nghiÊn cỨu phÁt triỂn hỆ thỐng chuyỂn gen bẰng...
TRANSCRIPT
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------
Nguyễn Thị Khuyến
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN
GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn
Hà Nội - 2016
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 4
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 6
1.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae ......................................................... 6
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae ................................................ 6
1.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae ................................................................. 7
1.1.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae .......................................................................................... 8
1.1.4. Ph}n biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin .... 9
1.2. C|c phương ph|p chuyển gen v{o nấm sợi ............................................................... 12
1.2.1. Phương ph|p chuyển gen sử dụng tế b{o trần (protoplast) .......................... 12
1.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation) ................................. 13
1.2.3. Phương ph|p chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT) .... 13
1.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc c|c chủng chuyển gen .................................... 17
1.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm .......................................... 19
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 23
2.1. Nguyên liệu .............................................................................................................................. 23
2.1.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................................................ 23
2.1.2. Thiết bị v{ hóa chất ........................................................................................................... 25
2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu..................................................................... 28
2.2. Phương ph|p nghiên cứu .................................................................................................. 28
2.2.1. Thu nhận b{o tử nấm ....................................................................................................... 29
2.2.2. T|ch chiết DNA, RNA v{ tổng hợp cDNA ................................................................. 29
2.2.3. Quan s|t hình th|i v{ kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa ................ 30
2.2.4. Ph}n biệt A. oryzae v{ A. Flavus bằng c|c kỹ thuật sinh học ph}n tử ........ 31
2.2.5. Tạo c|c vector nhị thể dùng cho chuyển gen ........................................................ 32
2.2.6. Chuyển gen v{o nấm sợi A. oryzae ............... Error! Bookmark not defined.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................... Error! Bookmark not defined.
3.1. X|c nhận chủng A. oryzae an to{n để sử dụng cho chuyển gen ............... Error!
Bookmark not defined.
3.1.1. Ph}n biệt c|c chủng A. oryzae an to{n v{ chủng Aspergillus flavus sinh độc
tố aflatoxin .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen . Error! Bookmark not
defined.
3.2. Lựa chọn marker chuyển gen v{o A. oryzae Error! Bookmark not defined.
3.3. X}y dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ...... Error!
Bookmark not defined.
3.3.1. Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil ........... Error!
Bookmark not defined.
3.3.2. Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen v{o A. oryzae trợ dưỡng
uridine/uracil .................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.4. Đ|nh gi| hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP v{
DsRed Error! Bookmark not defined.
3.4.1. Chuyển gen GFP v{ DsRed v{o nấm sợi A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
.................................................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.4.2. X|c nhận c|c thể chuyển gen .......................... Error! Bookmark not defined.
3.5. Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA m~ hóa
enzyme phytase của A. fumigatus ở A. oryzae ..... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 34
MỞ ĐẦU
Aspergillus oryzaelà loài nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực
phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nước châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung
Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines. Loài nấm này đã
được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn
(GRAS). Ở Việt Nam, A. oryzae được sử dụng để sản xuấttương truyền thống tại một
số địa phương ở các tỉnh phía Bắc.A. oryzae có khả năng tiết một lượng lớn các
enzyme khác nhau vào môi trường. Do đó, loài nấm này được sử dụng như nhà máy
tế bào để sản xuất thương mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên và tái
tổ hợp. Gần đây chủng A. oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại Nhật
Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen. Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của A.
oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm sợi
an toàn này.
Hiện nay, hai phương pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là
chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Tuy nhiên việcchuyển gen vào nấm sợiA. oryzaecho đến nay chỉ sử
dụng phương pháp chuyển gen qua tế bào trần.Phương pháp này tương đối phức tạp
và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn với chi phí
hợp lý. Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành
công ở nấm sợi A. oryzae. Bên cạnh đó, A. oryzaecókhả năng kháng lại hầu hết các
hợp chất kháng sinh thường được sử dụng cho chuyển gen.Do đó phát triển các
chủng A. oryzae trợ dưỡngđể sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải
biến di truyền cũng như biểu hiện gen ởA. oryzae.
Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển genhiệu quả cho nấm sợi A. oryzae
thông quavi khuẩn A. tumefaciensnhằm phục vụ hướng nghiên cứu bền vững về biểu
hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài“Nghiên
cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
cho nấm sợi Aspergillus oryzae” với những nội dung chính như sau:
- Xác nhận các chủng A. oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tượng
chuyển gen.
- Tạo chủng A. oryzae đột biến trợ dưỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen
pyrG.
- Tạomột số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu
hiện gen ở nấm sợi A. oryzae.
- Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh
quangGFP vàDsRed.
- Bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạođược để biểu hiện gen
phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus.
