BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Văn Thu Huyền

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI

NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055

BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Văn Thu Huyền

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI

NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055

BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hƣớng dẫn 1: TS. Lê Sơn

Hƣớng dẫn 2: TS. Đỗ Tiến Phát

Hà Nội - 2021

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu nhân giống các

dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi

cấy mô” là do tôi thực hiện với sự hƣớng dẫn của TS. Lê Sơn và TS. Đỗ Tiến

Phát. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là do tôi trực tiếp thu

thập, đồng thời có kế thừa kết quả các đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo giống Keo

lai sinh trưởng nhanh bằng chỉ thị phân tử‖ và đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo

giống Keo lai và Keo lá tràm phục vụ trồng rừng gỗ lớn ở một số vùng sinh

thái chính‖ do Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp –

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam chủ trì thực hiện.

Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có)

đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ

tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công

bố trên bất kỳ phƣơng tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam

đoan trên.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả

Văn Thu Huyền

Lời cảm ơn

Sau khi hoàn thành các môn học trong chƣơng trình đào tạo thạc sĩ,

đƣợc sự đồng ý của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, tôi tiến hành khóa luận ―Nghiên cứu nhân

giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương

pháp nuôi cấy mô’’. Khóa luận đƣợc thực hiện tại Viện Nghiên cứu Giống và

Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam,

Đức Thắng – Bắc Từ Liêm - Hà Nội.

Để hoàn thành khoá luận này tôi đƣợc sự quan tâm và giúp đỡ tận tình

về nhiều mặt của Ban lãnh đạo, các cán bộ công nhân viên Viện Nghiên cứu

Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt

Nam cũng nhƣ cũng nhƣ cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy lớp BIO-19A

khóa 2019A, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàm lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam. Qua đây tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành và

sâu sắc tới sự giúp đỡ và đóng góp vô cùng quý báu đó.

Tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Đỗ Tiến Phát, TS. Lê

Sơn đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và

ngƣời thân đã giúp đỡ tôi có đƣợc bản luận văn này.

Trong quá trình thực hiện, do năng lực và điều kiện nghiên cứu còn hạn

chế nên khoá luận không tránh khỏi thiếu sót. Rất mong nhận đƣợc sự đóng

góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để khoá luận đƣợc hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Học viên thực hiện

Văn Thu Huyền

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Viết tắt Nghĩa đầy đủ

BAP 6- Benzyl Amino Purine

HSNC Hệ số nhân chồi

B5 Môi trƣờng Gamborg

Ca(OCl)2 Canxi Hypoclorit

GA3 Gibberellic Acid

HgCl2 Clorua thuỷ ngân

IAA Indol 3- Acetic Acid

IBA Indol Butiric Acid

Kn Kinetin

MS* Môi trƣờng MS cải tiến

NAA Naphthy Acetic Acid

NaClO Hypoclorit Natri

PVP Poly Vinyl Pyrrolidone

Tb Trung bình

TLBCHH Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu

TLCHH Tỷ lệ chồi hữu hiệu

WPM Môi trƣờng cho cây thân gỗ

Danh mục các bảng

Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Keo lai ............................................ 44

Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng của từng giống nghiên cứu ............................. 47

Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản ............. 49

Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của BAP và Kn ở nồng độ

khác nhau đến khả năng nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy .................. 51

Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm chồi

Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy .......................................................................... 53

Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho nuôi

cấy các dòng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển ................................................ 56

Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định Phƣơng pháp cấy thích hợp .............. 57

Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho các dòng Keo lai dòng

BV376, BV586 và BB055............................................................................... 59

Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai ............................. 62

Bảng 3.10. Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai ............. 64

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1. Quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào .................................. 18

Hình 3.1. Chồi bất định Keo lai sau 25 ngày khử trùng ................................. 48

Hình 3.2. Cụm chồi Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày nuôi cấy trong các môi

trƣờng nhân chồi khác nhau ........................................................................... 50

Hình 3.3. Các cụm chồi Keo lai đƣợc nuôi cấy trong các công thức môi

trƣờng nhân chồi khác nhau ............................................................................ 52

Hình 3.4. Các chồi Keo lai dòng BV568 sau 25 ngày nuôi cấy trong các công

thức thí nghiệm khác nhau. ............................................................................. 54

Hình 3.5. Cụm chồi Keo lai sau các giai đoạn nuôi cấy: cụm chồi ban đầu,

cụm chồi sau nuôi cấy lần 1 và cụm chồi trong môi trƣờng tối ƣu ................ 58

Hình 3.6. Các chồi Keo lai dòng BB055 ra rễ trong môi trƣờng có bổ sung

IBA và NAA .................................................................................................... 60

Hình 3.7. Các chồi Keo lai dòng BV376 ra rễ sau 10 ngày ........................... 61

Hình 3.8. Bình ra rễ Keo lai ............................................................................ 61

Hình 3.9. Cây con Keo đã ra rễ đƣợc cấy vào bầu đất .................................... 63

Hình 3.10. Luống cây con Keo lai tại vƣờn ƣơm ........................................... 65

1

MỤC LỤC

MỤC LỤC ..................................................................................................... 1

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 6

1.1. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống cây rừng ...... 6

1.1.1. Trên thế giới ........................................................................................ 6

1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống cây rừng

ở Việt Nam .................................................................................................. 12

1.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào

thực vật ........................................................................................................ 15

1.2.1. Khái niệm .......................................................................................... 15

1.2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ..................... 17

1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ................................................ 17

1.2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào ..................................... 17

1.3. Các nhân tố ảnh hƣởng tới nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 19

1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy ......................................................................... 19

1.3.1.1. Môi trƣờng hóa học ........................................................................ 19

1.3.1.2. Môi trƣờng vật lý ........................................................................... 22

1.3.2. Vật liệu nuôi cấy ............................................................................... 23

1.3.3. Điều kiện vô trùng ............................................................................. 23

1.3.4. Buồng nuôi cấy ................................................................................. 24

1.4. Những vấn đề trong nhân giống in vitro .............................................. 25

1.4.1. Sự nhiễm mẫu ................................................................................... 25

1.4.2. Tính bất định về mặt di truyền .......................................................... 25

1.4.3. Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy .................................................... 25

1.4.4. Hiện tƣợng thủy tinh hóa .................................................................. 26

1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống .................................. 27

1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ............................................................................ 27

1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ................................................................... 27

1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh ....................................................................... 28

2

1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ................................................................ 28

1.5.5. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên ........................................................ 29

1.6. Một số kết quả nổi bật về chọn giống Keo lai và trồng rừng Keo lai ở

nƣớc ta ......................................................................................................... 30

1.7. Nghiên cứu về nhân giống in vitro các loài keo .................................. 31

1.7.1. Trên thế giới ...................................................................................... 31

1.7.2. Ở Việt Nam ....................................................................................... 34

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 36

2.1. VẬT LIỆU nghiên cứu......................................................................... 36

2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 36

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 37

2.3.1. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm ............................................... 37

2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.......................................................... 37

2.3.3. Xử lý số liệu ...................................................................................... 41

2.3.3.1. Tính toán các chỉ tiêu theo dõi ....................................................... 41

2.3.3.2. Kiểm tra ảnh hƣởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm ........ 42

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 44

3.1. Xác định Phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp cho các dòng Keo lai

nghiên cứu ................................................................................................... 44

3.2. Xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho Keo lai .............................. 48

3.3. Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi Keo lai ..................... 50

3.4. Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi cho Keo lai ............... 52

3.5. Tối ƣu hóa phƣơng pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng ..................... 55

3.5.1. Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp .............................................. 55

3.5.2. Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai ............ 56

3.6. Xác định môi trƣờng ra rễ cho Keo lai ................................................ 58

3.7. Xác định thời gian huấn luyện cây thích hợp ...................................... 62

3.8. Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô ...................... 63

3.9. Xây dựng quy trình nhân giống cho các dòng Keo lai nghiên cứu ..... 65

3.9.1. Mục tiêu quy trình ............................................................................. 66

3

3.9.2. Phạm vi áp dụng ................................................................................ 66

3.9.3. Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình .......................................... 66

3.9.3.1. Điều kiện khí hậu ........................................................................... 66

3.9.3.2. Nguồn giống ................................................................................... 66

3.9.3.3. Điều kiện nhân lực ......................................................................... 66

3.9.3.4. Cơ sở vật chất ................................................................................. 66

3.9.4. Nội dung quy trình ............................................................................ 67

3.9.4.1. Khử trùng mẫu ............................................................................... 67

3.9.4.2. Nhân tạo mẫu ................................................................................. 67

3.9.4.3. Nhân nhanh .................................................................................... 68

3.9.4.4. Nâng cao chất lƣợng chồi .............................................................. 68

3.9.4.5. Cho ra rễ ......................................................................................... 68

3.9.4.6. Huấn luyện cây ............................................................................... 68

3.9.4.7. Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất: ..................................................... 69

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 70

4.1. Kết luận ................................................................................................ 70

4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 72

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 78

4

MỞ ĐẦU

Giống Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tƣợng và Keo lá tràm (thƣờng

đƣợc gọi tắt là Keo lai) đã đƣợc ghi nhận là có nhiều đặc điểm ƣu việt hơn so

với 2 loài bố mẹ nhƣ: sinh trƣởng nhanh, thích ứng đƣợc trên nhiều dạng lập

địa và kháng sâu bệnh. Từ năm 1991, các dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát

hiện, nghiên cứu chọn lọc và đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Ở nƣớc

ta đến nay đã có trên 600.000 ha rừng Keo lai đã đƣợc trồng, trong đó nhu cầu

diện tích trồng rừng hàng năm của Keo lai đƣợc dự đoán từ 20.000 - 30.000

ha. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân mà cho đến nay mới chỉ có khoảng 10

dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Mặt khác,

rừng trồng các loài Keo nhiệt đới (bao gồm Keo lai và Keo tai tƣợng) gần đây

đƣợc ghi nhận là bị ảnh hƣởng nặng nề bởi nấm bệnh cũng nhƣ điều kiện bất

lợi của môi trƣờng và biến đổi khí hậu. Vì vậy, công tác chọn giống Keo lai

cần đƣợc liên tục tiến hành để vừa chọn tạo đƣợc các giống mới có năng suất,

chất lƣợng cao vừa đảm bảo đƣợc tính an toàn sinh học cho rừng trồng.

Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính Keo lai gần đây đã chọn đƣợc các

dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 là những dòng triển vọng và đã đƣợc

công nhận là giống Tiến bộ kỹ thuật nhằm đƣa các giống này vào sản xuất.

Để phát triển các giống này vào sản xuất thì việc nghiên cứu nhân giống bằng

phƣơng pháp nuôi cấy mô là hƣớng đi hiệu quả nhất. Mặc dù vậy, quy trình

nhân giống bằng nuôi cấy mô cho Keo lai trƣớc đây mặc dù đã đƣợc áp dụng

rộng rãi, nhƣng lại không thể áp dụng hoàn toàn cho các giống mới chọn lọc

này do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các

kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trƣờng nên trong cùng

một loài, với các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau

cho dù là cùng loài (do đặc điểm về mặt di truyền không đồng nhất), mặt khác

các công trình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào cho các dòng Keo lai mới

chọn tạo chƣa có. Do đó, xác định và tối ƣu hóa phƣơng pháp nhân giống cho

3 dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô là

cần thiết và có ý nghĩa trong việc phát triển nhanh các giống có năng suất cao

này vào trồng rừng sản xuất.

5

Trên cở sở đó đề tài: ―Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng

suất cao BV376, BV586 và BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào‖

đã đƣợc tiến hành nhằm đáp ứng yêu cầu thiết yếu của thực tiễn sản xuất.

6

1. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN

GIỐNG CÂY RỪNG

1.1.1. Trên thế giới

Nuôi cấy mô tế bào là phƣơng pháp nhân giống đƣợc thực hiện bằng

nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trƣờng dinh dƣỡng đặc

biệt hoàn toàn vô trùng và đƣợc kiểm soát. Vì vật liệu nuôi cấy thƣờng rất nhỏ

và thực hiện trong môi trƣờng nhân tạo nên phƣơng pháp nhân giống này còn

đƣợc gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống in vitro. Nuôi

cấy mô tế bào thực vật gồm: nuôi cấy callus, nuôi cấy dịch huyền phù tế bào,

nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy phôi, nuôi cấy các cơ quan (đỉnh sinh trƣởng, rễ,

lá, bao phấn, ...) [1].

Nuôi cấy in vitro đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất

thƣơng mại ở nhiều nƣớc trên thế giới (Thụy Điển, Braxin, Australia,Trung

Quốc, Malaysia, Thái Lan, Ấn Độ, ...) và đã thu đƣợc những thành công đáng

kể, đây là khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới

trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi

cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các

loài Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea abies),

Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus

caribaea) và Thông lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Australia… [2].

Ở Thụy Điển vào cuối năm 1980 công ty Hilleshoge đã nhân giống cây

Vân sam (Picea abies) với số lƣợng 3 triệu cây/năm. Số lƣợng các loài Bạch

đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng,

đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy thành

công. Các nhà khoa học ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây

trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E.

torelliana. Cây mô có nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần

và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ [3].

7

Tại Australia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho

các cây đƣợc chọn lọc cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc đƣa vào sản

xuất trên quy mô lớn cho loài Bạch đàn trắng (E. camandulensis).

Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây

trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. tereticornis, E. globulus, E.

torelliana. Tại Australia, nhân giống nuôi cấy mô đã đƣợc áp dụng để nhân

nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc sản

xuất với quy mô lớn cho loài E. camandulensis [3].

Trung Quốc là nƣớc có nhiều thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mô

cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ đƣợc nuôi cấy

nhƣ Dƣơng, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (Hông). Đến năm 1991 ở vùng Nam

Trung Quốc, ngƣời ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai

của một số loài cây trồng rừng chủ yếu đã đƣợc chọn lọc qua khảo nghiệm.

Những cây mô này đƣợc dùng nhƣ là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các

vƣờn ƣơm địa phƣơng hoặc dùng thẳng vào trồng rừng [3].

Cho tới năm 1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55

loài trong tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm. Công nghệ này cho phép nhân

nhanh loài Tre mạnh tông Dendrocalamus asper với số lƣợng khoảng 1 triệu

cây mỗi năm đáp ứng đƣợc nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng (dẫn theo

Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4].

Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc

áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng

rừng dòng vô tính. Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là:

Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài cây lá kim đƣợc nghiên

cứu nuôi cấy mô và đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong đó phải kể

đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách

xanh… Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có 4 loài đƣợc đƣa

vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempvirens) ở Pháp,

Thông ra-đi-a-ta (P. radiate) ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan;

Thông P. taera và P. seudotsuga menziesii ở Mỹ [3].

8

Gupta và các cộng sự đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của

cây non và từ mầm cây Tếch 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo đƣợc 500 cây nuôi

cấy mô từ một chồi ở cây trƣởng thành và 3.000 cây từ 1 cây non trong một

năm. Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986

cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm [5].

Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã đƣợc thử nghiệm nhân giống thành

công bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhƣ: Acer, Beluta, Fagus, Quercus,

Carpinus... Các cây mô đã đƣợc trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy

chúng có kiểu hình tƣơng đối giống nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây

đƣợc huấn luyện là khá cao có thể đạt 90% đến 100% cho một số loài (Dẫn

theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn) [4].

Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc áp dụng

nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng rừng

dòng vô tính. Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là Pinus

nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim

đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong

đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria) Liễu sam (Cryptomeria

japonica) Bách xanh. Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có

bốn loài đƣợc đƣa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia

sempevirens) ở Pháp; Thông P. radiate ở Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New

Dilân; Thông P. taeda và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ [3].

Ngƣời ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi

cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang

đƣợc áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trƣởng nhanh, kháng bệnh và cố

định đạm cao cho trồng rừng [3].

Số lƣợng các loài Bạch đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp

nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, báo cáo của McComb và Bennett (1986) cho

biết đã có trên 38 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy mô thành công từ

năm 1963, tiêu biểu là các công trình của Cresswell và Fossard (1974),

Cresswell và Nitsch (1975), Durnad – Cresswell và Nitsch (1977), Furze và

Cresswell (1985), Rao và Venkateswara (1985), Lakshmi Sita (1986), Warrag

9

và cộng sự (1987), (Warrag, và cộng sự, 1990). Các nhà khoa học Ấn Độ

thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus

camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana và cả từ các cây trội

có hàm lƣợng tinh dầu cao của bạch đàn chanh E. Citriodora [3]. Cây mô có

nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây

mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Tại Autralia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp

dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và

đang đƣợc đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn cho loài E. camaldulensis [6].

Năm 1983, Gupta và cộng sự đã báo cáo rằng các chồi E. torelliana và

E. camaldulensis đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung Kn, BAP,

Cal.Pan và Biotin. NAA ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của E. torelliana trong

khi, với E. camaldulensis, IAA, IBA, IPA và NAA đều cho hiệu quả ra rễ.

Tác giả cũng đề cập đến vai trò thúc đẩy quá trình ra rễ in vitro của than hoạt

tính đối với 2 loài cây này. Kết quả là từ 1 đoạn chồi của cây trƣởng thành,

sau 1 năm đã tạo ra đƣợc 50.000 cây con in vitro E. torelliana và 20.000 cây

con đối với E. camaldulensis [6, 7].

Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của ánh sáng đến kết quả nuôi cấy mô bạch

đàn Eucalyptus tereticornis của nhóm tác giả Das và Mitra (1990) cho thấy

không có chồi ra rễ trừ khi các chồi in vitro Eucalyptus tereticornis đƣợc

chuyển ra ngoài ánh sáng sau giai đoạn ủ tối [7]. Nghiên cứu của Warrag và

cộng sự (1990) đã chỉ ra khoảng thời gian ủ tối 4 tuần đã thúc đẩy sự hình

thành mô sẹo ở Bạch đàn lai [8].

Mullin và cộng sự (1997) đã thành công trong việc tái sinh chồi từ lá

cây Bạch đàn E. camaldulensis, môi trƣờng đƣợc tác giả sử dụng là môi

trƣờng cải tiến từ môi trƣờng của Muralidharan và Mascarenhas (1987) có bổ

sung 1,0 g/l Casein, 16,2 µmol/l NAA, 0,44 µmol/l BAP, 50g/l đƣờng và

0,5% Phytagar (dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9].. Theo Ho và

cộng sự (1998), môi trƣờng MS bổ sung 16,2 µmol/l NAA và 4,44 µmol/l 6-

BAP có thể kích thích tạo mô sẹo và tái sinh chồi ở Bạch đàn E.

camaldulensis [10]

10

Đến năm 2000, cũng nghiên cứu trên cùng đối tƣợng là cây Eucalyptus

tereticornis, Sharma và cộng sự [11] lại thu đƣợc kết quả đối lập với kết quả của

Das và Mitra (1990) khi quan sát thấy xuất hiện sự hình thành rễ từ các chồi khi

ủ mẫu trong thời gian dài từ 8-10 ngày. Cùng thời gian này, Arezki và cộng sự

đã tiến hành nuôi cấy mô phân sinh của Bạch đàn Caman trong môi trƣờng

MS bổ sung 5 µmol/l IBA, 30 g/l đƣờng, 0,5% agar và 0,2% than hoạt tính.

(dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9]. Báo cáo của González và

cộng sự (2002) đã nhấn mạnh tỷ lệ mô sẹo hình thành từ lá mầm của Bạch

đàn lai E. grandis x E. urophylla là cao nhất khi ở chế độ ủ tối 30 ngày [12].

Joshi và cộng sự (2003) đã nuôi cấy mô từ chồi nách của cây mẹ trƣởng

thành dòng FRI-6 Bạch đàn lai E. tereticornis x E. grandis. Môi trƣờng nhân

chồi MS bổ sung 1,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA sau 150 ngày nuôi cấy, từ 1

chồi ban đầu có thể nhân ra đƣợc 20 - 25 chồi. 1/2MS là môi trƣờng tạo chồi

đủ tiêu chuẩn ra rễ mà nhóm tác giả đã xác định đƣợc, môi trƣờng này tạo

đƣợc 30 - 35 chồi/cụm, chiều dài chồi từ 1,5 - 2,0 cm, chồi xanh, sinh trƣởng,

phát triển tốt. Báo cáo cũng ghi nhận, có 75% chồi ra rễ trong môi trƣờng

1/2MS bổ sung 1,0 mg/l IBA [13].

Roberson Dibax và cộng sự (2005) [12] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của

ánh sáng đến sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi Bạch đàn E. camaldulensis,

kết quả cho thấy, các công thức phối hợp chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc thí

nghiệm có tỷ lệ phần trăm chồi hình thành từ mô sẹo là đạt cao nhất (90,2%)

với tất cả các nồng độ NAA khi ủ mẫu trong tối 30 ngày. Cũng theo tác giả, ở

chế độ này tỷ lệ mẫu bị hoại tử đã giảm đi đáng kể. Kết quả này cũng trùng lặp

với kết quả nghiên cứu trên Bạch đàn E. grandis của tác giả Laine và David

(1994) [14]. Trong báo cáo, Roberson Dibax và cộng sự cũng đƣa ra môi

trƣờng nhân nhanh chồi cho Bạch đàn Caman là MS bổ sung 2,7µmol/l NAA

và 4,44 µmol/l BAP, sau 30 ngày nuôi cấy thu đƣợc 11,8 chồi/cụm. Môi trƣờng

nâng cao chất lƣợng chồi và ra rễ là 1/2MS bổ sung 0,2% than hoạt tính sẽ tạo

ra các chồi non cao 1 - 8 cm, lá xanh thẫm; sau 10 - 15 ngày tỷ lệ ra rễ là 80%,

có 8 rễ/cây, cây cao từ 2 - 4 cm [15].

11

Năm 2007, Sotelo M và Monza J đã nuôi cấy mô cho E. maidenii từ

các đoạn chồi 50 x 3 cm, mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt bằng xà phòng và

dung dịch Benlate (2g/l ) và dung dịch Captan (2g/l) trong thời gian 60 phút

và dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl2) 0,1% trong 5 phút sau đó tráng

sạch 3 lần với nƣớc và ngâm trong Polyvinil pirrilidona (PVP) 1,5 g/l trong

vòng 60 phút ở 40C. Tác giả ghi nhận môi trƣờng nhân nhanh chồi cho E.

maidenii là QL (môi trƣờng do Quoirin và Lepoivre, 1977) đƣợc bổ sung 0,2

mg/l BAP và 0,02 mg/l IBA. Để nâng cao chất lƣợng chồi, nhóm tác giả đã

nghiên cứu hiệu quả của Cytokinin và Auxin khi kết hợp cùng nhau trong môi

trƣờng nuôi cấy, đồng thời nghiên cứu hiệu quả tăng chiều cao chồi nhờ GA3.

Kết quả cho thấy, môi trƣờng phù hợp là QL bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,5 mg/l

IBA cho 4 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình trên 2 cm. Đặc biệt, tác giả

còn nghiên cứu ảnh hƣởng của auxin và chế độ ánh sáng đến khả năng ra rễ

của các dòng Bạch đàn, kết quả chỉ ra rằng môi trƣờng 1/4QL bổ sung 10mg/l

Thiamine và 2mg/l IB, ủ tối 7 ngày là công thức ra rễ tốt nhất [16].

Trong báo cáo về ra rễ in vitro cho Bạch đàn lai E. urophylla x E.

grandis, Sophie Nourissier và cộng sự (2008) cũng đƣa ra nhận định, chế độ

ánh sáng ảnh hƣởng tới việc kéo dài chồi và ra rễ. Tỷ lệ ra rễ của Bạch đàn lai

E. urophylla x E. grandis đạt tới 81% khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng

1/2MS có bổ sung 5 μM IBA và 12.5 μM NAA [17].

Năm 2012, Girijashankar đã lấy các đoạn chồi từ cây mẹ 18 tháng tuổi

Bạch đàn E. camaldulensis để khử trùng. Mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt với

3 công thức: công thức 1 - dùng cồn 70% trong thời gian 1 phút; công thức 2 -

ngâm trong NaOCl2 1% có bổ sung 1 vài giọt Tween trong thời gian 15 phút,

sau đó tráng với 3 lần nƣớc sạch; công thức 3 - ngâm mẫu trong HgCl2 0,1%.

Kết quả cho thấy, sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 – 15 phút làm mẫu

bị hóa nâu, bị hoại tử và thậm chí bị chết. Sử dụng NaOCl2 trong thời gian 15

– 17 phút giúp giảm số lƣợng mẫu nhiễm tƣơng tự nhƣ khi sử dụng HgCl2

0,1% nhƣng phƣơng pháp này lại không làm tổn thƣơng mẫu. Môi trƣờng

nhân nhanh chồi đƣợc xác định là MS bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l

NAA cho 6,3 chồi/cụm. Môi trƣờng 1/2MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số

12

lƣợng chồi tăng lên 3 lần, chiều dài chồi trên 2 cm. Môi trƣờng 1/2MS bổ

sung 1 mg/l IBA cho 60% chồi ra rễ, có 2 - 8 rễ/cây, rễ dài 2 - 7 cm [6].

Khi nghiên cứu nuôi cấy mô cho Bạch đàn lai HFRI-5 (E.

camaldulensis Dehn x E. tereticornis Sm), Natasha Mahajan và cộng sự

(2012) đã thực hiện trên chồi đỉnh, chồi cành và lá cây mẹ 4 - 8 tuổi. Vật liệu

đƣợc rửa dƣới vòi nƣớc chảy từ 1 – 2 h với một vài giọt Tween 20, sau đó

đƣợc khử trùng bề mặt bằng cách lắc trong cồn 70% trong thời gian 30 giây,

tiếp theo vật liệu đƣợc ngâm trong HgCl2 trong 2 phút. Kết quả cho thấy việc

bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy MS với 10%

nƣớc dừa và 500 mg/l PVP có ảnh hƣởng lớn tới khả năng nhân chồi Bạch

đàn lai. Nồng độ 3,0 mg/l BAP là nồng độ thích hợp để nhân nhanh lƣợng

chồi bạch đàn, trong khi đó, không có chồi nào đƣợc tạo thành khi ở nồng độ

BAP nhỏ hơn 3,0 mg/l và ở nồng độ lớn hơn 5,0 mg/l. Tác giả cũng khẳng

định chế độ ánh sáng là nhân tố vô cùng quan trọng đối với sự tái sinh chồi ở

Bạch đàn [18].

Có thể nói nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cho các loài

cây nông lâm nghiệp đang đƣợc áp dụng trên quy mô lớn ở nhiều nƣớc trên

thế giới. Đối với ngành lâm nghiệp nƣớc ta, đây là phƣơng pháp tối ƣu để đƣa

nhanh các giống mới chọn lọc vào trồng rừng sản xuất.

1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống

cây rừng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô đƣợc phát triển từ những năm 70 và đã đƣợc

một số đơn vị nhƣ: Trƣờng Đại học Nông Nghiệp, Viện CNSH, Viện KHKT

NN, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Trung tâm Nghiên cứu

Giống cây rừng (nay là Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm

nghiệp), ... nghiên cứu ứng dụng thành công cho nhiều loài cây trồng nông

lâm nghiệp. Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy

mô lớn trong lâm nghiệp nƣớc ta là Công ty Giống lâm nghiệp Trung ƣơng,

Trung tâm Khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, Xí nghiệp giống

Thành Phố Hồ Chí Minh, Công ty CP Giống cây trồng Nguyên Hạnh, Công

13

ty Lâm nghiệp Quy Nhơn, Công ty Lâm nghiệp Tiền Phong… [4]. Hiện nay

một số tỉnh và địa phƣơng đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho

công tác giống cây trồng và đã đạt đƣợc những thành công đáng kể, góp phần

không nhỏ trong việc phát triển trồng rừng dòng vô tính ở nƣớc ta.

Trồng rừng bằng cây từ nuôi cấy mô hoặc cây hom lấy từ dòng mẹ vô

tính tốt nhất của cây lai đời F1 (đã qua chọn lọc và đánh giá) thì rừng trồng

vừa sinh trƣởng nhanh vừa khá đồng đều. Chính vì thế trong công văn số 268

BNN- KHCN ngày 13/01/1998, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã

khuyến cáo các đơn vị không dùng hạt Keo lai để gây trồng rừng sản xuất mà

nên dùng dòng vô tính Keo lai đã đƣợc khảo nghiệm và đánh giá để gây trồng

rừng [19].

Dƣơng Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho 2 loài

Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và bạch đàn nâu (E. urophylla) từ cây trội

của 2 loài này đã tạo đƣợc một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2

lần [20].

Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho giống lai của Bạch đàn trắng đã

đƣợc Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1997) thực hiện thành công từ năm 1993

thấy rằng dùng BAP thêm vào môi trƣờng MS có thể tạo đƣợc 20-30 chồi/mẫu.

Môi trƣờng MS + IBA có thể đạt tỉ lệ ra rễ 80%. Tuy nhiên chất lƣợng các chồi

thu đƣợc chƣa cao, tỷ lệ sống cây con ngoài vƣờn ƣơm chƣa đáp ứng đƣợc yêu

cầu sản xuất (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4].

Thông qua chƣơng trình hợp tác với Trung Quốc một số dòng Bạch đàn

có năng suất cao: U6, U16 và công nghệ nhân giống đã đƣợc chuyển giao cho

các đơn vị trong nƣớc nhƣ: Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy, Trung tâm

Nghiên cứu Giống cây rừng, Trung tâm ứng dụng KHSX nông lâm nghiệp

Quảng Ninh, Xí nghiệp giống lâm nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, sau đó các

nghiên cứu nhân giống cho cây lâm nghiệp đã đƣợc nhiều đơn vị tiến hành.

Mai Đình Hồng (1995) đã đƣa ra môi trƣờng nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn

dòng U6 là: môi trƣờng nhân chồi (MS + 3% đƣờng + 4,5 g/l agar + 0,5 mg/l

BAP + 0,25 mg/l NAA), môi trƣờng tạo rễ (1/4 MS + 1,5 % đƣờng + 5g/l agar

14

+ 1mg/l IBA) (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2000) [21].

Kết quả nghiên cứu nhân giống thông qua hệ thống tái sinh mô sẹo phôi

hóa và nhân chồi in vitro cho Bạch đàn của Chu Bá Phúc, Đỗ Năng Vịnh,

Phạm Thị Kim Hạnh và cộng sự (2003) cho thấy môi trƣờng thích hợp để tạo

callus từ lá non của cây nuôi cấy mô đối với Bạch đàn là MS + 0,5mg/l BAP +

1,5mg/l 2,4-D, callus có chất lƣợng tốt, thích hợp cho tái sinh phôi, tỷ lệ callus

đạt 87,50%. Callus tạo ra từ đoạn thân cây non nuôi cấy mô của cây Bạch đàn

đều có tỷ lệ % thấp hơn so với tỷ lệ callus tạo ra từ mô lá non. Khả năng nhân

chồi Bạch đàn 5,20 lần ở môi trƣờng MS + 1,0mg/l BAP + 0,2mg/l Kinetin sau

20 ngày cấy chuyển.

Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000, 2011) đã nghiên cứu nuôi cấy mô

thành công cho giống Bạch đàn lai U29C3. Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị

nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng 5-8. Môi trƣờng MS có

bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6

chồi/cụm). Môi trƣờng ra rễ thích hợp là môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l

IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8 % [21,4].

Nghiên cứu nhân giống cho một số giống cây rừng nhƣ Trầm dó, Tre

tàu và Tre mạnh tông cũng đã đƣợc thực hiện và cho kết quả khích lệ [22,23].

Đoàn Thị Nga, Mai Đình Hồng thuộc Viện nghiên cứu Cây nguyên liệu

giấy Phù Ninh - Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng U6 và

PN2. Tác giả cho rằng, môi trƣờng thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5mg/l

BAP + 0,25 mg/l NAA. Môi trƣờng ra rễ tối ƣu là 1/4 MS + 1mg/l IBA (Dãn

theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2003) [22].

Đoàn Thị Mai, Lê Sơn và các cộng sự đã đƣa ra môi trƣờng nuôi cấy

mô cho cây Bạch đàn dòng UE35 hoá chất khử trùng thích hợp là chất kháng

sinh với nồng độ 4,5mg/l trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và

PN3D là mẫu bật chồi đạt 17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian

là 12 phút. Môi trƣờng nhân chồi thích hợp là môi trƣờng MS cải tiến (kí hiệu

MS*) + BAP 0,5mg/l + NAA 0,3mg/l + các phụ gia khác [4].

15

Đối với các loài cây thân gỗ, có thể kể đến các công trình nhân giống in

vitro cây Cà phê của Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự (1987); cây Điều

Anacardium occidentale L. của Vũ Ngọc Phƣợng và cộng sự (2003); cây Ba

kích Morinda officinalis How của Vũ Hoài Sâm và cộng sự (giai đoạn 2001 -

2005); cây Tre tàu Sinocalamus latiflorus và Tre mạnh tông Dendrocalamus

asper của Vũ Ngọc Phƣợng và cộng sự (2002); cây Tếch của Trần Văn Minh và

Bùi Thị Tƣờng Thu (2003); Thông Caribe Pinus caribaea của Trần Trung Hiếu

và cộng sự (2002 - 2003); cây Tếch, Trầm, Thông, Hông, Bạch đàn của Chu Bá

Phúc, Đỗ Năng Vịnh và cộng sự (2003); cây Trầm của Đoàn Thị Mai và cộng

sự (2005); cây Hông Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (2005); Lát hoa Đoàn

Thị Mai và cộng sự (2006 - 2010) (Dẫn theo Đoàn Thị Mai, Lê Sơn và cộng

sự) [4].

Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô cho cây rừng ở nƣớc

ta là tƣơng đối đa dạng. Các kết quả này không những mang ý nghĩa khoa học

mà còn mang tính thực tiễn rất cao trong việc phát triển các giống cây rừng

mới đƣợc chọn lọc trong sản xuất. Hiện nay, nhu cầu về cây giống từ nuôi cấy

mô cho trồng rừng dòng vô tính ở nƣớc ta lên tới khoảng 50 triệu cây/năm,

theo chƣơng trình phát triển trồng rừng kinh tế của Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn với mục tiêu sử dụng 10% cây giống vô tính trong trồng rừng

sản xuất (chủ yếu là nuôi cấy mô) thì số lƣợng cây giống cần thiết là khoảng

80 triệu cây/năm thì việc nghiên cứu nhân giống cho các giống cây rừng đã

đƣợc cải thiện về di truyền sẽ là hƣớng đi có ý nghiã lớn trong việc nâng cao

năng suất, chất lƣợng rừng trồng từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế của trồng

rừng, từ đó góp phần cải thiện cuộc sống của ngƣời làm nghề rừng [24].

1.2. KHÁI NIỆM VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP NUÔI

CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1. Khái niệm

Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (propagation by tissue

culture) hay vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các

phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ đƣợc tách khỏi cây đang

16

đƣợc dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các

bộ phận đƣợc dùng để nuôi cấy có thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh,

bao phấn, phôi và các bộ phận khác nhƣ vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl)

... [1].

Phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào thƣờng dùng gồm các phƣơng pháp

sau: nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào,

nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần, nuôi cấy

phôi hữu tính và vô tính. Trong đó, nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định

[2] là những phƣơng pháp chính đƣợc dùng trong nhân giống cây rừng.

Nuôi cấy mô thƣờng đƣợc trẻ hoá cao độ và có rễ giống nhƣ cây mọc từ

hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Ví dụ: cây

mô Keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng nhƣ các loài cây bố mẹ là Keo tai

tƣợng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá

giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc nhƣ những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây

hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trƣởng thành và không có rễ

cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế, còn tính bảo lƣu cục bộ thì biểu hiện rõ

rệt) [24]. Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ

hạt, Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây

mô, cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành và cây ghép của cây Bulô

(Betula sp.). Kết quả cho thấy, sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng

protein giống nhƣ cây mọc từ hạt, sau 4-8 tháng lại giống với cây trƣởng

thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành sau 4-8

tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải

sau 8 năm mới có hoa [25]. Điều đó chứng tỏ cây nuôi cấy mô tuy có mức độ

trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành (chứ

không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không thể trẻ nhƣ cây mọc từ

hạt.

17

1.2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào

1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật

Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng

của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ

lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ

gen (genom). Đặc tính của thực vật đƣợc thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong

từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di

truyền tƣơng ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp,

trong mối tƣơng tác qua lại với điều kiện môi trƣờng, cơ quan, mô hoặc tế bào

đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di

truyền giống nhƣ cây mẹ [29].

1.2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và

phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống

nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế

bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có đƣợc cấu

trúc chuyên môn hoá nhất định nhờ vào sự phân hoá.

Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào

của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể.

Quá trình phân hoá có thể diễn nhƣ sau:

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hoá chức năng

Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn

mất khả năng phân chia của mình. Trong trƣờng hợp cần thiết, ở điều kiện

thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống nhƣ tế bào phôi sinh và tiếp tục

thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế

bào.

18

Hình 1.1. Quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá

phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có

một số gen đƣợc hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức

chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa

trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp

điều kiện bất lợi thì các gen đƣợc hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ đƣợc xảy ra

theo một chƣơng trình đã định sẵn trong ADN của tế bào [26].

