jovens tornaram-se
similares àquelas de plantas crescidas no campo. Estes resultados estão de acordo com
Barboza et al. (2006) que relataram que as variações estruturais são decorrentes das
condições do ambiente, demonstrando plasticidade fenotípica.
O cultivo in vitro fornece à planta condições favoráveis, sem a necessidade de
realização de fotossíntese, de busca por água, assim como um ambiente de umidade
extremamente elevada. Essas condições criam uma planta que necessita posteriormente de
um período de adaptação para o ambiente externo. A duração desse período será
proporcional às diferenças observadas na espécie durante o cultivo in vitro e em condições
naturais. Muitas espécies de bromeliáceas, dentre as quais está o caroá, são plantas
xerófilas, que vivem em ambientes de extrema rusticidade, altas temperaturas e com longos
períodos de estiagem, o que explica caracteres anatômicos para resistir a essas condições,
que não existem durante o cultivo in vitro, dificultando, portanto, a aclimatização dessas
plantas.
99
Com base nos resultados pode-se observar que as condições de cultivo e a idade das
plantas alteram a anatomia foliar, tornando-as mais aptas a resistirem a estresses hídricos,
com o desenvolvimento dos tricomas, espessamento da cutícula, hipoderme mecânica de
maior número de camadas no parênquima aquífero (acúmulo de água) e a quantidade das
fibras. Sendo assim, uma estratégia que poderia ser proposta para reduzir o tempo de
aclimatização dessas plantas seria a indução de estresses na fase final do cultivo in vitro. A
redução nas fontes de sacarose poderia melhorar o funcionamento do aparato
fotossintetizante, assim como o aumento de temperatura e de luminosidade poderiam
provocar um adensamento nas estruturas que protegem a planta contra perda de água,
como é o caso da cutícula, ainda na fase in vitro.
100
Conclusões
1. Folhas das mudas de caroá nas três condições estudadas, in vitro, ex vitro e in vivo,
apresentam as estruturas básicas: hipoderme, parênquima aqüífero, parênquima clorofilado
e fibras semelhantes, porém, as mudas das condições in vivo têm essas estruturas mais
desenvolvidas.
2. As variações estruturais na espessura da cutícula, no formato dos tricomas e no formato
das células do parênquima aqüífero das plantas mantidas nos ambientes in vitro, ex vitro e
in vivo demonstram plasticidade fenotípica nessa espécie.
101
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105
CAPÍTULO 6
Variabilidade genética de populações naturais de caroá por meio de
marcadores RAPD1
1 Artigo aceito para publicação no periódico Pesquisa Agropecuária Brasileira em fevereiro de
2009.
106
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética entre e dentro de populações
de caroá, por meio de marcadores RAPD. Foram analisados 180 genótipos de caroá
coletados em três locais em cada um dos municípios Guanambi, Juazeiro e Valente, BA.
As dissimilaridades genéticas entre os genótipos foram calculadas pelo coeficiente de
Jaccard e foram utilizadas para análise de agrupamento dos genótipos pelo método
UPGMA. Os componentes de variância atribuída às diferenças entre as três populações
(municípios), entre locais dentro de municípios e entre indivíduos dentro de locais foram
estimados. Foi observado um elevado polimorfismo entre as populações de caroá. As
dissimilaridades genéticas entre os genótipos variaram de 0,08 a 0,95 com média de 0,44.
A análise de variância molecular mostrou que 56,47% da variação total foi explicada pela
variação entre indivíduos dentro de locais. A variação entre municípios foi de 17,41% do
total, enquanto entre locais dentro municípios foi 26,12%. Existe variabilidade genética
entre e dentro das populações de caroá, que pode ser explorada visando à conservação e
exploração comercial da espécie.
Termos para indexação: Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae, divergência genética,
marcadores moleculares.
107
Genetic variability estimated among caroá populations through RAPD markers
ABSTRACT
The objective of this work was to quantify the genetic variability among populations of
caroa, using RAPD markers. A high polymorphism was observed among the caroa
populations, fact that it can be resulted of the action and of the interactions of a series of
evolutionary mechanisms. The genetic dissimilarities among all of the genotypes ranging
from 0.08 to 0.95 with average of 0.44. The molecular analysis of variance showed that
56.47% of the total variation was explained by the variation among individuals inside of
places. The variation among cities was of 17.41% of the total, while among places inside
cities were in 26.12%. These results can serve how subsidize for the collection,
characterization and conservation of the germoplasm of caroá. Future researches can be
accomplished seeking to confirm the variability observed with molecular markers
contemplates also in the quality of the fiber, fundamental for the improvement of the
conditions of life of Caatinga families.
Index terms: Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae, genetic divergence, molecular
markers.
108
Introdução
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez, conhecida vulgarmente como caroá, é uma
bromeliácea endêmica da Caatinga, distribuída por todo o semi-árido do Nordeste
brasileiro (Ribeiro, 2007). Essa espécie já teve papel importante na economia nordestina na
primeira metade do século passado, a partir da produção de fibra por indústrias têxteis,
porém sua exploração foi abandonada com o surgimento das fibras sintéticas (Ribeiro,
2007). Atualmente, as fibras do caroá voltaram a ser uma das principais fontes de emprego
e renda para diversas famílias nordestinas com a fabricação artesanal de chapéus, bolsas,
entre outros produtos.
O uso em larga escala de forma extrativista desde o século passado, juntamente
com a devastação da Caatinga para desenvolvimento de atividades agropecuárias resultou
na redução drástica do caroá, havendo necessidade urgente de estudos para elaborar
estratégias de conservação genética desta espécie. Atualmente, o conhecimento da
estrutura genética de populações naturais de plantas é uma etapa fundamental para a
realização de programas conservacionistas, nos quais os dados gerados podem ser
utilizados para definir unidades de conservação e prioridades para o manejo de recursos
genéticos (Mamuris et al., 2001), além de ser fundamental para o estabelecimento de
formas de exploração econômica racional (Lacerda et al., 2001). Os rápidos avanços na
área de biologia molecular têm fornecido uma série de novos métodos para estudos
genéticos de populações naturais. Contudo, até o momento, nenhuma pesquisa foi
publicada sobre o uso de marcadores moleculares para estimar a diversidade genética em
caroá. Dessa forma, a caracterização da variabilidade entre e dentro das populações
naturais dessa espécie podem trazer subsídios para a implantação de estratégias de
conservação e de programas de melhoramento genético.
109
Entre os marcadores moleculares, a técnica de RAPD - “random amplified
polymorphic DNA”, desenvolvida por Williams et al. (1990), mostra-se como uma
ferramenta útil para a análise da diversidade genética molecular em populações naturais de
plantas.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade intra e interpopulacional de
caroá, por meio de marcadores RAPD, visando subsidiar futuras atividades de coleta,
caracterização, conservação e uso dessa espécie.
110
Material e Métodos
Foram coletadas três populações de caroá em três municípios Guanambi, Juazeiro e
Valente, BA (Tabela 1). Cada população foi representada por 60 indivíduos. Em cada
município foi realizada a coleta dos genótipos em três locais distintos, com 20 amostras
cada (Tabela 1). A distância entre esses locais variou entre 1 a 20 km, dependendo da
disponibilidade do material e a distância entre as plantas coletadas variou de 1 a 5 m; não
foram coletadas plantas da mesma touceira.
Tabela 1. Coordenadas geográficas e altitude dos locais de coleta das três populações de
caroá [Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez] no Estado da Bahia. Cruz das Almas (BA).
Municípios Locais Coordenadas geográficas Altitude (m)
Guanambi 1 14° 27' 06,1‟‟S e 43° 02' 38,1‟‟W 552
2 14° 26' 38,2‟‟S e 43° 02' 16,9‟‟W 559
3 14° 17' 39,1‟‟S e 42° 41' 19,9‟‟W 586
Juazeiro 1 9° 5‟ 52,5”S e 40° 28‟ 33,9”W 395
2 9°4‟34,26”S e 40° 19‟ 3,54W 376
3 9° 32‟ 10,62”S e 40°27‟3,24”W 401
Valente 1 11°20‟27,5‟‟S e 39°27‟33,2‟‟W 376
2 11°20‟20,9‟‟S e 39°27‟39,1‟‟W 356
3 11°20‟28,8‟‟S e 39°27‟27,8‟‟W 340
O DNA genômico dos 180 genótipos foi extraído de folhas jovens, utilizando o
método CTAB (Doyle & Doyle, 1990). A avaliação da quantidade e qualidade do DNA foi
realizada mediante análise comparativa das amostras em géis de agarose 0,8%, corados
com brometo de etídio, sendo as amostras diluídas em TE e padronizadas em 10 ng L-1
.
Uma pré-seleção de 48 iniciadores foi realizada em seis genótipos, e os mais
polimórficos foram aplicados na população. As reações de amplificação foram
completadas para o volume final de 16 µL, contendo: KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH
8,3), MgCl2 3 mM, 100 M de cada um dos dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 0,4 M
de cada iniciador, 15 ng de DNA e uma unidade de Taq DNA polimerase.
111
As reações foram realizadas em termociclador Perkin Elmer modelo 9700 de acordo
com a seguinte programação: 3 min a 94oC, 40 ciclos a 94
oC por 30 segundos, 35°C por 30
segundos e 72°C por 1 min, incluindo uma extensão final de 3 min a 72oC.
Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese horizontal a 100V
por 2 horas com gel de agarose a 1,5% e corados com brometo de etídio. Os fragmentos
amplificados foram avaliados como ausência (0) e presença (1). A dissimilaridade
genética entre os 180 genótipos foi calculada a partir do coeficiente de Jaccard (1908).
As dissimilaridades genéticas foram utilizadas para a análise de agrupamento dos
genótipos pelo método UPGMA - unweighted pair group method with arithmetic averages,
por meio do programa NTSYS-pc (Rohlf, 2000). O dendrograma foi gerado com base na
matriz de distâncias no programa MEGA4 (Tamura et al., 2007). O método de
reamostragens (“bootstrap”) foi realizado para verificar se o número de marcadores foi
suficiente para determinar com precisão as estimativas de dissimilaridade genética entre
os genótipos, utilizando o programa GQMol (Cruz & Shuster, 2004).
A segunda análise foi realizada no programa Structure 2.2 (Pritchard et al., 2000)
que se fundamenta no modelo bayesiano gerando uma distribuição posterior com base na
cadeia de Markov, que identifica a presença de estrutura na população, bem como a
proporção do genoma de cada acesso advindo de outros grupos. Para essa análise foi
considerado o modelo de informação a priori da população para a definição dos grupos e
freqüências alélicas independentes. Considerou-se, em todas as análises efetuadas um
“burn-in” período de 10.000 interações, seguido de 100.000 interações Monte Carlo
Markov Chain.
Os componentes de variância atribuída às diferenças entre as três populações
(municípios), entre locais dentro de municípios e entre indivíduos dentro de locais foram
estimados utilizando o programa Arlequin ver 3.0 (Excoffier et al., 1992). As
112
significâncias dos componentes de variâncias foram obtidas por meio de 10.000
permutações.
113
Resultados e Discussão
Os 36 iniciadores selecionados (Tabela 2) geraram 501 produtos de amplificação,
sendo 93% polimórficos e com média de 13 bandas por iniciador. O iniciador OPD-09
amplificou o maior número de bandas (19), enquanto o menor número ocorreu no iniciador
OPD-10 (5 bandas).
Tabela 2. Produtos da amplificação de 36 iniciadores RAPD em três populações de caroá
coletadas em três municípios do Estado da Bahia. Cruz das Almas (BA).
