522

Nested-PCR法 に よ る イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス の 検 出

川崎市衛生研究所

清 水 英 明

神奈川県衛生研究所

渡 辺 寿 美 今 井 光 信

(平成9年2月12日 受付)

(平成9年3月19日 受理)

Key words : influenza, nested-PCR, serotype

要 旨

イ ンフルエ ンザ ウイ ルス の迅速,高 感度 な検 査法 として のNested-PCR法 の検 討 を行 った.さ らに,

この 方法 を用 いて イ ンフルエ ンザ の血清 抗体 上昇 が認 め られ た ものの,ウ イル ス分離 試験 で陰 性 の検体

にっ いてNested-PCR法 に よるウ イル スRNAの 検 出 を行 った.近 年 の ワクチ ン株 と川崎 市衛 生研 究所

で分 離 され た株 の感染 細胞 上清 を用 い,プ ラ イマ ーの特 異 性 を先 に調 べ た結 果,型 特異 性 が高 く,各型 間

で の非特 異反 応 はみ られ なか った.検 討 した プ ライマ ー を用 い,検 出感 度 につ いて ワ クチ ン株 で測 定 した

結 果・AH1型 は1stPCRで90PFU/assey,2ndPCRで0 .9PFU/assey,AH3型 は1stPCRで100PFU/

assey,2ndPCRで1 .OPFU/assey,B型 は1stPCRで180PFU/assey ,2ndPCRで1.8PFU/asseyで あっ

た.血 清 抗体価 の上 昇 が み られ た に もか かわ らず,分 離陰 性 で,AH1型 に感 染 を受 けた もの と血清 学 的

に診 断 され た臨床 検体 で は20検 体 中17件(85 .0%),AH3型 で は19検 体 中15件(78 .9%),B型 で は7検

体 中6件(85.7%)で,合 計46検 体 中38件(82 .6%)がPCR陽 性 とな った.こ の こ とか ら,本 方法 は インフルエ ンザ の早期 診 断 に用 い るこ とが で きる もの と考 え られ た

.

序 文

インフルエンザは毎年冬期 に流行を繰 り返す公

衆衛生上重要なウイルス感染症 であ り,現 在,

AH3(香 港)型,AH1(ソ 連)型,B型 ウイルス

の3種 類がヒトか ら分離されている.さ らに,高

齢者,呼 吸器 ・循環器等基礎疾患を持つハイリス

クグループ,特 に高齢者福祉施設や病院の小児病

棟等基礎疾患を持つ閉鎖集団で,イ ンフルエンザ

ウイルスは急速に拡散するため,そ の集団のほと

ん どの者が感染する危険性がある1)～4).重 症例 と

しては細菌 との合併症による肺炎が多 く,そ の他

にライ症候群や脳症,熱 性痙攣の報告 も見られて

いる5)～7).

インフルエンザウイルスの検査法 としては,一

般的に発育鶏卵やMDCK細 胞 を用いてウイルス

を分離するか,急 性期 と回復期のペア血清を用い

た抗体価の上昇で診断する方法が用 い られてい

る.し かし,結 果を得 るために長期間を有 し,治

療 には役立たせることができない.ま た,冬 期の

集団かぜ患者において,流 行株のインフルエンザ

に対す る血清診断で抗体価 の上昇が認 められて

も,ウ イルスが分離 されないことをしばしば経験

する.そ こで,迅 速,高 感度なインフルエンザウ

イルスの検査法 としてNested-PCR法 について,

検出感度 を測定するとともに,こ の方法を用いて

ペア血清で抗体上昇が認められた ものの,ウ イル

ス分離陰性の検体からのインフルエンザウイルス

の遺伝子検出を試みた.