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô- tế bào thực chất là kết

quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế

bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào

thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách

định hƣớng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính

toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô

nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất

điều tiết sinh trƣởng thực vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lƣợng hai

nhóm chất này trong môi trƣờng khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái

khác nhau. Trong môi trƣờng nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA,

NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh

hình thái của mô nuôi cấy theo hƣớng tạo chồi, ngƣợc lại nếu tỷ lệ cao thì mô

nuôi cấy sẽ theo hƣớng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hƣớng tạo

mô sẹo (callus) [1].

Tế bào phôi sinh

Phân hóa tế bào

Tế bào chuyên hóa Tế bào giãn

Phản phân hóa

19

1.3. CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI

CẤY MÔ TẾ BÀO

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau,

quá trình này thƣờng bị ảnh hƣởng bởi các nhân tố sau:

1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy

1.3.1.1. Môi trường hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy đƣợc coi là

các yếu tố chính quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy. Môi

trƣờng nuôi cấy chính là nguồn cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự

tăng trƣởng và phân hoá mô nuôi cấy in vitro. Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm

thành phần sau:

+ Nguồn các bon: là nguồn cung cấp năng lƣợng chính cho các mẫu vật

nuôi cấy. Do trong giai đoạn này chúng chƣa có khả năng quang hợp để tổng

hợp nên chất hữu cơ phục vụ cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của

mình. Nguồn cácbon thƣờng đƣợc sử dụng là các loại đƣờng (chủ yếu là

saccarose và glucose) với nồng độ khoảng 20-30 mg/l. Nó có tác dụng giúp

mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, tăng sinh khối, ngoài ra nó

còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trƣờng [27].

+ Nguồn Nitơ: Thông thƣờng, nguồn nitơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở

hai dạng là HN4+ và NO3

- (nitrat) với tỷ lệ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái

phát triển mô. Qúa trình hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật có hiệu quả hơn

so với NH4+ [26].

+ Các nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này có chức năng cung cấp

nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc

giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trƣờng đƣợc

thuận lợi. Các nguyên tố đa lƣợng chính là những nguyên tố khoáng nhƣ: N,

P, K, S, Mg, Ca…. Nhìn chung, các nguyên tố này đƣợc sử dụng ở nồng độ

khá cao (trên 30 ppm) [26].

20

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: gồm các nguyên tố Fe, Cu, BO, Zn, Mn,

Co, I… đây là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát

triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động

của enzym. Chúng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố

đa lƣợng để đảm bảo sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của cây [28].

+ Các vitamin: Mặc dù mẫu vật nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp đƣợc

các Vitamin cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển, nhƣng sự đáp

ứng là chƣa đủ cho nhu cầu vì các mẫu đƣợc nuôi cấy mô thƣờng có sinh

trƣởng nhanh nên nhu cầu về dinh dƣỡng là khá lớn. Các Vitamin B1 và B6 là

những Vitamin cơ bản nhất thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy với nồng

độ thấp khoảng 0,1-1mg/l [29].

+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch

chiết nấm men, cà rốt, chuối, khoai tây... đƣợc bổ sung vào môi trƣờng có tác

dụng kích thích sinh trƣởng mô sẹo và các cơ quan. Nƣớc dừa đã đƣợc sử

dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong các

môi trƣờng nhân nhanh in vitro. Trong nƣớc dừa thƣờng chứa các axit amin,

acid hữu cơ, đƣờng, ARN và ADN. Đặc biệt trong nƣớc dừa còn có chứa

những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô nhƣ: Myo Inositol, các hợp chất

có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin [27].

+ Chất làm đông cứng môi trường (giá thể trong nuôi cấy): Agar

(thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm nƣớc khá cao 6-

12g/l. Độ thoáng khí của môi trƣờng thạch có ảnh hƣởng rõ rệt đến sinh

trƣởng mô nuôi cấy. Trong nhân giống cho các đối tƣợng cây rừng, nồng độ

thạch dao động trong khoảng 4-8g/l tuỳ thuộc mục tiêu và đối tƣợng nuôi cấy

nuôi cấy [28].

+ Các chất điều hoà sinh trƣởng

Sinh trƣởng và phát triển của cây đƣợc đảm bảo bởi hai cơ chế sinh lý

trái ngƣợc nhau, tác nhân kích thích và tác nhân ức chế. Việc cân bằng giữa

các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng có ý nghĩa

quyết định trong việc điều hòa sự sinh trƣởng của cây [29].

21

Các Phytohormon là những chất điều hòa sinh trƣởng lá các chất có bản

chất hóa học khác rất khác nhau, nhƣng có cùng chức năng điều khiển sinh

trƣởng và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá

trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật nhƣ: phân chia, biệt hoá tế bào…

ngoài ra còn có ảnh hƣởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác.

Các phytohormon thƣờng sử dụng cho nuôi cấy mô thuộc 3 nhóm: Auxin,

Cytokinin và Giberillin. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trƣờng

quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy.

* Auxin: là một loại phytohormon có khả năng kích thích sự phân chia

mạnh mẽ của tế bào, giúp cây phát triển chiều ngang và kích thích sự ra rễ ở

thực vật nhƣng lại kìm hãm sự phát triển của chồi phụ. Nhóm này gồm có các

chất chính là: IBA (3-Indol Butyric Acid), IAA (Indol Acetic Acid), NAA

(Nathyl Acetic Acid) … trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thƣờng đƣợc sử dụng

để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự

phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [1, 27].

* Cytokinin: đƣợc phát hiện sau GA và Auxin. Đây là một loại

phytohormon có tác dụng thúc đẩy sự phân chia tế bào, tạo chồi, rễ phụ; làm

chậm sự lão hóa của lá, tăng cƣờng các chất dinh dƣỡng về phía các bộ phận

đang phát triển. Các cytokinin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng chủ yếu để kích

thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo

và cơ quan. Các hợp chất thƣờng sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl Amino

Purine - C10H9N05), BAP (6-Benzyl Amino Purine), Zip (Izopentenyl

Adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kenitin và BAP đƣợc sử dụng phổ

biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ. Ngƣời ta cũng chứng

minh đƣợc tỉ lệ về hàm lƣợng auxin/cytokinin đóng vai trò quyết định trong

việc phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Để tạo rễ thì tỉ lệ này cần lớn hơn một,

nếu nhỏ hơn 1 mô sẽ biệt hóa theo hƣớng tạo chồi. Còn nếu tỉ lệ

auxin/cytokinin gần bằng 1 thì mẫu nuôi cây sẽ biệt hóa tạo mô sẹo [1, 27].

* Gibberellin: Nhóm này có khoảng 50 loại hormone khác nhau nhƣng

quan trọng nhất là GA3 (Gibberellin Acid 3). GA3 có tác dụng kích thích nảy

mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó

22

GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng nhƣ tạo

chồi phụ [1, 27]. Ngoài ra, nó còn có tác dụng ảnh hƣởng đến sự ra hoa của

một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trƣởng dinh dƣỡng của

cây.

Ngoài ra, độ pH của môi trƣờng có ảnh hƣởng khá rõ nét tới khả năng

hoà tan các chất khoáng trong môi trƣờng. Nếu pH thấp (<4,5) hoặc cao

(>7,0) đều gây ức chế sinh trƣởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro.

Nên việc xác định đƣợc độ pH ban đầu của môi trƣờng cho quá trình sinh

trƣởng và phát triển của mô cấy là cần thiết. Độ pH thƣờng đƣợc sử dụng

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6.

Các yếu tố khác cũng cần đƣợc chú ý khác trong nuôi cấy in vitro là: sự

ổn định của môi trƣờng và khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của cây.

1.3.1.2. Môi trường vật lý

Sự sinh trƣởng và phát triển của các tế bào, mô đƣợc điều khiển bởi sự

kết hợp giữa điều kiện vật lý trong phòng và điều kiện dinh dƣỡng trong ống

nghiệm. Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trƣờng vật lý đƣợc

quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.

+ Ánh sáng: là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái

của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hƣởng tới mẫu cấy thông qua thời gian

chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng [27].

Chu kỳ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng cũng phải phù hợp với đặc

tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng biến

động từ 8 − 12 h/ngày.

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng thì chất lƣợng ánh

sáng cũng ảnh hƣởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh

sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh

sáng xanh thì ức chế sự vƣơn cao của chồi nhƣng lại có ảnh hƣởng tốt tới sự

sinh trƣởng của mô sẹo.

+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tƣơng đối luôn bằng 100%

nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.

23

+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hƣởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và

các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hƣởng tới sự

hoạt động của Auxin, do đó làm ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của cây mô.

Theo kết quả nghiên cứu của Von Arnold (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là

200C/15

0C hoặc 20

0C/18

0C tỷ lệ ra rễ đạt đƣợc khoảng 33%, thậm chí còn

thấp hơn [30]. Ở nhiệt độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở

nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô,

nhiệt độ thƣờng đƣợc duy trì ổn định, ban ngày từ 25 - 300C và ban đêm từ

17- 200C.

1.3.2. Vật liệu nuôi cấy

Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành công của quá

trình nhân giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá

đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công. Tuy nhiên, thực

tế nghiên cứu cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ

nuôi cấy thành công khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế

bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành

công càng cao. Nhƣ vậy, tế bào và phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế

bào của đỉnh sinh trƣởng nhƣ: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tƣợng

tầng… sau đó là các tế bào sinh dục nhƣ noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai

đoạn non [1].

1.3.3. Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên của quá trình nuôi cấy in vitro. Nếu

điều kiện này không đƣợc đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trƣờng sẽ bị

nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại.

Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô

trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phƣơng pháp khử

trùng mẫu thích hợp, phƣơng tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy

vô trùng. Chọn đƣợc đúng phƣơng pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi

trƣờng dinh dƣỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trƣởng nhanh [29].

Các phƣơng tiện khử trùng chính gồm:

24

Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trƣờng nuôi cấy,

dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nƣớc có áp suất và nhiệt độ cao (1,1 - 1,2

atm, 120 -1300C).

Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy

Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đƣa vào nuôi cấy ngƣời ta

thƣờng sử dụng các dung dịch nhƣ HgCl2 (Clorua thuỷ ngân), NaOCl

(Hypoclorit Natri), Ca(OCl)2 (Hypoclorit Canxi), H2O2 (ôxi già)…cồn

dùng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.

Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng

đƣợc ở nhiệt độ cao nhƣ dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà

sinh trƣởng. Hiện nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng một hệ thống bơm khử

trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy

tế bào trần hay huyền phù tế bào.

Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng

phải đƣợc tiệt trùng liên tục trƣớc và sau khi làm việc bằng Foocmon

kết hợp chiếu đèn tử ngoại.

Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box.

Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng

và thổi không khí vô trùng về phía ngƣời ngồi thao tác.

1.3.4. Buồng nuôi cấy

Buồng cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải

đảm bảo các điều kiện:

- Nhiệt độ 25 – 270C.

- Ánh sáng đạt 2000 – 3000 lux.

- Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài.

25

1.4. NHỮNG VẤN ĐỀ TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO

1.4.1. Sự nhiễm mẫu

Nhiễm là vấn đề rất đƣợc quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực

vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây

nhiễm mẫu nhƣ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, môi trƣờng, dụng cụ và

các thiết bị (màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy)…

Để giảm khả năng nhiễm mẫu bằng cách:

- Có thể sử dụng một số chất kháng sinh (Amphostericin B,

Gentamicin, Penicillin…) để diệt vi khuẩn và nấm.

- Sử dụng mô phân sinh đỉnh sinh trƣởng để nuôi cấy.

1.4.2. Tính bất định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây

trồng đồng nhất với số lƣợng lớn nhƣng phƣơng pháp cũng tạo ra những biến

dị soma qua nuôi cấy mô sẹo… Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không

lặp lại. Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng

bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thƣờng là biến dị về chất lƣợng, số lƣợng

và năng suất nhƣng biến dị này không di truyền [29]. Những nhân tố gây ra

biến dị mẫu vật nuôi cấy mô gồm:

- Kiểu di truyền của mô nuôi cấy: các loài cây khác nhau có tỷ lệ đột

biến khác nhau

- Số lần cấy chuyển: số lần cấy chuyển càng nhiều càng cho độ biến dị

cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài. Số lần cấy chuyển

ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyển ngắn làm giảm sự biến dị.

1.4.3. Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy

Thƣờng chúng ta hay thấy hiện tƣợng hóa nâu hay hóa đen mẫu làm

sinh trƣởng của mẫu bị ngăn chặn. Hiện tƣợng này là do mẫu nuôi cấy có

chứa các hợp chất Tanin hay Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn mô

26

non. Để khắc phục hiện tƣợng này ngƣời ta thƣờng hay áp dụng phƣơng pháp

sau đây:

− Than hoạt tính đƣợc đƣa vào môi trƣờng giúp cản quá trình hóa nâu

hay đen với nồng độ thƣờng dùng 0,1-0,3%.

− Poly Vinyl Pyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thụ

phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loài cây trồng khác

nhau.

− Nuôi cấy mẫu trong môi trƣờng lỏng, oxy thấp, không có ánh sáng

trong 1 - 2 tuần

− Cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trƣờng ngăn chặn quá

trình oxy hóa phenol, chất khử thƣờng đƣợc dùng nhƣ ascorbic acid, citric

acid, L- cystein hydrochloride…

− Sử dụng mẫu nuôi cấy rất non có ít tanin, phenol…

1.4.4. Hiện tƣợng thủy tinh hóa

Trong nuôi cấy mô cũng thƣờng gặp hiện tƣợng này. Khi chuyển ra

khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nƣớc và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này

thƣờng thấy khi nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng hay môi trƣờng bán rắn, đặc

biệt là khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nƣớc tập trung trong cây.

Để hạn chế quá trình thủy tinh hóa có thể sử dụng một số phƣơng pháp

sau:

− Làm giảm ảnh hƣởng của hàm lƣợng nƣớc trong môi trƣờng nuôi cấy

bằng cách tăng nồng độ đƣờng và tạo điều kiện môi trƣờng nuôi cấy (nhiệt

độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp.

− Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy thông qua tạo môi trƣờng nuôi cấy

(thông gió tốt, tăng cƣờng ánh sáng, giảm nhiệt độ phòng cấy) thích hợp.

− Giảm nồng độ chất chứa N trong môi trƣờng nuôi cấy.

− Xử lý Acid Abxixic (ABA) hoặc các chất ức chế sinh trƣởng.

27

1.5. CÁC GIAI ĐOẠN CHÍNH TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG

1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho

các bƣớc tiếp theo. Giai đoạn này coi nhƣ là một bƣớc thuần hoá vật liệu để

nuôi cấy. Cây giống đƣợc đƣa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích

ứng với môi trƣờng mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu

nuôi cấy và chủ động trong công tác nhân giống. Trong trƣờng hợp cần thiết

có thể làm trẻ hoá vật liệu giống.

1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy.

Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong

những điều kiện vô trùng. Ngƣời ta thƣờng dùng một hoá chất nhƣ HgCl2,

Ca(0Cl)2, Na0Cl, H202, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật

liệu mà chọn hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về nguyên

tắc, mô nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa,

quả…) nhƣng theo Blatt thì mô lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi

cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trƣởng thành khác [32]. Vì

vậy, ngƣời ta thƣờng lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro.

Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng

thấp thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh

trƣởng mạnh của cây trong mùa sinh trƣởng cho khả năng tái sinh tốt hơn.

Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc

polyvinin pyrroline (PVP) vào môi trƣờng [19]. Giai đoạn này cần đảm bảo

các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt.

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên

khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thƣờng kéo dài

từ 4 - 6 tuần.

28

1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ƣu điểm của phƣơng pháp nhân giống in vitro so với

các phƣơng pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là

giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn

này biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trƣờng và điều kiện

ngoại cảnh thích hợp. Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh

trƣởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lƣợng cây con

tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây. Theo nguyên

tắc chung thì môi trƣờng có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ

nuôi thƣờng là ở nhiệt độ 25-270C và 10-16h/ngày, cƣờng độ chiếu sáng

1.000-2.000lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lƣợng cây con tối đa

trong thời gian ngắn nhƣng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của

cây.

1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ)

Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô

trùng khi đã đạt đƣợc kích thƣớc nhất định, các chồi đƣợc chuyển từ giai đoạn

3 sang môi trƣờng tạo rễ. Thƣờng sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ

và trở thành cây hoàn chỉnh. Môi trƣờng tạo rễ thƣờng giảm lƣợng Cytokinin

và tăng lƣợng Auxine để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Ngƣời ta

thƣờng dùng các chất NAA (Acid α- Naphthyl Acetic), IBA (Acid β - Indol

Butyric), IAA (Acid β - Indol Acetic) ở nồng độ 1mg/l - 5mg/l để tạo rễ cho

hầu hết các loại cây trồng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Giai đoạn này

thƣờng kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó đƣợc chuyển sang môi trƣờng Auxin để

rễ phát triển. Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do

hoạt động của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chƣa chuyển sang giai đoạn

tự dƣỡng.

Một số nghiên cứu gần đây đã cho thấy, đối với Keo lai và lát hoa, việc

cho ra rễ trực tiếp: dùng chồi nuoi cấy chấm bột kích thích ra rễ (là hỗn hợp

phụ gia và auxin), rồi chăm sóc trên luống cát nhƣ giâm hom có thể rút ngắn

đƣợc giai đoạn ra rễ trong phòng thí nghiệm với tỷ lệ ra rễ đảm bảo. Tuy

29

nhiên, cũng giống nhƣ với giâm hom, quá trình này phụ thuộc khá nhiều vào

điều kiện thời tiết [4].

1.5.5. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con trong ống nghiệm ra nhà kính rồi ra

ngoài trời. Cây mô đƣợc chuyển từ môi trƣờng dị dƣỡng sang môi trƣờng tự

dƣỡng, nên phải tập cho cây quen dần với môi trƣờng tự nhiên, tránh sự thay

đổi đột ngột làm cây có thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt

những tiêu chuẩn nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đƣa ra ngoài giá

thể. Giá thể tiếp nhận cây in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nƣớc và sạch

bệnh. Phải giữ ẩm cho cây mới đƣa từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm >50%

để cây con không mất nƣớc và làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh. Sau

2-3 ngày đƣa ra ngoài cây mô sẽ sinh trƣởng ổn định, chăm sóc cây mô tƣơng

tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.

Đối với nuôi cấy mô, chất kích thích ra rễ IBA, IAA và NAA ở các

nồng độ khác nhau (để bổ sung cho môi trƣờng MS) đã đƣợc thử nghiệm với

các đối tƣợng cây lâm nghiệp [4], kết quả cho thấy khi dùng IBA ở nồng độ 2

mg/l đối với ra rễ chồi trong ống nghiệm, còn ra rễ trực tiếp bằng cách ngâm

và chấm dung dịch ra rễ sử sụng nồng độ 3 ppm đã cho tỷ lệ ra rễ cao (80-

92%) ở các dòng Keo lai BV10, BV29, BV32 và BV33. Nồng độ cho tỷ lệ ra

rễ cao ở dòng BV16 (65%) và BV5 (50%) là 1ppm của IBA. Đồng thời đƣa

cây nuôi cấy mô ra rễ trực tiếp (bằng cách chấm thuốc bột TTG1) với giá thể

cát sông thực hiện thành công cho cây Lát hoa, Keo lai [4,21,23, 33,34].