Iniciador Seqüência
(5‟ 3‟)
Total de bandas
amplificadas
Número bandas
polimórficas
% de
polimorfismo
OPA-10 GTGATCGCAG 12 11 92
OPAF-03 GAAGAAGGCA 17 16 94
OPAF-04 TTGCGGCTGA 14 13 93
OPAF-11 ACTGGGCCTC 10 10 100
OPAF-13 CCGAGGTGAC 10 9 90
OPAG-11 TTACGGTGGG 15 15 100
OPAG-14 CTCTCGGCGA 13 12 92
OPAL-03 CCCACCCTTG 14 13 93
OPAL-05 GACTGCGCCA 15 14 93
OPAL-06 AAGCGTCCTC 16 14 87
OPAN-01 ACTCCACGTC 16 16 100 OPAN-03 AGCCAGGCTG 14 13 93
OPAN-06 GGGAACCCGT 12 12 100
OPAO-05 TGGAAGCACC 15 15 100
OPAO-07 GATGCGACGG 16 16 100
OPB-13 TTCCCCCGCT 8 8 100
OPB-17 AGGGAACGAG 11 10 91
OPD-09 CTCTGGAGAC 19 17 89
OPD-10 GGTCTACACC 5 5 100
OPD-18 GAGAGCCAAC 14 12 86
OPF-04 GGTGATCAGG 12 11 92
OPF-06 GGGAATTCGG 11 10 91
OPG-05 CTGAGACGGA 18 16 89 OPG-06 GTGCCTAACC 16 15 94
OPG-13 CTCTCCGCCA 14 13 93
OPG-15 ACTGGGACTC 17 16 94
OPH-18 GAATCGGCCA 17 15 88
OPI-02 GGAGGAGAGG 11 10 91
OPI-03 CAGAAGCCCA 16 14 87
OPI-18 TGCCCAGCCT 18 17 94
OPL-14 GTGACAGGCT 14 14 100
OPR-04 CCCGTAGCAC 11 10 91
OPR-05 GACCTAGTGG 18 17 94
OPR-06 GTGTACGGCA 17 16 94 OPR-16 CTCTGCGCGT 15 14 93
OPR-19 CCTCCTCATC 8 2 80
Total 501 467
Média 14 13 93
114
Na análise de reamostragens, 315 bandas foram suficientes para uma estimativa
precisa da variabilidade genética entre os 180 genótipos de caroá. A correlação entre a matriz
com todas as 467 bandas e a matriz com 315 bandas foi de 0,95, com valor de estresse (E) de
0,047 (Figura 1). De acordo com Kruskal (1964), um valor de E0,05 é indicativo de uma
excelente precisão nas estimativas.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 100 200 300 400 500
Marcadores RAPD
Correlação
Estresse
Figura 1. Análise de reamostragem para uma precisa estimativa da variabilidade genética
em caroá estimada por meio de marcadores RAPD. Cruz das Almas (BA).
Em trabalhos realizados com outras espécies da família do caroá (Bromeliaceae)
verificou-se, também, que existe uma grande variação em relação ao número de bandas
polimórficas geradas pela amplificação de iniciadores RAPD, resultando em altas taxas de
polimorfismo. Costa et al. (2002) caracterizaram geneticamente o curauá (Ananas
erectifolius), uma bromeliácea produtora de fibra utilizada na indústria automobilística, por
meio de sete iniciadores RAPD, que geraram 104 bandas, destas 76% foram polimórficas.
115
Pereira & Kerr (2001) genotiparam doze genótipos de abacaxizeiro por meio de 11
iniciadores RAPD obtendo 79 bandas polimórficas. Cavallari et al. (2006) avaliaram
populações naturais de três espécies do gênero Encholirium, bromélias ameaçadas de
extinção e endêmicas do Brasil, e obtiveram aproximadamente 60 bandas polimórficas
geradas por cinco iniciadores RAPD, representando 90% do total de bandas. Gottardi et al.
(2001) genotiparam plantas matrizes do abacaxizeiro cv. Smooth Cayene com 43
iniciadores RAPD que amplificaram 777 bandas, das quais 99% foram polimórficas.
O elevado polimorfismo detectado nas populações de caroá analisadas neste
trabalho pode ser resultado da ação e das interações de mecanismos evolutivos e
ecológicos, entre eles a seleção natural e o fluxo gênico. Essa espécie ainda é pouco
estudada, sabe-se que ela se propaga principalmente por via assexuada, pelo
desenvolvimento de gemas e rizomas laterais formando densos agrupamentos, e apresenta
floração nos meses de outubro a dezembro, sendo polinizada preferencialmente por
pássaros (Leal et al., 2006) e que em cada planta abre-se de duas a três flores por dia com
duração de 12 horas (Leal et al., 2006), possuindo um sistema sexual hermafrodita
(Machado & Lopes, 2004). A inflorescência do caroá é simples, com escapo ereto e flores
protegidas por bractéas com coloração viva contendo três sépalas e três pétalas e frutos em
bagas suculentas (Smith & Downs, 1979). Com base nessas informações e no elevado
polimorfismo encontrado neste trabalho, é possível inferir que essa espécie apresenta
sistema reprodutivo preferencialmente alógamo. Sendo assim, seu germoplasma deve ter
sofrido baixa pressão de seleção, o que pode garantir ganhos genéticos significativos com a
seleção (Oliveira et al., 2007). Vale ressaltar que os locais onde as plantas de caroá foram
coletadas fazem parte da Caatinga baiana, ainda que esses municípios estejam distantes
entre si cerca de 300 km (Juazeiro a Valente), 650 km (Guanambi a Juazeiro) e 800 km
(Guanambi a Valente).
116
As dissimilaridades genéticas entre os 180 genótipos de caroá variaram de 0,08 a
0,95 com média de 0,44 (Tabela 3). Os menores valores de dissimilaridade foram
registrados entre os genótipos coletados no município de Juazeiro (0,12). A maior
dissimilaridade genética foi observada entre genótipos coletados nos municípios de
Guanambi (0,52) e Valente (0,60). O local 2, do município de Juazeiro, foi o que
apresentou a maior variabilidade genética entre todos os seis locais de coleta (0,16 a 0,90),
com média de 0,41. Para os municípios de Guanambi e Valente, maior variabilidade
genética foi observada nos locais 2 e 1, respectivamente. Estas diferenças podem estar
associadas, de certa forma, a mutações ocorridas no germoplasma nos locais de coleta,
como também a reprodução sexual ocasional gerando novos genótipos que são mantidos e
propagados vegetativamente e devido ao efeito do ambiente, em especial diferenças na
fertilidade do solo e clima.
117
Tabela 3. Análise de dissimilaridade intra e interpopulacional de caroá (Neoglaziovia variegata) em três municípios do Estado da Bahia,
considerando os locais de coleta. Cruz das Almas, 2008.
Município Local 1 Local 2 Local 3 Média
Méd Min Max Méd Min Max Méd Min Max Méd Min Max
Guanambi 0,58 0,36 0,85 0,56 0,23 0,83 0,60 0,32 0,88 0,52 0,22 0,88
Juazeiro 0,61 0,36 0,87 0,41 0,16 0,90 0,52 0,30 0,85 0,44 0,12 0,90
Valente 0,70 0,43 0,95 0,68 0,50 0,89 0,82 0,50 0,95 0,60 0,35 0,95
Total 0,44 0,08 0,95
118
Por meio do dendrograma das dissimilaridades genéticas com base em marcadores
RAPD (Figura 2), é possível observar a formação de grupos em razão dos municípios de
coleta do germoplasma, com exceção de 18 genótipos que formaram agrupamentos fora
dos municípios onde foram coletados.
No município de Valente foi observada a formação de agrupamentos em razão dos
locais de coleta, o que permite inferir que os genótipos coletados nesses locais apresentam
diferenças genéticas. Nos municípios de Juazeiro e Guanambi, comportamento semelhante
foi observado, porém com alguns genótipos formando agrupamentos fora do seu local de
coleta (Figura 2). Pelos resultados, os marcadores RAPD utilizados neste trabalho foram
eficientes em separar os genótipos de caroá em função dos municípios e seus respectivos
locais de coleta.
Figura 2. Dendrograma gerado pelo programa MEGA4 com base na matriz genética de
467 bandas polimórficas de RAPD em 180 genótipos de caroá (Neoglaziovia variegata)
coletados em três municípios baianos: Guanambi (genótipos de 1 a 60), Juazeiro
(genótipos de 61 a 120) e Valente (genótipos de 121 a 180). Em cada município foram
coletadas amostras em três locais diferentes, sendo Local 1 (circulo cheio), Local 2
(triângulo vazio) e Local 3 (triângulo cheio).
119
A utilização do modelo com base em distância e em estatística bayesiana por meio
do programa Structure permitiu identificar os mesmos grupos, além de permitir a
identificação de relações de parentescos entre os indivíduos avaliados. Dos 180 indivíduos
avaliados, 63 possuem ancestral em outras populações. No município de Guanambi, nove
genótipos apresentaram parte do seu genoma semelhante ao observado em Juazeiro, com
variação de aproximadamente 5 a 100% (Figura 3). Isso justifica o agrupamento dos
indivíduos 3, 4, 13, 29, 41, 42,47, 54 e 57 juntamente com a população de Juazeiro.
Em relação ao município de Juazeiro, foram identificados 23 genótipos com fração
do genoma pertencendo às populações de Valente e 26 genótipos com genoma da
população de Guanambi (Figura 3). Essa população é essencialmente formada de uma
mistura das populações de Guanambi e Valente confirmando a maior variabilidade
genética identificada neste município (Figura 2).
Em relação ao município de Valente, foram identificados cinco genótipos com
fração do genoma pertencendo à população de Juazeiro (Figura 3).
120
Figura 3. Estrutura genética das populações de caroá (Neoglaziovia variegata), em razão
dos municípios de coleta. Guanambi (cor vermelha = 1 a 60), Juazeiro (cor verde = 61 a
120) e Valente (cor azul = 121 a 180). Os genótipos (1 a 180) estão representados no eixo
X por barras verticais cujo tamanho é proporcional (eixo Y) a população a que pertence. O
número entre parênteses representa os municípios de coleta (1 = Guanambi, 2 = Juazeiro e
3 = Valente).
O caroá, apesar de ser propagado principalmente por via vegetativa, apresentando
hábito clonal formando densos agrupamentos e morfologia uniforme, apresentou um
número elevado de diferentes genótipos, sendo contrastante com a aparente reduzida
participação da reprodução sexuada na formação das populações. Resultados similares
foram constatados por Cavallari et al. (2006) que obtiveram elevada variabilidade genética
em três espécies de Encholirium, uma bromeliácea endêmica dos campos rupestres da
Cadeia do Espinhaço. Contudo, em uma das espécies os autores observaram uma floração
regular durante todo o ano, facilitando o fluxo gênico entre as populações; porém nas
121
outras espécies, a floração ocorreu de forma irregular, com poucos indivíduos em antese ao
mesmo tempo, o que teria contribuído para limitar o fluxo gênico.
Em relação ao caroá, as inflorescências dessa espécie são difíceis de serem
observadas devido a sua utilização como alimento para animais e pássaros (Xavier, 1982).
Entretanto, o surgimento das flores só ocorre em um período do ano e com a abertura de
duas a três flores por dia em cada inflorescência, o que pode dificultar a propagação sexual
da espécie.
No caso da baixa dissimilaridade genética observada entre a maioria dos genótipos
da população de Valente, é possível que tenha ocorrido em decorrência de cruzamentos
entre indivíduos aparentados ou mesmo pela autofecundação (Souza, 2002). Além disso,
populações dessa localidade passam por problemas sérios de exploração extrativista, e
muitos animais, principalmente caprinos, alimentam-se das bagas verdes e maduras,
diminuindo assim, a possibilidade da ampliação da variabilidade genética nessa região.
Chung et al. (1999), trabalhando com uma espécie da família Anacardiacea afirma que a
dispersão de sementes e pólen é determinante para a estrutura genética espacial dentro de
populações, fato que pode justificar a separação entre as populações de caroá, obtida por
meio de marcadores RAPD.
A análise molecular da variância (AMOVA) mostrou que 56,47% da variação total
foi explicada pela variação entre indivíduos dentro de locais. A variação entre municípios
foi de 17,41% do total, enquanto entre locais dentro municípios foi de 26,12% do total
(Tabela 4). Em razão da grande distância existente entre os municípios pode-se dizer que
houve um fluxo gênico moderado, provavelmente devido ao fluxo entre várias populações
intermediárias que não foram amostradas, uma vez que os municípios da Caatinga baiana
são centros de origem do caroá. Cavallari et al. (2006) observaram resultados semelhantes
122
em Encholirium subsecundum (Bromeliaceae) no quais as populações foram coletadas
numa distância média de 117 km.
Tabela 4. Resultados da análise molecular de variância (AMOVA) na população de caroá
coletada em três municípios do Estado da Bahia. Cruz das Almas (BA).
FV GL SQ Variância CV (%)
Entre municípios 2 2419,64 2
a = 12,97 ** 17,41
Entre locais dentro municípios 6 2587,93 2
b = 19,46 ** 26,12
Entre indivíduos dentro locais 171 7195,30 2
c = 42,08 ** 56,47
Total 179 12202,87 2
= 74,51
** Significativo a 1% de probabilidade.
Por meio dos resultados é possível sugerir novas coletas em Juazeiro, uma vez que
esse município apresenta maior variabilidade genética, e novas coletas nos outros
municípios, devido às análises genéticas terem mostrado que cada indivíduo tem seu
próprio perfil molecular, que varia com a sua distribuição geográfica.