材料 と方法

検体

別刷請求先:(〒210)川 崎市川崎 区大島5-13-10

川崎市衛生研究所 清水 英明

感染症学雑誌 第71巻 第6号

イ ン フル エ ンザ ウイル ス のNested-PCR法 523

用 い た ウイ ル ス は,川 崎 市 で 分 離 さ れ たAH1型

(A/kawasaki/76/92), AH3型(A/kawasaki/

161/94),B型(B/kawasaki/47/93)お よび1995

年 度 の ワ クチ ン株(A/yamagata/32/89, A/kita-

kyusyu/159/93, B/mie/1/93)のMDCK感 染 細

胞 上 清 を用 い て プ ライ マ ー の 特 異 性 を 調 べ た.検

体 か らの ウ イ ル ス検 出 に は,1992～1994年 に採 取

され た イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス分 離 陽性 の 咽 頭 ぬ

ぐい液23件(AH1型3件,AH3型10件,B型10件),

血 清 抗 体 価 の上 昇 が み られ 分 離 陰 性 で あ った うが

い液46件(AH1型20件,AH3型19件,B型7件)

を 用 い た.な お,検 体 の うが い液 は急 性 期 の血 液

と同 日 に採 取 した.ま た,ワ ク チ ン株 に つ い て は

MDCK細 胞 を用 い た ウ イ ル ス の プ ラー ク 定 量 法

を行 い,PCR法 の 検 出感 度 を測 定 した.

プ ラ イ マ ー

プ ラ イ マ ー の設 定 は,イ ン フル エ ン ザ ウイ ル ス

HA1遺 伝 子 中 の 変 異 の 少 な い領 域 で,す で に報 告

さ れ て い る も の8)9),ま た 自 ら設 定 し た もの を用

い,1stPCRの プ ラ イ マ ー は3種 類 の型 が 泳 動 す

る際 に判 別 しや す い よ うに,増 幅DNAの サ イ ズ

を変 えて 作 製 し,混 合 して使 用 した(Table1).

PCR

RNAの 抽 出 は ホ ッ ト フ ェ ノ ー ル 法10)を 用

い,-20.Cで 一晩 静 置 後,エ タ ノ ー ル 沈 殿 を 行 い

RNAを 回 収 し,そ の 沈 渣 に10μlの 減 菌 蒸 留 水 を

加 えた.RT反 応 はRNA10μlにRTBuffer(100

mMTris-HCI, 500mMKC1, 15mMMgC12, 100

mMDTT)2μl, 10mMdNTPs4μl, 20UReverse

Transcriptase1μl, 40URNaselnhibitor, 20μM

senseprimers各0.5μlに 蒸 留 水 を 加 え 総 量20μ1

と し て,42.C60分, 95℃5分 イ ン キ ュ ベ ー ト し

cDNAを 作 製 し た. lstPCRはcDNA20μ1に

PCRbuffer(100mMTris-HC1, 500mMKC1,

15mMMgC12)3μ1, 5UTaqDNAPolymerase

0.3μ1, 20μManti-senseprimers0.5μ1お よ び 蒸

留 水 を 加 え,総 量50μ1と し て,94℃1分, 55℃1

分,72.C1分 を30サ イ ク ル 行 っ た. 2ndPCRは1

stPCR product 5μ1にPCR buffer 4.5μ1, 5UTaq

DNA Polymerase 0.3μ1, 10mM dNTPs 4μ1,

20μM sense primer, antisense primer各0.5μ1お

よ び 蒸 留 水 を加 え,総 量50μ1と し て,94℃1分,

55℃1分,72℃1分 を30サ イ ク ル 行 っ た.増 幅

DNAバ ン ド の 検 出 はlstPCR, 2ndPCR product

にlordingbufferを 加 え,3%NuSieveで100V

30分 間 泳 動 し,ethidiumbromideで 染 色 後,紫 外

線 を 照 射 し 確 認 し た.