Tuy vậy, kết quả xử lý ra rễ cho cây mô bằng thuốc bột TTG1 1,0%

trên môi trƣờng cát sông do Lê Đình Khả cùng kỹ sƣ lâm nghiệp Malaysia

thực hiện tại tập đoàn sản xuất gỗ dán Ta Ann ở Sarawak (Malaysia) vào ngày

1 tháng 12 năm 1999 và kiểm tra vào ngày 6 tháng 1 năm 2000 đã thấy các

dòng BV5, BV10, BV16, BV32 và BV33 đều có tỷ lệ ra rễ 100%, dòng BV29

có tỷ lệ ra rễ thấp nhất cũng đạt 86,7% đến ngày 24 tháng 1 (gần 2 tháng sau

khi cấy giâm) vẫn giữ đƣợc tỷ lệ sống là 81- 100% (với tỷ lệ chung là

91,51%) [19]. Điều đó cho thấy khi giâm trên môi trƣờng cát sông. IBA đƣợc

30

sử dụng ở dạng thuốc bột TTG1 1% là chất kích thích có hiệu quả ra rễ cao

nhất đối với các dòng keo lai đã đƣợc đánh giá và lựa chọn [35].

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra

ngoài trời. Cây mô đƣợc chuyển từ môi trƣờng dị dƣỡng sang môi trƣờng tự

dƣỡng nên phải tập cho cây quen dần với môi trƣờng tự nhiên, tránh sự thay

đổi đột ngột làm cho cây có thể bị sốc hoặc bị chết. Khi cây con đã cứng cáp

và đạt đƣợc tiêu chuẩn về chiều cao, số lá và số rễ thì đƣa ra ngoài giá thể.

Giá thể tiếp nhận cây nuôi cấy mô phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nƣớc và

sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây khi mới đƣa cây từ bình nuôi ra, cần duy trì

độ ẩm trên 50% để cây con không mất nƣớc và làm giàn che để tránh ánh

sáng quá mạnh. Sau 2-3 tuần đƣa ra ngoài cây mô sẽ sinh trƣởng ổn định,

chăm sóc cây mô tƣơng tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.

Tóm lại, quá trình nhân giống in vitro có thể đƣợc chia thành các giai

đoạn nhƣ trên nhƣng kết quả của mỗi giai đoạn không tách biệt nhau mà có sự

kế thừa của giai đoạn trƣớc. Trong các giai đoạn trên thì giai đoạn chuẩn bị

môi trƣờng là đặc biệt quan trọng, giai đoạn này ảnh hƣởng xuyên suốt và

quyết định sự thành công hay thất bại của quá trình nhân giống.

1.6. MỘT SỐ KẾT QUẢ NỔI BẬT VỀ CHỌN GIỐNG KEO LAI VÀ

TRỒNG RỪNG KEO LAI Ở NƢỚC TA

Keo lai (Acacia hybrid) là tên gọi tắt của giống lai tự nhiên giữa Keo tai

tƣợng và Keo lá tràm. Giống lai này lần đầu tiên đƣợc phát hiện nhờ công của

Messrs Herburn và Shim vào năm 1972 trong số các cây Keo tai tƣợng trồng

ven đƣờng ở Sook Telupid thuộc bang Sabah của Malaysia [19]. Đây là giống

cây sinh trƣởng nhanh, có khả năng thích ứng lớn, khả năng cải tạo đất tốt và

có tiềm năng bột giấy cao hơn Keo tai tƣợng và Keo lá tràm. Ở Việt Nam, vào

đầu những năm 1990, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng (nay là Viện

Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp) đã phát hiện, chọn lọc

và khảo nghiệm một số dòng Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tƣợng và Keo lá

tràm có năng suất trung bình từ 17 - 35 m3/ha/năm, cao gấp 1,5 - 3 lần các loài

cây bố mẹ [19]. Trong giai đoạn 1993 - 1999, một số giống keo lai tự nhiên đã

31

đƣợc Trung tâm Khoa học sản xuất lâm nghiệp Đông Nam Bộ phối hợp với

Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng (Nay là Viện Nghiên cứu Giống và

Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp) chọn lọc và khảo nghiệm tại Trảng Bom với

ký hiệu là TB (dẫn theo Viện Nghiên cứu Giống và CNSHLN, 2011). Từ 1996

- 2000 và 2001 - 2005, đề tài ―Nghiên cứu chọn các dòng keo và bạch đàn

chống chịu bệnh có năng suất cao‖ (PGS.TS Nguyễn Hoàng Nghĩa) cũng đã

chọn tạo đƣợc 2 dòng keo lai tự nhiên ký hiệu là AH1 và AH7, có mẹ là keo lá

tràm và bố là keo tai tƣợng, có dáng thân thẳng, chiều cao dƣới cành lớn, kích

thƣớc lá nhỏ và thƣa (giống keo lá tràm), dễ dàng tránh đƣợc sự xâm nhiễm của

nấm Corticium salmonicolor, một loài nấm gây bệnh phấn hồng rất nguy hiểm

cho Keo tai tƣợng và Keo lai [36]. Keo lai đang đƣợc coi là giống cây trồng

chính ở nhiều nơi trong nƣớc, đặc biệt là ở các tỉnh vùng Trung bộ và Đông

Nam bộ. Năm 1995, diện tích trồng Keo lai mới 160 ha thì đến cuối năm 2004

cả nƣớc đã trồng hơn 100.000 ha [19]. Đến 2020, diện tích rừng trồng Keo lai ở

nƣớc ta đạt khoảng 700.000ha với nhu cầu trồng mới hàng năm vào khoảng

15.000-20.000ha.

Cho tới nay, các kết quả của chƣơng trình chọn giống cho các loài keo

đƣợc Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp thực hiện đã

chọn lọc đƣợc nhiều giống keo có tiềm năng sinh trƣởng và sức chống chịu tốt,

nhiều giống đƣợc công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật và giống có triển vọng

1.7. NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÁC LOÀI KEO

1.7.1. Trên thế giới

Cho tới nay, đã có rất nhiều loài Keo đã đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô

thành công. Có thể kể đến một số công trình của các tác giả: A. albida

(Duhoux E và cộng sự, 1985; Ahee J và cộng sự, 1994; Gassama Y K và cộng

sự, 1986, 1987, 1989, 1992; Ruredzo và cộng sự, 1993; ...); A. bivenosa

(Jones và cộng sự, 1990); A. catechu (Rout và cộng sự, 1995; Kaur và cộng

sự, 1997;); A. ligulata (Williams và cộng sự, 1985), A. senegal (Kathju và

Tewari, 1973; Badji và cộng sự, 1993; Palma và cộng sự, 1994, 1996; ...); A.

nicolata (Marthur và Chandra, 1983; Dewan và cộng sự, 1992; Gupta và cộng

32

sự, 1992; Singh và cộng sự, 1993; Garg và cộng sự 1996 ...); A. hybird

(Crawford và Hartney, 1987; Darus - Haji và cộng sự, 1992; Nor Asmah H.

và cộng sự, 2012; ...) [37].

Darus thuộc Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Malaysia đã tiến hành thí

nghiệm nuôi cấy mô tế bào cho cây Keo tai tƣợng (Acacia mangium) bằng

môi trƣờng MS có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP trong

giai đoạn nhân chồi. Sau đó, những chồi đạt chiều cao trên 0,5cm đƣợc cấy

vào môi trƣờng tạo rễ đƣợc bổ sung IBA nồng độ 1000 ppm, đã cho tỷ lệ ra rễ

là 40% [38].

Năm 1999, Gerard và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh chồi Keo tai tƣợng

bằng cách nuôi cấy mô từ hạt, kết quả cho thấy môi trƣờng DKW bổ sung BAP

và thidiazuron hoặc N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea thích hợp cho quá

trình nhân chồi. Đồng thời, tác giả cũng khẳng định môi trƣờng ra rễ thích hợp

khi bổ sung 3 hoặc 6% đƣờng và 30,0 mg/l 2,4-D [39]

Cũng với cây Keo tai tƣợng, Hartney và cộng sự (Division of Forest

Research) đã sản xuất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi

trƣờng nuôi cấy đƣợc sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM

BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 4

0C),

giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối

hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút [3].

Năm 2001, De-Yu và Hong đã nghiên cứu nhân giống Keo tai tƣợng bằng

nuôi cấy mô bằng các bộ phận: phôi mầm, lá non, cuống lá, thân. Môi trƣờng nuôi

cấy cơ bản phù hợp là môi trƣờng MS bổ sung 9,05 µM 2,4-D và 13,95 µM Kn.

Môi trƣờng nhân chồi thích hợp là môi trƣờng MS bổ sung 4,55 µM TDZ và 1,43

µM IAA. Môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi trƣớc khi tiến hành ra rễ thích hợp

là môi trƣờng MS bổ sung 0,045 µM TDZ và 7,22 µM GA3. Môi trƣờng ra rễ

thích hợp là môi trƣờng MS có bổ sung 10,75 µM NAA và 2,33 µM Kn [40].

Năm 2003, Rashmi và cộng sự cũng đã nghiên cứu và thấy môi trƣờng

MS bổ sung 1,0 mg/l BAP, 1,0 mg/l GA3 và 0,05 mg/l IAA là môi trƣờng nuôi

cấy cơ bản cho Keo arabica; Khi bổ sung vào môi trƣờng MS 1,5 mg/l BAP,

33

0,05 mg/l IAA và 100 mg/l Adenine sulfate (Ads) thì tỷ lệ chồi thu đƣợc tăng

cao (1 đến 8 chồi phụ thuộc vào nồng độ đƣợc điều chỉnh). Môi trƣờng ra rễ

thích hợp là ½ MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA hoặc 0,5 mg/l IAA và 20g/l đƣờng

sau chu kỳ nhân chồi 13 - 14 ngày [41].

Nanda và các cộng sự (2004) đã nghiên cứu nhân giống mô cho cây

Keo tai tƣợng 10 tuổi và đã thành công trong điều kiện nuôi cấy ở 16 h sáng /

8 h tối bằng ánh sáng đèn Neon ở cƣờng độ ánh sáng 50 μE m–2 s–1 trong

điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 °C, và độ ẩm 55%. Kết quả cho thấy hệ số nhân có

thể đạt 8 lần và ra rễ trong 13-14 ngày. Môi trƣờng cơ bản trong nhân giống

mô Keo tai tƣợng đã đƣợc các tác giả này xác định là môi trƣờng MS + BAP

(1,0 mg/L) + GA3 (1,0 mg/L) + IAA (0,05 mg/L), môi trƣờng nhân chồi MS

+ BAP (1,5 mg/L) +IAA (0,05 mg/L) + 100 mg/L adenine sulfate (Ads) và

môi trƣờng ra rễ là 1/2MS + IBA hoặc IAA (0,5 mg/L) + 20 g/L đƣờng

sucrose [42].

Năm 1989, Mittal và cộng sự [43] đã nuôi cấy mô cho Keo lá tràm (Acacia

auriculiformis) bằng môi trƣờng Gamborg’s (B5) bổ sung 5 - 10% nƣớc dừa và

(10-6 M) BAP. Những chồi này đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng bổ sung (10

-

7M) IAA hoặc (10

-6 - 10

-7M) NAA để thử nghiệm ra rễ. Kết quả cho thấy môi

trƣờng nhân chồi thích hợp cho Keo lá tràm là B5 bổ sung 5% nƣớc dừa và (10-6

M) BAP (tỷ lệ hình thành chồi đạt 76%, có 2-3 chồi/cụm). Hiệu quả ra rễ với

NAA là tốt hơn so với IAA. Mẫu đƣợc nuôi trong môi trƣờng B5 bổ sung (10-6

M) NAA sau 75 ngày cho tỷ lệ ra rễ cao nhất với 24%, rễ khỏe.

Nitiwattanachai (Theo Trindate và cộng sự, 1990) đã nuôi cấy thành

công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trƣờng nhân nhanh chồi là

MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trƣờng sử dụng cho tạo rễ là

White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA [44].

Shukor (2000) đã khẳng định chỉ cần nồng độ BAP rất thấp (0,1 - 0,5

mg/l) đã có thể hình thành chồi ở Keo lá tràm (Acacia auriculiformis), và môi

trƣờng nhân nhanh chồi cho Keo lá tràm thích hợp là MS bổ sung 0,5 mg/l

GA3 và 0,02 mg/l NAA cùng 0,25 mg/l BAP, trƣớc khi tiến hành ra rễ in

34

vitro, các chồi đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS bổ sung 2,0 mg/l IBA và 1,0

mg/l NAA [45].

Nuôi cấy mô phân sinh Keo lai đã đƣợc tác giả Darus thuộc Viện nghiên

cứu Lâm nghiệp Malaysia (1991; 1993) tiến hành lần đầu bằng môi trƣờng cơ

bản Murashige và Skooge (MS) có thêm 6-Benzylaminopyrine (BAP) 0,5mg/l

và cho ra rễ trong phòng ở nền cát sông 100% với tỷ lệ ra rễ có thể đạt 70%.

(dẫn theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2011) [4]. Darus cũng đã nuôi cấy in

vitro cho Keo tai tƣợng (Acacia mangium) bằng môi trƣờng MS có bổ sung

3% sucrose, 0,6% agar và 0,5mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi

có chiều cao trên 0,5 cm đƣợc cấy vào môi trƣờng tạo rễ và chất điều hoà sinh

trƣởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (dẫn theo

Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2011) [4]. Cũng trong giai đoạn này, Hartney và

cộng sự đã chính thức công bố có thể sản xuất cây con Keo tai tƣợng thành

công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc sử dụng là WPM

+ 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong quá

trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 4

0C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu

ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian

20 phút [19].

1.7.2. Ở Việt Nam

Năm 1995, Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự đã có nghiên cứu nhân giống

đầu tiên cho Keo lai bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô. Keo lai nuôi cấy trong

môi trƣờng MS có bổ sung BAP 2mg/l cho hệ số nhân chồi cao hơn ở các

nồng độ khác từ 3-4 lần. Cây mô có thể cho ra rễ trực tiếp trên nền cát phun

sƣơng trong nhà kính bằng cách ngâm hoặc nhúng nhanh trong các chất kích

thích sinh trƣởng IBA hoặc ABT đều cho tỷ lệ ra rễ trên 70% đồng thời rút

ngắn đƣợc thời gian tạo rễ cho cây [46,47].

Ngoài những nghiên cứu nuôi cấy mô Keo lai tự nhiên dòng BV5,

BV10, BV16, BV29, BV32 và BV33 đã đƣợc giới thiệu khi tổng kết đề tài

KH03.03 năm 1996 [47], trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc

Tân Và cs (1996) [47], nhóm nghiên cứu nuôi cấy mô (Đoàn Thị Mai và cộng

sự 2000) [21] đã thực hiện một số nghiên cứu bổ sung cho các dòng Keo lai

35

này và thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau: khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,1%

với thời gian 2,4,6,8,10,12 phút trong tháng 2, 5, 8, 10 và 12 cho thấy trong 8

- 10 phút cho kết quả tốt. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng đến khả

năng nẩy chồi là BAP (2ppm) và BAP (2ppm) + Kn (0,05 ppm) và môi

trƣờng MS là công thức cho mẫu vật phát sinh chồi nhiều nhất. Ảnh hƣởng

của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai riêng biệt là:

IBA (3ppm) cho tỷ lệ ra rễ cao (80-92) đối với BV10, BV29, BV16, BV33.

Nồng độ IBA 1ppm ra rễ tốt cho dòng BV10 (65%), BV5 (50%) [21]. Năm

2003, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã nhân giống thành công cho Keo lá tràm

dòng Clt83 [22].

Giai đoạn 2006 - 2010, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã nghiên cứu nhân

nhanh giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo bằng công nghệ tế bào. Đối với

Keo lai: Phƣơng pháp khử trùng thích hợp cho cả Keo lai tự nhiên và Keo lai

nhân tạo là sử dụng HgCl2 nồng độ 0,05% trong 8 - 10 phút; môi trƣờng nhân

nhanh chồi là MS* + 1,5mg/l BAP; môi trƣờng tiền ra rễ là MS

* + 1,5mg/l BAP

+ 0,5mg/l NAA; môi trƣờng tạo rễ thích hợp là ½ MS* có bổ sung IBA nồng độ

1,5mg/l. Keo lai có thể ra rễ bằng chấm thuốc bột TTG có gốc là IBA nồng độ

1,5% với tỷ lệ ra rễ trên 90% [4].

Giai đoạn 2011-2020, một loạt các quy trình nhân giống cho Keo lai và

Keo lá tràm trên quy mô công nghiệp đã đƣợc hoàn thiện và đƣợc triển khai áp

dụng vào sản xuất. Qua đó, hàng triệu cây mô cho các đối tƣợng này đã đƣợc sản

xuất đáp ứng đƣợc 1 phần nhu cầu cây con có chất lƣợng cho trồng rừng sản

xuất [48,49,50].

36

2. CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Các dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 do Viện Nghiên cứu

Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp rừng tuyển chọn có sinh trƣởng

trung bình 20-35m3/ha/năm đã đƣợc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

công nhận là giống cây trồng mới theo quyết định số 761/QĐ-BNN-TCLN

ngày 06/03/2019 ngày 06 tháng 03 năm 2018.

- Vật liệu nghiên cứu: vật liệu đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tạo

mẫu ban đầu (khử trùng) là các chồi bánh tẻ chƣa bật chồi nách thu từ cây mẹ

(cây vật liệu gốc) của các dòng Keo lai từ 6 tháng tuổi đƣợc trồng tại vƣờn

ƣơm Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu của khóa luận bao gồm những nội dung sau:

- Xác định loại hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp cho các dòng

Keo lai nghiên cứu

- Xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo lai nghiên

cứu

- Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi Keo lai

- Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi cho Keo lai

- Tối ƣu hóa Phƣơng pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng

+ Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp

+ Xác định Phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai

- Xác định môi trƣờng ra rễ cho Keo lai

- Xác định thời gian huấn luyện thích hợp

- Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô

37

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm

* Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào, Viện Nghiên cứu

Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt

Nam - Đức Thắng - Bắc Từ Liêm - Hà Nội.

* Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm đƣợc duy trì trong điều kiện

nhân tạo với các thông số:

- Số giờ chiếu sáng trong ngày là 10h/ ngày.

- Cƣờng độ ánh sáng 2.000- 3.000 lux.