Estes resultados podem servir também, como subsidio para a coleta, caracterização
e conservação do germoplasma de Neoglaziovia variegata,; para novas estratégias de
caracterização desse germoplasma, em especial visando confirmar se a variabilidade
observada com marcadores moleculares reflete também na qualidade da fibra, fundamental
para a melhoria das condições de vida de muitas famílias da Caatinga brasileira, em
especial no Estado da Bahia.
123
Conclusões
1. Existe variabilidade genética entre e dentro das populações de caroá, que pode ser
explorada visando à conservação e exploração comercial da espécie.
2. São necessárias, no mínimo, 315 bandas de RAPD para uma precisa estimativa da
variabilidade genética entre os entre os 180 genótipos.
124
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SOUZA, P.C.A. de. Aspectos ecológicos e genéticos de uma população natural de
Euterpe oleracea Mart. no estuário amazônico. 2002. 60p. Dissertação (Mestrado) -
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba.
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TAMURA, K.; DUDLEY, J.; NEI, M.; KUMAR, S. MEGA4: molecular evolutionary
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Acids Research, v.18, p.6531-6535, 1990.
128
CONCLUSÕES GERAIS
1. A temperatura de 30 oC foi a que proporcionou as melhores respostas de
germinação das sementes de caroá.
2. A germinação das sementes de caroá foi responsiva à redução dos potenciais
osmóticos do meio de incubação, apresentando o limite máximo de tolerância a -
0,6 MPa.
3. A viabilidade das sementes foi mantida após a recuperação das sementes em
água, mesmo sob potenciais mais negativos.
4. As melhores porcentagens de germinação com sementes in vitro foram obtidas
na presença de luz.
5. A taxa de multiplicação mais alta foi obtida no tratamento ANA (0,5 µM) + BAP
(4,4 µM) e, o número de raízes, com ANA (0.5 µM) + CIN (2.2 µM).
6. Independentemente das fontes de citocininas utilizadas no meio de cultura para
a micropropagação dessa espécie, é possível sua aclimatização nos substratos
Ecoterra® e Plantmax® sem a necessidade de uma etapa de enraizamento in vitro.
7. O tempo de aclimatização das mudas de caroá, 210 dias, ainda é considerado
longo, necessitando otimizar essa etapa.
8. Para o enraizamento in vitro de caroá, a presença da auxina aumenta a taxa de
enraizamento.
9. A presença de cinetina influencia de forma negativa no alongamento e no
número de raízes das plantas de caroá.
10. As mudas enraizadas in vitro, independente do tipo de explante, apresentaram
sucesso na aclimatização no substrato Plantmax®.
129
11. Folhas das mudas de caroá nas três condições estudadas, in vitro, ex vitro e
in vivo, apresentam as estruturas básicas: hipoderme, parênquima aqüífero,
parênquima clorofilado e fibras semelhantes, porém, as mudas das condições in
vivo têm essas estruturas mais desenvolvidas.
12. As variações estruturais na espessura da cutícula, no formato dos tricomas e
no formato das células do parênquima aqüífero das plantas mantidas nos
ambientes in vitro, ex vitro e in vivo demonstram plasticidade fenotípica nessa
espécie.
13. Existe variabilidade genética entre e dentro das populações de caroá, que
pode ser explorada visando à conservação e exploração comercial da espécie.
14. São necessárias, no mínimo, 315 bandas de RAPD para uma precisa
estimativa da variabilidade genética entre os entre os 180 genótipos.
15. Os marcadores RAPD são eficientes para a classificação dos genótipos de
Caroá em função dos municípios e locais de coleta.
130
RESUMO
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez é uma bromélia nativa da Caatinga
usada para extração de fibras na Região Nordeste do Brasil. Atualmente essas
fibras têm sido usadas para a confecção de produtos artesanais gerando renda e
emprego para muitas famílias dessa Região. Contudo, um extrativismo predatório
no último século vem causando importantes perdas genéticas no pool genético
dessa espécie. O objetivo desse trabalho foi o desenvolvimento de um protocolo
de produção de plantas in vitro, incluindo diversos estudos correlatos, como a
germinação in vivo e in vitro de sementes, aclimatização das plantas produzidas,
anatomia de folhas em diferentes condições de cultivo e o uso de marcadores
moleculares para avaliação da variabilidade genética em populações naturais de
caroá no Estado da Bahia. Para os estudos de germinação in vivo diferentes
temperaturas foram avaliadas (25, 30, 34 e 37 °C). A temperatura de 30 °C
proporcionou os melhores resultados e foi usada em um novo experimento com
diferentes concentrações de PEG. Os resultados desse experimento mostraram
que as sementes não germinam em potencial osmótico acima de -0.6 MPa. Por
outro lado, os ensaios de germinação in vitro foram realizados em meio MS sob
condições de escuro e em presença de luz. As plântulas germinadas in vitro foram
multiplicadas em meio MS suplementado com as combinações de 0,05 e 0,50 µM
de ANA e 2,2 e 4,4 µM de BAP e de CIN, constituindo oito tratamentos e um
controle, no qual as plântulas foram cultivadas no mesmo meio sem a presença
dos reguladores de crescimento. As melhores porcentagens de germinação foram
obtidas com sementes incubadas na presença de luz e as maiores taxas de
multiplicação no meio com ANA (0,5 µM) + BAP (4,4 µM), assim como o maior
número de raízes foi proporcionado pelo tratamento com ANA (0.5 µM) + CIN (2.2
µM). Visando a otimização do protocolo de produção de plantas in vitro de caroá
avaliou-se o efeito da interação entre diferentes concentrações de ANA (0,0 µM;
0,5 µM and 5,3 µM) e CIN (0,0 µM, 2,2 µM e 4,4 µM) para o estabelecimento de
um sistema de enraizamento in vitro eficiente. A aclimatização dessas plantas foi
realizada utilizando-se o substrato Plantmax®. As avaliações mostraram que a
adição de ANA ao meio de cultura é fundamental para o enraizamento das
plantas in vitro, tendo promovido os melhores resultados para os parâmetros
avaliados. Por outro lado, brotos e plantas produzidos in vitro e que não foram
131
submetidos a uma fase específica de enraizamento foram avaliados. Esses brotos
e plantas foram aclimatizados nos seguintes substratos: areia lavada, Ecoterra®,
fibra de coco, fibra de coco + Plantmax®, Plantmax®, vermiculita, vermiculita +
Plantmax®. Os melhores resultados para aclimatização foram obtidos nos
substratos Ecoterra® e Plantmax®. Uma das limitações na micropropagação de
bromélias é o longo período de aclimatização das microplantas. Dessa forma, o
estudo anatômico de folhas em diferentes etapas do cultivo pode gerar subsídios
para a superação deste problema. Foram avaliados os aspectos anatômicos de
folhas de caroá, oriundas de seu ambiente natural (Caatinga), de folhas oriundas
de plantas in vitro, assim como de folhas de plantas em etapa de aclimatização.
As folhas foram seccionadas e observadas em microscópio óptico. A análise de
estômatos e escamas foi realizada através da microscopia eletrônica de
varredura. Folhas oriundas de plantas in vitro e aclimatizadas apresentaram
estruturas básicas, como hipoderme, parênquima aqüífero, parênquima clorofilado
e fibras, às das plantas coletadas em seu ambiente natural, porém com variações
no tamanho, número e morfologia de algumas delas. As variações estruturais,
espessura da cutícula, formato dos tricomas e formato das células do parênquima
aqüífero, foram relacionadas às condições especiais às quais as plantas foram
submetidas, devido às diferentes condições ambientais que determinam o seu
desenvolvimento. Finalmente foi quantificada a variabilidade genética entre
populações de caroá coletadas, usando-se marcadores moleculares do tipo
RAPD. Observou-se um elevado polimorfismo entre as populações de caroá, fato
que pode ser resultado da ação e das interações de uma série de mecanismos
evolutivos. As dissimilaridades genéticas entre todos os genótipos variaram de
0,08 a 0,95 com média de 0,44. A análise molecular da variância mostrou que
56,47% da variação total foi explicada pela variação entre indivíduos dentro de
locais. A variação entre municípios foi de 17,41% do total, enquanto que entre
locais dentro municípios ficou em 26,12%. Estes resultados podem servir como
subsidio para a coleta, caracterização e conservação do germoplasma de Caroá.
132
ABSTRACT
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez is a native Bromeliad of Caatinga. It is
used for fiber extraction in the Northeast Region of Brazil. Nowadays these fibers
have been used for artisanal products generate that jobs and income to several
families from Northeast Region. However, the anthropic activity from this species
has been caused important losses in genetic pool of this species since the last
century. The objctive of this work was the development of a protocol for in vitro
plant production, that includes several correlated studies such as germination in
vivo and in vitro of seeds, acclimatization of plants, anatomy of leaves in different
growing conditions and the use of molecular markers to evaluate the genetic
variability in natural populations of caroá in Bahia State. Different temperatures
such as 25, 30, 34 e 37 °C were evaluated for germination in vivo. The
temperature of 30 °C promoted the best germination rate and was used with
different concentration of PEG in another experiment. The results of this
experiment showed that the seed did not germinate in osmotic potential above -0.6
MPa. On the other hand, the in vitro germination seeds were carried in MS media
under light and dark condition. In vitro germinated seedlings were multiplied in MS
medium supplemented with the combinations of different concentration of NAA
(0,05, 0.50 µM) x BA (2.2, 4.4 µM) x KIN (2.2, 4.4 µM). The best percentages of
germination were obtained with the seeds incubated in the presence of light and
the highest multiplication ratio was obtained for the NAA (0,5 µM) + BAP (4,4 µM)
treatment. The highest number of roots occurred with NAA (0.5 µM) + KIN (2.2
µM). In order to optimize the protocol of plants of caroá, the effect of interaction
between different concentrations of NAA (0,0 µM; 0,5 µM and 5,3 µM) and KIN
(0,0 µM, 2,2 µM e 4,4 µM) in MS was evaluated for establishment of an efficient in
vitro rooting system. The acclimatization of this plant was accomplished by using
Plantmax® substrate. The evaluations showed that the addition of the NAA in
culture media is fundamental to in vitro plant rooting and promotes the best results
for the evaluated parameters. On the other hand, shoots and plants of caroá
produced in vitro that were not submitted to the in vitro rooting stage were
evaluated. These shoots and plants were acclimatized in the followed substrates:
washed sand, Ecoterra®, coconut fiber, coconut fiber + Plantmax®, Plantmax®,
vermiculita, vermiculita + Plantmax®. The best results for direct acclimatization
133
were obtained with Ecoterra® and Plantmax® substrates. One of the limitations in
the micropropagation of bromeliads is the long period of acclimatization. In this
context, leaf anatomy studies are important to give subsidies to overcome this
problem. Anatomical aspects of caroá leaves were carried with plants grown under
different environmental conditions (in vivo, in vitro or during acclimatization stage).
For a comparative analysis leaves collected directly in Caatinga, leaves from in
vitro plants and leaves from plants under acclimatization process were used and
sectioned transversely and observed under optical microscope. The analysis of
stomats and scales was performed using scanning electron microscopy. Leaves
from in vitro and the acclimatized plants showed similar structures as hypodermis,
aquiferous parenchyma, photosynthetic parenchyma and fibers to the plants from
field condition, but with variations in the size, number and format of some
structures. Structural variations such as cuticle thickness, shape of trichomes as
well of the aquifer parenchyma cells were related to the special conditions in which
plants were submitted due to the different environmental conditions that determine
their development. Finally was quantified the genetic variability among populations
of caroá, using RAPD markers. A high polymorphism was observed among the
caroá populations, fact that it can be resulted by action and by interactions of a
series of evolutionary mechanisms. The genetic dissimilarities among all of the
genotypes varied from 0.08 to 0.95 with average of 0.44. The molecular analysis
of variance showed that 56.47% of the total variation was explained by the
variation among individuals within locations. The variation among cities was of
17.41% of the total, while among locations, within cities were 26.12%. These
results can support collection, characterization and conservation of the
germoplasm of caroá.
134
ANEXOS
135
REVISTA CIÊNCIA E AGROTECNOLOGIA
Editora UFLA – Universidade Federal de Lavras – E-mail: [email protected]
Normas para Publicação de Artigos Científicos
1. Os conceitos e afirmações contidos nos artigos serão de inteira
responsabilidade do(s) autor(es).
