nghiên cứu hpv việt nam

8/18/2019 Nghiên cứu HPV Việt Nam

1/61

1

CHƢƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1.

Giớ i thiệu.Human Papillomavirus (HPV) là tác nhân thườ ng gặ p nhất trong các nhiễm

trùng lây truyền qua đườ ng tình dục và là nguyên nhân quan tr ọng dẫn tới ung thư

cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư đứng hàng thứ hai trong các loại ung thư ở nữ

giới sau ung thư vú. Là tác nhân gây tử vong thứ năm thế giớ i ở nữ giớ i.

Hàng năm trên thế giới, ướ c tính có khoảng 529.000 trườ ng hợ p mắc mớ i

UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trườ ng hợp trong đó 85% tổng số các trườ ng hợ p

bệnh gặ p ở những nước đang phát triển. Cùng vớ i sự tăng nhanh tỷ lệ nhiễm HPV

trong cộng đồng, UTCTC thực sự tr ở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh

hưở ng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giớ i.

HPV thuộc họ papillomaviridea với hơn 200 genotype khác nhau về vật liệu

di truyền trong đó đã được xác định khoảng 100 genotype, và khoảng 40 genotype

HPV đã được xác định ở niêm mạc đườ ng sinh dục ngườ i [15], [31]. Tám genotype

HPV (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -45, -52, và -58) đượ c thống kê là nhữnggenotype phổ biến nhất, có liên quan tới hơn 90% các trườ ng hợ p UTCTC trên toàn

thế giớ i và riêng HPV -16, -18 gặ p ở 70% các trườ ng hợ p [16],[30].

HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết vớ i UTCTC mà còn có vai trò

quan tr ọng trong sự hình thành ung thư hậu môn, âm hộ, âm đạo, dương vật, ung

thư phổi và một số ung thư vùng hầu họng. Đồng thờ i, HPV còn là nguyên nhân của

nhiều bệnh cảnh lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-

hậu môn, u nhú thanh quản tr ẻ sơ sinh...

Ở Việt Nam, ung thư cổ tử cung là loại ung thư sinh dục phổ biến nhất vớ i

53.5% ung thư ác tính ở nữ giớ i. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm

2010, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất ở nữ lứa tuổi 15 -44,

với hơn 6000 ca nhiễm mớ i (tỷ lệ: 11,7 trên 100,000 phụ nữ) và tử vong hơ n 3000

trườ ng hợ p mỗi năm [40]. Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trườ ng hợ p

UTCTC thường đượ c phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn tiến từ


2/61

2

nhiễm vi rút đến ung thư thườ ng tr ải qua trong một thờ i gian dài. Từ đây đã đặt ra

vấn đề chuẩn đoán phát hiện sớ m HPV, sàng lọc những người có nguy cơ mắc

UTCTC nhằm giúp quá trình tiên lượ ng điều tr ị hiệu quả các tổn thương tiền ung

thư và ung thư giai đoạn sớ m.

Vớ i mong muốn góp phần tìm hiểu sự phân bố HPV cung cấ p thông tin trong

chuẩn đoán phát hiện sớ m và điều tr ị UTCTC cũng như phòng chống UTCTC ở

cộng đồng. Đồng thời đưa kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại cho k ết quả chính xác

trong phát hiện HPV đến gần vớ i bệnh nhân hơn. Đề tài “ Xác định t ỉ l ệ nhiễ m và

phân bố genotype Human papillomavirus (HPV) bằng kĩ thuật PCR-ELISA trong

các mẫ u nghiên cứ u t ại phòng xét nghiệm công ty Nam Khoa Biotek ” đượ c lựa

chọn thực hiện đáp ứng nhu cầu từ thực tế.

1.2. Mục đích

Nhằm góp phần nhỏ vào hiểu biết chung về vấn đề xâm nhiễm HPV cũng

như phòng chống UTCTC ở phụ nữ Việt Nam đề tài đượ c thực hiện vớ i mục đích

chính:

Xác định tỉ lệ nhiễm HPV, đặc biệt trong các mẫu xét nghiệm xác định hoặcnghi ngờ viêm cổ tử cung.

Xác định phân bố tỉ lệ genotype phổ biến trong các trườ ng hợp dương tính

HPV.

1.3. Nội dung nghiên cứ u

‒ Thực hiện xét nghiệm sàng lọc nhằm xác định các trườ ng hợp dương tính vớ i

HPV bằng việc li trích DNA tổng số và thực hiện phản ứng PCR khuếch đại

trình tự đặc trưng của HPV.

‒ Điện di kiểm tra k ết quả.

‒ Thực hiện PCR khuếch đại vòng trong trình tự đặc trưng của từng genotype

HPV. Sử dụng kĩ thuật ELISA vớ i các probe phủ sẵn để xác định các

genotype HPV phổ biến đượ c chấ p thuận.

‒ Thu nhận thông tin xác định tỉ lệ nhiễm chung, phân bố genotype.


3/61

3

CHƢƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.

Đặc điểm chung của Human Papil lomavir us (HPV)

2.1.1. Hình thái và cấu trúc của HPV

Hình ảnh đầu tiên về các thành phần của virus qua kính hiển vi điện tử đượ c

Strauss và đồng sự công bố năm 1979 [38]. HPV là nhóm vi rút có kích thướ c nhỏ,

họ Papillomavirideae, không vỏ, đối xứng xoắn ốc. HPV có kích thướ c khoảng 50-

55 nm, có DNA dạng vòng, mạch đôi, liên kết vớ i protein giống Histon. Vỏ capsid

đượ c hình thành từ 72 đơn vị capsumere. Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của

protein cấu trúc L1 k ết hợ p vớ i một protein L2 (protein này là thành phần kháng

nguyên đượ c sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu).

Hình 2.1. Hạt vi rút của HPVs

Cả hai protein cấu trúc đều do vi rút tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có

kích thướ c khoảng 55kd và chiếm khoảng 80% tổng số protein của vi rút. Protein

capsid phụ (L2) có kích thướ c khoảng 70kd [15].

2.1.2. Đặc điểm cấu trúc và chức năng các gen của HPV

2.1.2.1. Đặc điểm cấu trúc

HPV có vật liệu di truyền là DNA, một mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại

dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-DNA). Bộ gen của vi rút chiếm khoảng 12%

tr ọng lượ ng của hạt vi rút, có chiều dài khoảng 7800 đến 8000 cặ p base (bp) trong

L2 protein L1 capsomer

(Pentamer của

protein L1)

DNA hai

chuỗi, hình


4/61


5/61

5

o Promoter cho quá trình phiên mã tổng hợ p RNA (P97 ở HPV16 và P105 ở

HPV18). Promoter này bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu phiên mã.

o

Điểm khởi đầu sao chép ORI, các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gen câm

(Silencing gene)…

2. Vùng gen sớ m (Early region): Gồm 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và

các khung đọc mở ORF. Sản phẩm của vùng gen này là các protein chức năng cần

cho quá trình nhân lên và khả năng gây bệnh của virus. Các gene E6 và E7 đượ c

xem là nguyên nhân chính dẫn đến tính bất tử và ác tính của tế bào ung thư cổ tử

cung nhiễm HPV.

3. Vùng gen muộn (Late region): Gồm 2 gen tổng hợ p protein L1 và L2, là những

protein cấu trúc capsid của vi rút. Đây là vùng gen mã hóa muộn hơn, nên vùng

chứa gen L1 và gen L2 còn đượ c gọi là vùng sao chép muộn.

Hình 2.3. Cấu trúc bộ gen HPV dạng mạch thẳng

2.1.2.2.

Chức năng các gen và sản phẩm của gen HPV

Chức năng gen E1

HPV là vi rút sử dụng hoàn toàn các thành phần tế bào chủ để sao chép

DNA. Gen E1 là một trong hai vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng vớ i L1) mã

hóa các protein chức năng có vai trò cần thiết cho quá trình sao chép DNA và

plasmid. Gen E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá

trình chia tách DNA (helicase) và giúp các chuỗi gen của vi rút duỗi ra trong quá

trình sao chép. Hoạt động tháo xoắn của gen E1 không phụ thuộc ATP.


6/61

6

Tại cơ thể sống, gen E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá

trình nhân lên của vi rút. Gen E2 còn có khả năng gắn vớ i chuỗi DNA đặc hiệu (vị

trí gắn E2 - E2BSs) và protein E1. Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gen

E1 điều chỉnh. Trong quá trình sao chép vi rút, có nhiều thành phần tế bào phụ

thuộc gen E1 như DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao

chép A vì gen E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này.

Chức năng gen E2

Khung đọc mở của E2 mã hóa từ 2-3 protein khác nhau, tất cả đều là các yếu

tố phiên mã. Chúng có ảnh hưở ng khác nhau đến sự biểu hiện gene của virus và

thực hiện điều hòa trong bộ gene bằng cách tạo các dimer ở những vị trí thích hợ p.

Trong nhiều trườ ng hợ p, protein E2 có khả năng ức chế sự phiên mã của protein E6

và E7. Protein E2 của HPV-16 và HPV-18 có chức năng của một yếu tố hoạt hóa

phiên mã ở tế bào sừng cổ tử cung ngườ i. Sự mất gene E2 thườ ng thấy trong sinh

thiết ung thư cổ tử cung và trong dòng tế bào của loại ung thư này, cho thấy sự mất

đoạn gene E2 tạo thuận lợ i cho sự chuyển sang tr ạng thái ác tính. Không chỉ đột

biến trong khung đọc mở của E2 mà cả những đột biến trong vùng DNA gắn E2trong vùng URR cũng dẫn đến tăng cườ ng hoạt động gây ung thư của HPV-16.

Trong quá trình phát triển ung thư, sự đứt gãy E2 là một hiện tượ ng xảy ra muộn vì

trong những tổn thương tiền ác tính không có hiện tượ ng này. Ngoài chức năng hoạt

hóa phiên mã, E2 còn tương tác với E1 làm tăng cườ ng sao chép DNA virus. Các

protein này làm cho E2 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép hơn.

Chức năng gen E1^E4

Giống như các protein khác của HPV, protein điều hòa E1^E4 là sản phẩm

đượ c tạo ra từ mRNA k ết nối khi vòng mở dịch chuyển gen E1 và E4, có chức năng

giúp cho quá trình trưở ng thành và phóng thích vi rút ra khỏi tế bào mà không làm

tan tế bào chủ.

Chức năng gen E5

Gen E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5, một protein chuỗi đôi kỵ nướ c,

kích thướ c nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lướ i nguyên sinh chất của tế bào, cần


7/61

7

thiết cho quá trình xâm nhậ p và tồn tại của vi rút trong tế bào chủ. Protein E5 là

yếu tố tác động ngay trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, tạo ra các phức

hợ p vớ i các thụ thể của yếu tố kích thích tăng trưở ng và biệt hóa tế bào đồng thờ i

giúp cho virus lẩn tr ốn đáp ứng miễn dịch của chủ thể.