- Nhiệt độ phòng nuôi 25- 270C.

* Các dụng cụ sử dụng và môi trƣờng nuôi cấy đƣợc hấp khử trùng

trƣớc khi đƣa vào thí nghiệm.

* pH của môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh ở 5,8.

2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm

Các nội dung thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau:

* Nội dung 1: Xác định loại hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp

cho các dòng Keo lai nghiên cứu

Thí nghiệm sử dụng loại hóa chất khử trùng là HgCl2 (ở 2 nồng độ

0,05% và 0,1%) và Ca(OCl)2 (ở nồng độ 5% và 10%).

Thời gian khử trùng:

+ Đối với HgCl2: thời gian khử trùng 3, 5, 7, 9, 11 phút

+ Với Ca(OCl)2: thời gian khử trùng là 5, 10, 15, 20, 25 phút

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Chỉ tiêu theo dõi: số mẫu sống, số mẫu chết, số mẫu nhiễm, số mẫu nảy

chồi.

38

* Nội dung 2: Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo

lai nghiên cứu

Kế thừa các kết quả nghiên cứu về Keo lai trƣớc đây [4] môi trƣờng

MS đƣợc chọn lọc là môi trƣờng khoáng chất cơ bản để nuôi cấy cho các

dòng keo lai. Các loại môi trƣờng có sự thay đổi về tỷ lệ, thành phần các chất

đa lƣợng, vi lƣợng dựa trên môi trƣờng này đƣợc thí nghiệm, cụ thể nhƣ sau:

- Môi trƣờng MS cơ bản (MS): sử dụng môi trƣờng MS (Murashige

and Skoog, 1962) và thành phần Vitamin của Morel

- Môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (MS1)

- Môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (MS2)

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi.

* Nội dung 3: Xác định môi trường nhân nhanh số lượng chồi Keo lai

Kế thừa các kết quả nghiên cứu về Keo lai trƣớc đây [4], 7 công thức

thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của BAP và Kn đến khả năng nhân chồi các

dòng Keo lai đƣợc bố trí nhƣ sau:

- Công thức 1: Đối chứng

- Công thức 2: MS cải tiến + 1.0 mg Kinetin/ lít

- Công thức 3: MS cải tiến + 1.5 mg Kinetin/ lít

- Công thức 4: MS cải tiến + 2.0 mg Kinetin/ lít

- Công thức 5: MS cải tiến + 1.0 mg BAP/ lít

- Công thức 6: MS cải tiến + 1.5 mg BAP/ lít

- Công thức 7: MS cải tiến + 2.0 mg BAP/ lít

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ

2cm trở lên

39

* Nội dung 4: Xác định môi trường nâng cao chất lượng chồi cho Keo

lai

Sau khi đã xác định đƣợc môi trƣờng tốt nhất trong trong nội dung 3,

thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của sự phối hợp giữa Cytokinin và Auxin đến

sự phát triển chồi của Keo lai đƣợc tiến hành với các công thức:

- Công thức 1: Đối chứng (Môi trƣờng MS*)

- Công thức 2: MS* + 0,25 mg NAA/ lít

- Công thức 3: MS* + 0.5 mg NAA/ lít

- Công thức 4: MS* + 0,75 mg NAA/ lít

- Công thức 5: MS* + 1,0 mg NAA/ lít

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ

2cm trở lên

* Nội dung 5: Tối ưu hóa Phương pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng

- Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp

Thí nghiệm xác định chế độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô Keo

lai đƣợc bố trí nhƣ sau:

+ Công thức 1 (đối chứng): Nuôi sáng 10-12h/ngày, trong 1 vòng cấy

chuyển là 25 ngày bằng ánh sáng nhân tạo.

+ Công thức 2: Nuôi sáng 7-9h/ngày trong 1vòng cấy chuyển là 25

ngày bằng ánh sáng nhân tạo.

+ Công thức 3: Nuôi sáng 5h/ngày bằng ánh sáng tự nhiên, 5h/ngày

bằng ánh sáng nhân tạo trong 25 ngày.

+ Công thức 4: Sử dụng 100% ánh sáng tự nhiên trong 25 ngày nuôi

cấy.

40

- Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai

Để xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên

cứu, khóa luận đã tiến hành thí nghiệm với 3 công thức:

+ Công thức 1: Cấy các chồi đơn lẻ

+ Công thức 2: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 3-5 cụm chồi

+ Công thức 3: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 5 cụm chồi trở

lên (mỗi cụm chồi có từ 3-5 chồi)

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ

2cm trở lên

* Nội dung 6: Xác định ảnh hưởng của IBA và NAA đến ra rễ của

chồi Keo lai

Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2,0cm cứng cáp khoẻ mạnh đƣợc cấy

vào môi trƣờng ra rễ là môi trƣờng có1/2 thành phần của MSA* đƣợc bổ sung

IBA hoặc NAA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l.

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Chỉ tiêu theo dõi: số ra rễ, chiều cao rễ, số rễ/chồi

* Nội dung 7: Xác định phương pháp huấn luyện cây có hiệu quả nhất

trước khi đưa cây mô ra vườn ươm

Chồi nuôi cấy mô sau khi ra rễ (5-7 ngày) đƣợc chuyển ra khu huấn

luyện cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Để xác định thời gian huấn

luyện thích hợp, cây đƣợc huấn luyện ở 5 công thức thời gian khác nhau:

- 0-3 ngày sau khi cây bắt đầu ra rễ

- 4-6 này

- 7-10 ngày

- 11-14 ngày

41

- 15-20 ngày

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Số liệu thu thập gồm: số cây sống, chiều cao cây

* Nội dung 8: Xác định loại giá thể phù hợp để cấy cây

Để xác đinh loại giá thể thích hợp cho cây nuôi cấy mô, khóa luận đã

tiến hành thí nghiệm với 5 loại giá thể khác nhau gồm:

- Cát sông

- 100% đất màu

- 50% đất màu + 50% than trấu

- 70% đất màu + 30% thanh trấu

- 70% đất màu + 20% than trấu + 10 xơ dừa

Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.

Số liệu thu thập gồm: số cây sống, chiều cao cây

2.3.3. Xử lý số liệu

2.3.3.1. Tính toán các chỉ tiêu theo dõi

Chiều cao trung bình của chồi (cm) =

Tổng chiều cao của chồi

Tổng số chồi

Hệ số nhân chồi =

Tổng số chồi mới hình thành

Tổng số chồi ban đầu

42

Tỷ lệ ra rễ (%) =

Tổng số chồi ra rễ

x 100

Tổng số chồi nuôi cấy

Chiều dài rễ trung bình (cm) =

Tổng chiều dài rễ

Tổng số rễ

Tỷ lệ sống (%) =

Tổng số cây sống

x 100

Tổng số cây huấn luyện

2.3.3.2. Kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm

- Kiểm tra ảnh hƣởng của các nhân tố thí nghiệm đến số rễ và chiều dài

rễ bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai.

+ Tính FA: FA=VV

N

A

n

an.

1

Nếu FA < F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n –a thì nhân tố

A tác động đồng đều lên kết quả thí nghiệm.

Nếu FA > F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n - a thì nhân tố A

tác động không đồng đều đến kết quả thí nghiệm. Khi đó, công thức thí

nghiệm có ảnh hƣởng trội nhất đƣợc xác định thông qua kết quả kiểm tra sai

dị về trị số trung bình giữa hai công thức có trị số lớn nhất theo tiêu chuẩn

của Student:

t =

ji nnS

XX11,,

2max1max

43

Trong đó:

S’’ =

an

VN

là sai tiêu chuẩn ngẫu nhiên.

Ni và nj là dung lƣợng mẫu tƣơng ứng với công thức thí nghiệm có số

trung bình lớn nhất và lớn thứ hai.

Nếu /t/ < t tra bảng với k = n – a, thì giả thiết Ho đƣợc chấp nhận, hay

sai khác giữa hai trị số trung bình lớn thứ nhất và thứ hai là không rõ rệt, có

thể chọn công thức thí nghiệm ứng với số trung bình lớn thứ nhất hoặc số

trung bình lớn thứ hai.

Nếu /t / > t tra bảng với k = n – a, thì giả thiết Ho bị bác bỏ, hay có sai

khác giữa hai trị số trung bình lớn thứ nhất và số trung bình lớn thứ hai vì thế

chọn công thức thí nghiệm ứng với số trung bình lớn nhất có ảnh hƣởng trội

nhất.

Quá trình xử lý số liệu đƣợc thực hiện trên phần mềm Excel và SPSS.

44

3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. XÁC ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MẪU THÍCH HỢP CHO

CÁC DÒNG KEO LAI NGHIÊN CỨU

Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy in vitro, có vai

trò quan trọng trong việc tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các giai đoạn nuôi

cấy tiếp theo. Hiện nay, phƣơng pháp hóa học đƣợc sử dụng phổ biến để khử

trùng mẫu cấy. Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn đƣợc sử dụng phổ biến

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nhƣ: HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O2, AgNO3,

các chất kháng sinh, … cũng có thể bổ sung thêm Tween 20, Tween 80, ... hoặc

xử lý bằng cồn 700 để tăng độ xâm nhập và bám dính của các chất diệt khuẩn

vào bề mặt mẫu cấy.

Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của loại hóa chất và thời gian

đến kết quả khử trùng cho các dòng Keo lai đƣợc thể hiện tại Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Keo lai

Hóa

chất

Thời gian

(phút) CT

Tỷ lệ mẫu

sống (%)

Tỷ lệ mẫu

nhiễm (%)

TLNCHH

(%)

HgCl2

0,05%

3 1 93,1±1,7 57,6±2,6 4,4±0,9

5 2 91,2±1,3 51,2±3,1 8,2±1,9

7 3 86,2±2,1 36,4±1,8 27,9±2,1

9 4 69,1±2,2 29,1±1,5 21,3±2,3

11 5 61,2±2,6 25,2±1,3 25,1±2,8

45

Hóa

chất

Thời gian

(phút) CT

Tỷ lệ mẫu

sống (%)

Tỷ lệ mẫu

nhiễm (%)

TLNCHH

(%)

HgCl2

0,1%

3 6 88,9±2,0 51,9±1,9 12,4±1,9

5 7 85,2±2,1 38,3±1,4 37,5±2,8

7 8 75,3±2,0 27,9±1,3 28,6±2,3

9 9 63,9±1,4 19,8±2,0 23,2±2,5

11 10 53,1±1,4 16,3±1,6 18,4±2,3

Ca(OCl)

2 5%

5 11 97,6±0,6 97,6±0,7 1,1±0,3

10 12 95,2±0,5 92,4±0,7 1,3±0,6

15 13 89,4±0,8 88,3±1,2 2,9±0,9

20 14 83,6±1,0 86,2±1,4 3,2±1,3

25 15 81,6±1,3 81,4±1,0 5,4±1,4

Ca(OCl)

2 10%

5 16 97,1±1,3 91,1±1,2 1,6±0,4

10 17 94,2±1,2 87,1±0,5 2,5±0,6

15 18 88,3±1,7 80,9±1,9 3,9±0,9

20 19 82,1±1,2 76,5±0,9 5,1±1,2

25 20 80,4±1,5 70,1±1,8 6,4±0,9

Ftính 22,90 71,84 6,22

Fbảng (.05; 19; 40) = 1,85

46

Đặc điểm mẫu vật nuôi cấy ở từng loài là khác nhau, ngay cả trong loài,

trên cùng 1 cây mẹ, các vị trí lấy mẫu vật khác nhau đƣợc sử dụng nồng độ và

thời gian khử trùng khác nhau cũng sẽ cho kết quả khác nhau. Do đó, cần lựa

chọn nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp để vừa đảm bảo tỷ lệ mẫu

nhiễm thấp vừa đảm bảo tỷ lệ mẫu nảy chồi cao, và chồi tạo đƣợc có khả năng

sinh trƣởng phát triển tốt. Nếu nồng độ hoá chất thấp và thời gian khử trùng

chƣa đủ, các nguồn bụi bẩn, nấm bệnh, khuẩn, ... trên mẫu vật sẽ không thể

đƣợc loại trừ hết; trái ngƣợc lại, nếu nồng độ hóa chất quá cao hoặc thời gian

khử trùng quá dài, hóa chất sẽ ngấm sâu và phá vỡ cấu trúc tế bào, ảnh hƣởng

đến sinh trƣởng, làm giảm khả năng tái sinh chồi.

Kết quả phân tích số liệu cho thấy: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và

tỷ lệ mẫu nảy chồi ở 20 công thức thí nghiệm với Keo lai đều có sự sai khác

rõ rệt (Ftính > F.05).

Trong 2 loại hóa chất đƣợc sử dụng thì HgCl2 cho hiệu quả khử trùng

cao hơn hẳn so với Ca(OCl)2 (Bảng 3.1). Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ một

số nghiên cứu trƣớc đây cho một số đối tƣợng cây rừng và các dòng Keo lai

mới đƣợc tuyển chọn.

Sử dụng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 5 phút đem lại hiệu quả

khử trùng tốt nhất (tiêu chuẩn Duncan). Cụ thể là: khi sử dụng HgCl2 0,1%

trong 5 phút thì tỷ lệ mẫu sống là 85,2%, tỷ lệ mẫu nhiễm là 38,3% và tỷ lệ

nảy chồi hữu hiệu đạt tới 37,5%.

Nhƣ vậy, HgCl2 mặc dù có những hạn chế nhất định (có tính độc mạnh

cho con ngƣời và môi trƣởng) nhƣng vẫn là chất rất thích hợp trong nghiên cứu

khử trùng mẫu vật cho các giống cây rừng. Một số nghiên cứu gần đây cho

thấy, sử dụng dung dịch Javen có thể là Phƣơng pháp thay thế mang tính an

toàn hơn so với sử dụng thủy ngân trong việc khử trùng mẫu vật cho một số

giống Keo và bạch đàn.

47

Giữa các giống khác nhau, hiệu quả khử trùng ở công thức tốt nhất

cũng có sự sai khác rõ rệt. (Ftính > F.05) (Bảng 3.2). Trong 3 giống Keo lai

nghiên cứu hiệu quả khử trùng tốt nhất ở giống BV376 với tỷ lệ nảy chồi hữu

hiệu đạt 51,6%, trong khi tỷ lệ nhiễm chỉ là 35,9%. Mặc dù vậy, khi tiến hành

sản xuất trên quy mô lớn, để tiết kiệm thời gian và chi phí việc sử dụng chung

1 công thức khử trùng cho cả 3 giống Keo lai nghiên cứu là hoàn toàn đáp

ứng đƣợc yêu cầu của sản xuất mà vẫn đảm bảo đƣợc hiệu quả của quá trình

khử trùng mẫu vật.

Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng của từng giống nghiên cứu

Dòng CT khử trùng tốt nhất Tỷ lệ nhiễm (%) TLNCHH (%)

BV586 HgCl2 0,1% - 5 phút 31,7±1,2 44,2±1,5

BB055 HgCl2 0,1% - 5 phút 32,6±2,5 41,3±3,5

BV376 HgCl2 0,1% - 5 phút 35,9±0,6 51,6±1,7

Ftính 29,89 111,64

F05 tra bảng F (.05; 3; 8) = 4,06

Kết quả này tƣơng tự nhƣ các nghiên cứu trƣớc đây về nhân giống cho

các dòng Keo lai tự nhiên BV71, BV73, BV75 trong nghiên cứu của Đoàn Thị

Mai, Lê Sơn và cộng sự (2011) [4] cũng đã đƣợc khử trùng bằng HgCl2 nồng

độ 0,1% với 8 - 10 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (chỉ từ 58,52 đến 72,59%) và

tỷ lệ bật chồi khá cao (đạt từ 8,15 đến 11,11%). Tuy nhiên, ở một nghiên cứu

khác, tác giả Girijashankar (2010) [6] lại sử dụng dung dịch sodium

hypochlorite (NaOCl) 1,0% thêm một vài giọt Tween- 20 lắc trong 15 phút để

đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất cho các dòng Keo lai nghiên cứu.

48

Hình 3.1. Chồi bất định Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày khử trùng

3.2. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY CƠ BẢN CHO KEO LAI

Môi trƣờng có vai trò quan trọng quyết định khả năng phân chia, phân

hóa và hình thái của các mẫu cấy vì nó là nguồn cung cấp dinh dƣỡng duy

nhất cho mẫu vật nuôi cấy. Việc xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản là tiền

đề để có thể thiết kế các thí nghiệm nhằm xác định môi trƣờng nhân chồi, xác

định môi trƣờng ra rễ cho các đối tƣợng nghiên cứu.

Thí nghiệm xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo lai

đƣợc tiến hành với 3 loại môi trƣờng khác nhau đó là: MS, MS1 (là môi

trƣờng đã đƣợc sử dụng cho nhân chồi các dòng Keo lai tự nhiên trong các

nghiên cứu trƣớc đây) [4]. Đây những môi trƣờng đã đƣợc sử dụng tƣơng đối

rộng rãi cho nghiên cứu nhân giống cho cây rừng bằng nuôi cấy mô. Kết quả

nhân chồi sau 30 ngày cấy thí nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.

Kết quả thí nghiệm cho thấy, môi trƣờng MS1 đã đƣợc sử dụng để nuôi

cấy các dòng Keo lai tự nhiên thành công trƣớc đây [4, 22, 33, 46, 47, 48]

song lại không cho kết quả cao khi sử dụng để nuôi cấy các dòng Keo lai mới

chọn tạo (Bảng 3.3). Trong các môi trƣờng đã thử nghiệm, môi trƣờng MS2 là

thích hợp nhất cho quá trình tái sinh trong nuôi cấy, từ đó môi trƣờng này

49

đƣợc sử dụng để cấy khởi động nhằm tạo ra một số lƣợng chồi đủ lớn, sạch

bệnh và tƣơng đối đồng đều về mặt sinh lý cho những thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy cơ bản

Môi

trƣờng

Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055

HSNC Chiều dài

chồi (cm)

HSNC Chiều dài

chồi (cm)

HSNC Chiều dài

chồi (cm)

MS 2,3±0,8 2,7±1,2 3,1±1,2 3,1±0,9 2,2±1,0 2,8±1,1

MS1 2,5±0,6 3,1±1,1 2,6±1,1 2,7±1,0 2,4±1,1 3,1±1,1

MS2 3,3±0,7 3,2±0,9 3,7±1,2 3,4±1,1 3,4±1,2 3,5±1,1

Ftính = 5,34>Ftra bảng = 3,42

Khi sử dụng môi trƣờng này, các đối tƣợng nghiên cứu có hệ số nhân

chồi cao hơn sử dụng các loại môi trƣờng còn lại, đạt từ 3,3 đến 3,7 và chiều

dài trung bình của chồi cũng đạt từ 3,2 đến 3,5cm. Các chồi mới tạo đƣợc khi

nuôi cấy trong môi trƣờng MS2 cũng có chất lƣợng khá tốt: thân chồi cứng

cáp, lá phát triển. Điều này cho thấy các môi trƣờng đƣợc cải tiến dựa trên

môi trƣờng MS cơ bản rất thích hợp cho nuôi cấy mô Keo lai do có thành

phần, tỷ lệ giữa các nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng và vitamin phù hợp cho sự

sinh trƣởng và phát triển của Keo lai nói chung hơn là các môi trƣờng khác

[4]. Kết quả này một lần nữa cho thấy, đối với Keo lai nói chung, mỗi dòng

lại có phản ứng khác nhau với môi trƣờng nuôi cấy. Vì thế, các nghiên cứu

xác định môi trƣờng nhân giống thích hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu là

cần thiết

50

Hình 3.2. Cụm chồi Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày nuôi cấy trong

các môi trường nhân chồi khác nhau (MS, MS1 và MS2 theo thứ tự từ trái

sang phải)

3.3. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NHÂN NHANH SỐ LƢỢNG CHỒI KEO

LAI

Để xác định môi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các đối tƣợng nghiên

cứu, môi trƣờng MS đã đƣợc xác định ở thí nghiệm trên (ký hiệu là MS2 với

Keo lai ) đƣợc sử dụng làm môi trƣờng cơ bản cho các thí nghiệm tiếp theo. Để

kích thích tạo chồi trong nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trƣởng hay đƣợc sử

dụng là BAP và Kn. BAP và Kn là các chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm

Cytokinin, có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào, duy trì sự sống của

mô, định hƣớng phân hóa tế bào và tăng khả năng tổng hợp diệp lục ở lá cây.