2. A Revista “Ciência e Agrotecnologia”, editada bimestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos nas
áreas de “Ciências Agrárias, Ciência e Tecnologia de Alimentos, Economia e
Administração do Agronegócio, Engenharia Rural, Medicina Veterinária e
Zootecnia”, elaborados por membros da comunidade científica nacional e
internacional. É condição fundamental que os artigos submetidos à apreciação da
“Revista Ciência e Agrotecnologia” não foram e nem serão publicados
simultaneamente em outro lugar. Com a aceitação do artigo para publicação, os
editores adquirem amplos e exclusivos direitos sobre o artigo para todas as
línguas e países. A publicação de artigos dependerá da observância das Normas
Editoriais, dos pareceres do Corpo Editorial e da Comissão ad hoc. Todos os
pareceres têm caráter sigiloso e imparcial, e tanto os autores quanto os membros
do Corpo Editorial e/ou Comissão ad hoc não obtêm informações identificadoras
entre si.
3. Custo para publicação: O custo da publicação é de R$20,00 (vinte reais) por
página editorada (página impressa no formato final) até seis páginas e R$40,00
(quarenta reais) por página adicional. No encaminhamento inicial, efetuar o
pagamento de R$50,00 (cinqüenta reais), não reembolsável, valor esse a ser
descontado no custo final do artigo editorado (formato final). Por ocasião da
submissão, deverá ser encaminhado o comprovante de depósito ou transferência
bancária a favor de FUNDECC/Editora, Banco do Brasil, agência 0364-6, conta
corrente 37.724-4.
4. Os artigos submetidos para publicação deverão ser encaminhados via
eletrônica (www.editora.ufla.br/revista), editados em língua portuguesa ou em
língua inglesa e usar somente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas,
não empregando abreviaturas no título do artigo. O trabalho deverá ser digitado
no processador de texto Microsoft Word for Windows (versão 98, 2000, 2003 ou
XP), tamanho A4 (21cm x 29,7cm), espaço duplo entre linhas, fonte: Times New
136
Roman, tamanho: 12, observada uma margem de 2,5 cm para o lado esquerdo e
de 2,5 cm para o direito, 2,5 cm para margem superior e inferior, 2,5 cm para o
cabeçalho e 2,5 cm para o rodapé. Cada trabalho deverá ter no máximo 16
páginas. Todos os autores deverão enviar e-mail concordando com a publicação
para o seguinte endereço eletrônico: [email protected]. Qualquer alteração na
ordem dos autores deverá ser notificada mediante concordância de todos os
autores (inclusive do autor excluído).
5. O artigo científico deverá conter os seguintes tópicos: a) TÍTULO,
suficientemente claro, conciso e completo, evitando palavras supérfluas.
Recomenda-se começar pelo termo que represente o aspecto mais importante do
trabalho, com os demais termos em ordem decrescente de importância. Deve ser
apresentada a versão do título para o idioma inglês; b) NOME(s) DO(s)
AUTOR(es) EM LETRAS MAIÚSCULAS, no lado direito, um nome debaixo do
outro, e no rodapé da primeira página , deverão vir a formação acadêmica e o
endereço profissional completo de todos os autores, com e-mail e no máximo com
6 (seis) autores; c) RESUMO (de acordo com NBR6028 da ABNT). O resumo não
deve ultrapassar a 250 (duzentos e cinqüenta) palavras e não possuir parágrafos.
Após o Resumo deve-se incluir TERMOS PARA INDEXAÇÃO (palavras-chave),
diferentes daqueles constantes do título e separados por vírgula. Os termos para
indexação devem estar descritos na forma maiúscula e minúscula, serem
expressões que identifiquem o conteúdo do artigo, ser indicadas entre 3 e 5; d)
TÍTULO EM INGLÊS; ABSTRACT, incluindo, em seguida, INDEX TERMS
(tradução para o inglês do resumo); e) INTRODUÇÃO (incluindo a revisão de
literatura); f) MATERIAL E MÉTODOS; g) RESULTADOS E DISCUSSÃO
(podendo conter tabelas e figuras); h) CONCLUSÕES; e i) REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS.
6. RODAPÉ: Deve constar formação, titulação, endereço comercial completo (rua,
número, bairro, Cx. P., cep, cidade, estado) e e-mail de todos os autores.
7. AGRADECIMENTOS: ao fim do texto e, antes das Referências Bibliográficas,
poderão vir os agradecimentos a pessoas ou instituições. O estilo, também aqui,
deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas quais se fazem os
agradecimentos.
8. TABELAS E QUADROS: deverão ser feitos no Word e inseridos após citação
dos mesmos dentro do próprio texto, salvo em doc.
137
9. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS, GRÁFICOS, FIGURAS,
SÍMBOLOS E FÓRMULAS, ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
9.1 Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco, nítidas e com
contraste, inseridas no texto após a citação das mesmas e também em um
arquivo à parte, salvas em extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.
9.2 Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco, nítidas e com contraste,
inseridas no texto após a citação das mesmas e também em um arquivo à parte,
salvas em extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi. As figuras
deverão ser elaboradas com letra Times New Roman, tamanho 10, sem negrito;
sem caixa de textos e agrupadas.
9.3 Gráficos deverão ser inseridos no texto após a citação dos mesmos, e
também em um arquivo à parte. Esses deverão ser elaborados preferencialmente
em Excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem negrito, salvos em
extensão XLS e transformados em TIFF ou JPG, com resolução de 300 dpi.
9.4 Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em processador que
possibilite a formatação para o programa Page Maker (ex: MathType, Equation),
sem perda de suas formas originais.
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: a partir do Volume 18, Número 1 de
1994, a normalização das referências bibliográficas é baseada na NBR6023/2002
da ABNT. A exatidão das referências constantes da listagem e a correta citação
no texto são de responsabilidade do(s) autor(es) do artigo.
Orientações gerais:
- Devem-se apresentar todos os autores do documento científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de publicação (cidade), a ser
descrito no lugar adequado para cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente e “alinhadas à margem
esquerda”, conforme NBR6023/2002 (ABNT, 2002, p.3).
- Deve-se deixar espaçamento simples nas entrelinhas e duplo entre as
referências.
EXEMPLIFICAÇÃO (TIPOS MAIS COMUNS):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
138
DINIZ, E.R.; SANTOS, R.H.S.; URQUIAGA, S.S.; PETERNELLI, L.A.;
BARRELLA, T.P.; FREITAS, G.B. de. Crescimento e produção de brócolis em
sistema orgânico em função de doses de composto. Ciência e Agrotecnologia,
Lavras, v.32, n.5, p.1428-1434, set./out. 2008.
LIVRO:
a) livro no todo:
FERREIRA, D.F. Estatística multivariada. Lavras: UFLA, 2008. 672p.
b) Parte de livro com autoria específica:
BERGEN, W.G.; MERKEL, R.A. Protein accretion. In: PEARSON, A.M.; DUTSON,
T.R. Growth regulation in farm animals: advances in meat research. London:
Elsevier Science, 1991. v.7, p.169-202.
c) Parte de livro sem autoria específica:
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Tecido muscular. In: ______. Histologia
básica. 11.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 524p.
DISSERTAÇÃO E TESE:
FERREIRA, W.C. Estabelecimento de mata ciliar em áreas degradada e
perturbada. 2006. 133p. Dissertação (Mestrado em Manejo Ambiental)-
Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2006.
Nota: “A folha é composta de duas páginas: anverso e verso. Alguns trabalhos,
como teses edissertações são impressos apenas no anverso e, neste caso,
indica-se f.” (ABNT,NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
COUTINHO, L.L.; GABRIEL, J.E.; ALVARES, L.E. Controle molecular do
desenvolvimento da musculatura esquelética. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL
DE GENÉTICA E MELHORAMENTO ANIMAL, 12., 1999, Viçosa, MG. Anais...
Viçosa, MG, 1999. p.355-376.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme normas específicas para
cada tipo de documento (monografia no todo e em parte, trabalho apresentado
em evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.), acrescidas de informações
sobre o endereço eletrônico apresentado entre braquetes (< >), precedido da
expressão “Disponível em:” e da data de acesso ao documento, precedida da
expressão “Acesso em:”.
139
Nota: “Não se recomenda referenciar material eletrônico de curta duração nas
redes” (ABNT, NBR6023/2000, p. 4). Segundo padrões internacionais, a divisão
de endereço eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília, DF: Socinfo/MCT, 2000.
90 p. Disponível em: <http//www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In: ______. Sociedade da
informação no Brasil: livro verde. Brasília, DF: Socinfo/MCT, 2000. cap.2, p. 13-
24. Disponível em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H.O. Avaliação de desempenho de institutos de pesquisa
tecnológica: a experiência de projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza, CE. Gestão de institutos de pesquisa
tecnológica. Fortaleza, CE: Nutec, 2000. Disponível em:
<http://www.abipti.org.br>. Acesso em: 01 dez. 2000.
d) Tese
OLIVEIRA, A.H. Erosão hídrica em florestas de eucalipto na região sudeste do
Rio Grande do Sul. 2008. 62p. Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo)-
Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2008. Disponível em:
<http://bibtede.ufla.br/tede//tde_busca/arquivo.php?codArquivo=1382>. Acesso
em: 24 nov. 2008.
Artigo de periódico (acesso online):
JASPER, S.P.; BIAGGIONI, M.A.M.; RIBEIRO, J.P. Avaliação do desempenho de
um sistema de secagem projetado para os pequenos produtores rurais. Ciência e
Agrotecnologia, Lavras, v.32, n.4, p.1055-1061, jul./ago. 2008. Disponível em:
<http://www.editora.ufla.br/revista/32_4/(04)%20Artigo%204193.pdf>. Acesso em:
25 nov. 2008.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTOR-DATA) (baseado na ABNT,
NBR10520/2002).
Dois autores - Silva & Leão (2008) ou (Silva & Leão, 2008).
Três ou mais autores - Ribeiro et al. (2008) ou (Ribeiro et al., 2008).
140
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma obra deve-se separá-los
pelo sinal & (comercial).
Se houver mais de uma citação no mesmo texto, deve-se apresentar os autores
em ordem cronológica crescente, por exemplo: Souza (2004), Pereira (2006),
Araújo (2007) e Nunes Júnior (2008); ou: (Souza, 2004; Pereira, 2006; Araújo,
2007; Nunes Júnior, 2008).
11. A Editora UFLA notificará o autor do recebimento do original e,
posteriormente, o informará sobre sua publicação.
12. Processo para publicação: os artigos submetidos para publicação são
encaminhados ao Conselho Editorial para que seja verificado se está apresentado
de acordo com as normas editoriais. Posteriormente, o artigo é encaminhado a (2)
dois consultores „ad hoc‟ para emitirem seus pareceres. Se aprovado por ambos,
o artigo é re-enviado aos autores para as correções (se necessário). Após
corrigido, retorna aos consultores para verificarem se as sugestões foram
atendidas para emissão do parecer final. O não cumprimento das solicitações dos
consultores implicará na devolução do artigo ao autor. Finalmente, o artigo é
encaminhado para correções de Nomenclatura Científica, Inglês, Referências
Bibliográficas e Português. A seguir o artigo é encaminhado para editoração e
publicação. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação.
141
BRAZILIAN ARCHIVES OF BIOLOGY AND TECHNOLOGY
Instituto de Tecnologia do Paraná (TECPAR) – E-mail:[email protected]
Instructions for Authors
Submission of papers
Brazilian Archives of Biology and Technology publishes original research papers,
Short notes and Review articles in English in the interdisciplinary areas of
biological sciences and engineering/technology. Submission of paper implies that
it has not been published or being considered for publication elsewhere. Care
should be taken to prepare a compact manuscript with precision in presentation,
which will help authors in its acceptance. All the papers are subjected to review by
referees.
Manuscript
Three copies of the single-spaced typed manuscript (maximum 12 pages for
original and review articles and 2-4 pages for short notes) on a high grade A-4 size
paper (210x297 mm), with margins (left 25, right 20, superior and inferior 30 mm)
should be prepared. This should be divided under the following headings:
ABSTRACT, INTRODUCTION, MATERIALS AND METHODS, RESULTS,
DISCUSSION, ACKNOWLEDGEMENTS, RESUMO, REFERENCES. These
headings should be typed in bold upper case (12 font). For review articles, authors
should make their own headings along with Abstract and Introduction.
Title
The title (18 font, bold) of the paper should clearly reflect its contents. It should be
followed by the name(s) of author(s) with expanded initials (12 font, bold) and the
address(s) (italic, 10 font) of the institution(s) where the work has been carried out.
ABSTRACT
Each paper should be provided with an abstract (italic) of 100-150 words,
describing briefly on the purpose and results of the study. It should be prepared as
concisely as possible.