Mặt khác, protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết theo

chương trình (apoptosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính vi rút gây ra. Khả

năng của E5 gây nên sự biến đổi của tế bào do gen E5 có khả năng hoạt hóa

receptor của yếu tố phát triển và ức chế ATPase không bào.

Chức năng gen E6

Gen E6 mã hóa cho protein E6, là protein gồm khoảng 150 acid amin hình

thành cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn vớ i k ẽm (Zn) điều hòa, mã hóa cho khung đọc mở

ORF đầu tiên trong chuỗi gen của HPV và là một trong các protein gây ung thư

chính của HPV.

Ba chức năng chính của gen E6 cũng là ba chức năng rất nguy hiểm đối vớ i tế bào

vật chủ:

1.

Protein E6 của HPV nhóm “nguy cơ cao” liên kết hoặc không liên k ết vớ i protein E7 gây kích thích tế bào chủ phân chia mạnh mẽ và sự phân chia này là

mãi mãi, gây tế bào bất tử hóa tế bào. Protein E6 có khả năng gây quá sản bằng

cách ức chế chu k ỳ nghỉ của vòng tế bào do sự phá hủy DNA và gây thúc đẩy

sự tiến triển của tế bào. Khả năng gây ung thư của E6 được điều hòa bở i khả

năng hoạt động như giá đỡ và điều hòa tương tác protein vớ i protein. Một số

tương tác protein mà đượ c mã hóa trên chuỗi E6 gồm: p53, protein liên quan

đến E6 (E6AP), protein gắn vớ i E6 (E6BP), c-myc, p300/CBP, paxillin, protein

PDZ, yếu tố điều hòa interferon 3 và đồng phần của Bcl-2 (Bak).

2. Tương tác vớ i p53 thông qua sự liên k ết giữa E6 vớ i E6AP bằng liên k ết ligand,

tạo ra thoái triển của p53 (yếu tố giải mã và ức chế ung thư, có vai trò điều hòa

chính hoạt động ức chế tổng hợ p DNA thông qua chu k ỳ nghỉ của vòng tế bào).

Bình thườ ng, khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sự nhân lên sai của DNA,

gen ức chế ung thư p53 đượ c hoạt hóa sẽ chuyển vòng tế bào sang chu k ỳ nghỉ


8/61

8

hoặc gây chết tế bào theo chương trình (apotosis) thông qua hoạt động giải mã

của gen.

Hơn nữa, E6 còn có khả năng gắn k ết vớ i protein PDZ dẫn đến sự thoái triển

của protein PDZ, một protein đượ c bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết

cho sự phát triển, k ết dính, tăng sinh, biết hóa và duy trì chu k ỳ sống của tế bào.

3. Liên k ết vớ i gen ras trong quá trình bất tử hóa tế bào và kích thích sự phát triển

của NIH 3T3, đồng thờ i hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus.

Chức năng gen E7

Protein E7 đượ c mã hóa từ E7 chỉ gồm 98 acid amin, tuy nhỏ hơn protein E6

nhưng cũng có vai trò không kém phần quan tr ọng trong cơ chế gây ung thư ở tế

bào chủ.

Hoạt động chức năng của E7 trong cơ chế gây ung thư do (1) protein E7 có

vùng bảo tồn đầu tận cùng N và có domain gắn K ẽm ở đầu C giúp liên k ết chặt chẽ

hơn vớ i E6, hỗ tr ợ nhau trong cơ chế gây bất tử hóa tế bào; (2) E7 chứa motif gắn

protein pocket (LXCXE) giúp E7 gắn k ết vớ i các gen ức chế khối u (như pRb) hoặc

gắn vớ i 2 protein pocket khác là p107 và p130 làm giải phóng một số lượ ng lớ n yếutố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào.

Protein E7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” cũng như của nhóm “nguy cơ

thấp” đều có khả năng gắn k ết vớ i protein pocket. Tuy nhiên, sự ưu tiên gắn k ết của

protein E7 vớ i protein pocket khác nhau giữa hai nhóm HPV này. Ái lực liên k ết

này ở những type “nguy cơ cao” cao gấ p 10 lần so vớ i ở những type “nguy cơ

thấ p”.

Chức năng gen L1 và L2

L1 và L2 là hai vùng gen cấu trúc còn gọi là vùng gen mã hóa muộn cho

protein vỏ capsid chính và phụ. Trên kính hiển vi điện tử, vỏ capsid của HPV chứa

72 capsomere có cấu trúc vòng bảy cạnh trên hàng rào dạng lướ i icosahedral T=7

với kích thước đườ ng kính khoảng 55nm. Gen L1 là vùng bảo tồn nhất của vi rút và

được dùng để phát hiện cũng như trong phân loại Papillomavirus.


9/61

9

Thành phần chính của vỏ capsid vi rút gồm protein vỏ capsid chính L1, và

capsid phụ L2. Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả vi rút hoặc phân

tử giống vi rút (Virus like particles, VLPs), các thành phần này khó phân biệt vớ i vi

rút thực sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất vi rút, sản xuất vắc xin. Nếu

L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhưng L2 không cần thiết

cho việc hình thành vỏ capsid. L1 và L2 bộc lộ đặc hiệu trong hầu hết lớ p ngoài

cùng của tế bào sừng (nơi giải phóng các vi rút mới đượ c hình thành)..

Mặc dù L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhưng có

vai trò quan tr ọng trong chu k ỳ sống và trong quá trình xâm nhậ p của vi rút do L2

có khả năng tạo sự gắn k ết giữa receptor bề mặt tế bào vớ i actin và vớ i PML, cần

thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm.

2.2. Phân loại HPV

2.2.1.

Lịch sử phân loại

Ban đầu, Papillomavirus đượ c xế p cùng nhóm vớ i Polyomavirus thuộc họ

Papovaviridae. Tên họ Papovaviridae được đặt theo hai chữ cái đầu của các vi rút

đầu tiên đượ c phân loại trong họ vi rút này: rabbit pa pillomavirus, mousepo lyomavirus và simian va cuolating virus (SV40) [28].

Đặc điểm chung của các vi rút họ Papovaviridae là có kích thướ c nhỏ, không

vỏ bọc, capsid hai mươi mặt và DNA gồm hai chuỗi tồn tại dạng siêu xoắn hình

vòng. Tuy nhiên, khi so sánh về kích thướ c, Papillomavirus (khoảng 55nm) có kích

thướ c lớn hơn so vớ i Polyomavirus (khoảng 45nm). Dựa trên sự khác biệt về này,

họ Papovaviridae chia làm hai nhóm là Polyomavirus (bao gồm các Polyomavirus

và SV40) và Papillomavirus [28].

Hơn nữa, những nghiên cứu về sinh học chức năng và sinh học phân tử đã

cho thấy sự khác biệt rõ ràng về đặc điểm di truyền cũng như tính chất sinh vật học

của hai nhóm vi rút, từ đó cho phép phân loại Papillomavirus một cách hoàn chỉnh và

tách hoàn toàn riêng biệt khỏi nhóm Polyomavirus. Như vậy, tất cả Papillomavirus

chỉ là một nhóm duy nhất, thuộc họ Papillomaviridae [28], [30], [35].

2.2.2. Phân loại HPV


10/61

10

Phân loại theo sự tương đồng trình t ự nucleotide trên gen E6, E7, L1

Theo Hội phân loại vi rút học quốc tế (International Committee on the

Taxonomy of Viruses), họ Papillomavirideae gồm 15 loại khác nhau (Ký hiệu:

Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon-, Zeta-, Theta-, Iota-, Kappa-, Lambda-,

Mu-, Nu-, Xi-, Omikron-, Pi-papillomavirus) [19].

HPV là papillomavirus họ Papillomavirideae gây bệnh trên ngườ i và là một

trong những vi rút có nhiều genotype nhất. Gần 200 genotype đượ c biết đến, nhưng

chỉ xác định đượ c khoảng 100 genotype bao gồm khoảng 40 type có khả năng lây

truyên qua đườ ng sinh dục. Mỗi genotype gồm các phân type khác nhau (subtype)

và dưới các phân type đượ c chia thành các biến thể (variant) còn gọi là các chủng vi

rút [30], [31], [34].

Việc xác định genotype HPV không dựa vào huyết thanh như vớ i các loại vi

rút khác (vi rút gây viêm gan, HIV …) mà dựa trên mức độ giống nhau của thành

phần nucleotide và mức độ tương đồng giữa các thành phần acid amin trên chuỗi

gen E6, E7 và L1 do đó, các type của HPV thường đượ c gọi là các genotype [19].

Khi một genotype HPV có ít nhất 10% gen vùng E6, E7, L1 khác vớ i cácgenotype đã biết trước đó thì được xác định là một genotype mớ i. Một subtype

trong genotype được xác định là phân nhóm mớ i khi bộ gen của chúng khác 2-10%

so vớ i phân nhóm khác trong cùng một genotype đã biết. Nếu các subtype có vùng

mã hóa khác nhau 1-2% hoặc khác 5% ở vùng không mã hóa thì đượ c gọi là các

biến thể [19].


11/61

11

Hình 2.4. Cây phả hệ của 118 genotype Papillomavirus dự a trên trình tự gen

vùng L1 ORF. Chuỗi gen đƣợ c xử lý bằng phần mềm Phylip version 3.572 và

phân tích phả hệ bằng Treeview program [19].

Hầu hết HPV gây bệnh trên người và động vật đều thuộc loại Alpha-

papillomavirus (thích ứng ở niêm mạc) hoặc thuộc loại Gamma-papillomavirus

(thích ứng ở biểu mô sừng) [28].

Phân loại theo khả năng tác động của HPV trên t ế bào chủ (khả năng gây ungthư)

Theo khả năng gây ung thư, HPV đượ c chia thành 3 nhóm:

1. Nhóm genotype HPV “nguy cơ thấp” (Low-risk type): những genotype HPV

thuộc nhóm này chỉ gây những mụn cóc hoặc khối u lành tính. Bộ gen của

chúng tồn tại độc lậ p vớ i tế bào chủ. Các genotype HPV trong nhóm “nguy cơ

thấp” thườ ng gặ p là: HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89 và

CP6108.


12/61

12

2. Nhóm genotype HPV “nguy cơ cao” (High-risk type): gồm những genotype

HPV có khả năng gắn DNA vào gen ngườ i, làm r ối loạn quá trình nhân lên của

tế bào chủ, gây ra hiện tượng tăng sinh và bất tử hóa tế bào hình thành các khối

u ác tính. Những genotype có khả năng gây ung thư thườ ng gặ p gồm HPV 16,

18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 và HPV 26, 53, 66.