成 績

PCR法 の 特 異 性 の 検 討

1stPCR産 物 はAH1型(A/kawasaki/76/92,

A/yamagata/32/89)で431bp, AH3型(A/

kawasaki/161/94, A/kitakyusyu/159/93)で578

bp, B型(B/kawasaki/47/93, B/mie/1/93)で

329bpにDNAバ ン ド が 検 出 さ れ た(Fig.1).2

ndPCR産 物 はAHI型 で197bp, AH3型 で232bp,

B型 で195bpにDNAバ ン ド が 検 出 さ れ た(Fig.

Table 1 Sequence of PCR primers used to detect HA gene of influenza virus

平成9年6月20日

524 清水 英明 他

Fig. 1 Detection of PCR product (lstPCR)

Fig. 2 Detection of PCR product (2ndPCR)

AH3 AH1 B AH3 AH1 B AH3 AH1 B primer

2).1stPCR,2ndPCR共 ,各 型 間 で の 交差 反 応 は

み られ ず プ ラ イ マ ー の 特 異 性 が 証 明 さ れ た .

PCR法 の検 出 感 度 の検 討

PCR法 の 検 出 感 度 に つ い て プ ラ ー ク 法 を用 い

定 量 し た ウ イ ル ス で 検 討 を 行 っ た .AH1型 はl

stPCRで90PFU/assey, 2ndPCRで0 .9PFU/

assey, AH3型 は1stPCRで100PFU/assey ,2

ndPCRで1.OPFU/assey,B型 は1stPCRで180

PFU/assey, 2ndPCRで1 .8PFU/asseyで あ っ

た.

ウ イ ル ス分 離 陽 性 検 体 とPCR法 との比 較

ウ イ ル ス分 離 陽 性 の 咽 頭 ぬ ぐい液23件 は全 て分

離 ウ イ ル ス と同 じ型 の プ ラ イ マ ー に の みDNAバ

ン ドの 増 幅 が み られ た .

ウ イ ル ス 分 離 陰 性 検 体 とPCR法 との 比 較

イ ン フ ル エ ンザ 流 行 時 に採 取 され,イ ン フル エ

ンザ 分 離 陰 性 で ペ ア血 清 で 抗 体 価 の 上 昇 が み られ

た うが い液 で は,AH1型 は1stPCRで20検 体 中1

件(5.0%),2ndPCRで17件(85.0%)でDNAバ

Table 2 Results of antibody titer and PCR

method (AH1 type)

ン ドが検 出 さ れ た(Table 2) .AH3型 は1stPCR

で19検 体 中3件(15 .8%),2ndPCRで15件

(78.9%)でDNAバ ン ドが 検 出 さ れ た(Table

3).B型 で は1stPCRで7検 体 中3件(42 .9%),

2ndPCRで6件(85.7%)でDNAバ ン ドが検 出 さ

れ た(Table 4) .合 計1stPCRで46検 体 中7件

(15.2%),2ndPCRで38件(82 .6%)がPCR陽 性

で あ った.ま た,PCR陽 性 検 体 に つ い て抗 体 上 昇

が み られ た 型 とPCRでDNAバ ン ドが 増 幅 さ れ

た 型 は全 て一 致 し た.

PCR陽 性 は発 病 後2～9日 まで に 採 取 さ れ た

血 清 で,1stPCRで 陽 性 で あ っ た7件 は す べ て 急

性 期 の 抗 体 価 が32倍 以 下 で あ った .ま た,急 性 期

の 抗 体 価 が32倍 以 下 か ら256倍 ま で,抗 体 価 の 比 較

的 高 い検 体 か ら も,DNAバ ン ドが 検 出 され た .