Key words
Authors should provide three to six key words that will be used in indexing their
paper.
INTRODUCTION
142
This should describe the background and relevant information about the work. It
should also state the objective of the work.
MATERIALS AND METHODS
Authors must take care in providing sufficient details so that others can repeat the
work. Standard procedures need not be described in detail.
RESULTS AND DISCUSSION
Results and Discussion may be presented separately or in combined form
(authors may decide easier way for them). Preliminary work or less relevant
results are not to be described. The reproducibility of the results, including the
number of times the experiment was conducted and the number of replicate
samples should be stated clearly.
RESUMO
An abstract of the paper should also be prepared in Portuguese and placed before
the list of References. Authors from other than Latin American countries can seek
the help of Editor's office to prepare Portuguese resumo of their papers.
REFERENCES
References in the text should be cited at the appropriate point by the name(s) of
the author(s) and year (e.g. Raimbault & Roussos, 1996; Raimbault et al., 1997).
A list of references, in the alphabetic order (10 font), should appear at the end of
the manuscript. All references in the list should be indicated at some point in the
text and vice versa. Unpublished results should not be included in the list.
Examples of references are given below.
In journals:
Pandey, A. (1992), Recent developments in solid state fermentation. Process
Biochem., 27, 109-117
Thesis:
Chang, C. W. (1975), Effect of fluoride pollution on plants and cattle. PhD Thesis,
Banaras Hindu University, Varanasi, India
In books:
Tengerdy, R. P. (1998), Solid substrate fermentation for enzyme production. In-
Advances in Biotechno-logy, ed. A. Pandey. Educational Publishers & Distributors,
New Delhi, pp. 13-16 Pandey, A. (1998), Threads of Life. National Institute of
Science Communication, New Delhi
In conferences:
143
Davison, A. W. (1982), Uptake, transport and accumulation of soil and airborne
fluorides by vegetation. Paper presented at 6th International Fluoride Symposium,
1-3 May, Logan, Utah
Tables and Figures
Tables and figures, numbered consecutively with Arabic numerals must be
inserted at appropriate place in the text. These should be used to present only
those data, which can not be described in the text
Units and Abbreviations
The SI system should be used for all experimental data. In case other units are
used, these should be added in parentheses. Only standard abbreviations for the
units should be used. Full stop should not be included in the abbreviation (e.g. m,
not m. or rpm, not r.p.m.). Authors should use '%' and '/' in place of 'per cent' and
'per'.
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Manuscript lay-out
It is suggested that authors consult a recent issue of the journal for the style and
layout. Except the title, abstract and key words, entire text should be placed in two
columns on each page. Footnotes, except on first page indicating the
corresponding author (8 font) should not be included. The entire manuscript
should be prepared in Times New Roman, 11 font (except reference list, which
should be in 10 font).
Spacing
Leave one space between the title of the paper and the name(s) of the author(s),
and between the headings and the text. No space should be left between the
paragraphs in the text. Leave 0.6-cm space between the two columns.
Electronic submission
Manuscript should be accompanied by a diskette indicating the name and version
of the word processing programme used (use only MS Word 6/7 or compatible).
Referees
When submitting the manuscript authors may suggest up to three referees,
preferably from other than their own countries, providing full name and address
with email. However, the final choice of referees will remain entirely
with the Editor.
Page charges and reprints
144
There will be no page charges. Reprints can be ordered up on acceptance of the
paper.
Manuscripts and all correspondence should be sent to the Editor:
Prof. Dr. Carlos R. Soccol
Brazilian Archives of Biology and Technology
Rua Prof. Algacyr Munhoz Mader 3775-CIC 81350-010
Curitiba-PR, Brazil
Fax +55-41-247 67 88
Email:[email protected]
145
PLANT CELL CULTURE & MICROPROPAGATION
Editora UFLA – Universidade Federal de Lavras – E-mail:[email protected]
Normas para Publicação de Artigos e Comunicações Científicas
1. SUBMISSÃO:
Cada trabalho deverá ter no máximo 14 páginas e junto do mesmo deverá
ser encaminhado ofício dirigido ao Editor Chefe da revista, solicitando a
publicação do artigo. Esse ofício deverá conter o pedido de apreciação na revista
ao editor chefe, a declaração de ser um trabalho original e não ter sido submetido
a nenhuma outra revista, ser assinado por todos os autores, constar o
endereço completo, telefone e e-mail de todos. Qualquer inclusão, exclusão ou
alteração na ordem dos autores, deverá ser notificada mediante ofício assinado
por todos os autores (inclusive do autor excluído).
Originais: quatro vias impressas em e uma via em CDR, com texto e ilustrações
e gráficos. Das 4 vias impressas apenas 1 deve conter os nomes completos dos
autores e rodapé na primeira página.
Processador de texto: Word for Windows (version 98, 2000, XP ou 2003).
Redigido em português, inglês ou espanhol
Espaçamento do texto: Duplo. Margens: esquerda (3cm), direita (2cm), inferior e
superiores (2,5cm). Cabeçalho e Rodapé (2,5cm).
Papel: formato A4.
Fonte: Times New Roman, tamanho 12.
Número de páginas: até 14 páginas, numeradas consecutivamente, incluindo as
ilustrações.
Tabelas: devem fazer parte do corpo do artigo e ser apresentadas no módulo
tabela do Word. O título deve ficar acima.
Gráficos, Figuras e Fotografias: devem ser apresentados em preto e branco,
nítidos e com contraste, escaneados, inseridos no texto após a citação dos
mesmos e também em um arquivo à parte, salvos em extensão “tif” ou “jpg”, com
resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também em excel, com letra Times
New Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas. em
arquivo à parte.
146
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em processador que
possibilite a formatação para o programa Page Maker, sem perda de suas formas
originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo, evitando-se palavras supérfulas, em
letras maiúsculas, centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota de rodapé da
primeira página em apenas 1 das 4 vias do manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor está filiado – endereço
da instituição – CEP – cidade, estado – endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o conteúdo, expondo objetivos,
materiais e métodos, os principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de cinco. Não devem
repetir os termos que se acham no título, podem ser constituídas de expressões
curtas e não só de palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola Nacional, desenvolvido
pela CENAGRI (indicação da revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”
para evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação).
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não ultrapassando 250 palavras,
deve ser uma tradução próxima do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave para a língua inglesa.
INTRODUÇÃO
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual do conhecimento sobre o
assunto, que o manuscrito aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem
constituir-se em extensa revisão e, na parte final, os objetivos da pesquisa. Deve
incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
147
Esta seção pode ser dividida em subtítulos, indicados em negrito.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos concisos e descritivos, e
conter tabelas e figuras.
CONCLUSÕES
Finalizar com os resultados de acordo com os objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências Bibliográficas, a pessoas
ou instituições. O estilo, também aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as
razões pelas quais se fazem os agradecimentos
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada na seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo, evitando-se palavras supérfluas, em
letras maiúsculas, centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota de rodapé da
primeira página em apenas 1 das 4 vias do manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor está filiado – endereço
da instituição – CEP – cidade, estado – endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o conteúdo, expondo objetivos,
materiais e métodos, os principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028.
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de cinco. Não devem
repetir os termos que se acham no título, podem ser constituídas de expressões
curtas e não só de palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola Nacional, desenvolvido
pela CENAGRI (indicação da revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”
para evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
148
Além de seguir as recomendações do resumo, não ultrapassando 250 palavras,
deve ser uma tradução próxima do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e métodos, resultados e
discussão (podendo conter tabelas e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências Bibliográficas, a pessoas
ou instituições. O estilo, também aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as
razões pelas quais se fazem os agradecimentos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS, GRÁFICOS, FIGURAS,
SÍMBOLOS E FÓRMULAS, ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
3.1 Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco, nítidas e com
contraste, inseridas no texto após a citação das mesmas e também em um
arquivo à parte, salvas em extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300
dpi.
3.2 Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco, nítidas e com
contraste, inseridas no texto após a citação das mesmas e também em um
arquivo à parte, salvas em extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300
dpi. As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New Roman, tamanho
10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.3 Gráficos deverão ser inseridos após citação dos mesmos, dentro do próprio
texto, elaborado preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4 Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em processador que
possibilite a formatação para o programa Page Maker (ex: MathType, Equation),
sem perda de suas formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para que o trabalho seja
devidamente protocolado. Caso este não esteja nas normas, o mesmo será
recusado.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências bibliográficas devem ser
citadas conforme a NBR6023/2002 da ABNT.
149
A exatidão das referências constantes da listagem e a correta citação no
texto são de responsabilidade do(s) autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de publicação (cidade), a ser
descrito no lugar adequado para cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de ervilha em Patos de
Minas, Uberaba e Janaúba, Minas Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.
24, n. 1, p. 74-80, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and procedures of statistics. New
York: McGraw-Hill Book, l960. 481 p.
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos da automação sobre a
organização da produção de trabalho. In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da
empresa. Brasília: IPEA/IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em confinamento. In: ______.
Confinamento de bovino de corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-
89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica de trigo (Triticum
aestivum L.) e controle de Rhyzopertha dominica (F.) durante o
armazenamento em atmosfera controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas mastíticas no
rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p. Dissertação (Mestrado em Ciências
dos Alimentos) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
150
Nota: “A folha é composta de duas páginas: anverso e verso. Alguns trabalhos,
como teses e dissertações são impressos apenas no anverso e, neste caso,
indica-se f.” (ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de madeira em floresta
densa de terra firme da Amazônia brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL
BRASILEIRO, 6., 1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão:
SBS/SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme normas específicas para
cada tipo de documento (monografia no todo e em parte, trabalho apresentado
em evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.), acrescidas de informações
sobre o endereço eletrônico apresentado entre braquetes (< >), precedido da
expressão “Disponível em:” e da data de acesso ao documento, precedida
da expressão “Acesso em:”.
Nota: “Não se recomenda referenciar material eletrônico de curta duração nas
redes” (ABNT, NBR6023/2000, p. 4). Segundo padrões internacionais, a divisão
de endereço eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília: Socinfo/MCT, 2000. 90
p. Disponível em: <http//www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In: ______. Sociedade da
informação no Brasil: livro verde. Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24.
Disponível em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de institutos de pesquisa
tecnológica: a experiência de projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de institutos de pesquisa
tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000. Disponível em: <http://www.abipti.org.br>.
Acesso em: 01 dez. 2000.
d) Tese
151
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira de sinais (LIBRAS).
1997. 144 p. Dissertação (Mestrado em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua)
- Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997. Disponível em:
<http://www.terra.com.br/virtualbooks/ freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em:
28 nov. 2000.
Artigo de periódico (acesso online):
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um conceito contemporâneo.
Informação e Sociedade, Recife, v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível
em: <http://www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov. 2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTOR-DATA) (conforme ABNT,
NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE, 1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al., 1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma obra deve-se separá-los
pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICARÁ O AUTOR DO RECEBIMENTO DO
ORIGINAL E, POSTERIORMENTE, O INFORMARÁ SOBRE SUA
PUBLICAÇÃO. OS ARTIGOS QUE NECESSITAREM DE MODIFICAÇÕES
SERÃO DEVOLVIDOS AO AUTOR PARA A DEVIDA REVISÃO.
6. OS ARTIGOS NÃO APROVADOS SERÃO DEVOLVIDOS.
7. OS ARTIGOS SERÃO PUBLICADOS EM ORDEM DE APROVAÇÃO.
8. O NÃO-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS IMPLICARÁ NA DEVOLUÇÃO
DO ARTIGO AO AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SERÃO RESOLVIDOS PELA COMISSÃO
EDITORIAL.
10. O ARTIGO DEVERÁ SER ENVIADO PARA:
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 – Lavras – MG – BRAZIL
152
ACTA HORTICULTURAE
GENERAL INFORMATION
ISHS Publication Policy All oral presenters, including invited and key-note
speakers, must submit a manuscript for the Acta Horticulturae. If this is not
agreed to by the author(s), the work can be presented as a poster. Authors of
posters are welcomed to submit their manuscript for Acta Horticulturae but
posters cannot be published as such. The manuscript should be submitted a few
weeks before the symposium starts or at the symposium in order to avoid
unnecessary delay in the reviewing process and editing of the Acta Horticulturae
volume.
Submission of a manuscript implies that the work described has not been
published before (except in form of an abstract or as part of a published lecture,
review or thesis); that it is not under consideration for publication elsewhere; that
its publication has been approved by all co-authors, if any, as well as - tacitly or
explicitly - by the responsible authorities at the institution where the work was
carried out.