3. Nhóm genotype HPV “chưa xác định nguy cơ” (Unknown-risk type): gồm đa

số các genotype HPV chưa xác định đượ c khả năng gây ung thư như HPV 2a, 3,

7, 10, 13, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74, 77, 83, 84, 85, 86,

87, 90, 91.

Phân loại theo vị trí gây bệnh của HPV (khả năng thích ứ ng của HPV trên t ế bào

đích)

Mỗi genotype của HPV có một sự thích nghi cao vớ i một loại biểu mô nhất

định và khả năng gây bệnh của các genotype không giống nhau trên tế bào đích tùy

thuộc vào phương thức gây bệnh trên vật chủ. Chính vì vậy, HPV còn có thể phân

loại theo khả năng gây bệnh và vị trí gây bệnh. Dựa vào đặc điểm trên, HPV đượ c

chia thành 3 nhóm [15]:1. Nhóm HPV thích ứng biểu mô sừng: Những HPV ở nhóm này có khả năng xâm

nhiễm trên da, hình thành các dạng hạt cơm thông thườ ng (HPV 2, 4, 26, 27,

29, 57), hạt cơm phẳng (1, 2, 4), hạt cơm Butcher (HPV 7). Tổn thương thườ ng

xuất hiện ở da mặt, cổ, tay và chân. Đặc biệt, một số genotype HPV ở nhóm này

còn có khả năng gây loạn sản thượ ng bì dạng hạt cơm Epidermodysplasia

Verruciformis (HPV 2, 3, 5, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 25, 36, 37, 46, 47,

50), một dạng bệnh lý có khả năng dẫn đến ung thư da và thườ ng xuất hiện trên

bệnh nhân suy giảm miễn dịch.

2. Nhóm thích ứng tế bào niêm mạc, không phải là niêm mạc đườ ng sinh dục: Gồm

những HPV có khả năng gây bệnh ở niêm mạc miệng và hầu họng (HPV 6, 11,

13, 32), gây đa bướ u gai hô hấ p tái diễn (Recurrent respiratory papillomatosis).

Một số genotype HPV là nguyên nhân gây bệnh lý lành tính (khối u sùi) hoặc


13/61

13

gây bệnh lý ác tính (ung thư) vùng hậu môn, ung thư phổi (HPV 6, 11, 16, 18,

33, 52).

3. Nhóm thích ứng tế bào niêm mạc đườ ng sinh dục: Nhóm HPV gây bệnh tại

đườ ng sinh dục như sùi mào gà (HPV 6, 11, 42, 43, 44, 54), UTCTC, ung thư

dương vật, ung thư âm hộ, ung thư âm đạo (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,

52, 56, 58, 59, 68, 73, 82).

2.3. Chu k ỳ sống của HPV

Chu k ỳ sống của HPV liên quan chặt chẽ vớ i tế bào biểu mô vật chủ, đượ c

chia làm 4 giai đoạn:

Giai đoạn xâm nhậ p: Vị trí đầu tiên HPV xâm nhậ p vào là tế bào lớp đáy ở

những vị trí dễ tổn thương thông qua receptor integrin. Ở lớ p tế bào này, số lượ ng vi

rút thấ p và tồn tại ở dạng episomal tách r ờ i vớ i gen của tế bào vật chủ.

Giai đoạn tiề m tàng : DNA HPV có thể tồn tại r ất lâu vớ i số lượ ng ít và

không sao chép, không tạo các hạt vi rút. Các gen E1, E2 r ất cần thiết cho sự nhân

lên của vi rút ở giai đoạn này.

Giai đoạn nhân bản mạnh: Cùng vớ i quá trình nhân lên và biệt hóa từ lớ p tế bào đáy lên các tế bào ở lớ p trên, các tế bào sừng bị nhiễm HPV mớ i hình thành

cũng di chuyển lên các lớ p trên, các gen muộn HPV đượ c bộc lộ và khởi động giai

đoạn tăng sinh của vi rút, DNA HPV đượ c nhân lên trong tế bào chủ. Chu k ỳ nhân

lên của vi rút không kèm theo hiện tượ ng chết hoặc phân hủy tế bào do vậy không

gây hiện tượ ng viêm và sản xuất các cytokine tiền viêm. Các gen E5, E6, E7 tác

động hỗ tr ợ cho hoạt động nhân lên của vi rút đồng thời tăng hoạt động tổng hợ p

DNA của tế bào chủ và ngăn hiện tườ ng apotosis.

Giai đoạn giải phóng : Ở lớ p tế bào sừng ngoài cùng, gen L1 và L2 có vai trò

hình thành vỏ capsid cho DNA của vi rút. Các hạt vi rút mới đượ c hình thành giải

phóng ra bề mặt tế bào sừng.

Quá trình biểu hiện gen và quá trình phát triển nhân lên của vi rút xảy ra trong

nhân tế bào chủ, liên quan chặt chẽ với quá trình tăng sinh của tế bào chủ ở lớ p tế

bào đáy mà không có giai đoạn HPV di chuyển trong máu. Tuy nhiên, HPV DNA


14/61

14

vẫn có thể đượ c tìm thấy trong các tế bào bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi, trong

các tế bào di căn trên các bệnh nhân ung thư do HPV, các trườ ng hợp đồng nhiễm

HIV. Điều này đượ c giải thích do trong quá trình biểu hiện gen và trong quá trình

nhân nhân bản mạnh của vi rút đã xảy ra hiện tượng đứt gãy đoạn gen E2 và gen

E6.

Có nhiều cơ chế giải thích sự lẩn tr ốn của HPV khỏi đáp ứng miễn dịch của

vật chủ đối, gây nhiễm dai dẳng HPV dẫn đến sự biến đổi tế bào. E6 và E7 của

HPV nhóm “nguy cơ cao” làm cơ thể suy giảm khả năng sản xuất interferon,

cytokine, ức chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên tiêu diệt vi rút và điều hòa miễn dịch.

Mặc dù, HPV có khả năng lẩn tr ốn khỏi cơ chế đáp ứng bảo vệ của cơ thể vật

chủ nhưng hầu hết các trườ ng hợ p nhiễm HPV diễn ra ngắn và tổn thương có thể tự

hết trong vòng một năm hoặc dưới tác động của đáp ứng của hệ miễn dịch cơ thể.

Khoảng 91% HPV bị loại bỏ tự nhiên trong năm đầu sau nhiễm và 70% xảy tra

trong năm thứ hai. Tuy nhiên, một tỷ lệ nhỏ HPV có thể tồn tại dai dẳng ở lớ p tế

bào đáy và là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi tế bào.

Hình 2.5. Chu k ỳ sống của HPV

2.4. Cơ chế gây bệnh của HPVHPV lây truyền chủ yếu qua đườ ng tình dục và có thể lây truyền khi tiế p xúc

tr ực tiế p từ da qua da. HPV có khả năng thích ứng ở biểu mô sừng và niêm mạc gây


15/61

15

tăng sinh tế bào biểu mô và gây biến đổi tế bào dẫn đến ung thư qua các bướ c sau

[12], [14].

Xâm nhậ p chuỗ i gen của HPV vào t ế bào chủ

Bộ gen HPV xâm nhậ p vào chuỗi gen của vật chủ ở dạng episome (DNA

dạng vòng ở ngoài nhiễm sắc thể vật chủ) đối với HPV nhóm “nguy cơ thấp” hoặc

xâm nhậ p vào nhiễm sắc thể vật chủ đối với HPV nhóm “nguy cơ cao”.

Ở dạng episome, vùng gen mã hóa E2 không bị biến đổi. Nồng độ protein E2

tăng lên cùng vớ i sự tăng sinh sao chép DNA HPV gây hiện tăng sinh tế bào đồng

thờ i ức chế giải mã gen sớ m kìm chế hoạt động của E6 và E7. Khi E6 và E7 bị kìm

chế sẽ hoạt hóa con đườ ng p53 và yếu tố ức chế hình thành u pRb giúp tế bào sửa

chữa hoặc chết theo chương trình phụ thuộc vào mức độ của sự tác động phá hủy.

Do đó, có hiện tăng sinh một số lượ ng lớ n tế bào nhưng vẫn dướ i sự kiểm soát của

p53 và pRb.

Khi chuỗi gen HPV xâm nhậ p vào nhiễm sắc thể vật chủ sẽ gây phá vỡ gen

E2 và giải phóng sự kìm chế hoạt động của E6 và E7. Hai oncogen E6, E7 có khả

năng gắn và làm giảm chức năng của p53 và pRb, đây là điều kiện quan tr ọng để gây biến đổi gen tế bào chủ [23].

Gây bấ t t ử hóa t ế bào

Protein E6, E7 của các genotype HPV nhóm “nguy cơ cao” còn có khả năng

k ết hợ p vớ i ras. Protetin ras là phân tử truyền thông tin nội tế bào, khi ras đượ c

hoạt hóa làm tế bào phát triển, biệt hóa và duy trì sự sống. Gen mã hóa protein ras

được coi là gen gây ung thư phát hiện đầu tiên. Cơ chế của protein E6 gây bất tử tế

bào đượ c chứng minh bằng khả năng bất hoạt p53, bộc lộ hTERT (human

telomerase reverse transcriptase) và tăng hoạt động telomerase [23].

Bấ t ổn định gen t ế bào chủ

Bất thườ ng quá trình phân bào có thể gây ra bở i protein E6 và E7 của các

genotype nhóm “nguy cơ cao” mà không gặ p ở genotype nhóm “nguy cơ thấp”, gây

mất alen ở một số gen nhất định mà các gen này liên quan đến sự xuất hiện và tiến

triển của ung thư. E7 gây bất ổn định gen thông qua sự bất hoạt của pRb và gây bất


16/61

16

ổn định gen do khả năng tác động lên tổng hợ p trung thể và hậu quả gây biến đổi sự

chia tách DNA trong quá trình phân chia tế bào. Trong khi đó E6 gây bất ổn định

gen do khả năng ức chế chức năng p53 dẫn đến r ối loạn quá trình sửa chữa DNA

bình thườ ng và hậu quả gây thay đổi gen.

Biến đổi đáp ứ ng vớ i phá hủ y DNA

Gen E6 và E7 có thể gây mất khả năng đáp ứng của cơ thể vớ i sự phá hủy

DNA. Khi có sự phá hủy DNA, cơ thể đáp ứng bở i hoạt hóa p53 tạo ra protein điều

hòa quá trình nghỉ giữa hai chu trình nhân lên của tế bào. E6 và E7 có khả năng ức

chế quá trình nghỉ giữa quá trình phân bào được điều khiển bở i p53.