考 察

今 回,迅 速 か つ 高 感 度 の検 査 法 と してNested-

PCR法 に よ る イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル スRNAの

検 出 を ワ ク チ ン株 を用 い て 行 っ た と こ ろ,検 出 感

度 は各 型 で,1stPCRで90～180PFU/assey, 2nd

PCRで0.9～1.8PFU/asseyで あ っ た.こ の こ と

感染症学雑誌 第71巻 第6号

イ ン フル エ ンザ ウイ ル スのNested-PCR法 525

Table 3 Results of antibody titer and PCRmethod (AH3 type)

Table 4 Results of antibody titer and PCR

method (B type)

から検出感度 は細胞培養法に比べ,極 めて高いも

のと判断される.そ こで血清抗体価の上昇がみら

れたが分 離試 験 陰性 であった46検 体 につ いて

Nested-PCR法 を用いたところ38件(82.6%)か ら

インフルエンザ遺伝子が検出された.そ のうち7

件(18.4%)は1stPCR産 物でもDNAバ ンドが検

出された.こ れらの検体 に共通することは急性期

の抗体価が32倍 以下で,こ の ことから感染初期 に

採取 されたものであると推定される.イ ンフルエ

ンザは感染初期 に多量のウイルスが咽頭か ら採取

される11)が,凍結融解によって不活化 され,分 離率

が低下することがある.今 回用いた検体 は医療機

関か ら凍結保存されて搬入 されたため,検 体中の

ウイルスが失活 していたことが考えられる.また,

検体採取が,発 病後9日 目でもPCR陽 性 のもの

がみられた.採 取時期が遅い場合,ウ イルス抗体

複合物が形成 され細胞でのウイルス分離が陰性に

なる可能性がある.PCR法 では保存状態が悪 く,

ウイルスが失活 してしまった検体,ま た,ウ イル

ス抗体複合物が形成 され,ウ イルス分離が困難 な

ものでもインフルエンザウイルスのRNAを 検出

し,同 時に血清型別ができる利点がある.

近年,ア マンタジン,リ マ ンタジン等抗ウイル

ス剤がインフルエンザの治療や事前投与による予

防に有効であると報告されている12)13).今回用い

たNested-PCR法 では検体が搬入された翌日(約

24時間)に インフルエンザウイルス遺伝子を検出

することができ,早 期診断に利用することができ

る.こ のことからインフルエンザウイルスを迅速

に検出す ることのできる本方法は,早 期診断に有

用であると言える.ま た,イ ンフルエンザ感染時

における脳症患者の髄液からPCR法 によるイ ン

フルエンザ遺伝子の検出が報告され,イ ンフルエ

ンザの全身感染 による中枢神経症状 との因果関係

が解明されつつある14)15).本法 はインフルエンザ

脳炎時の髄液や全身感染時における各臓器等,ウ

イルス量が少ない検体か らの遺伝子検出も可能で

あ り,こ の方法 は,今 後,生 体内のウイルスの増

殖,そ の分布等 を解明するうえで有用なもの とな

りうると考えられる.

本論文の要旨は第44回日本ウイルス学会総会(1996年10

月)に おいて発表した.

文 献

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平成9年6月20日

526 清水 英明 他

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説抄録, 1995; 70.

Rapid Detection of Influenza Virus A (AH1, AH3) and B by

Nested-Polymerase Chain Reaction

Hideaki SHIMIZU1), Sumi WATANABE & Mitsunobu IMAI2)

Rapid Detection of Influenza Virus A (AH1, AH3) and B by

Nested-Polymerase Chain Reaction

Hideaki SHIMIZU1, Sumi WATANABE & Mitsunobu IMAI2)1)Kawasaki City Institute of Public Health

2)Kanagawa Prefectural Public Health Laboratory

We applied the Nested-polymerase chain reaction (PCR) for laboratory diagnosis of influ-

enza virus infection. We used three primer sets for detection of influenza virus A (AH1 , AH3) andB. The primer sets for each type (AH1, AH3 ,B) was able to detect specifically each type ofinfluenza. We measured the sensitivity for detection of vaccine strains . The PCR method wasable to detect 0.9 PFU/assey of AH1 type, 1.0 PFU/assey of AH3 type and 1.8 PFU/assey ofB type. Out of 46 isolation negative but antibody positive cases , 38 cases were positive for PCR(82.6%).

This method is sensitive and useful for rapid diagnosis of influenza virus infection .

感染症学雑誌 第71巻 第6号