The copyright to an article submitted for publication is transferred to the
International Society for Horticultural Science (for U.S. government
employees: to the extent transferable) effective if and when the article is accepted
for publication. The author warrants that his/her contribution is original and that
he/she has full power to make this grant. The author signs for and accepts
responsibility for releasing this material on behalf of any and all co-authors. The
copyright transfer covers the exclusive right to reproduce and distribute the article,
including reprints, translations, photographic reproductions, microform, electronic
form (offline, online) or any other reproductions of similar nature.
An author may self-archive an author-created version of his/her article on his/her
own website. He/she may also deposit that version on his/her institution's and
funder's (funder-designated) repository at the funder‟s request or as a result of a
legal obligation, including his/her final version, provided it is not made publicly
available until after 12 months of official publication. He/she may not use the
publisher's PDF version which is posted on www.actahort.org for the purpose of
self-archiving or deposit. Furthermore, the author may only post his/her version
provided acknowledgement is given to the original source of publication and a link
153
is inserted to the published article on ISHS's website. The link must be
accompanied by the following text: "The original publication is available at
www.actahort.org".
Important elements of the publisher's role in the scientific communication process
are reviewing, recognition and consistent quality assurance. In order to guarantee
that the requirements of these elements are fully met, control of the dissemination
of the final article is necessary. Permitting an article to be published elsewhere on
public servers without a clear connection to the final article can potentially confuse
readers who use the article for their own research and will not be in the interest of
science. The transfer of copyright from the author to the publisher assists ISHS to
protect the mutual interests of both the author/researcher and the publisher.
Articles disseminated via www.actahort.org are indexed, abstracted and
referenced by many abstracting and information services, bibliographic networks,
subscription agencies, library networks and consortia.
Length of the Printed Paper
All symposium verbal and poster presentations are eligible for publication in the
proceedings if a suitable manuscript is prepared according to this ISHS Authors
Guide and submitted on time to the Convener of the meeting. The convener will
send the manuscript to the Editorial Board for reviewing.
Manuscripts should be as concise as possible in order to reduce to a minimum the
number of pages of Acta Horticulturae. As a general rule the maximum
recommended length of an invited paper is 16 pages and of a submitted oral paper
or poster is 8 pages, including figures and tables. An average page of text will
contain about 800 words. Manuscript reviewers will cut unnecessary information
and will advise on the number of pages each manuscript should have taking into
account its content and characteristics. For any length over the recommended
number of pages the convener will have the right to charge 75,- euro per additional
page.
Language
English is the official language of Acta Horticulturae. However, if the original
contribution is presented at a bilingual symposium, a manuscript in Spanish or
French is also acceptable, provided it includes a one page extended abstract in
English. An abstract in French or Spanish can be added to manuscripts in English.
Spelling
154
ISHS has no preference whether English or American spelling is used although
uniformity within each paper is required. Latin words or phrases are in italics, with
the exception of very common expressions such as "i.e.," "e.g.," "et al.," "in vitro,"
"ex vitro" and "etc. The expression "etc." for "and so forth" should be used only
with series, such as 1, 2, 3, etc.
Units
Use the metric system exclusively. Use abbreviation L for liter, mg/L for
milligram(me) per liter, ml for milliliter, and t for tonne (metric ton). SI units can be
used where appropriate.
Font and Type Size
Use Times New Roman font exclusively. Titles are printed in 14 point but the rest
of the manuscript, including tables should be 12 point. When italic typeface is
required use italic type, not underline.
Plant Names
Scientific names are to be included for all plant species and are to be in italic font
except for the abbreviations “var.”, “subsp.”, “f.”, etc. which indicate rank at
infraspecific level (e.g., Cedrus libani subsp. atlantica, Phytophthora parasitica var.
nicotianae).
Author citation should only be used when helpful for historical or taxonomic
reasons, and then it should only be used when the name is first mentioned in the
body of the text (do not use author citation in the abstract or title). Author names
are to abbreviated in accordance with the international standard provided by
Brummitt, R.K., & Powell, C.E., “Authors of Plant Names”, Royal Botanic Gardens,
Kew 1992. An on-line version of this work may be consulted via
http://www.rbgkew.org.uk/data/authors.html.
Common names may be used for well-known plants once the scientific name has
been provided (e.g., apple, pear, potato, rose, tomato).
Cultivated varieties which are the product of selection and/or breeding are to be
referred to as “cultivars” and not “varieties”. Cultivar names are to be written in
accordance with the International Code of Nomenclature for Cultivated Plants. The
current (2004) edition is obtainable from ISHS via
http://www.actahort.org/books/647.In particular, the part of a name which
denotes the cultivar is it be placed within single quotation marks. The abbreviation
155
“cv.” is not to be used within a name (e.g., Malus ×domestica „Golden Delicious‟,
not Malus ×domestica cv. Golden Delicious).
If indicating hybrid status, the multiplication symbol should be used before the
name of the genus or the species epithet as appropriate (e.g., ×Cupressocyparis
leylandii, Mentha ×piperita), or within the formula denoting the hybrid (e.g., Mentha
aquatica × M. spicata). If the multiplication symbol is not available in your font set,
use the letter “x” in lower case, but leave a space between it and the word to which
it should be applied (e.g., x Cupressocyparis leylandii, Mentha x piperita). Neither
the multiplication symbol nor the letter “x” are to be in italics.
Use the letter “x” to indicate a cross such as “red x yellow” and for the term “by” in
measurements (2 cm x 4 cm). Use italic n and x when indicating sporophytic or
basic chromosome number (e.g., 2n=4x = 48).
Headings Ranks and Format
Papers contain one to four headings, all aligned at the left hand margin, as follows:
RANK ONE Use boldface and all capital letters. Use a space before this rank but
subsequent paragraph(s) continue without a space. Subsequent paragraphs within
this section are indented without spaces between paragraphs. Headings such as
INTRODUCTION, MATERIALS AND METHODS, RESULTS, DISCUSSION are
Rank one headings. Do not use a period after this heading.
Rank Two This heading subdivides RANK ONE headings, thus there must be at
least two or more Rank Two subheads. Titles are boldface with the first letter of
important words in capital letters and the others in lower case. Rank Two headings
are separated by a space above the heading as in RANK ONE headings. No
period after Rank Two headings. The paragraph starts on the first line after the
Rank Two heading and is indented.
1. Rank Three. This heading may be used to divide Rank Two headings. Initiate
this heading with Arabic numerals (1,2,3 etc.). with numbers and title in boldface
with the beginning of each word in capital letters. The subheading ends with a
period. The paragraph continues on the same line. Do not separate this heading
with blank lines.
Rank Four. This heading subdividing Rank Three headings will be used rarely.
Align left, end with a period, and continue on same line. The font is italic, non-
boldface, with the beginning of each word in capital letters. Do not separate with
blank lines.
156
Paper
Use first quality white paper for your printout. The printable area on your sheet of
paper is strictly fixed (15.3 x 23.5 cm = 6.02 x 9.25 inches) irrespective of paper
size. For A4 size paper this printable area is obtained by entering following margin
settings in the "page set-up" of your word-processor: top: 2.7 cm (1.06"); bottom:
3.5 cm (1.38"); left: 2.8 cm (1.10"); right: 2.9 cm (1.14")
Papers should be printed preferably on laser-writers but Ink-jet printers also give
satisfactory results. Papers produced on a type-writer will not be accepted.
Spacing and Indentations
The final text should be single spaced but a double spaced manuscript may be
submitted for editing by the convener. Titles of subheadings should not be
underlined. Text should be "justified" in order to fill the entire printable area.
Provide a hanging indent (0.6 cm) on the second line of the Keywords and
Literature Cited references. First lines of all paragraphs should have a 1.25 cm
indentation except those that immediately follow rank three and rank four
subheadings. Do not include blank lines between paragraphs within a section.
ORGANIZATION OF A RESEARCH PAPER
Title
Titles are printed in boldface in 14 point type. If the paper is in Spanish or French
with extended English abstract, (see Language above) the title is in boldface in
English and not in boldface for other languages. Use capital and lower case for the
first word in the titles except for articles ("a" and "the"), prepositions ("of," "in" "on."
"during," "between"), and conjunctions ("and" and "but"), except when they are the
first word. Gene symbols, which normally begin with lower case letters are not
capitalized in titles nor is the first word of specific epithets in binomials. Do not
include authorities for binomials in titles. Keep titles as concise as possible.
Binomials will be in boldface Italics.
Bylines
The byline under the title includes the name of author(s) (without titles) and
affiliations. The given name of authors may be either written out in full or listed by
initials. Initials are followed by a period. If two initials are listed, do not include a
space between them but provide a space before the family name. The family
name is always presented after the given name, even for those countries that use
a different sequence (Spanish names are alphabetized by the paternal family
157
name. Accents should be kept in names so as not to violate their spelling rules).
The affiliation or address of author is included below the name. The address of the
author may be in the language of the country, but spell out the country name in
English. For multi-authored papers keep the affiliation of each author separately;
when space permits, these can be listed side by side; if not, underneath each
other. If there are two authors, separate the author name by "and," e.g. A.B. Smith
and C.D. Jones; three authors would be A.B. Smith, C.D Jones and E.F. Brown.
Do not use footnotes in the bylines. Footnotes should be avoided in bylines. They
might be appropriate when there are two departments in one institution.
Journal Paper Numbers
Journal paper numbers, or reference numbers, if needed, are placed in the
Acknowledgement section (see below).
Keywords
This is a rank 2 heading followed by colon (Keywords: apple, pear). List five to
seven key words not used in the title. Remember that electronic search engines
focus on Title and Keywords. The second line of keywords is a hanging indent (0.6
cm).
Abstract
Use a rank 2 heading for Abstract. An abstract in English, limited to 200-300
words in a single paragraph, all boldface, is required in all cases. Indent the first
line of the abstract. The abstract should contain a concise but comprehensive
statement of the problem and results. The entire abstract should be in boldface.
The title and abstract will be freely available on the ISHS website and should be
considered an advertisement for the paper as it may be all that most viewers will
read. Thus, it should be carefully and accurately written.
Introduction
This should include a statement of the problem, a brief survey of previous work,
and the scope and purpose of the investigation. References to previous work
should be included.
Materials and Methods (Experimental Procedures)
This section should be included in papers describing experiments but may not be
required in review papers. Describe concisely the plant materials, the growing
technique, methods used, and lay-out of experiments. Include the name of all
158
chemicals and compounds. An indication of the statistical methods used to
analyze data should be included
Results and Discussion
This is the heart of the paper. The section(s) may either be presented as a single
section or divided into separate Results and Discussion sections. If separate,
describe experimental results in the Results section and reserve interpretations,
speculations, and conclusions for the Discussion section. At the end of the paper
attempt to answer questions formulated in the introduction and conclude with a
summary of results and an assessment of future research or prospects.
Acknowledgements
This is reserved for journal paper numbers, source of funding, and name of
project, if required. Acknowledgement of help from colleagues or professional
associates is appropriate but avoid acknowledgement of routine secretarial help or
family members.
Citations and Literature Cited
1. Format. Citations to references in the text are listed chronologically surrounded
by parentheses with the following format: (Peters, 1950; Jones and Smith, 1990;
Brown et al., 1999a). If there are two authors with the same name that have
published in the same year, initials may be used to avoid confusion. Note: "et al."
is used for three or more authors.
Citations to personal communications include the surname or initials of the person
and are only to be included within the text, not in the Literature Cited section. The
date is optional. Thus: (A.B. Peters, pers. commun.) or (A.B. Peters, pers.
commun., 2001).
Consider Literature Cited as a Rank 2 heading,. Literature cited should only
include references used in the paper. List the authors in alphabetical order, letter
by letter, and in chronological order for publications of the same author(s). Do not
use a comma before "and" after the penultimate author. Do not use an issue
number if the journal uses consecutive numbers for each volume. In the format
that follows, note that in all cases the given name or initials follow the family name.
Journal Paper:
Navazoi, J.P. and Simon, P.W. 2001. Diallel analysis of high carotenoid content in
cucumber. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 126:100-104.
159
Van Os, E. and Benoit, F. 1999. Stare of the art of Dutch and Belgian greenhouse
horticulture and hydroponics. Acta Hort. 481:765-767
Book:
Darrow, G.M. 1966. The Strawberry: History, Breeding and Physiology. Holt,
Rinehart and Winston, New York.
Chapter in Book:
Daubeny, H.A. 1996. Brambles. p.109-190. In: J. Janick and J.N. Moore (eds.),
Fruit Breeding, Vol. 3, Nuts. Wiley, New York.