Tăng sinh và biệt hóa t ế bàoHPV nhân lên theo quá trình biệt hóa của tế bào đáy dướ i dạng episome,

đồng thờ i nhân lên trong các tế bào lớ p trên tế bào đáy đã thoát khỏi chu trình nhân

lên của tế bào nhờ vai trò tái thiết lập chương trình tiế p tục tổng hợ p DNA ở tế bào

sừng bị nhiễm của E6, E7 HPV.

2.5. Các bệnh lý thƣờ ng gặp do HPV

2.5.1. Bệnh lý lành tính M ụn cơm

Loạn sản thượ ng bì d ạng hạt cơm (Epidermodysplasia Verruciformis)

U nhú thự c quản

Đa bướ u gai hô hấ p tái diễ n (Recurrent respiratory papillomatosis)

Sùi mào gà

2.5.2. Bệnh lý ác tính

Ung thư da không phải u hắ c t ố (Nonmelanoma Skin cancer)

Ung thư cổ t ử cung

Ung thư dương vật

Ung thư hậu môn

Ung thư vùng hầu họng

2.6. Điều trị


17/61

17

Đa số HPV xâm nhiễm vào tế bào chủ chỉ tồn tại trong thờ i gian ngắn,

khoảng 90% HPV bị đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và đáp ứng

miễn dịch (Ig A) trong 12 đến 36 tháng đầu sau nhiễm.

Những tổn thương tại chỗ ở biểu mô trên da và niêm mạc được điều tr ị bằng

phương pháp điều tr ị lạnh (cryotherapy), bằng phương pháp lazer hoặc bằng

phương pháp cắt vòng bằng điện (Loop electrosurgical excision procedure).

Ở bệnh nhân ung thư nội mạc tử cung, phẫu thuật là phương pháp đượ c sử

dụng chủ yếu. Xạ tr ị và hóa tr ị liệu chỉ đượ c sử dụng trong trườ ng hợ p bệnh

nhân không thể phẫu thuật đượ c.

2.7. Các phƣơng pháp phát hiện HPV ở mức độ phân tử (Molecular

Diagnostics)

Các kháng nguyên capsid của HPV xuất hiện không ổn định và kháng thể

kháng protein capsid HPV vẫn tồn tại nhiều năm sau khi đã loại bỏ hoàn toàn HPV

nên các xét nghiệm miễn dịch học r ất ít đượ c sử dụng trong phát hiện HPV. Các

công cụ huyết thanh học cũng như điều kiện nuôi cấy virus không phù hợp đã thúc

đẩy chuẩn đoán phân tử tr ở thành giải pháp tối ưu trong phát hiện sự xâm nhiễmHPV. [8], [29]

2.7.1. Phƣơng pháp lai phân tử

Cơ sở phƣơng pháp lai

Ở nhiệt độ cao, các liên k ết hidro trong phân tử DNA bị cắt đứt, hai mạch

DNA tách r ời nhau, đây là khả năng biến tính của DNA. Dựa trên đặc tính trên của

DNA , người ta đun DNA ở nhiệt độ cao (quá nhiệt độ nóng chảy Tm). Sau khi hai

mạch tách r ờ i, nếu nhiệt độ giảm từ từ, cùng với điều kiện phản ứng thích hợ p thì

hai các mạch DNA sẽ bắt cặ p tr ở lại theo qui tắc bổ sung, gọi là hiện tượ ng lai phân

tử.

Lai phân tử có độ đặc hiệu tuyệt đối vì sự tái bắt cặ p chỉ xảy ra vớ i hai trình

tự hoàn toàn bổ sung. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hoặc RNA, do đó có các

loại lai DNA-DNA, DNA-RNA và RNA-RNA.

Các kiểu lai phân tử


18/61

18

+ Lai trên pha l ỏng : Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là một dung dịch đệm.

Quá trình lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặ p nhau do chuyển động nhiệt thấ p

hơn nhiệt độ nóng chảy. Lai trên pha lỏng thườ ng thực hiện lai giữa các trình tự

cùng loài hoặc cùng một cá thể.

+ Lai trên pha r ắ n: Một trong hai trình tự lai cần cố định trên giá thể r ắn (màng lai),

phát hiện phân tử lai thông qua mẫu dò (probe). Các k ỹ thuật lai trên pha r ắn thườ ng

sử dụng là Southern-blot; Dot-blot và Northern-blot.

+ Lai t ại chỗ : Trình tự acid nucleic cần tìm không tách chiết khỏi mô bệnh phẩm

hoặc tế bào. Quá trình lai vớ i mẫu dò đã được đánh dấu trướ c và phát hiện các phân

tử lai ngay trên nhiễm sắc thể, trong tế bào hay trên các lát cắt mô.

Các loại phƣơng pháp lai sử dụng trong phát hiện HPV

Trong phương pháp, chuỗi gen DNA đượ c tách chiết tr ực tiế p từ bệnh phẩm

sẽ đượ c gây biến tính và lai vớ i mồi RNA. Sau đó, sản phẩm lai DNA-RNA đượ c

phát hiện ở pha r ắn bở i enzym hiển thị màu alkaline phosphatase có gắn vớ i kháng

thể kháng DNA-RNA. Có nhiều loại alkaline phosphate khác nhau đượ c gắn vớ i

từng loại kháng thể và có nhiều loại kháng thể gắn vớ i mỗi phức hợ p lai.

Hình 2.6. Phƣơng pháp lai phân tử phát hiện HPV

o H ệ thố ng xét nghiệm bắ t giữ lai II (Hybrid Capture II Test System)

(1) Bi n tính DNA(2) Lai vớ i m u dò HPV RNA

(3) Lai b t giữ vớ i kháng

thể đơn dòng

(4) G n kháng th đơndòng vớ i

alkaline phosphatase

(5) Phát hiện Alkalinephosphatase găn kháng thể

đơn dòng bằng máy miễn dịchhuỳnh quang


19/61

19

Có nhiều phương pháp lai đượ c ứng dụng phát hiện HPV nhưng kỹ thuật lai

bắt giữ (Hybrid Capture technology) là k ỹ thuật đượ c ứng dụng phổ biến nhất. Kít

ứng dụng k ỹ thuật lai bắt giữ để phát hiện HPV thế hệ 2 (second-generation HPV

detection kit - HCII) do tập đoàn Diegene công bố và đượ c US FDA công nhận vào

năm 1999 là kỹ thuật đượ c sử dụng nhiều hơn trong lâm sàng. [25]

Nguyên tắc k ỹ thuật dựa trên hiện tượ ng lai HPV DNA với đầu dò RNA đặc

hiệu. Đầu dò RNA có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc không đánh dấu

phóng xạ. Phức hợ p lai DNA-RNA đượ c phát hiện bở i kháng thể đặc hiệu đã gắn

alkaline-phosphatase trên máy miễn dich huỳnh quang. Mỗi phức hợ p lai sẽ phát

một tín hiệu huỳnh quang (relative light unit - RLU), số lượ ng tính hiệu huỳnh

quang tương ứng lượng DNA đích trong mẫu bệnh phẩm.

Kít HCII sử dụng mồi DNA đặc hiệu 13 type HPV “nguy cơ cao”: HPV16,

18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68 và 5 type HPV “nguy cơ thấp”: 6, 11, 42,

43, 44.

Mặc dù HCII có khả năng ứng dụng cao, có độ nhạy cao và dễ thực hiện,

nhưng hạn chế chính của phương pháp này là có độ đặc hiệu không cao (có thể chok ết quả âm tính hoặc dương tính ở bệnh phẩm có k ết quả tế bào học bình thườ ng).

Hơn nữa, phương pháp HCII không thực hiện đượ c vớ i bệnh phẩm đã bảo quản và

chỉ đánh giá định tính là dương tích hoặc âm tính với hai nhóm nguy cơ của HPV

mà không phát hiện đượ c từng genotype riêng biệt.

o Phương pháp lai Southern-blot

Đây là kĩ thuật lai trên pha r ắn đặc trưng. Nguyên tắc lai Southern-blot dựa

trên khả năng tiế p nhận DNA của màng lai nitrocellulose. Sự ra đờ i của phương

pháp điện di trên gel đã cho phép phân tách các đoạn DNA đượ c cắt bở i enzym cắt

giớ i hạn dựa trên kích thướ c của chúng và phương pháp chuyển DNA từ gel sang

màng lai nitrocellulose là cơ sở cho sự ra đờ i của phương pháp lai do E.M Southern

mô tả năm 1975.

Lai Southern- blot là phương pháp đượ c ứng dụng sớ m nhất trong phát hiện

HPV. Đây là phương pháp có độ nhạy r ất cao, cho phép phát hiện đoạn DNA đích


20/61

20

sử dụng các mẫu dò được đánh dấu bằng phóng xạ (hệ thống phát hiện bằng

enzym).

Có nhiều phương pháp đánh dấu mẫu dò oligonucleotid khác nhau đượ c sử

dụng nhưng đa số mẫu dò thường đánh dấu ở đầu 5’ bằng các đồng vị phóng xạ hay

gắn các chất phát huỳnh quang. Sau đó, phức hợ p mẫu dò đã đánh dấu sẽ đượ c phát

hiện bở i các kháng thể đặc hiệu [5].

Lai Southern-blot có thể sử dụng DNA tách từ bệnh phẩm đã bảo quản hoặc

bệnh phẩm tươi. Sự xuất hiện của sản phẩm lai được đánh giá như tiêu chuẩn chẩn

đoán sự có mặt của HPV trong bệnh phẩm vì kích thướ c của kích thướ c của đoạn lai

được đánh giá bằng nội kiểm dương đặc hiệu cho mỗi phản ứng. Tuy nhiên, độ đặc

hiệu của phương pháp này không cao và cần thực hiện bắt buộc tại các phòng xét

nghiệm chuyên sâu, cũng như thao tác tương đối phức tạ p và mất nhiều thờ i gian.

o Dot-blot và Slot-blot

Dot-blot và Slot-blot cũng dựa trên nguyên tắc lai tương tự như phương pháp

Southern- blot nhưng thờ i gian tiến hành nhanh và đơn giản hơn. Sản phẩm PCR sau

khuếch đại đượ c chuyển tr ực tiế p sang màng và lai hóa tr ực tiế p với đầu dò đặchiệu. K ỹ thuật này không phải qua giai đoạn điện di trên gel và không qua giai đoạn

chuyển màng. Phương pháp này cho phép xác định 105 – 106 bản DNA sao chép của

HPV. Trong quá trình lai ngược, DNA được đánh dấu và đượ c sử dụng như mẫu dò

để lai trên màng có nhiệt độ cao.

o Phương pháp lai huỳnh quang t ại chỗ (Fluorescence in situ

hybridization)

Phản ứng lại tại chỗ là phương pháp có khả năng phát hiện, xác định

genotype và xác định vị trí của DNA HPV trong tế bào hoặc mô bằng các mẫu dò

đặc hiệu đã gắn huỳnh quang, do đó có thể sử dụng một mẫu mô cho cả xét nghiệm

tế bào học và xét nghiệm lai phát hiện HPV


21/61

21

Hình 2.7. Phƣơng pháp lai huỳnh quang tại chỗ phát hiện HPV

Hiện nay, phương pháp lai tại chỗ thường đượ c sử dụng để phát hiện HPV

trên mẫu mô là phương pháp khuếch đại tín hiệu không cần phản ứng khuếch đại

DNA đích Tyramide (Tyramide Signal Amplification -TSA™). TSA™ có thể

khuếch đại đồng thờ i cả chất nhuộm và tín hiệu huỳnh quang nên giúp tăng độ nhạy

gấ p 1000 lần so với phương pháp chỉ sử dụng kháng thể đơn thuần. Khi số lượ ng vi

rút thấ p, có thể phối hợ p phản ứng PCR khuếch đại DNA đích và phương pháp lai

tại chỗ [8], [29].2.7.2. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng khuếch đại chuỗi PCR là phản ứng dây chuyền nhân bản DNA in

vitro nhờ DNA polymerase nhằm thu nhận một số lượ ng lớ n bản sao của một trình

tự xác định, do Kary Mullis phát minh năm 1983.