Các loại chất này thƣờng đƣợc sử dụng để tạo cụm chồi trong nuôi cấy in vitro.

Việc lựa chọn chất kích thích sinh trƣởng cũng nhƣ các nồng độ khác nhau để

xác định môi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các đối tƣợng nghiên cứu trong

khóa luận đƣợc thiết lập dựa trên các kết quả nghiên cứu về nhân giống cho Keo

lai tự nhiên trƣớc đây của Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự [47], Đoàn Thị Mai và

cộng sự với các nồng độ 1,0mg/l; 1,5mg/l và 2,0mg/l [4]. Kết quả thí nghiệm xác

51

định ảnh hƣởng của BAP và Kn đến khả năng tạo chồi của các dòng Keo lai

đƣợc trình bày tại Bảng 3.4 sau đây.

Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP và Kn ở

nồng độ khác nhau đến khả năng nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy

Môi trƣờng

MS2 +

Ký

hiệu

Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055

HSNC

Chiều

dài

chồi

(cm)

HSNC

Chiều

dài

chồi

(cm)

HSNC

Chiều

dài

chồi

(cm)

BAP 1,0 mg/l 1 3,9±1,2 3,5±1,1 4,5±1,3 3,5±1,1 3,8±1,2 3,9±1,3

BAP 1,5 mg/l 2 4,5±1,3 3,9±1,3 4,6±1,4 3,6±1,2 4,4±1,3 4,4±1,2

BAP 2,0 mg/l 3 4,2±1,1 3,6±1,2 4,8±1,3 3,5±1,1 3,9±1,2 4,3±1,2

Kn 1,0 mg/l 4 3,4±1,2 3,2±1,1 4,1±1,3 3,5±1,2 3,6±1,1 3,5±1,1

Kn 1,5 mg/l 5 3,7±1,2 3,4±1,3 4,3±1,2 3,6±1,1 3,8±1,2 3,7±1,2

Kn 2,0 mg/l 6 3,5±1,1 3,3±1,2 4,2±1,3 3,4±1,3 3,5±1,3 3,6±1,1

0 ĐC 3,3±0,7 3,2±0,9 3,7±1,2 3,4±1,1 3,4±1,2 3,5±1,1

Ftính=5,34 > Ftra bảng = 3,4

Kết quả thí nghiệm cho thấy, BAP có tác dụng rõ lên quá trình tạo chồi

của các dòng Keo lai khi so sánh với công thức đối chứng (không sử dụng

chất kích thích sinh trƣởng) hay khi sử dụng chất kích thích sinh trƣởng là Kn

ở cùng nồng độ.

Môi trƣờng bổ sung BAP ở nồng độ 1,5mg/l có hệ số nhân chồi đạt

đƣợc cao nhất là từ 4,4 đến 4,5 tuỳ thuộc vào các dòng thí nghiệm. Khi sử

dụng công thức này, các chồi tạo đƣợc cũng có chiều cao trung bình cao hơn

hẳn các công thức còn lại (3,9-4,5cm). Môi trƣờng đƣợc bổ sung BAP ở nồng

52

độ 2,0mg/l cũng cho hệ số nhân chồi tƣơng đối cao đối với dòng Keo lai

BV586 (HSNC đạt 4,8) tuy nhiên chiều cao chồi thu lại chỉ đạt 3,5 cm (trong

khi chỉ số này đạt 3,6cm khi nuôi cấy trong môi trƣờng bổ sung BAP nồng độ

1,5mg/l). Do đó, môi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l đƣợc

chọn làm môi trƣờng nuôi cấy chung cho cả 3 dòng Keo lai nghiên cứu. Kết

quả này cũng tƣơng tự nhƣ trong các nghiên cứu trƣớc đây về nhân giống các

dòng Keo lai, Keo lá tràm mới đƣợc chọn lọc [4, 46, 47,48] chính tỏ với Keo

lai nói chung môi trƣờng có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l hoặc 2 mg/l là

tƣơng đối phù hợp cho quá trình nhân chồi.

Hình 3.3. Các cụm chồi Keo lai được nuôi cấy trong các công thức môi

trường nhân chồi khác nhau

3.4. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG CHỒI CHO

KEO LAI

Đối với Keo lai nói chung và Keo lai nói riêng, để chuẩn bị cho quá

trình ra rễ cần phải nâng cao chất lƣợng chồi. Mục đích của giai đoạn này là

tăng số lƣợng chồi có đủ tiêu chuẩn cho quá trình ra rễ, thông thƣờng môi

trƣờng nuôi cấy sẽ đƣợc bổ sung thêm auxin ở các nồng độ khác nhau tuỳ

thuộc vào đối tƣợng nghiên cứu.

53

Trong nhóm Auxin, NAA thƣờng đƣợc bổ sung thêm vào môi trƣờng

nuôi cấy để tăng chất lƣợng chồi thu đƣợc đặc biệt cho Keo lai tự nhiên [1].

NAA có tác dụng làm tăng khả năng hô hấp của mô, tăng hoạt tính Enzim và

ảnh hƣởng mạnh đến trao đổi Nitơ (N) và tiếp nhận các-bon trong môi trƣờng.

Ở nồng độ thích hợp. NAA còn có vai trò kích thích sinh trƣởng tế bào và

kích thích tạo rễ.

Môi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l đã đƣợc xác định

cho quá trình nhân nhanh số lƣợng chồi cho Keo lai. Tuy nhiên, khi sử dụng

môi trƣờng này, tỷ lệ chồi hữu hiệu thu đƣợc cho quá trình ra rễ là chƣa cao,

do đó để nâng cao chất lƣợng các chồi tạo đƣợc chuẩn bị cho ra rễ môi trƣờng

này còn đƣợc bổ sung thêm NAA ở các nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 và

1,5 gm/l. Số liệu thu thập sau 30 ngày nuôi cấy đƣợc trình bày tại Bảng 3.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm

chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy

MS2 +

BAP

1,5mg/l

+ NAA

(mg/l)

Ký

hiệu

Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055

HSNC

Chiều

dài

chồi

(cm)

HSNC

Chiều

dài

chồi

(cm)

HSNC

Chiều

dài chồi

(cm)

0,25 N1 3,8±1,2 4,1±1,1 4,7±1,4 4,2±1,2 4,5±2,1 4,5±1,3

0,5 N2 5,5±2,3 5,8±1,9 5,1±2,1 5,2±1,5 4,9±1,2 5,5±1,4

0,75 N3 5,3±2,5 5,6±1,8 4,7±1,3 4,8±1,1 4,7±1,3 5,2±1,5

1,0 N4 4,7±2,2 4,4±2,5 4,4±1,7 4,7±1,4 4,2±1,6 4,9±2,1

1,25 N5 4,5±1,4 4,2±1,9 4,3±1,3 4,2±1,1 6,1±2,1 4,6±1,6

1,5 N6 4,8±1,7 3,9±1,2 4,0±1,2 4,1±1,5 5,8±1,6 4,3±1,7

0 ĐC 4,5±1,3 3,9±1,3 4,6±1,4 3,6±1,2 4,4±1,3 4,4±1,2

Ftính=6,81 > Ftra bảng = 3,67 /t/=2,76>t0,5 = 1,96

54

Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi bổ sung thêm NAA vào môi trƣờng

nuôi cấy không chỉ có chỉ tiêu hệ số nhân chồi thu đƣợc cao hơn so với khi sử

dụng BAP riêng lẻ mà chất lƣợng các chồi thu đƣợc (số đốt lá, màu sắc và

hình thái chồi) cũng nhƣ chiều cao chồi cũng tăng lên đáng kể (Bảng 3.5).

Công thức môi trƣờng MS1* + BAP 1,5mg/l + NAA 0,5mg/l cho hệ số

nhân chồi chỉ từ 4,9 đến 5,8 tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng nghiên cứu đồng

thời số chồi thu đƣợc có chất lƣợng tốt, tƣơng đối đồng đều (thể hiện ở mức

độ sai dị thấp hơn so với công thức đối chứng), số chồi có chiều cao từ 3cm

trở nên đạt khoảng 60% của tổng số chồi thu đƣợc, có nghĩa là cứ 10 chồi tạo

đƣợc thì có trung bình 6 chồi đủ chất lƣợng cho quá trình ra rễ. Nếu trong môi

trƣờng không bổ sung NAA số chồi đủ chất lƣợng cho quá trình ra rễ chỉ đạt

30 đến 40%, thì rõ ràng việc bổ sung này có ý nghĩa rất lớn cho quá trình

nhân nhanh cuả các dòng Keo lai thí nghiệm.

Hình 3.4. Các chồi Keo lai dòng BV568 sau 25 ngày nuôi cấy trong các

công thức thí nghiệm khác nhau.

55

3.5. TỐI ƢU HÓA PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ CHẾ ĐỘ CHIẾU

SÁNG

Ngoài ảnh hƣởng của loại môi trƣờng, thành phần và nồng độ các chất

kích thích sinh trƣởng có trong môi trƣờng nuôi cấy thì phƣơng pháp nuôi cấy

cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng nhân nhanh của các đối tƣợng nghiên

cứu. Đối với Keo lai nói chung, mặc dù không chịu ảnh hƣởng của chế độ ánh

sáng một cách rõ ràng nhƣ đối với Bạch đàn nhƣng sự thay đổi này cũng có

những tác dụng đáng kể trong quá trình nhân nhanh. Các thí nghiệm về thay

đổi chế độ chiếu sáng, phƣơng pháp nuôi dƣỡng và số lƣợng chồi nuôi cấy/

bình nuôi cấy (bình tam giác 250ml) đã đƣợc tiến hành nhằm tìm ra phƣơng

thức nuôi dƣỡng hiệu quả nhất. Môi trƣờng đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm

này là môi trƣờng nhân chồi thích hợp đã xác định đƣợc trong các thí nghiệm

trên.

3.5.1. Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp

Thí nghiệm xác định chế độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô Keo

lai đƣợc bố trí nhƣ sau:

Công thức 1 (đối chứng): Nuôi sáng 10-12h/ngày, trong 1 vòng cấy

chuyển là 25 ngày bằng ánh sáng nhân tạo.

Công thức 2: Nuôi sáng 7-9h/ngày trong 1vòng cấy chuyển là 25 ngày

bằng ánh sáng nhân tạo.

Công thức 3: Nuôi sáng 5h/ngày bằng ánh sáng tự nhiên, 5h/ngày bằng

ánh sáng nhân tạo trong 25 ngày.

Công thức 4: Sử dụng 100% ánh sáng tự nhiên trong 25 ngày nuôi cấy.

Kết quả cho thấy, đối với các dòng Keo lai chế độ chiếu sáng thích hợp

là công thức 2: nuôi sáng 7-9h/ngày bằng ánh sáng nhân tạo (Bảng 3.6).

Kết quả thí nghiệm cho thấy, các công thức thí nghiệm có sự sai khác

rõ rệt về các chỉ tiêu theo dõi, với công thức thí nghiệm số 1 (là phƣơng pháp

nuôi dƣỡng đã đƣợc áp dụng trong hầu hết các nghiên cứu về nhân giống Keo

lai bằng nuôi cấy mô) tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt từ 80%. Tuy nhiên, với công

56

thức 2, tỷ lệ chồi hữu hiệu đã tăng lên trên 85% cho tất cả các dòng còn các

chỉ số khác nhƣ số chồi/cụm và chiều dài chồi là không có sự sai khác rõ rệt.

Ở các công thức thí nghiệm 3 và 4 các chỉ số theo dõi đều thấp hơn so với

công thức thí nghiệm số 2. Điều này có thể giải thích nhƣ sau: với các công

thức có tỷ lệ sử dụng ánh sáng tự nhiên trên 50%, với cƣờng độ và thời gian

chiếu sáng thay đổi: cƣờng độ mạnh hơn (trên 5.000lux), thời gian chiếu sáng

không ổn định theo mùa vụ và thƣờng dài hơn (trên 12 tiếng) nên các chỉ số

theo dõi không đạt đƣợc nhƣ khi sử dụng công thức 2. Mặc dù vậy, nếu tận

dụng đƣợc ánh sáng tự nhiên cho quá trình nuôi cấy sẽ tiết kiệm đƣợc chi phí

sản xuất. Vì thế, các nghiên cứu về sử dụng nguồn ánh sáng tự nhiên cần

đƣợc tiến hành một cách có hệ thống hơn trong tƣơng lai.

Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho

nuôi cấy các dòng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển

Dòng Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 Công thức 4

Số

chồi/

cụm

Chiều

dài

chồi

(cm)

Tỷ

lệ

chồi

hữu

hiệu

(%)

Số

chồi/

cụm

Chiều

dài

chồi

(cm)

Tỷ

lệ

chồi

hữu

hiệu

(%)

Số

chồi/

cụm

Chiều

dài

chồi

(cm)

Tỷ

lệ

chồi

hữu

hiệu

(%)

Số

chồi/

cụm

Chiều

dài

chồi

(cm)

Tỷ

lệ

chồi

hữu

hiệu

(%)

BV376 5,2 4,3 80,6 5,3 5,2 86,4 4,8 4,7 82,6 4,7 4,8 76,3

BV586 5,4 4,2 82,3 5,2 5,3 85,8 4,7 4,6 83,3 5,4 4,7 72,4

BB055 5,3 4,2 81,5 5,5 5,1 88,2 4,5 4,3 85,1 4,5 4,6 75,5

3.5.2. Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai

Để xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên

cứu, khóa luận đã tiến hành thí nghiệm với 3 công thức:

Công thức 1: Cấy các chồi đơn lẻ.

57

Công thức 2: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 3-5 cụm chồi.

Công thức 3: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 5 cụm chồi trở

nên (mỗi cụm chồi có từ 3-5 chồi).

Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với các dòng Keo lai nghiên cứu, số

lƣợng cụm chồi đƣợc cấy cho 01 bình tam giác 250ml có chứa 70-75ml môi

trƣờng nuôi cấy là từ 3 đến 5 cụm chồi với hệ số nhân chồi cũng nhƣ chất

lƣợng chồi thu đƣợc tốt nhất trong các công thức thí nghiệm (Bảng 3.7). Với

lƣợng cụm chồi nhƣ vậy, các chồi Keo lai vừa không có sự cạnh tranh nhau

về ánh sáng và dinh dƣỡng lại vừa tiết kiệm đƣợc không gian nuôi dƣỡng,

đảm bảo cho cây có thể hấp thụ tối đa nguồn dinh dƣỡng có trong môi trƣờng

nuôi cấy. Nếu chỉ cấy các chồi đơn lẻ, sẽ hạn chế quá trình nhân chồi do khả

năng tái sinh thấp và lãng phí nguyên vật liệu, nếu cấy quá nhiều cụm chồi

trong bình nuôi cấy, sẽ làm cho cây có sự cạnh tranh trao đổi chất và không

gian từ đó làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng cũng nhƣ sự đồng đều của các chồi

thu đƣợc.

Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định Phương pháp cấy thích hợp

Dòng Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3

Số

chồi/

cụm

Chiều

dài

chồi

(cm)

Tỷ lệ

chồi hữu

hiệu (%)

Số

chồi/

cụm

Chiều

dài

chồi

(cm)

Tỷ lệ

chồi hữu

hiệu (%)

Số

chồi/

cụm

Chiều

dài

chồi

(cm)

Tỷ lệ

chồi hữu

hiệu (%)

BV376 3,2 4,5 65,7 6,8 4,2 91,1 4,1 4,1 68,5

BV586 3,4 4,4 64,8 6,9 4,3 92,0 4,2 4,0 71,3

BB055 3,3 4,4 61,1 5,7 3,6 88,2 4,5 3,6 55,5

Ftính = 34,5>Ftra bảng

58

Hình 3.5. Cụm chồi Keo lai sau các giai đoạn nuôi cấy: cụm chồi ban

đầu, cụm chồi sau nuôi cấy lần 1 và cụm chồi trong môi trường tối ưu

3.6. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG RA RỄ CHO KEO LAI

Giai đoạn tạo rễ là một trong những khâu quan trọng nhất của nuôi cấy

mô, do đó việc xác định đƣợc phƣơng thức ra rễ thích hợp: môi trƣờng, thời

gian và phƣơng pháp huấn luyện sẽ giúp tăng tỷ lệ ra rễ, cũng nhƣ chất lƣợng

cây con từ đó nâng cao hiệu quả của quy trình nhân nhanh.

Để xác định môi trƣờng ra rễ thích hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu.

Môi trƣờng cơ bản đƣợc sử dụng là một nửa các chất đa lƣợng và vi lƣợng

của môi trƣờng MS cải tiến (1/2MS2) đƣợc bổ sung thêm các Auxin: IBA và

NAA ở các nồng độ khác nhau. Các chồi có chiều cao từ 2,0cm có đủ chất

lƣợng đƣợc chọn lọc và cấy vào môi trƣờng ra rễ, nuôi cấy trong điều kiện

nhân tạo, sau 5-7 ngày rễ bắt đầu xuất hiện và sau 14 -16 ngày cấy, các chồi

ra rễ đƣợc đo đếm các số liệu về tỷ lệ ra rễ, chiều dài rễ và số rễ trên chồi.