Chapter in Conference Proceedings:
Aviram, M. and Fuhrman, B. 1998. Tomato lycopene and (-carotene inhibit LDL
oxidation. Proc. Tomato and Health Seminar. Pamplona, Spain 25-28 May. p. 45-
52.
Website:
Food and Agricultural Organization. 2002. www.fao.org
2. Abbreviations. Do not abbreviate single word journals. Do not abbreviate
states or provinces of countries. When in doubt do not abbreviate. Commonly
used abbreviations are as follows:
Tables and Figures
Tables and figures are normally included at the end of the article in that sequence.
Prefix the table section with the word Tables and the figure section with the word
Figures. Captions are provided directly above each table and below each figure
with hanging indents. They are numbered consecutively with Arabic numbers, and
aligned with the width of the Table or Figure, or to the full width of the page if the
figure or table occupies more than half of the width of the page. Thus, Table 1,
Table 2 etc. and Fig. 1, Fig. 2. etc. If the table or figure is not original, give the
source at the end of the caption, e.g. Source: Jones et al. 2001.
1. Tables. Use tables sparingly. Titles of tables go above the table. Place all
headings to the center of their column. The size of the table should not exceed the
standard page width and length, but tables may be placed portrait or landscape
format. Solid lines are used in the heading and in the bottom of the table but are to
be avoided in the body, but, if necessary, use dotted lines. The units of the data
must be indicated in parentheses in the table headings. If table footnotes are
needed, use superscript Arabic numbers 1, 2, 3, etc. The sources of tables should
be in the caption (see model).
160
Proper format for tables in Acta Horticulturae should include 4 parts:
(1) caption, (2) masthead, (3) body, and (4) footnotes. This can best be
demonstrated with two examples, listed as Table 1 and Table 2 in the sample
article file.
Caption. The caption should be understandable without recourse to the paper
itself. The caption has only the first word capitalized (except for proper names) and
ends in a period. The caption may be more than a single sentence. The source of
the table, if necessary to include, is indicated in the caption (see Table 2).
Masthead. In general, tables are best read up and down. Each column of the table
must be explained by a masthead heading. The masthead is enclosed top and
bottom by two lines extending to the each edge of the table (see Table 1 and 2).
Horizontal lines within the masthead can be used to separate groups under a
common heading (see Table 2). The units of each column need to be clearly
indicated, e.g., No. fruit; Fruit wt. (g); Harvest index (%). Masthead headings
should be located on the bottom of the masthead cell.
Body. Avoid internal lines in the body of the table. Center values under the
masthead heading. Use rounding to avoid unwarranted precision. Means may be
separated by using lower case letters (5% significance) or upper case letters (1%
significance). Indicate statistical tests and significance by footnotes, preferably
superscript 1, 2, 3, etc. [If letters are used, start at the end of the alphabet (z, y, x,
etc.).] The body of the table is enclosed in a line.
Footnotes. Footnotes go underneath the body of the table. Put each footnote on a
separate line.
2. Figures. Titles of figures go underneath the figure. Figures may be submitted
electronically but provide a hard copy since resolution may be imperfect. If a figure
is outsized it may be reduced photographically. Be sure to include clear, sharp
pictures. Figures, graphs and drawings normally should be all in black and white,
not color. Color photographs can only be printed after a special agreement with
the conveners and ISHS Secretariat and there will be a charge to authors.
ARTICLE SUBMISSION
See sample article provided for format. Submit a hard copy (printout preferably
on A4 size paper) as well as an electronic version of the article in a commonly
used word processor format (preferably MSWord or alternatively WordPerfect).
161
For print-technical reasons and to ensure accurate reproduction of your figures,
graphs or pictures in Acta Horticulturae, please provide, in addition to the Word
document, the original images you "placed" into your Word Document, i.e. in the
file type in which they were created; in other words please include a separate
(electronic) copy of any picture-, image- or other graphic object files in high
resolution and also add the source files for charts, tables etc. that you used in your
article.
Most common acceptable file formats are:
jpg, eps, tiff or psd (at a resolution of 300 dpi)
original Adobe Illustrator (.ai or eps file)
Note: Powerpoint or Excel files are acceptable if you used these programs to
create the original figure or graph.
Note: Typically, files of less than 150 dots per inch do not reproduce well when
printed (even if they look good on your computer screen!) so please mind the
resolution of your figure/graph file.
162
PESQUISA AGROPECUÁRIA BRASILEIRA
Embrapa - E-mail: [email protected]
Instruções para Submissão de Trabalhos
Os trabalhos enviados à PAB devem ser inéditos e não podem ter sido
encaminhados a outro periódico científico ou técnico. Dados publicados na forma
de resumos, com mais de 250 palavras, não devem ser incluídos no trabalho.
São considerados, para publicação, os seguintes tipos de trabalho: Artigos
Científicos, Notas Científicas, Novas Cultivares e Artigos de Revisão, este último
a convite do Editor.
Os trabalhos publicados na PAB são agrupados em áreas técnicas, cujas
principais são: Entomologia, Fisiologia Vegetal, Fitopatologia, Fitotecnia,
Fruticultura, Genética, Microbiologia, Nutrição Mineral, Solos e Zootecnia.
O texto deve ser digitado no editor de texto Word, em espaço duplo, fonte Times
New Roman, corpo 12, folha formato A4, margens de 2,5 cm, com páginas e
linhas numeradas.
APRESENTAÇÃO DO ARTIGO CIENTÍFICO
O artigo científico deve ter, no máximo, 20 páginas, incluindo-se as ilustrações
(tabelas e figuras), que devem ser limitadas a seis, sempre que possível.
A ordenação do artigo deve ser feita da seguinte forma:
Artigos em português – Título, autoria, endereços institucionais e eletrônicos,
Resumo, Termos para indexação, título em inglês, Abstract, Index terms,
Introdução, Material e Métodos, Resultados e Discussão, Conclusões,
Agradecimentos, Referências, tabelas e figuras.
Artigos em inglês – Título, autoria, endereços institucionais e eletrônicos, Abstract,
Index terms, título em português, Resumo, Termos para indexação, Introduction,
Material and Methods, Results and Discussion, Conclusions, Acknowledgements,
References, tables, figures.
Artigos em espanhol – Título, autoria, endereços institucionais e eletrônicos,
Resumen, Términos para indexación; título em inglês, Abstract, Index terms,
Introducción, Material y Métodos, Resultados y Discusión, Conclusiones,
Agradecimientos, Referencias, cuadros e figuras.
163
O título, o resumo e os termos para indexação devem ser vertidos fielmente para
o inglês, no caso de artigos redigidos em português e espanhol, e para o
português, no caso de artigos redigidos em inglês.
Título
* Deve representar o conteúdo e o objetivo do trabalho e ter no máximo 15
palavras, incluindo-se os artigos, as preposições e as conjunções.
* Deve ser grafado em letras minúsculas, exceto a letra inicial, e em negrito.
* Deve ser iniciado com palavras chaves e não com palavras como "efeito" ou
"influência".
* Não deve conter nome científico, exceto de espécies pouco conhecidas; neste
caso, apresentar somente o nome binário.
* Não deve conter subtítulo, abreviações, fórmulas e símbolos.
* As palavras do título devem facilitar a recuperação do artigo por índices
desenvolvidos por bases de dados que catalogam a literatura.
Nomes dos autores
* Grafar os nomes dos autores com letra inicial maiúscula, por extenso, separados
por vírgula; os dois últimos são separados pela conjunção "e", "y" ou "and", no
caso de artigo em português, espanhol ou em inglês, respectivamente.
* O último sobrenome de cada autor deve ser seguido de um número em
algarismo arábico, em forma de expoente, entre parênteses, correspondente à
respectiva chamada de endereço do autor.
Endereço dos autores
* São apresentados abaixo dos nomes dos autores, o nome e o endereço postal
completos da instituição e o endereço eletrônico dos autores, indicados pelo
número em algarismo arábico, entre parênteses, em forma de expoente.
* Devem ser agrupados pelo endereço da instituição.
* Os endereços eletrônicos de autores da mesma instituição devem ser separados
por vírgula.
Resumo
* O termo Resumo deve ser grafado em letras minúsculas, exceto a letra inicial,
na margem esquerda, e separado do texto por travessão.
* Deve conter, no máximo, 200 palavras, incluindo números, preposições,
conjunções e artigos.
164
* Deve ser elaborado em frases curtas e conter o objetivo, o material e os
métodos empregados na pesquisa, os resultados e a conclusão.
* O objetivo deve estar separado da descrição de material e métodos.
* Não deve conter citações bibliográficas nem abreviaturas.
* O final do texto deve conter a principal conclusão, com o verbo no presente do
indicativo.
Termos para indexação
* A expressão Termos para indexação, seguida de dois-pontos, deve ser grafada
em letras minúsculas, exceto a letra inicial.
* Os termos devem ser separados por vírgula e iniciados com letra minúscula.
* Devem ser no mínimo três e no máximo seis, considerando-se que um termo
pode possuir duas ou mais palavras.
* Não devem conter palavras que componham o título.
* Devem conter o nome científico (só o nome binário) da espécie estudada.
Introdução
* A palavra Introdução deve ser centralizada na página e grafada com letras
minúsculas, exceto a letra inicial, e em negrito.
* Deve ocupar, no máximo, duas páginas.
* Deve apresentar a justificativa para a realização do trabalho, situar a importância
do problema científico a ser solucionado e estabelecer sua relação com outros
trabalhos publicados sobre o assunto.
* O último parágrafo deve expressar o objetivo, de forma coerente com o descrito
no início do Resumo.
Material e Métodos
* A expressão Material e Métodos deve ser centralizada na página e grafada em
negrito; Os termos Material e Métodos devem ser grafados com letras minúsculas,
exceto as letras iniciais.
* Deve ser organizado, de preferência, em ordem cronológica.
* Deve apresentar a descrição do local, a data e o delineamento do experimento,
e indicar os tratamentos, o número de repetições e o tamanho da unidade
experimental.
* Deve conter a descrição detalhada dos tratamentos e variáveis.
* Deve-se evitar o uso de abreviações ou as siglas.
165
* Os materiais e os métodos devem ser descritos de modo que outro pesquisador
possa repetir o experimento.
* Devem ser evitados detalhes supérfluos e extensas descrições de técnicas de
uso corrente.
* Deve conter informação sobre os métodos estatísticos e as transformações de
dados.
* Deve-se evitar o uso de subtítulos; quando indispensáveis, grafá-los em negrito,
com letras minúsculas, exceto a letra inicial, na margem esquerda da página.
* Pode conter tabelas e figuras.
Resultados e Discussão
* A expressão Resultados e Discussão deve ser centralizada na página e grafada
em negrito; Os termos Resultados e Discussão devem ser grafados com letras
minúsculas, exceto a letra inicial.
* Deve ocupar quatro páginas, no máximo.
* Todos os dados apresentados em tabelas ou figuras devem ser discutidos.
* As tabelas e figuras são citadas seqüencialmente.
* Os dados das tabelas e figuras não devem ser repetidos no texto, mas
discutidos frente aos apresentados por outros autores.
* Dados não apresentados não podem ser discutidos.
* Não deve conter afirmações que não possam ser sustentadas pelos dados
obtidos no próprio trabalho ou por outros trabalhos citados.
* As chamadas às tabelas ou às figuras devem ser feitas no final da primeira
oração do texto em questão; se as demais sentenças do parágrafo referirem-se à
mesma tabela ou figura, não é necessária nova chamada.
* Não apresentar os mesmos dados em tabelas e em figuras.
* As novas descobertas devem ser confrontadas com o conhecimento
anteriormente obtido.
Conclusões
* O termo Conclusões deve ser centralizado na página e grafado em negrito, com
letras minúsculas, exceto a letra inicial.
* Devem ser apresentadas em frases curtas, sem comentários adicionais, com o
verbo no presente do indicativo, e elaboradas com base no objetivo do trabalho.
* Não podem consistir no resumo dos resultados.
* Devem apresentar as novas descobertas da pesquisa.
166
* Devem ser numeradas e no máximo cinco.
Agradecimentos
* A palavra Agradecimentos deve ser centralizada na página e grafada em
negrito, com letras minúsculas, exceto a letra inicial.
* Devem ser breves e diretos, iniciando-se com "Ao, Aos, À ou Às" (pessoas ou
instituições).
* Devem conter o motivo do agradecimento.
Referências
* A palavra Referências deve ser centralizada na página e grafada em negrito,
com letras minúsculas, exceto a letra inicial.