Cơ sở của phương pháp dựa trên khả năng tổng hợ p một mạch mớ i của DNA

polymerase từ một mồi đã bắt cặ p sẵn với khuôn (DNA đích). Mồi là những đoạn

oligonucleitid vớ i chiều dài tối ưu khoảng 15-25 base, có khả năng bắt cặ p bổ xung

M u

C định

Lai

Đ u dòCh t nhuộmhuỳnh quang

Đích: 16S rRNA

Đ u dò oligonucleotid g n

huỳnh quang

R ử a

M u đã lai

Phân tích k t quả

Máy phân tích

tế bào theo

dòng chảy


22/61

22

vớ i một đầu của khuôn và enzym chịu nhiệt DNA polymerase có vai trò nối dài mồi

để hình thành mạch mớ i. Những đoạn DNA mớ i hình thành lại tiế p tục đượ c sử

dụng làm khuôn do đó, sau mỗi chu k ỳ thì số lượng DNA đượ c nhân lên theo cấ p số

nhân. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR có thay đổi, tùy thuộc chủ

yếu vào loại mồi sử dụng, kích thước đoạn DNA đích, chu trình nhiệt và các thành

phần tham gia phản ứng (dung dịch đệm, ddNTP, MgCl2, DNA polymerase...). PCR

có độ nhạy cao, có thể phát hiện đượ c 1-10 đoạn gen sao chép cho mỗi phản ứng

tương đương 10 – 100 ng/µl của DNA. Tuy nhiên, k ỹ thuật thực hiện PCR phức tạ p

hơn phương pháp lai bắt giữ.

Các giai đoạn cơ bản trong một chu k ỳ của phản ứng PCR gồm:

+ Biến tính DNA: Giai đoạn hình thành DNA sợi đơn (DNA khuôn) từ DNA sợ i

đôi. Nhiệt độ thực hiện biến tính khoảng 94oC - 95oC trong khoảng 30 giây đến 1

phút.

+ Bắt cặp: Giai đoạn mồi bắt cặ p vớ i khuôn kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Nhiệt

độ bắt cặ p khoảng 40oC - 70oC, phụ thuộc vào tỷ lệ G + C trong trình tự mồi.

+ Tổng hợp: Giai đoạn DNA polymerase tổng hợ p DNA mớ i trên khuôn, kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Nhiệt độ phản ứng thườ ng ở 72oC.

Sản phẩm PCR có thể đượ c phân tích tiế p tục vớ i các k ỹ thuật khác nhau như

k ỹ thuật điện di trên gel, lai dot-blot, slot-blot hoặc giải trình trình tự gen tr ực tiế p.

Phƣơng pháp PCR sử dụng trong phát hiện HPV

PCR là phương pháp khuếch đại đích đượ c sử dụng phổ biến nhất, DNA

HPV đượ c khuếch đại và phát hiện nhờ enzym chịu nhiệt DNA polymerase vớ i sự

tham gia của các mồi đặc hiệu sau một chu trình nhiệt.

Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR thường để khuếch đại vùng gen L1

HPV. Cặ p mồi đượ c sử dụng nhiều nhất là GPMY09/GPMY11 khuếch đại 450 bp

trên đoạn L1 ORF và cặ p mồi GP5+/GP6+ khuếch đại 140 bp vùng L1. Đây là hai

loại mồi có độ nhạy cao, có thể khuếch đại từ 10-200 bản copy DNA, tuy nhiên, độ

nhạy của PCR vớ i hai loại mồi trên không giống nhau.


23/61

23

Mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ gốc đều có nhiệt độ bắt cặ p thấ p

nên mồi đượ c biến đổi thành các cặ p mồi gồm hỗn hợp các đoạn oligonucleotid

khác nhau gọi là các mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ thế hệ hai. Những cặ p

mồi mớ i có thể khắc phục nhược điểm nhiệt độ bắt cặ p thấp nhưng lại có thể tổng

hợ p nên những mẫu DNA đứt gãy hoặc DNA không đặc hiệu DNA đích [Molecular

diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections]. Do đó, hiện nay, phản ứng

PCR thườ ng sử dụng mồi xuôi- mồi ngượ c không gồm những trình tự của những

đoạn DNA đứt gãy và thay vào đó là các inosine có thể bắt cặ p vớ i bất k ỳ trình tự

nucleotid khác.

Trong phản ứng PCR lồng (nested PCR) có thể sử dụng cả hai loại mồi

GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ nên độ nhạy phản ứng cao hơn.

Hiện nay, phương pháp PCR còn sử dụng loại cặ p mồi mớ i ký hiệu là SPF10

nhằm khuếch đại 65-bp trên vùng L1 ORF.

Một số Kít HPV thương mại dựa trên nguyên lý phương pháp HPV:

+ K ỹ thuật Reverse line blot (Roche Molecular systems - Alameda, CA) là k ỹ

thuật đầu tiên ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện HPV DNA và HPVgenotype. K ỹ thuật line blot dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng mồi PGMY09/11

khuếch đại vùng gen L1 HPV. Sản phẩm PCR đượ c lai vớ i các mẫu dò gồm các

mẩu olionucleotid đặc hiệu đa type HPV gắn trên màng. Phức hợ p gắn đượ c phát

hiện bằng mắt thườ ng. Reverse line blot có thể phát hiện đượ c 27 HPV genotype

khác nhau trong đó có 11 type HPV "nguy cơ thấ p".

+ Amplicor HPV test (Roche Molecular Systems) là k ỹ thuật có thể phát hiện

13 type HPV "nguy cơ cao". Nguyên lý kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR khuếch đại

sản phẩm lai sau khi DNA đích đã lai kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang.

Amplicor HPV test chỉ có giá tr ị xác định nhóm genotype HPV mà không phát hiện

từng HPV genotype đặc hiệu.

+ Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix, Heidelberg, Gemany) là k ỹ

thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và mẫu dò đặc hiệu. Mồi Kít gồm 24 mẫu dò

tương ứng 24 genotype HPV, 1 mẫu dò β-globin và 1 mẫu dò chứng. Sau khi sản


24/61

24

phẩm PCR đượ c lai vớ i các mẫu dò sẽ đượ c gắn R- phycoerythrin đã đánh dấu

streptavidin và được đọc trên máy phân tích Luminex. Đây là Kít có độ nhạy cao và

có thể ứng dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học, tuy nhiên hiện nay Kít thườ ng chỉ

sử dụng cho mục đích nghiên cứu vì giá thành cao.

+ Phương pháp PCR đặc hiệu theo type (type-specific PCR) là phương pháp

PCR phát hiện riêng cho từng type HPV khác nhau dựa vào sự khác nhau trên vùng

gen E6 và E7. Phát hiện đa nhiễm các type HPV trong cùng một mẫu cũng phải

đượ c thực hiện riêng biệt cho từng type. Kít gồm cặ p mồi đặc hiệu cho 14 genotype

HPV nhóm “nguy cơ cao” dựa trên khả năng khuếch đại 100 bp trên vùng gen E7

HPV. Các genotype HPV có mồi đặc hiệu đượ c phát hiện là HPV 16, 18, 31, 33, 35,

39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68.

Phương pháp PCR đặc hiệu theo type có độ nhạy r ất cao, có thể phát hiện vớ i

0,005 – 0,01ng DNA HPV/µl, tiến hành nhanh và xác định được đa nhiễm.

2.7.3. Phƣơng pháp real-time PCR

Các phương pháp PCR thông thườ ng chỉ đánh giá định tính mà không đánh

giá định lượ ng vi rút. Real-time PCR là phương pháp khuếch đại đích có độ nhạycao, thường đượ c sử dụng trong định tính và định lượ ng DNA HPV.

Real-time PCR cho phép khuếch đại và xác định số lượ ng bản sao đượ c tạo

ra trong từng chu k ỳ nhiệt. K ết quả DNA đích đượ c hiển thị ngay sau mỗi chu k ỳ

nhiệt dựa trên sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu huỳnh quang phát ra và số lượ ng bản dao

DNA đượ c tổng hợ p.

Phương pháp real-time PCR có thể thực hiện nhanh, giá thành không đắt,

định lượng đượ c sản phẩm DNA và RNA. Phương pháp này có thể phát hiện đượ c

10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm). Việc xác định

số lượng vi rút cho phép xác định được mRNA, đánh giá sự hoạt động của gen E6

và E7. Khi 2 vùng gen này hoạt động sẽ gây ra những biến đổi cũng như cho các

sản phẩm của các vùng gen này. Đây là phương pháp có độ nhạy 100% và độ đặc

hiệu 70%.


25/61

25

Trên thương mại có các loại Kít khác nhau dựa trên nguyên lý của real-time

PCR như Roche LightCycler 2, Applied Biosystems 7900 HT và Corbett Rotor -

Gene 6600. Những Kít này thường đượ c sử dụng trong chẩn đoán in vitro tại Châu

Âu, tuy nhiên vẫn chưa đượ c FDA công nhận.

2.7.4. Phƣơng pháp DNA microarray (Phƣơng pháp DNA chip)

Phương pháp DNA microarray là kỹ thuật phát hiện DNA HPV hoặc cDNA

HPV bằng cách lai hóa sản phẩm đích vớ i các mẫu dò đặc hiệu đã gắn vớ i các hạt

chip silicon trong các giếng trên phiến kính. Sản phẩm lai giữa DNA đích và mẫu

dò đượ c phát hiện bằng tín hiệu huỳnh quang hoặc bằng phương pháp hóa phát

quang. Cường độ của tín hiệu thu đượ c phụ thuộc vào nồng độ DNA đích.