59

Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho các dòng Keo lai

dòng BV376, BV586 và BB055

Môi trƣờng 1/2

MS2 +

Ký

hiệu

Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055

Tỷ lệ

ra rễ

(%)

Chiều

dài rễ

(cm)

Số rễ

trung

bình

(cái)

Tỷ lệ

ra rễ

(%)

Chiều

dài rễ

(cm)

Số rễ

trung

bình

(cái)

Tỷ lệ

ra rễ

(%)

Chiều

dài rễ

(cm)

Số rễ

trung

bình

(cái)

IBA 0,5 mg/l I1 65,25 3,5 3,2 67,36 3,7 3,4 67,12 3,7 3,4

IBA 1,0 mg/l I2 71,23 4,2 3,5 73,48 4,8 3,7 73,4 4,3 3,9

IBA 1,5 mg/l I3 79,45 3,8 4,2 81,27 4,2 4,5 81,06 3,7 4,1

IBA 2,0 mg/l I4 73,36 3,2 4,5 79,24 3,5 4,6 82,45 3,2 4,3

NAA0,5 mg/l N1 55,24 4,2 2,6 62,47 3,7 3,1 58,14 3,8 3,2

NAA1,0 mg/l N2 58,35 3,5 3,1 65,46 3,9 3,5 60,53 4,2 3,6

NAA1,5 mg/l N3 60,48 3,2 3,4 67,23 4,4 3,6 65,45 3,6 3,8

NAA2,0 mg/l N4 58,52 3,3 3,7 62,6 3,8 3,8 62,18 3,2 4,0

0 ĐC 30,24 1,7 1,4 55,20 2,0 1,7 33,43 1,9 1,8

FA = 12,3> Ftra bảng = 6,2 /t/=22,1>tra bảng = 3,1

Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với các dòng Keo lai mới chọn tạo,

IBA có tác dụng mạnh mẽ đến quá trình tạo rễ. Tỷ lệ chồi ra rễ thu đƣợc của

tất cả các dòng nghiên cứu đều cao hơn so với NAA. Tỷ lệ ra rễ đạt từ 65,25

đến 82,45%, trong khi sử dụng NAA để kích thích tạo rễ thì tỷ lệ này chỉ đạt

từ 55,24 đến 67,23%, trong khi đó các công thức đối chứng chỉ cho tỷ lệ ra rễ

đạt từ 30,24 đến 45,20% (Bảng 3.8). Mặt khác, khi sử dụng IBA với nồng độ

cao, chỉ tiêu số rễ trung bình/chồi đạt cao hơn so với khi sử dụng chất kích

60

thích tạo rễ ở nồng độ thấp hơn nhƣng chiều dài rễ trung bình và chất lƣợng rễ

tạo đƣợc lại thấp hơn.

Môi trƣờng có bổ sung IBA nồng độ 1,5mg/l cho tỷ lệ ra rễ thấp nhất

đạt 79,45% và cao nhất đạt 81,27%, trong khi đó nếu sử dụng môi trƣờng có

IBA nồng độ 2,0mg/l thì tỷ lệ ra rễ lại giảm với hai trên ba dòng Keo lai

nghiên cứu, và chỉ tiêu chiều dài rễ cũng giảm đi. Điều này chứng tỏ, nồng độ

IBA cao làm ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình trao đổi chất, từ đó kìm hãm sự

phân chia tế bào và quá trình tạo rễ của các dòng Keo lai nghiên cứu. Mặc dù,

môi trƣờng 1/2 MS2 có bổ sung IBA nồng độ 2,0mg/l cho tỷ lệ ra rễ dòng

BB055 cao hơn so với nồng độ 1,5mg/l nhƣng sự khác nhau là không đáng kể

(82,45 và 81,06%). Từ đó, có thể kết luận với các dòng Keo lai thí nghiệm

môi trƣờng tạo rễ thích hợp nhất là môi trƣờng 1/2MS* + IBA nồng độ

1,5mg/l, thời gian cho quá trình ra rễ là từ 17 đến 20 ngày.

Hình 3.6. Các chồi Keo lai dòng BB055 ra rễ trong môi trường có bổ

sung IBA (hàng trên) và NAA (hàng dưới)

61

Hình 3.7. Các chồi Keo lai dòng BV376 ra rễ sau 10 ngày

Hình 3.8. Bình ra rễ Keo lai

62

Bảng số liệu cũng cho thấy, cùng loại chất, cùng nồng độ, các dòng

Keo lai khác nhau thì khả năng ra rễ cũng khác nhau, trong 3 dòng Keo lai thí

nghiệm, có thể nhận xét rằng dòng BV586 vẫn là dòng cho tỷ lệ ra rễ cao hơn

so với các dòng còn lại.

3.7. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN HUẤN LUYỆN CÂY THÍCH HỢP

Cây mô sau khi ra rễ trong điều kiện nhân tạo đƣợc huấn luyện để thích

nghi dần với các điều kiện tự nhiên. Thông thƣờng, sau khi ra rễ trong vòng 7

ngày, cây mô đƣợc chuyển ra khu huấn luyện trong thời gian nhất định để

thích nghi với điều kiện vật lý tự nhiên. Kết quả thí nghiệm về thời gian huấn

luyện cây đƣợc trình bày trong Bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai

Thời gian huấn

luyện (ngày) Tỷ lệ cây sống (%)

Chiều cao trung bình

(cm)

0-3 46,4±8,5 5,3±2,1

4-6 63,2±12,1 5,7±2,1

7-10 73,8±11,7 6,2±1,9

11-14 78,9±8,6 6,3±2,0

15-20 69,5±9,2 6,1±1,9

Ftính = 14,1> Ftra

bảng

Ftính = 5,7> F tra bảng

Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với Keo lai ra rễ trong lọ (hay ra rễ in

vitro) thời gian huấn luyện tốt nhất là sau khi các chồi ra rễ đƣợc 11 -14 ngày

lúc này các chồi ra rễ đã đủ cứng cáp để có thể thích nghi dần với điều kiện tự

nhiên. Mặt khác, quá trình hình thành và hoàn thiện rễ đến thời điểm này cũng

63

là thích hợp nhất để chuyển cây con ra giá thể mới. Nếu thời gian huấn luyện

ít hơn 10 ngày, các rễ và bản thân cây mô còn non nên ảnh hƣởng đến khả

năng sinh trƣởng và phát triển tại vƣờn ƣơm. Trong khi, nếu thời gian huấn

luyện (từ 15 ngày trở nên), các rễ quá dài khi cấy vào bầu rễ rất bị cong, thời

điểm này đầu rễ bắt đầu chuyển sang màu đen sẽ kìm hãm việc sinh lông hút

và làm hạn chế quá trình phát sinh rễ mới sau khi cấy chuyển cây con vào giá

thể. Kết quả thí nghiệm này cho thấy, so với các dòng Keo lai tự nhiên đã

đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, các dòng Keo lai mới có yêu cầu cao hơn cả về

dinh dƣỡng lẫn chế độ và phƣơng pháp nuôi cấy (với các dòng Keo lai tự

nhiên, thời gian huấn luyện chỉ 7-10 ngày là cho tỷ lệ sống cao nhất [9]).

Hình 3.9. Cây con Keo đã ra rễ được cấy vào bầu đất

3.8. XÁC ĐỊNH LOẠI GIÁ THỂ PHÙ HỢP CHO KEO LAI NUÔI CẤY

MÔ

Để xác định loại giá thể thích hợp cho cây nuôi cấy mô, khóa luận đã

tiến hành thí nghiệm với 5 loại giá thể khác nhau. Các loại giá thể đƣợc thí

nghiệm là các loại giá thể đã đƣợc sử dụng rộng rãi, có sẵn và đƣợc sử dụng

64

rộng rãi trong sản xuất. Cây mô sau khi đƣợc huấn luyện từ 11-14 ngày, rửa

sạch thạch, ngâm trong dung dịch Benlat C 0,3% trong vòng 2-3 phút rồi cấy

vào các loại giá thể thí nghiệm. Cây đƣợc che nắng, tƣới phun sao cho đủ độ

ẩm và tránh ánh nắng gắt trực tiếp. Sau 40-45 ngày cấy, kết quả thu đƣợc

trình bày trong Bảng 3.10 sau đây.

Bảng 3.10. Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai

Loại giá thể Tỷ lệ cây sống

(%)

Chiều cao

trung bình

(cm)

Cát sông 80,6±7,5 9,3±3,2

100% Đất mầu 73,5±8,1 10,6±4,7

50% Đất mầu + 50% than trấu 78,9±9,3 11,3±5,1

70% Đất mầu + 30% Than trấu 79,3±8,3 11,3±4,5

70% Đất mầu + 20% Than trấu +10%

xơ dừa 87,2±6,6 11,4±3,2

Ftính

=12,5>Ftra bảng

Ftính

=8,3>Ftra bảng

Kết quả thí nghiệm cho thấy, cây mô Keo lai đã ra rễ đƣợc cấy vào 5

loại giá thể khác nhau đều cho có tỷ lệ sống tƣơng đối cao (từ 73% trở nên)

nhƣng mỗi loại giá thể đều có những ƣu, nhƣợc điểm nhất định. Trong đó, với

giá thể cát sông, do khả năng thoát nƣớc tốt, rễ có thể phát triển nhanh nên tỷ

lệ cây sống đạt trên 80%, chiều cao cây trung bình cũng đạt trên 11cm, nhƣng

lại nghèo về dinh dƣỡng và sau đó lại phải cấy chuyển từ giá thể cát sang bầu

đất nên sẽ kéo dài thời gian chăm sóc và huấn luyện cây con.

Trong các giá thể bầu đất đƣợc sử dụng thì loại giá thể gồm hỗn hợp

giữa bầu đất, than trấu và xơ dừa có tỷ lệ sống cao nhất và chiều cao cây con

cũng đạt cao nhất trong các công thức thí nghiệm. Điều này có thể giải thích

65

nhƣ sau: trong thành phần ruột bầu có than trấu và xơ dừa (có 1 lƣợng phân

hữu cơ nhất định) sẽ làm cho bầu tơi, xốp và dễ thoát nƣớc nhƣng lại có độ

ẩm cần thiết cho quá trình sinh trƣởng của cây con nên cho tỷ lệ sống cao, cây

phát triển tốt hơn so với các loại giá thể còn lại.

Hình 3.10. Luống cây con Keo lai tại vườn ươm

3.9. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO CÁC DÒNG KEO

LAI NGIÊN CỨU

Qua kết quả thí nghiệm, luận văn đã bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình

nhân giống cho các dòng Keo lai nghiên cứu với các nội chính sau đây:

66

3.9.1. Mục tiêu quy trình

Quy trình kỹ thuật này giới thiệu những kỹ thuật cơ bản về nhân giống

bằng nuôi cấy mô các cho giống Keo lai tự nhiên BV586, BV376, BB055 đã

đƣợc công nhận là giống cây trồng mới.

3.9.2. Phạm vi áp dụng

Bản hƣớng dẫn kỹ thuật này đƣợc áp dụng trong tất cả các thành phần

kinh tế, những nơi có điều kiện thích hợp cho sản xuất giống Keo lai tự nhiên

BV586, BV376, BB055

3.9.3. Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình

3.9.3.1. Điều kiện khí hậu

Nhiệt độ không khí trung bình hàng năm 21 - 27oC, tối cao tuyệt đối

dƣới 42oC, tối thấp tuyệt đối trên 0

oC.

3.9.3.2. Nguồn giống

Sử dụng dòng Keo lai BV586, BV376, BB055 đã đƣợc nhà nƣớc công

nhận và do cơ quan chuyên môn cung cấp.

3.9.3.3. Điều kiện nhân lực

Có đủ nhân lực đƣợc tập huấn về kỹ thuật nhân giống giống Keo lai nói

trên, có hiểu biết về kỹ thuật lâm sinh, kỹ thuật nhân giống và phòng chống

sâu bệnh.

3.9.3.4. Cơ sở vật chất

Có đủ các thiết bị và thuốc phòng chống sâu bệnh và các biện pháp bảo

đảm an toàn lao động

Nơi sản xuất hom phải có nhà giâm hom với hệ thống phun sƣơng đƣợc

vận hành tốt hoặc có khu giâm hom với đủ thiết bị tƣới phun

Nơi sản xuất cây mô phải có nhà nuôi cấy mô với đủ thiết bị cần thiết.

67

3.9.4. Nội dung quy trình

3.9.4.1. Khử trùng mẫu

Vật liệu khử trùng là các chồi đạt chiều cao 10 - 15 cm và chƣa xuất

hiện các chồi bất định bên nách là đƣợc thu từ cây giống gốc

Đoạn chồi đã cắt đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc chảy bằng tay, sau đó

đƣợc rửa bằng nƣớc xà phòng và tráng sạch dƣới vòi nƣớc chảy, sau đó lau

bằng bông tẩm cồn 70% rồi rửa lại thật sạch bằng nƣớc cất, cắt thành đoạn

mẫu có ciều dài 3-5cm và có ít nhất một mắt chồi ngủ.

Khử trùng mẫu vật bằng Clorua thuỷ ngân (HgCl2) 0,1% trong thời

gian từ 5 phút, tráng vài lần bằng nƣớc cất vô trùng cho sạch dung dịch khử

trùng bám trên bề mặt mẫu, rồi cấy cào môi trƣờng tạo mẫu.

3.9.4.2. Nhân tạo mẫu

Môi trƣờng nhân chồi ban đầu là MS (Murashige và Skooge) cải tiến

có bổ sung thêm Riboflavin 0,1 mg/lít, Biotin 0,1 mg/lít, đƣờng 30 g/lít,

Agar-Agar 7 g/lít, và Polyvinyl pyrroline (PVP) 1 g/lít. Điều chỉnh độ pH =

5,8. Môi trƣờng đƣợc hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC ở áp suất 1,1 atm trong

thời gian 20 phút. Môi trƣờng đã hấp vô trùng đƣợc cho vào bình cấy hình

hộp hoặc bình tam giác miệng rộng.

Chồi đƣợc nuôi trong bình đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000

lux, nhiệt độ trong phòng 25oC 2

oC, thời gian chiếu sang là 8h/ngày.

Trƣớc khi cấy chồi phải khử trùng cho panh gắp bằng cách đốt trên

ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy phải đậy lọ bằng nắp nhựa (bình hình hộp)

hoặc nút bông (bình tam giác miệng rộng).

Sau 30 - 35 ngày, khi chồi bất định dài 1,5 - 2,0 cm, cắt và cấy chuyển

sang môi trƣờng nhân chồi MS cải tiến (MS*) đƣợc bổ sung 6g/lít thạch, 1,5

mg/lít BAP và các chất phụ gia, vitamin, điều chỉnh pH = 5,8 và đƣợc hấp vô

trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút.

68

3.9.4.3. Nhân nhanh

Môi trƣờng nhân nhanh chồi cho giống keo lai tự nhiên là môi trƣờng

MS* có bổ sung 6g/lít thạch, 30g/lít đƣờng, 1,5 mg/lít BAP hoặc 2,0mg/l,

cùng các chất phụ gia, các vitamin khác điều chỉnh độ pH đến 5,8 và đƣợc

hấp vô trùng trong điều kiện tƣơng tự nhƣ các môi trƣờng trên.

Chồi đƣợc nuôi trong bình đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000

lux, nhiệt độ trong phòng 25oC 2

oC, thời gian chiếu sáng là 8h/ngày.

Sau đó cứ 22 - 27 ngày cấy chuyển một lần cho đến lúc đủ lƣợng chồi

cần thiết để ra rễ.

3.9.4.4. Nâng cao chất lượng chồi

Môi trƣờng nhân nhanh chồi là MS* có bổ sung 6g/lít thạch, 30g/lít

đƣờng, 1,5mg/lít BAP (hoặc 2,0 mg/l) + 0,5g/lít NAA cùng các chất phụ gia,

các vitamin khác điều chỉnh độ pH đến 5,8 và đƣợc hấp vô trùng trong điều

kiện tƣơng tự nhƣ các môi trƣờng trên.

Cấy từ 3 đến 5 cụm chồi/bình nuôi cấy 250ml (có từ 60-75ml môi

trƣờng) và mỗi cụm chồi có từ 3 đến 5 chồi/cụm. Chồi đƣợc nuôi trong bình

đặt trên giá có độ chiếu sáng 2500 - 3000 lux, nhiệt độ trong phòng 25oC

2oC, thời gian chiếu sáng là 8h/ngày.

Sau 25 - 30 ngày cấy chuyển có thể cho các chồi ra rễ.

3.9.4.5. Cho ra rễ

Môi trƣờng ra rễ cho Keo lai là 1/2 thành phần môi trƣờng MS cải tiến,

bổ sung 7g/lít thạch có bổ sung IBA nồng độ 2 mg/lít, đƣờng 15g/lít và PVP 1

g/lít.

3.9.4.6. Huấn luyện cây

Các chồi keo lai sau khi đã ra rễ trong lọ (khoảng 7-10 ngày) đƣợc

chuyển ra khhu huấn luyện nhằm cho cây thích nghi dần với điều kiện tự

nhiên. Thời gian huấn luyện từ 11-14 ngày.

69

3.9.4.7. Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất:

Sau thời gian huấn luyện, cây mô đã ra rễ đƣợc cấy vào bầu đất với

thành phần nhƣ sau: 70% đất mầu, 10% phân campot và 20% hỗn hợp ruột

bầu, có thể thay hỗn hợp ruột bầu bằng than trấu và xơ dừa.

Lấy cây mầm từ trong lọ, rửa hết thạch bằng nƣớc sạch rồi xử lý bằng

benlat C nồng độ 3% trong 3-5 phút.

Dùng que cấy cắm vào giữa bầu một lỗ có độ sâu 2-3cm, dùng ngón tay

cái và ngón trỏ giữ cho cây thẳng đứng, đƣa nhẹ cây vào lỗ có trên bầu, không

đƣợc làm cong rễ, lấy que cấy ấn nhẹ xung quanh gốc để rễ cây tiếp xúc với

đất, cấy đến đâu dùng ô doa tƣới nhẹ đến đó.

Sau khi cấy cây mô vào bầu cần chú ý che nắng và bảo đảm ẩm cho cây

trong một tuần đầu, sau đó theo chế độ chăm sóc thông thƣờng cho đến khi

cây đủ tiêu chuẩn xuất vƣờn.

70

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

1- Phƣơng pháp khử trùng thích hợp cho các dòng keo lai nghiên cứu là

sử dụng dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% trong vòng 5 phút cho tỷ lệ bật chồi

hữu hiệu đạt 37,5%.

2- Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho các dòng Keo lai nghiên cứu là môi

trƣờng MS cải tiến về thành phần và nồng độ các chất đa lƣợng, vi lƣợng (kí

hiệu MS2).

3- Môi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các dòng keo lai BV376,

BV586 và BB055 là môi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l và

NAA 0,5mg/l.

4- Chế độ chiếu sáng thích hợp để nuôi cấy các dòng Keo lai nghiên

cứu là chiếu sáng 7-9h/ngày với cƣờng độ ánh sáng 2.000-2.500 lux trong cả

chu kỳ nuôi cấy (25 ngày/chu kỳ).