* Devem ser de fontes atuais e de periódicos: pelo menos 70% das referências
devem ser dos últimos 10 anos e 70% de artigos de periódicos.
* Devem ser normalizadas de acordo com as normas vigentes da ABNT.
* Devem ser apresentadas em ordem alfabética dos nomes dos autores,
separados por ponto-e-vírgula, sem numeração.
* Devem apresentar os nomes de todos os autores da obra.
* Devem conter os títulos das obras ou dos periódicos grafados em negrito.
* Devem conter somente a obra consultada, no caso de citação de citação.
* Todas as referências devem registrar uma data de publicação, mesmo que
aproximada.
* Devem ser trinta, no máximo.
Exemplos:
Artigos de Anais de Eventos (aceitos apenas trabalhos completos)
AHRENS, S. A fauna silvestre e o manejo sustentável de ecossistemas florestais.
In: SIMPÓSIO LATINO-AMERICANO SOBRE MANEJO FLORESTAL, 3., 2004,
Santa Maria. Anais. Santa Maria: UFSM, Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Florestal, 2004. p.153-162.
Artigos de periódicos
SANTOS, M.A. dos; NICOLÁS, M.F.; HUNGRIA, M. Identificação de QTL
associados à simbiose entre Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii e soja.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.41, p.67-75, 2006.
Capítulos de livros
AZEVEDO, D.M.P. de; NÓBREGA, L.B. da; LIMA, E.F.; BATISTA, F.A.S.;
BELTRÃO, N.E. de M. Manejo cultural. In: AZEVEDO, D.M.P.; LIMA, E.F. (Ed.). O
167
agronegócio da mamona no Brasil. Campina Grande: Embrapa Algodão;
Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2001. p.121-160.
Livros
OTSUBO, A.A.; LORENZI, J.O. Cultivo da mandioca na Região Centro-Sul do
Brasil. Dourados: Embrapa Agropecuária Oeste; Cruz das Almas: Embrapa
Mandioca e Fruticultura, 2004. 116p. (Embrapa Agropecuária Oeste. Sistemas de
produção, 6).
Teses e dissertações
HAMADA, E. Desenvolvimento fenológico do trigo (cultivar IAC 24 - Tucurui),
comportamento espectral e utilização de imagens NOAA-AVHRR. 2000.
152p. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Campinas.
Fontes eletrônicas
EMBRAPA AGROPECUÁRIA OESTE. Avaliação dos impactos econômicos,
sociais e ambientais da pesquisa da Embrapa Agropecuária Oeste: relatório do
ano de 2003. Dourados: Embrapa Agropecuária Oeste, 2004. 97p. (Embrapa
Agropecuária Oeste. Documentos, 66). Disponível em:
http://www.cpao.embrapa.br/publicacoes/ficha.php?tipo=DOC&num=66&ano=2004.
Acesso em: 18 abr. 2006.
Citações
* Não são aceitas citações de resumos, comunicação pessoal, documentos no
prelo ou qualquer outra fonte, cujos dados não tenham sido publicados.
* A autocitação deve ser evitada.
Redação das citações dentro de parênteses
* Citação com um autor: sobrenome grafado com a primeira letra maiúscula,
seguido de vírgula e ano de publicação.
* Citação com dois autores: sobrenomes grafados com a primeira letra maiúscula,
separados pelo "e" comercial (&), seguidos de vírgula e ano de publicação.
* Citação com mais de dois autores: sobrenome do primeiro autor grafado com a
primeira letra maiúscula, seguido da expressão et al., em fonte normal, vírgula e
ano de publicação.
* Citação de mais de uma obra: deve obedecer à ordem cronológica e em seguida
à ordem alfabética dos autores.
* Citação de mais de uma obra dos mesmos autores: os nomes destes não
devem ser repetidos; colocar os anos de publicação separados por vírgula.
168
* Citação de citação: sobrenome do autor e ano de publicação do documento
original, seguido da expressão "citado por" e da citação da obra consultada.
* Deve ser evitada a citação de citação, pois há risco de erro de interpretação; no
caso de uso de citação de citação, somente a obra consultada deve constar da
lista de referências.
Redação das citações fora de parênteses
* Citações com os nomes dos autores incluídos na sentença: seguem as
orientações anteriores, com os anos de publicação entre parênteses; são
separadas por vírgula.
Fórmulas, expressões e equações matemáticas
* Fórmulas, expressões, símbolos ou equações matemáticas, escritas no editor de
equações do programa Word, devem ser enviadas também em arquivos
separados, no programa Corel Draw, gravadas com extensão CDR.
* No texto, devem ser iniciadas à margem esquerda da página e apresentar
tamanho padronizado da fonte Times New Roman.
* Não devem apresentar letras em itálico ou negrito.
Tabelas
* As tabelas devem ser numeradas seqüencialmente, com algarismo arábico, e
apresentadas em folhas separadas, no final do texto, após referências.
* Devem ser auto-explicativas.
* Seus elementos essenciais são: título, cabeçalho, corpo (colunas e linhas) e
coluna indicadora dos tratamentos ou das variáveis.
* Os elementos complementares são: notas-de-rodapé e fontes bibliográficas.
* O título, com ponto no final, deve ser precedido da palavra Tabela, em negrito;
deve ser claro, conciso e completo; deve incluir o nome (vulgar ou científico) da
espécie e das variáveis dependentes.
* No cabeçalho, os nomes das variáveis que representam o conteúdo de cada
coluna devem ser grafados por extenso; se isso não for possível, explicar o
significado das abreviaturas no título ou nas notas-de-rodapé.
* Todas as unidades de medida devem ser apresentadas segundo o Sistema
Internacional de Unidades.
* Nas colunas de dados, os valores numéricos devem ser alinhados pelo último
algarismo.
169
* Nenhuma célula (cruzamento de linha com coluna) deve ficar vazia no corpo da
tabela; dados não apresentados devem ser representados por hífen, com uma
nota-de-rodapé explicativa.
* Na comparação de médias de tratamentos são utilizadas, no corpo da tabela, na
coluna ou na linha, à direita do dado, letras minúsculas ou maiúsculas, com a
indicação em nota-de-rodapé do teste utilizado e a probabilidade.
* Devem ser usados fios horizontais para separar o cabeçalho do título, e do
corpo; usá-los ainda na base da tabela, para separar o conteúdo dos elementos
complementares.
* Fios horizontais adicionais podem ser usados dentro do cabeçalho e do corpo;
não usar fios verticais.
* As tabelas devem ser editadas em arquivo Word, usando os recursos do menu
Tabela; não fazer espaçamento utilizando a barra de espaço do teclado, mas o
recurso recuo do menu Formatar Parágrafo.
Notas de rodapé das tabelas
* Notas de fonte: indicam a origem dos dados que constam da tabela; as fontes
devem constar nas referências.
* Notas de chamada: são informações de caráter específico sobre partes da
tabela, para conceituar dados. São indicadas em algarismo arábico, na forma de
expoente, entre parênteses, à direita da palavra ou do número, no título, no
cabeçalho, no corpo ou na coluna indicadora. São apresentadas de forma
contínua, sem mudança de linha, separadas por ponto.
* Para indicação de significância estatística, são utilizadas, no corpo da tabela, na
forma de expoente, à direita do dado, as chamadas ns (não-significativo); * e **
(significativo a 5 e 1% de probabilidade, respectivamente).
Figuras
* São consideradas figuras: gráficos, desenhos, mapas e fotografias usados para
ilustrar o texto.
* Só devem acompanhar o texto quando forem absolutamente necessárias à
documentação dos fatos descritos.
* O título da figura, sem negrito, deve ser precedido da palavra Figura, do número
em algarismo arábico, e do ponto, em negrito.
* Devem ser auto-explicativas.
170
* A legenda (chave das convenções adotadas) deve ser incluída no corpo da
figura, no título, ou entre a figura e o título.
* Nos gráficos, as designações das variáveis dos eixos X e Y devem ter iniciais
maiúsculas, e devem ser seguidas das unidades entre parênteses.
* Figuras não-originais devem conter, após o título, a fonte de onde foram
extraídas; as fontes devem ser referenciadas.
* O crédito para o autor de fotografias é obrigatório, como também é obrigatório o
crédito para o autor de desenhos e gráficos que tenham exigido ação criativa em
sua elaboração.
* As unidades, a fonte (Times New Roman) e o corpo das letras em todas as
figuras devem ser padronizados.
* Os pontos das curvas devem ser representados por marcadores contrastantes,
como: círculo, quadrado, triângulo ou losango (cheios ou vazios).
* Os números que representam as grandezas e respectivas marcas devem ficar
fora do quadrante.
* As curvas devem ser identificadas na própria figura, evitando o excesso de
informações que comprometa o entendimento do gráfico.
* Devem ser elaboradas de forma a apresentar qualidade necessária à boa
reprodução gráfica e medir 8,5 ou 17,5 cm de largura.
* Devem ser gravadas no programa Word, Excel ou Corel Draw (extensão CDR),
para possibilitar a edição em possíveis correções.
* Usar fios com, no mínimo, 3/4 ponto de espessura.
* No caso de gráfico de barras e colunas, usar escala de cinza (exemplo: 0, 25,
50, 75 e 100%, para cinco variáveis).
* Não usar negrito nas figuras.
* As figuras na forma de fotografias devem ter resolução de, no mínimo, 300 dpi e
ser gravadas em arquivos extensão TIF, separados do arquivo do texto.
* Evitar usar cores nas figuras; as fotografias, porém, podem ser coloridas.
NOTAS CIENTÍFICAS
* Notas científicas são breves comunicações, cuja publicação imediata é
justificada, por se tratar de fato inédito de importância, mas com volume
insuficiente para constituir um artigo científico completo.
APRESENTAÇÃO DE NOTAS CIENTÍFICAS
171
* A ordenação da Nota Científica deve ser feita da seguinte forma: título, autoria
(com as chamadas para endereço dos autores), Resumo, Termos para
indexação, título em inglês, Abstract, Index terms, texto propriamente dito
(incluindo introdução, material e métodos, resultados e discussão, e conclusão,
sem divisão), Referências, tabelas e figuras.
As normas de apresentação da Nota Científica são as mesmas do Artigo
Científico, exceto nos seguintes casos:
* Resumo com 100 palavras, no máximo.
* Deve ter apenas oito páginas, incluindo-se tabelas e figuras.
* deve apresentar, no máximo, 15 r eferências e duas ilustrações (tabelas e
figuras).
NOVAS CULTIVARES
* Novas Cultivares são breves comunicações de cultivares que, depois de
testadas e avaliadas pelo Sistema Nacional de Pesquisa Agropecuária (SNPA),
foram superiores às já utilizadas e serão incluídas na recomendação oficial.
APRESENTAÇÃO DE NOVAS CULTIVARES
Deve conter: título, autoria (com as chamadas para endereço dos autores),
Resumo, título em inglês, Abstract, Introdução, Características da Cultivar,
Referências, tabelas e figuras. As normas de apresentação de Novas Cultivares
são as mesmas do Artigo Científico, exceto nos seguintes casos:
* Resumo com 100 palavras, no máximo.
* Deve ter apenas oito páginas, incluindo-se tabelas e figuras.
* deve apresentar, no máximo, 15 r eferências e quatro ilustrações (tabelas e
figuras).
* A introdução deve apresentar breve histórico do melhoramento da cultura,
indicando as instituições envolvidas e as técnicas de cultivo desenvolvidas para
superar determinado problema.
* A expressão Características da Cultivar deve ser digitada em negrito, no centro
da página.
* Características da Cultivar deve conter os seguintes dados: características da
planta, reação a doenças, produtividade de vagens e sementes, rendimento de
grãos, classificação comercial, qualidade nutricional e qualidade industrial,
sempre comparado com as cultivares testemunhas.
OUTRAS INFORMAÇÕES
172
• Não há cobrança de taxa de publicação.
• Os manuscritos aprovados para publicação são revisados por no mínimo dois
especialistas.
• O editor e a assessoria científica reservam-se o direito de solicitar modificações
nos artigos e de decidir sobre a sua publicação.
• São de exclusiva responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos
nos trabalhos.
• Os trabalhos aceitos não podem ser reproduzidos, mesmo parcialmente, sem o
consentimento expresso do editor da PAB.
• Contatos com a secretaria da revista podem ser feitos por telefone:
(61)3448-4231 e 3273-9616, fax: (61)3340-5483, via e-mail:
[email protected] ou pelos correios: Embrapa Informação Tecnológica,
Pesquisa Agropecuária Brasileira – PAB, Caixa Postal 040315, CEP 70770-
901 Brasília, DF.