Mỗi giếng lai có khoảng 10-12 mole trình tự oligonucleotid mẫu dò đượ c thiết

k ế đặc hiệu vớ i các trình tự bổ xung trên DNA đích hoặc vớ i các khung đọc mở trên

DNA đích. Chiều dài mẫu dò tùy thuộc vào đoạn DNA đích mong muốn.

Phương pháp DNA microarray gồm hai loại:

Loại DNA microarray hai kênh (two-channel microarray): Thường đượ c sử dụng

phát hiện cDNA từ hai mẫu cần so sánh vớ i hai loại probes được đánh dấu bằnghai loại huỳnh quang khác nhau. Loại huỳnh quang thường đượ c sử dụng là Cy3

(phát xạ huỳnh quang ở bướ c sóng 570 nm) và Cy5 (phát xạ huỳnh quang ở bướ c

sóng 670 nm). Hai mẫu DNA đích sau khi lai sẽ đượ c tr ộn chung lại tạo ra một

hỗn hợp lai và đọc trên máy scan bằng laser vớ i hai loại bướ c sóng khác nhau.

Loại DNA microarray một kênh (one-channel microarray): Phương pháp này chủ

yếu sử dụng trong đánh giá kết quả lai của DNA đích vớ i probe mà ít có giá tr ị

trong đánh giá so sánh vớ i các mẫu khác vì việc đánh giá so sánh khả năng lai

của cùng DNA đích vớ i probe phải thực hiện trong điều kiện hoàn toàn giống

nhau.

Với phương pháp DNA microarray, có thể phát hiện các genotype HPV khác

nhau riêng biệt và phát hiện đa nhiễm các genotype HPV. DNA microarray còn có

thể đượ c sử dụng nhằm đánh giá những thay đổi trong mức độ biểu hiện gen như

các biểu hiện đơn, đa hình thái hoặc các trình tự đột biến trên gen.


26/61

26

Hình 2.8. Các bƣớ c tiến hành của phƣơng pháp DNA microarray

Hiện nay trên thương mại, Kít dựa trên DNA microarray đượ c sử dụng là

PapilloCheck (Greiner Bio-One, Monroe, NC) phát hiện 24 HPV genotype. E1

HPV genotype đượ c khuếch đại trong phản ứng PCR sẽ đượ c lai với DNA chip đã

gắn cố định các HPV oligoprobe. PapilloCheck có thể tiến hành vớ i 12 mẫu trong

cùng thời điểm nên có thể tránh k ết quả âm tính hoặc dương tính giả. So sánh vớ i

Kít Roche Linear array, DNA array cho k ết quả xác định genotype HPV tương đồng

2.7.5. Phƣơng pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

Khác với phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học và

phương pháp enzym, phương pháp giải trình tự gen trên máy tự động dùng 4 màu

M u

Tinh sạch

T ng hợ p cDNA

Đánh d u cDNA

Lai cDNA và đ u dò đặc hiệu

Đọc k t quả trên máy scan

Phân tích k t quả


27/61

27

huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nguyên tắc hoạt động của máy

là dựa trên sự nhận biết sự phát sáng của vạch điện di trên gel polyacrylamide trong

quá trình điện di khi chiếu chùm tia laser đi qua và ghi lại cường độ sáng trên biểu

đồ bằng các đỉnh màu khác nhau [6].

Các DNA có thể được xác định trình tự nucleotide tr ực tiế p hoặc sau khi

dòng hóa. Phương pháp giải trình tự gen tr ực tiế p cho phép tiến hành nhanh và tiết

kiệm, tuy nhiên phương pháp này chỉ có thể áp dụng vớ i nguyên liệu giải trình tự là

DNA trong sản phẩm PCR có chất lượ ng tốt, đảm bảo độ tinh sạch vì đôi khi có

những vùng gen được nhân lên không đặc hiệu trong phản ứng PCR mà qua điện di

không thể xác định đượ c sẽ làm k ết quả xác định nucleotide bị r ối và khó xác định.

Mục đích của việc dòng hóa nhằm phân tích chính xác vùng DNA cần

nghiên cứu và nhân số lượ ng DNA cần giải trình tự nếu số lượ ng DNA trong sản

phẩm PCR quá ít. Hơn nữa, dòng hóa còn giúp duy trì và bảo tồn sản phẩm PCR

đặc biệt là bảo tồn những vùng gen quý.

Phương pháp giải trình tự đượ c cho là tiêu chuẩn vàng trong xác định

genotype HPV. Tuy nhiên, khả năng phát hiện đa type của phương pháp rất hạn chế.2.8. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giớ i

2.8.1. Tình hình nhiễm HPV trên thế giớ i

Tỷ lệ nhiễm HPV phân bố theo tuổi và giớ i

HPV là tác nhân lây truyền qua đườ ng tình dục do đó tỷ lệ nhiễm HPV phụ

thuộc vào hành vi tình dục của các cá thể trong cộng đồng. Sự thay đổi về hành vi

tình dục ở các lứa tuổi khác nhau sẽ dẫn đến tỷ lệ nhiễm cũng thay đổi.

Tỉ lệ nhiễm HPV trên thế giớ i gần như phụ thuộc vào phân hóa độ tuổi chịu

ảnh hưở ng bở i sinh lí và hoạt động tình dục cộng đồng. Những nghiên cứu tổng hợ p

về dịch tễ học cho thấy tỉ lệ nhiễm cao nhất là ở lứa tuổi dướ i 25 tuổi, sau đó giảm

dần từ 35-44 tuổi trước khi đạt ngưỡ ng cao lần thứ hai ở lứa tuổi 45-54 ( tr ừ Châu Á

luôn giảm dần). [18]

Sự phân bố theo độ tuổi của HPV có thể giải thích do HPV đạt tỷ lệ nhiễm

cao nhất trong những năm đầu sau khi hoạt động tình dục. Tuy nhiên, sau khi


28/61

28

nhiễm, đa số HPV bị đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ loại bỏ. Tuổi bắt đầu

quan hệ tình dục khác nhau giữa các nướ c. Ở các nướ c phát triển, tuổi quan hệ tình

dục lần đầu tiên đang có xu hướ ng giảm dần còn tại các nước đang phát triển tuổi

bắt đầu quan hệ tình dục thườ ng duy trì trong khoảng 15 đến 24 tuổi [18]. Khi phụ

nữ ở độ tuổi 50, cơ thể có hiện tượ ng suy giảm về chức năng miễn dịch và bị giảm

đột ngột nồng độ hormone sinh dục tạo cơ hội cho HPV xâm nhiễm vào cơ thể.

Nam giới đượ c coi là nguồn mang HPV không triệu chứng và là điều kiện

làm lây lan HPV trong cộng đồng. Tỷ lệ nhiễm chung ở nam (7.9%) thấp hơn so vớ i

ở nữ (17.9%)

Nếu như ở nữ giớ i, tỷ lệ nhiễm ở nhóm tuổi dưới 25 cao hơn nhóm tuổi

trung niên thì ngượ c lại, tỷ lệ nhiễm HPV ở nam trên 30 tuổi cao gấ p 2 lần so vớ i

nhóm tr ẻ dướ i 30.

Tỷ lệ nhiễm HPV theo khu vực địa lý

Tỷ lệ nhiễm HPV không chỉ thay đổi theo các lứa tuổi mav còn khác nhau

giữa các khu vực địa lý. Khi điều chỉnh theo khu vực thì tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ

trong cộng đồng trên toàn cầu là 10.41% (95% CI: 10.2 – 10.7%) vớ i khoảng giaođộng r ộng từ 2 đến 44% [18] và tỷ lệ nhiễm chung ở nam giớ i là 7.9%.

Sự phân bố genotype HPV trên thế giớ i

HPV là một trong những virus có nhiều genotype nhất, với hơn 100 genotype

đã được xác định có khoảng 40 genotype lây truyền qua đườ ng sinh dục. HPV 16,

18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 và 82 là những type “nguy cơ cao”

thườ ng gặ p nhất chiếm tới 90% các trườ ng hợp UTCTC, trong đó chỉ riêng HPV 16

và HPV 18 đã gặ p ở 70%.

Hiện nay, vaccine đặc hiệu type 16, 18 đã góp phần đáng kể trong công tác

phòng chống gánh nặng bệnh tật do UTCTC gây ra cho cộng đồng. Tuy nhiên, các

genotype HPV lại thay đổi theo từng vùng địa lý khác nhau vì có sự tương tác giữa

các type và các biến thể khác nhau với đáp ứng miễn dịch trong tế bào vật chủ.

Tỷ lệ nhiễm HPV16/18 khác nhau giữa các nướ c phát triển và các nướ c kém

phát triển hơn. Mặc dù tỷ lệ nhiễm HPV 16/18 ở các nước đang phát triển cao hơn ở


29/61

29

các nướ c kém phát triển hơn nhưng ngượ c lại, ở các nướ c kém phát triển lại có tỷ lệ

UTCTC cao hơn do công tác triển khai xét nghiệm cổ tử cung sàng lọc ung thư và

các xét nghiệm phát hiện HPV còn tương đối hạn chế hơn so với các nướ c phát triển

[21].

Hình 2.9. Tỷ lệ nhiễm HPV trên thế giớ i

2.8.2. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam

Đến năm 2010, theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giớ i về tình hình nhiễm

HPV tại Việt Nam cho biết tỷ lệ nhiễm chung trên toàn quốc chiếm 5.4% [40],

trong đó có tớ i 41.6% số trườ ng hợp đa nhiễm vớ i ít nhất hai genotype HPV. Như

vậy, Việt Nam có tỷ lệ nhiễm HPV thấp hơn so vớ i tỷ lệ nhiễm chung ở các khu vựckhác trên thế giới nhưng chủ yếu là đa nhiễm các genotype và làm tăng nguy cơ

nhiễm dai dẳng HPV dẫn đến UTCTC.

Về sự phân bố các genotype HPV tại Việt Nam, HPV 16 và HPV 18 là hai

genotype “nguy cơ cao” chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 29.7% và 1.5% [9].


30/61

30

CHƢƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

3.1. Vật liệu

3.1.1. Đối tƣợ ng nghiên cứ u

Đối tượ ng nghiên cứu là bệnh nhân thực hiện khám phụ khoa tại các bệnh

viện trong thành phố Hồ Chí Minh, thực hiện xét nghiệm tại phòng xét nghiệm

NamKhoa BioTek.

Thờ i gian thực hiện thu mẫu xét nghiệm từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014.

Đối tượ ng trong nghiên cứu nhận được tư vấn phụ khoa, hiểu rõ ý nghĩa của

xét nghiệm, đồng ý cung cấp thông tin chính xác cho đơn vị xét nghiệm.