5- Phƣơng thức cấy có hiệu quả nhất trong việc kích thích tạo chồi

cũng nhƣ tiết kiệm đƣợc không gian dinh dƣỡng cho các dòng Keo lai nghiên

cứu là cấy từ 3 đến 5 cụm chồi/bình nuôi cấy 250ml (có từ 60-75ml môi

trƣờng) và mỗi cụm chồi có từ 3 đến 5 chồi/cụm.

6- Môi trƣờng ra rễ thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên cứu là

1/2MS2 + IBA nồng độ 1,5-2,0mg/l cho tỷ lệ ra rễ trên 80%.

7- Thời gian huấn luyện cây con ra rễ trƣớc khi đƣa ra vƣờm ƣơm là từ

11-14 ngày.

8- Giá thể thích hợp nhất để cấy cây mô đã ra rễ là 70% Đất mầu +

20% Than trấu +10% xơ dừa cho tỷ lệ sống trên 80% cây sinh trƣởng tốt.

9- Từ các kết quả trên, đã đề xuất đƣợc quy trình nhân giống bằng nuôi

cấy mô cho các dòng Keo lai nghiên cứu nhằm từ đó chuyển giao giống và

quy trình nhân giống cho các đơn vị nghiên cứu và sản xuất giống cây lâm

nghiệp để phát triển các giống mới này vào trồng rừng sản xuất.

71

4.2. KIẾN NGHỊ

Do hạn chế về thời gian tiến hành các thí nghiệm, các nghiên cứu trong

khuôn khổ luận án này mới chỉ là những kết quả bƣớc đầu. Vì thế, để xác định

phƣơng pháp nhân nhanh tối ƣu cũng nhƣ xây dựng quy trình nhân giống cho

các dòng Keo lai này với mục tiêu chuyển giao công nghệ nhân giống vào

thực tiễn sản xuất, thời gian tới cần có thêm các nghiên cứu bổ sung với quy

mô rộng hơn nhƣ:

+ Đánh giá sinh trƣởng bƣớc đầu của cây con trong giai đoạn vƣờn

ƣơm cũng nhƣ ảnh hƣởng cuả thời vụ tới kết quả huấn luyện cây con tại vƣờn

ƣơm.

+ Cải tiến, tối ƣu hóa môi trƣờng và Phƣơng pháp nuôi cấy cho phù

hợp với điều kiện sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm từ đó xây dựng và hàn

thiện quy trình nhân giống để áp dụng vào sản xuất thực tiễn.

+ Đánh giá khả năng nhân giống cho từng đối tƣợng riêng rẽ cũng nhƣ

nghiên cứu mở rộng về phƣơng pháp ra rễ chồi non bằng chấm thuốc bột kích

thích tạo rễ trong điều kiện vƣờn ƣơm.

72

4. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu và

ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

2. Lê Đình Khả, Đoàn Thị Mai 2002, Một số phƣơng thức nhân giống sinh

dƣỡng trong sản xuất lâm nghiệp‖, Công nghệ nhân và sản xuất giống cây

trồng, giống cây lâm nghiệp và giống vật nuôi, Nhà xuất bản Lao động xã hội

(Chủ biên: Ngô Thế Dân, Lê Hƣng Quốc). Hà Nội, tr. 166-182.

3. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2001, Nhân giống vô tính và trồng rừng dòng vô

tính, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 120 trang.

4. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, 2011, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp Nhà nước

―Nghiên cứu nhân nhanh giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn

uro, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào‖.

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

5. Gupta P.K., Nadgir A.L., Mascarenhas A.F., Jagannathan V, 1980,

Tissue culture of forest trees: Clonal multiplication of Tectona grandis L.

(teak) by tissue culture. Plant Science Letters, 7 (3): 259-268

6. Girijashankar, 2012, In vitro regeneration of Eucalyptus camaldulensis.

Physiol Mol Biol Plants, 18 (1): 79–87.

7. Das T, Mitra GC, 1990, Micropropagation of Eucalyptus tereticornis

Smith. Plant cell Tissue Organ Cult, 22: 95 - 103.

8. Warrag E.I., Lesney M. S. and Rockwood D. L., 1990.

Micropropagation of field tested superior Eucalyptus grandis hybrids. Kluwer

Academic Publishers. New Forests, 4: 67 – 79.

9. Roberson Dibax, Cristiane de Loyola Eisfeld, Francine Lorena Cuquel,

Henrique Koehler, Marguerite Quoirin, 2005, Plant regeneration from

cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis. Sci. Agric., 62 (4): 406 -

412.

73

10. Ho C. K., Chang S. H., Tsay J. Y., Tsay C. J., Chiang V. L., Chen Z. Z.,

1998, Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Eucalyptus

camaldulensis and production of transgenic plants, Plant Cell Rep., 17: 675-680.

11. Sharma S.K., Ramamurthy V., 2000, Micropropagation of 4-year-old

elite Eucalyptus tereticornis trees, Plant Cell Report, 19: 511 – 518.

12. González E.R., Andrade A., Bertolo A.L., Lacerda G.C., Carneiro R.T.,

Defávari V.A.P., Labate M.T.V., Labate C.A., 2002, Production of

transgenic Eucalyptus grandis × E. urophylla using the sonication-assisted

Agrobacterium transformation (SAAT) system, Functional Plant Biology, 29:

97-102.

13. Joshi I., Bisht P., Sharma V. K, Uniyal D. P., 2003, In vitro clonal

propagation of mature Eucalyptus F1 hybrid (E. tereticornis Sm x E. grandis

Hill ex. Maiden), Silvae Genetica, 52 (3-4): 110 - 113.

14. Lainé E., David A., 1994, Regeneration of plants from leaf explants of

micropropagated clonal Eucalyptus grandis, Plant Cell Rep., 13: 473-476.

15. Roberson D., Regina C. Q., Cleusa B., Quoirin M, 2010, Plant regeneration

from cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis dehn and histological

study of organogenesis in vitro, Braz. arch. biol. technol., 53 (2): 311-318.

16. Sotelo M. and Monza J. 2007, Micropropagation of Eucalyptus maidenii

elite trees, Agrociencia, 11: 81 – 89.

17. Sophie N. and Olivier M., 2008, In vitro rooting of two Eucalyptus

urophylla X Eucalyptus grandis mature clones, In Vitro Cellular and

Developmental Biology – Plant, 44(4): 263-272.

18. Natasha Ma, Manoj Kumar, Vikas Shrivastava, Vijayta Sharma, Uma

Bhardwaj, 2012, Direct regeneration of HFRI-5 from nodes internodes and

apical shoot explants, Asia Journal of Plant Science and Research, 2 (6): 653

- 658.

19. Lê Đình Khả, 1999, Nghiên cứu sử dụng giống lai tự nhiên giữa Keo tai

tượng và Keo lá tràm ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

74

20. Dƣơng Mộng Hùng, 1993, Chọn cây trội và nhân giống bằng nuôi cấy

mô tế bào cho hai loài Bạch đàn E. camaldulensis và E. urophylla, Báo cáo

đề tài, trƣờng Đại học Lâm nghiệp, Hà Tây.

21.Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2000, ―Kết quả bƣớc đầu về nhân giống Bạch

đàn lai bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô phân sinh‖, Tạp chí Lâm nghiệp, số

10, tr. 46-47.

22. Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2003, Nhân giống cho một số giống cây rừng

mới chọn tạo bằng nuôi cấy mô, Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội - tháng

11 năm 2003.

23. Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2005, Bƣớc đầu ứng dụng công nghệ mô -

hom trong nhân giống Trầm hƣơng, Tạp chí NN&PTNT (số 2), tr. 57-67.

24. Lê Đình Khả, Dƣơng Mộng Hùng (2003), Giống cây rừng, NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

25. Brand M., & Lineberger R., 1992, In vitro Rejuvenation of Betula

(Betulaceae): Biochemical Evaluation, American Journal of Botany, 79(6),

626-635.

26. Vũ Văn Vụ, 1994, Sinh lý học thực vật, Nhà xuất bản Khoa học - Kỹ

thuật, Hà Nội.

27. Trần Văn Minh, 1994, Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phân viện Công

nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.

28. Nguyễn Văn Uyển, 1993, Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống

cây rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

29. Đỗ Năng Vịnh, 2002, Công nghệ sinh học cây trồng, Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Hà Nội.

30.Von Arnold S., 1982, Factors influencing formation, development and

rooting of adventitious shoots from embryos of Picea abies (L.), Plant Sci.

Lett. 27: 275-287.

75

31.Nguyễn Quang Thạch, 2000, Giáo trình sinh lý thực vật, Nhà xuất bản

Nông nghiệp, Hà Nội.

32.Bhat K. M. and Hwanok Ma (2004), Teak growers unite, in ITTO tropical

forest update.

33. Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng, Vũ Thị Ngọc, Trần Thanh

Hƣơng, Văn Thu Huyền, 2009a, Nuôi cấy một số giống Keo lai mới chọn tạo,

Tạp chí khoa học Lâm nghiệp số 2/2009, trang 905 – 910.

34. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Ngô Thị Minh Duyên, Lƣơng Thị Hoan, 2009b,

Nhân giống sinh dƣỡng và xây dựng mô hình trồng một số dòng keo lá tràm

(Acacia auriculiformis) mới tuyển chọn, Báo cáo Hội nghị KHCN lâm nghiệp

khu vực phía Bắc.

35. Lê Đình Khả, 2003, Nghiên cứu chọn tạo giống và nhân giống cho một

số loài cây trồng rừng chủ yếu ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

36. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2011, Báo cáo tổng kết đề tài ―Nghiên cứu chọn

các dòng keo và bạch đàn chống chịu bệnh có năng suất cao‖, Viện Khoa học

Lâm nghiệp Việt Nam.

37. Beck S.L. and Dunlop R. W., 2001, Micropropagation of the Acacia

species – A review, In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant, 37:531–538.

38. Darus H. Ahmad (1994), Multiplication of Acacia mangium by stem

cutting and tissue culture techniques, Advances in tropical acacia research,

pp. 32-34.

39. Gerard C. Douglas and John Mcnamara, 1999, Shoot regeneration from

seedling explants of Acacia mangium Willd. In Vitro Cellular & Developmental

Biology - Plant, 36: 412–415

40. De-Yu Xie and Yan Hong, 2001, In vitro regeneration of Acacia

mangium via organogenesis, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 66(3):167-

173.

76

41. Nanda R.M., Rout G.R., 2003, In vitro somatic embryogenesis and plant

regeneration in Acacia arabica, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 73,

131-135.

42. Nanda R. M., Das P., Rout G. R., 2004, In vitro clonal propagation of

Acacia mangium Willd. and its evaluation of genetic stability through RAPD

markers. Ann. For. Sci. 61 (2004) 381–386.

43. Mittal A., Agarwal R. and Gupta S.C., 1989, In vitro development of

plantlets from axillary buds of Acacia auriculiformis — a leguminous tree,

Plant Cell Tiss Organ Cult 19, 65–70.

44. Trindate H. F., Pais J. G., Aloni M. S., 1990, The role of Cytokinin and

auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globolus grown in vitro,

Aust. For. 53(4), pp. 221-223.

45. Shukor N.A.A., Griffin A., Jainol J.E., Awang K., Basharuddin J.,

Ismail H., Yusoff A.M., 2000, Shoot proliferation of three potential tropical

plantation tree species, Proceedings of Forests and Society (2000): The Role

of Research, Posters IUFRO World Congress, Malaysia, p. 74.

46. Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự, 1995, Nhân giống Keo lai bằng nuôi cấy

mô phân sinh, In trong Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ giai đoạn

1990-1995, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

47. Nguyễn Ngọc Tân, Trần Hồ Quang, Ngô Thị Minh Duyên, 1997, Nhân

giống Keo lai bằng nuôi cấy mô phân sinh, In trong Kết quả nghiên cứu khoa

học về chọn giống cây rừng, Tập 2, Chủ biên Lê Đình Khả, NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

48. Lê Sơn và các cộng tác viên, 2013, Hoàn thiện quy trình nhân nhanh

bằng nuôi cấy mô cho 6 giống Keo lai đã được công nhận, Báo cáo dự án

SXTN cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

49. Cấn Thị Lan và cộng sự, 2017, Nghiên cứu nhân nhanh một số giống

Keo và Bạch dàn mới bằng công nghệ tế bào thực vật, Báo cáo tổng kết đề tài

cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

77

50. Cấn Thị Lan và cộng sự, 2020, Hoàn thiện công nghệ vi nhân giống

quy mô công nghiệp và sản xuất các giống Keo lá tràm Clt18, Clt57, Clt98,

Báo cáo tổng kết dự án sxtn cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt

Nam.

PHỤ LỤC

Bảng 1. Môi trƣờng MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962)

Thành phần hóa chất Hàm lƣợng (mg/l)

KNO3 1900

NH4NO3 1650

MgSO4.7H2O 370

KH2PO4 170

CaCl2 332

H3BO3 6,2

MnSO4.H2O 22,3

ZnSO4 8,6

Na2MO4 0,25

CuSO4.7H2O 0,025

CoCl2 0,025

Na2EDTA 37,3

FeSO4.7H2O 27,8

Glycin 2

Myo-inositol 100

Nicotinic acid 0,5

Thiamin HCl 0,1

Prydoxin HCl 0,5

Bảng 2. Thành phần môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (kí hiệu MS1)

Thành phần hóa chất Hàm lƣợng (mg/l)

KNO3 1900

NH4NO3 1650

KH2PO4 170

CaCl2 220

MgSO4 180

Na2EDTA 37,3

FeSO4.7H2O 27,8

MnSO4.4H2O 16,7

H3BO3 6,2

ZnSO4.7 H2O 8,6

KI 0,83

Na2MoO4.2 H2O 0,25

CoCl2.6H2O 0,025

CuSO4 0,025

Glycin 2,0

Myo-Inositol 100

Nicotinic acid 5,0

Pyridoxine HCl (vitamin B6) 5,0

Thiamine HCl (vitamin B1) 1,0

Biotin 0,01

Axit ascorbic (Vitamic C) 100

PVP 1000

Casein 100

Bảng 3. Thành phần môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (Kí hiệu MS2)

Thành phần hóa chất Hàm lƣợng (mg/l)

KNO3 1900

NH4NO3 1650

KH2PO4 225

CaCl2 440

MgSO4 370

Na2EDTA 37,3

FeSO4.7H2O 27,8

MnSO4.4H2O 33,75

H3BO3 9,3

ZnSO4.7 H2O 12,9

KI 1,25

Na2MoO4.2 H2O 0,3

CoCl2.6H2O 0,03

CuSO4 0,03

Glycin 2,0

Myo-Inositol 150

Nicotinic acid 1,0

Pyridoxine HCl (vitamin B6) 1,0

Thiamine HCl (vitamin B1) 1,0

Biotin 0,1

Axit ascorbic (Vitamic C) 150

PVP 1000

Casein 100

Bảng 4. Môi trƣờng MS* (là môi trƣờng MS giảm ½ Nitơ tổng số)

Thành phần Hàm lƣợng (mg/l)

KNO3 950

NH4NO3 825

MgSO4.7H2O 370

KH2PO4 170

CaCl2 332

H3BO3 6,2

MnSO4.H2O 22,3

ZnSO4 8,6

Na2MO4 0,25

CuSO4.7H2O 0,025

CoCl2 0,025

Na2EDTA 37,3

FeSO4.7H2O 27,8

Glycin 2

Myo-inositol 100

Nicotinic acid 0,5

Thiamin HCl 0,1

Prydoxin HCl 0,5

Bảng 5. Xử lý số liệu vào khử trùng mẫu

ANOVA Tỷ lệ sống (%)

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 984.3 19 523.4 22.90 .000

Within groups 121.5 40 144.65

Total 1105.8 59

ANOVA Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 864.3 19 412.6 71.84 .000

Within groups 71.2 40 74.57

Total 935.5 59

ANOVA Tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu (%)

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 542.1 19 523.4 6.22 .000

Within groups 62.3 40 144.65

Total 604.4 59

Bảng 6. So sánh hiệu quả khử trùng từng giống

ANOVA Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 864.3 2 412.6 71.84 .000

Within groups 71.2 4 74.57

Total 935.5 6

ANOVA Tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu (%)

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 542.1 2 523.4 6.22 .000

Within groups 62.3 4 144.65

Total 604.4 6

Bảng 7. Kết quả phân tích ANOVA this nghiệm xác định môi

trƣờng nuôi cấy cơ bản

ANOVA Hệ số nhân chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 64.2 2 151.2 5.34 .000

Within groups 41.7 4 81.9

Total 105.9 6

ANOVA chiều dài chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 182.4 2 478.1 7.28 .000

Within groups 63.7 4 157.3

Total 246.1 6

Bảng 8. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định môi

trƣờng nhân nhanh

ANOVA Hệ số nhân chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 684.1 6 452.2 5.34 .000

Within groups 411.3 12 180.2

Total 1095.4 18

ANOVA chiều dài chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 689.7 6 788.2 8.4 .000

Within groups 243.5 12 247.7

Total 933.2 18

Bảng 9. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định môi

trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi

ANOVA Hệ số nhân chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 745.2 6 234.1 6.81 .000

Within groups 214.6 12 167.9

Total 959.8 18

ANOVA chiều dài chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 871.2 6 647.3 5.77 .000

Within groups 321.4 12 189.2

Total 1192.6 18

Bảng 10. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định độ chiếu

sáng thích hợp

ANOVA Hệ số nhân chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 453.1 3 145.8 7.24 .000

Within groups 68.4 6 48.4

Total 521.5 9

ANOVA chiều dài chồi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 245.8 3 89.4 4.25 .000

Within groups 89.4 6 46.2

Total 335.2 9

ANOVA tỷ lệ chồi hữu hiệu

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 465.2 3 245.3 6.25 .000

Within groups 189.7 6 141.1

Total 654.7 9

Bảng 11. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định độ chiếu

sáng thích hợp

ANOVA Tỷ lệ ra rễ

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 897.2 8 258.1 12.3 .000

Within groups 124.6 16 68.4

Total 1021.8 24

ANOVA chiều dài rễ

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 342.5 8 108.5 7.4 .000

Within groups 121.4 16 62.1

Total 463.9 24

ANOVA số rễ trung bình

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 415.3 8 312.4 9.46 .000

Within groups 99.4 16 105.8

Total 514.7 24

Bảng 12. Kết quả phân tích ANOVA thí nghiệm xác định thời gian

huấn luyện

ANOVA Tỷ lệ cây sống

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 245.8 5 152.7 5.2 .000

Within groups 64.7 10 57.3

Total 309.5 15

ANOVA chiều cao trung bình

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between groups 264.1 5 106.7 4.4 .000

Within groups 98.6 10 72.6

Total 362.7 15