3.1.2. Hóa chất, sinh phẩm

3.1.2.1. Hóa chất và sinh phẩm phát hiện HPV DNA

* Hóa chất và sinh phẩm tách chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm cổ tử cung:

Tách chiết DNA toàn phần bằng bộ thuốc thử NK DNAPREP-PHCHL vớ i

thành phần đượ c cung cấ p từ nhà sản xuất:

Bảng 3.1. Thành phần hóa chất sinh phẩm cho bộ NK

DNAPREP-PHCHL

Tên thuốc thử Thành phần ĐK bảo quản

NK P/C/I Phenol, chloroform,

isoamyl alcool

-20oC

NK Na Acetate 3M Na Acetate 3M, pH 5.2 4oC

NK Ethanol 100% Ethanol 100% 4oCNK Ethanol 70% Ethanol 70% 4oCNK TE1X Tris HCl, EDTA Na2 4

oCNK PROKPREP 10X Proteinase K, Triton X100, Tris HCl -20oC

Tube 1.5ml Tube Eppendorf 1.5ml, vô trùng ToPTN

* Hóa chất và sinh phẩm dùng cho phản ứ ng PCR khuếch đại HPV DNA

Tên bộ xét nghiệm: NK HPV PCR kit


31/61

31

Bảng 3.2. Thành phần NK HPV PCR kit

Thành phần thuốc thử Nôi dung thuốc thử

NK Multiplex-PCRMix MgCl2, Tris HCl, KCl, taq polymerase,

dNTP

NK HPVHBG-PrimerMix Mồi MY09 & MY11, HBG-F &HBG-R

NK TE 1X

Chứng [-]

NK HPVDNA-C[+] Chứng [+] là plasmid chèn NK HPVDNA

genotype 6

* Dung dịch điện di phát hiện HPV DNA

+ Dung dịch đệm điện di TBE 0,5X: Pha loãng từ dung dịch gốc TBE 5X có thành

phần như sau:

Tris base 27 g

Axit Boric 13,8 g

0,5M EDTA pH 8,0 10 ml

Nướ c khử ion vừa đủ 500 ml

Khuấy đều trên máy khuấy từ trong vòng 1 giờ

+ Gel agarose 2%: Cân 2 gam agarose, bổ xung 100 ml đệm TBE 0,5X. Đun tan

trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút. Để nhiệt độ hạ xuống dần khoảng đến 50oC r ồi đổ

ra khay điện di đã có lượ c tạo giếng tra mẫu.

+ Gel red (cấu trúc tương tự như Ethium bromide nhưng không độc) dung dịch mẹ

(10ug/ml): Hóa chất đượ c tổng hợ p sẵn tại phòng xét nghiệm NamKhoaTek. Hóachất đượ c giữ lạnh thườ ng. Khi dùng pha 10 µl dung dịch mẹ trong 1 ml đệm.

+ Đệm tra mẫu DNA (Loading buffer) 5X:

Tris-HCl 1M, pH 8,0 1ml

EDTA 0,5M, pH 8,0 0,2 ml

Glycerol 2 ml

Bromphenol Blue 1% 2 ml


32/61

32

3.1.2.2. Hóa chất và sinh phẩm xác định genotype HPV

* Xác định genotype HPV bằng phƣơng pháp PCR - ELISA: Sử dụng bộ sinh

phẩm NK HPV PCR-ELISA kit

K ỹ thuật xác định genotype HPV : PCR và ELISA

Số lượ ng mẫu/plate : 6 mẫu/ plate.

Số lượ ng genotype HPV có thể xác định : 23 genotype

- Các gene gắn trong giếng gồm:

HPV genotype : HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,

56, 58, 59, 68.

(15 gene)

Bảng 3.3. Thành phần bộ kit PCR- ELISA xác định genotype HPV

Thành ph ần thu ố c th ử Nôi dung thu ố c th ử NK HPV-PCR1 mix Mồi MY09/MY11, MgCl2, Tris HCl,

KCl, taq polymerase, dNTP

NK HPV-PCR2 mix Mồi MY09-in & MY11-in, MgCl2, Tris

HCl, KCl, taq polymerase, dNTP

NK HPV-DIGPCR2 mix Mồi MY09-in & MY11-in, MgCl2, TrisHCl, KCl, taq polymerase, dNTP, DIG-

dUTP

NK TE 1X Chứng [-]NK HPVDNA-C[+] Chứng [+] là plasmid chèn NKHPVDNA

genotype 6NK DNAPREP-PHCHL Tr ọn bộ

NK AGE Tr ọn bộ thuốc thử dành cho điện di

Washing buff er 10X PBS-T đậm đặc 10 lần

Dilution buffer PBS-T-BSA

Conjugate Kháng thể đơn dòng đặc hiệu DIG

TMB TMB

URP URP


33/61

33

Substrate buf fer Đệm citrate

Stop solution H 2SO4

Plate A Có các giế ng ELISA phủ probe đặc hiệu 8

genotype HPV: 6 (A), 11 (B), 16 (C), 18

(D), 31 (E), 33 (F), 35 (G), 39 (H).

Plate B Có các giế ng ELISA phủ probe đặc hiệu 8

genotype HPV: 45 (A), 51 (B), 52 (C), 56

(D), 58 (E), 59 (F), 68 (G), C [+]ELISA

(H).

3.1.3. Trang thiết bị:

- Tủ cấy vô trùng cấ p II (Cleanbench Shingsaeng).

- Máy ủ nhiệt khô (V2 PHVG Nam Khoa).

- Lò vi sóng (Intellowave LG).

- Máy lắc ổn nhiệt 37oC, máy khuấy từ, máy khuấy tr ộn vortex (Thermomixer

comfort, Yellowline, Stuart).- Tủ lạnh sâu – 30oC, – 80oC (Sanyo Biomedical Freeze).

- Máy soi chụ p ảnh gel (Bio-rad).

- Cân phân tích 10-4g, cân điện tử 10-2g (Sartorius).

- Bộ nguồn điện di, bộ điện di ADN (TaKaRa, Nhật Bản).

- Pipettman, đầu côn các loại (Thermo science).

- Máy PCR Bio-rad, GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystem)

- Máy li tâm (Beckman Coulter, HITACHI).

- Máy hút chân không (YUYUE).

- Buồng đổ gel Tetair.

- Máy r ửa ELISA (Immunowash, Bio-rad).

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứ u

3.2.1. Thiết k ế nghiên cứ u


34/61

34

Tiến hành nghiên cứu nhằm xác định các tỷ lệ nhiễm và sự phân bố genotype

HPV từ mẫu bệnh phẩm cổ tử cung k ết hợ p theo thiết k ế nghiên cứu thuần tậ p hồi

cứu để xác định các yếu tố nguy cơ. Cỡ mẫu trong nghiên cứu đượ c áp dụng theo

công thức của Leslie Kish:

n = (Z1-α)2. [p. (1-p)/D2]

Trong đó:

N : Cỡ mẫu

1-α : Độ tin cậy 95%

Z1-α : Z0,95 = 1.96

P : Tỷ lệ nhiễm HPV đã đượ c nghiên cứu và công bố.

D : Khoảng sai lệch của k ết quả nghiên cứu so vớ i quần thể nghiên cứu chung.

Có giá tr ị từ 3% - 5% (0.03 – 0.05).

Theo công thức tính nêu trên vớ i khảng sai lệch của k ết quả nghiên cứu so vớ i quần

thể nghiên cứu chung là 5% và tỉ lệ nhiễm HPV trung bình trong các quần thể đã

đượ c nghiên cứu và công bố là 30% [32]. Kích thướ c mẫu cần thực hiện là 323

mẫu. Trong đề tài thực hiện vớ i cỡ mẫu là 400. Kích thướ c mẫu đượ c kiểm tra lại bằng phần mềm tính cỡ mẫu Sample size 2.0.

3.2.2. Thu thập mẫu nghiên cứ u

Các đối tượ ng trong nghiên cứu thực hiện xét nghiệm tự nguyện theo tư vấn

và chỉ định của bác sĩ chuyên khoa.

Tiêu chuẩn đối tượ ng trong nghiên cứu:

Phụ nữ đã có quan hệ tình dục.

Hiện tại không có thai. Không thụt r ửa âm đạo trướ c khi xét nghiệm.

Không được đặt thuốc điều tr ị phụ khoa trước đó ít nhất 7 ngày.

Khi xét nghiệm không trong thờ i k ỳ hành kinh.

Không quan hệ tình dục trướ c xét nghiệm 3 ngày.Khám phụ khoa:

Lấy bệnh phảm cổ tử cung chỉ cho xét nghiệm sinh học phân tử phát hiện

HPV. Dùng bông tâm vô trùng (Nam Khoa) phết mỏng lên bề mặt tử cung. Nhanh


35/61

35

chóng lưu giữ lạnh trong dụng cụ và gửi an toàn đến phòng xét nghiệm. Trên mẫu

thu ghi rõ thông tin liên quan đến đối tượ ng (tên, tuổi, ngày lấy mẫu).

3.2.3. Qui trình k ỹ thuật phân tích mẫu nghiên cứ u:

Mẫu nghiên cứu sau khi thu nhận đượ c thực hiện phân tích tại phòng xét

nghiệm công ty Nam Khoa Biotek, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

Hình 3.1. Qui trình kĩ thuật phân tích mẫu xét nghiệm trong nghiên cứ u.

Khuếch đại lần hai gen L1 bằng cặ p mồi

MY09-in/MY11-in trên sản hẩm dươn tính

Khuếch đại gen L1 Multiplex PCR bằng mồi

MY09/ MY11 và c mồi HBG F/ HBG R

Tách chiết DNA tổng số

Bệnh phẩm cổ tử cung

Mẫu nghiên cứu

Điện di phát hiện sản

phẩm khuếch đại 450bps

Điện di phát hiện sản phẩm khuếch

đại lần 2 140bps

Lai sản phẩm PCR trên giếng ELISA

để phát hiện genotype HPV

Mẫu âm tính


36/61

36

3.2.4. Quy trình k ỹ thuật phát hiện HPV DNA và xác định genotype HPV

3.2.4.1. Quy trình k ỹ thuật phát hiện HPV

Tách chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm cổ tử cung

Quy trình đượ c thực hiện trong buồng hút vô trùng, tránh tạ p nhiễm.

X ử lí tiề n tách chiế t vớ i proteinase K:

Tâm bông vô trùng lấy mẫu đượ c chuyển sang enpendoff 1.5 ml, bổ sung

lượ ng dung dịch TE 1X cùng vớ i proteinase K theo tỉ lệ 9:1.

Mẫu sau đó được vortex trong 30 s để rã tan lớ p bông chứa DNA và đồng

nhất. Ủ mẫu ở 60oC trong ít nhất 2 giờ trướ c khi xử lí ( khuyến cáo ủ qua

đêm từ nhà sản xuất).

Tách chiế t DNA:

Thêm 400l P:C:I. Vortex mạnh trong 10 giây. Ly tâm 13,000RPM trong 2

phút. Hút chuyển 400l phần phase nướ c chứa DNA ở trên vào một tube ly

tâm mớ i. Lặ p lại bướ c này một lần nữa (cho thêm 400l P:C:I r ồi vortex và

ly tâm) nếu ở phần tiế p xúc giữa hai phase vẫn còn tủa.

Thêm 40l (1/10 thể tích) sodium acetate 3M, pH 5.2 vào dung dịch DNA để

làm cho DNA dễ bị tủa khi cho Ethanol vào. Tr ộn bằng vortex ngắn hay

bằng cách búng ngón tay nhẹ vào tube nhiều lần. Thêm 1000l (2.5 thể tích)

ethanol 100% đã để lạnh trong đá rồi vortex. Giữ tube trong đá khô bào, hay

trong kem đá khô/ ethanol trong hơn 5 phút, hay giữ trong tủ đông – 70oC

trong 15 phút, hay trong tủ lạnh ngăn – 20oC trong 30 phút. Ly tâm

13,000RPM trong 5 phút. Dùng pipette Pasteur hút bỏ phần nướ c nổi bằng

cách vừa hút cạn dần vừa cho đầu pipette vào dọc thành tube đối diện vớ i

chổ đóng cắn DNA.

R ửa cắn DNA vớ i 1ml ethanol 70%, không vortex mà chỉ úp ngửa vài lần.

Vớ i DNA dướ i 200bp, r ửa cắn vớ i ethanol 95%. Ly tâm 13,000RPM trong 5

phút, hút bỏ ethanol, và làm khô cắn trong máy ly tâm chân không hay úp

tube trên giấy lọc trong 30 phút ở nhiệt độ PTN.


37/61

37

Hòa tan cắn DNA trong 100l đệm TE. Có thể dùng 10l dịch tách chiết

DNA này để chạy PCR hay real-time PCR. Phần còn lại giữ -20oC để lưu.

Thự c hiện PCR phát hiện HPV:

Vớ i mỗi mẫu tách chiết DNA từ mẫu thử, sử dụng 1 PCR1 mix và cho vào

đó 5µl tách chiết DNA. Để làm chứng [+], sử dụng 1 PCR1 mix và cho vào

đó 5µl NK HPVDNA C [+]. Để làm chứng [-], sử dụng 1 PCR1 mix và cho

vào đó 5µl TE1X. Lưu ý là phải vortex tube NK HPVDNA C [+] k ỹ trong 1

phút trướ c khi sử dụng, và trướ c khi mở nắ p phải ly tấm lắng bọt trong 5

giây ở máy ly tâm 13,000rpm.

Sau khi đã cho tách chiết DNA của mẫu thử vào các PCR1 mix và đã chuẩn

bị xong các PCR1 mix chứng [+] và chứng [-], cho các tube PCR1 mix vào

ly tâm lắng bọt trong 5 giây trướ c khi cho vào buồng ủ của máy PCR.

Chạy chương trình chu kỳ nhiệt HPV-PCR1 như sau:

o 1 chu k ỳ: 95oC - 15 phút

o 40 chu k ỳ 95oC – 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1 phút

o

1 chu k ỳ 72o

C - 10 phút Kiể m tra HPV DNA trong sản phẩ m phản ứ ng PCR bằng điện di trên thạch

agarose:

Chuẩn bị gel agarose 2%: cho 4g agarose vào 200 ml dung dịch đệm TBE

0,5X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống

khoảng 50oC r ồi đổ dung dịch agarose vào khuôn gel đã cài sẵn lượ c. Sau

khoảng 1h, khi gel đã đông, gỡ lược và đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm

TBE 0,5X vào bể để dung dịch ngậ p cách mặt gel từ 1-2 mm.

Tra mẫu DNA: Lấy 5l sản phẩm PCR pha trong 3 l đệm tra mẫu 5X và tra

vào các giếng nhỏ trong gel. Tra 15l DNA marker thang 100 bp vào 1 giếng

trên gel để làm chỉ thị phân tử.

Chạy điện di ở hiệu điện thế 135 V, trong khoảng 25 phút. DNA di chuyển từ

cực âm đến cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu BromophenolBlue để


38/61

38

biết khi nào cần dừng điện di. Bromophenol Blue đã hòa tan Gelred ( tỉ lệ

100:1).

Sau đó lấy bản gel ra tráng nướ c r ồi quan sát và chụ p ảnh dướ i ánh sáng tia

tử ngoại.

3.2.4.2. Quy trình k ỹ thuật xác định genotype HPV

Lựa chọn sản phẩm DNA tách chiết từ những mẫu có HPV DNA dương tính

(phát hiện bằng phản ứng PCR vớ i các cặ p mồi MY09/MY11) để xác định genotype

HPV bằng k ỹ thuật ELISA.

Thự c hiện DIG-PCR2:

Thực hiện DIGPCR2 các sản phẩm PCR1 của mẫu được xác định dương tính

HPV, và của chứng [-], không thực hiện cho sản phẩm PCR1 của các mẫu

được xác định âm nghiệm HPV.

Vớ i mỗi sản phẩm PCR1 của mẫu và của chứng [+], sử dụng một NK HPV-

DIGPCR2 mix và cho vào đó 1µl sản phẩm PCR1.

Chạy chương trình chu kỳ nhiệt HPV-DIGPCR2 như sau:

o

1 chu k ỳ 95o

C - 15 phúto

40 chu k ỳ 95oC - 30 giây, 57oC - 30 giây, 72oC - 1 phút

o 1 chu k ỳ 72oC - 10 phút.


39/61

39

Hình 3.2. Quy trình xác định genotype HPV và ghi nhận k ết quả.

Xác định genotype HPV

Thực hiện lai sản phẩm DIGPCR2 trên các giếng ELISA đã phủ các probe đặc

hiệu genotype cho HPV: Các plate ELISA đã phủ probe phải đượ c lấy khỏi tủ lạnh

30 phút trướ c khi tiến hành thử nghiệm để tránh đọng nước. Đếm số lượ ng sản

phẩm DIGPCR2 của các mẫu để lấy đủ các thanh ELISA, ứng vớ i mỗi sản phẩm

DIGPCR2 của mẫu, sử dụng một thanh của plate A và một thanh của plate B. Plate

ELISA vớ i các thanh còn lại đượ c cho vào túi và vuốt kín miệng r ồi cho lại vào tủ

lạnh.

Cho vào mỗi giếng ELISA 100µl dilution buffer. Dùng băng keo bịt miệng

giếng. Sau đó giữ trong 55oC (máy ủ ELISA hay tủ ấm, chỉnh 55oC)

Biến tính các sản phẩm DIGPCR2 (của các mẫu và của chứng [+]) bằng cách

cho 70µl TE1X vào 50µl sản phẩm PCR2. Thực hiện biến tính 95oC/10phút

trong buồng ủ nhiệt của máy PCR, 30 giây trước khi chương trình nhiệt k ết

thúc lấy các tube PCR còn nóng ra khỏi máy luân nhiệt giữ các tube này

trong đá bào để duy trì tình tr ạng biến tính. Vẫn giữ thanh ELISA ở 55oC, cho vào các giếng A, B, C, D, E, F, G và H

của thanh ELISA của plate A và các giếng A, B, C, D, E, F và G thanh

ELISA của plate B; mỗi giếng 6µl sản phẩm DIGPCR2 đã biến tính của mẫu.

Cho vào giếng H của plate B 6µl sản phẩm DIGPCR2 đã biến tính của chứng

[+]. Sau khi xong, cào nhẹ đáy giếng vài lần để tr ộn. Dùng băng keo đậy

miệng giếng, r ồi ủ tiế p ở 55oC trong 30 phút.

R ửa các giếng của thanh ELISA vớ i 300µl washing buffer cho mỗi giếng.

R ửa 3 lần như vậy vớ i mỗi lần r ửa ngâm 30 giây r ồi đổ bỏ. Lưu ý là sau mỗi

lần đổ bỏ dung dịch r ửa phải đậ p thanh ELISA vào giấy thấm cho hết lượ ng

dung dịch thừa trong giếng. Phải bỏ giấy thấm sau mỗi đợ t r ửa. Nếu có điều

kiện, tốt nhất r ửa bằng máy r ửa ELISA và đảm bảo máy r ửa phải đượ c sạch

trướ c khi thực hiện thao tác.


40/61

40

Chuẩn bị cộng hợ p bằng cách cho 1 ml dilution buffer vào tube có sẵn 2µl

cộng hợ p (chuẩn bị hai tube cộng hợ p), tr ộn đều. Cho 100 µl cộng hợ p vào

mỗi giếng, búng nhẹ để tr ộn đều. Ủ 37oC trong 30 phút. Sau 30 phút, r ửa các

giếng của plate ELISA vớ i 300 µl washing buffer cho mỗi giếng.

Chuẩn bị TMB buffer bằng cách pha TMB, URP vào substrate buffer vớ i tỷ

lệ 1:1:18. Nếu sử dụng cho 2 thanh ELISA thì cho 100 µl TMB và 100 µl

URP vào 1800 µl substrate buffer, tr ộn đều. Cho 100 µl TMB buffer (dung

dịch hiện màu) vào mỗi giếng, lắc nhẹ. Để ở nhiệt độ phòng trong khoảng từ

15-20 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Có thể đọc đượ c k ết quả ngay trong giai

đoạn này: các giếng có sản phẩm lai sẽ xuất hiện màu xanh biển đậm, còn

các giếng không có sản phẩm lai thì sẽ không có màu. Xác định genotype

dựa vào k ết quả phát hiện sản phẩm lai có trên giếng nào của thanh ELISA:

o Nếu trên thanh ELISA A thì sẽ k ết luận genotype 6 (giếng A), 11

(giếng B), 16 (giếng C), 18 (giếng D), 31 (giếng E), 33 (giếng F), 35

(giếng G), 39 (giếng H).

o

Nếu trên thành ELISA B thì sẽ k ết luận genotype 45 (giếng A), 51(giếng B), 52 (giếngC), 56 (giếng D), 58 (giếng E), 59 (giếng F), 68

(giếng G); riêng giếng H của thanh ELISA B là giếng chứng [+] phải

luôn luôn [+] để xác định qui trình xét nghiệm hoàn chỉnh từ giai đoạn

PCR phát hiện HPV đến giai đoạn ELISA xác định genotype.

3.3. Xử lý số liệu

Sử dụng phương pháp thống kê y sinh học, phân tích các k ết quả thu đượ c

theo chương trình IBM SPSS STATISTICS 22.0 và R console.


41/61

41

CHƢƠNG 4

K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U VÀ BIỆN LUẬN

4.1. Tỉ lệ nhiễm HPV trên các mẫu nghiên

nghiên cứu hpv việt nam

Documents