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về nấm sợiAspergillus oryzae
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợiAspergillus oryzae
Nấm sợiA. oryzae thuộc phân nhóm Flavicủachi Aspergillus, trong
họTrichocomaceae. A. oryzae có cấu tạo đa bào, khi được nuôi cấy trên môi trường
đĩa thạch,hệ sợicó màu trắng xámsau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến
xanh. Hệ sợi nấm A. oryzae sinh trưởng rất nhanh và phân mảnh, chiều ngang có kích
thước 5-7 µm. Trên những sợi này hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi là cuống
sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của A. oryzae thường dài 1-2 mm. Trên cuống phồng
lên tạo thành bọng, từ bọng này mọc lên các tế bào nhỏ, thuôn dài hình chai, xếp sát
nhau, gọi là thể bình; trên thể bình có đính những chuỗi bào tử màu vàng lục hay
màu vàng hoa cau (còn gọi là bào tử đính)[31, 53, 80, 99]. Hình thái khuẩn lạc và
cuống sinh bào tử của nấm sợi A. oryzae được Machida và cộng sựmô tả chi tiết như
trong Hình 1.1.
Hinh 1.1.Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi Aspergillus
oryzae RIB40[53]
Nấm sợiA. oryzae sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng có thể sinh
trưởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau như các mảnh vụn
thực vật, cây lá, gỗ mục nát, các loại hạt, thức ăn gia súc...A. oryzae phân bố rộng rãi
trên toàn thế giới, đặc biệt phổ biếnở các nước nhiệt đới. Trong quá trình sinh trưởng
và phát triển, A. oryzae tiết ra môi trường một lượng lớn các enzyme thủy phân như
cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase[36, 53].
1.1.2.Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae
Gần đây, chủng A. oryzaeRIB40 được sử dụngtrong công nghiệp sản xuất các
thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen,
theo đó hệ gencủa A. oryzaegồm 8 nhiễm sắc thể với tổng kích thước là 37 megabase
(Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25%-30% so với các loài khác
thuộc chi Aspergillus. Chẳng hạn,hệ gen của A. oryzae lớn hơn loài A. nidulans(loài
chuẩn dùng cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm) và A. fumigatus(tác nhân gây
bệnh cơ hội ở người) lần lượt là 29% và 34%[53].Hệ gencủa A. oryzae lớn hơnchủ
yếu do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa. Việc mở rộng kích thước hệ gen
dường như đặc trưng cho các loài có quan hệgần gũi với A. oryzaenhư A. niger và A.
flavus, các loài này cókích thước hệ gen tương đương nhau. Đặc biệt loài có quan hệ
rất gần gũi với A. oryzae là A. flavuscó độ tương đồng DNA đến 99,5%[2, 53, 85].
A. oryzae có khả năng phân giải mạnh nhiều loại cơ chất có trong tự nhiêndo
loài này sở hữu các gen mã hóa enzyme thủy phân khác nhau. Các loàiA. oryzae, A.
fumigatusvà A. nidulans chứa lần lượt 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease,
chiếm khoảng 1% tổng số các gen trong hệ gen. Tất cả các gen mã hóa protease được
tìm thấy trong A. fumigatus và/hoặcA. nidulansđều có mặt trong A. oryzae, tuy
nhiêncác gen mã hóa một sốenzyme aminopeptidase có mặt trongA. oryzaelại không
có mặt trong hệ gen củaA. fumigatus và A. nidulans. Ngoài ra,A. oryzaecòn sở hữu
thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả năng hoạt động trong môi trường có tính
axit. Sự gia tăng các protease hoạt động trong pH axit củaA. oryzaecó thể hình thành
trong quá trình thuần hóa của con người [53].Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của
Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu cải biến di truyền
ứng dụng loài nấm an toàn này trong sản xuất các sản phẩm nhằm phục vụ mục đích
con người.
1.1.3. Vai trò của nấm sợiA.oryzae
Nấm sợiA. oryzaeđược thuần hóa từ ít nhất 2000 năm trước và hiện nay được
sử dụng rộng rãitrong sản xuất thực phẩmởNhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông
Á như lên men đậu nành, làm nước sốt, tương và một số đồ uống có cồn như
huangjiu, sake, makgeolli và shochu[4, 36, 111]. A. oryzae được sử dụng rộng rãi
trong thực phẩm do đặc tính sinh trưởng nhanh,tiết lượng lớn các enzyme thủy
phânnhư amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh
trưởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho các sản phẩm lên men[37].Trong lên men truyền
thống, A. oryzae thường được nuôi ởmôi trường rắn, điều kiện này thích hợp cho sự
phát triển hiếu khí của sợi nấm. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi
trường rắn giúp tăng khả năng sản sinh các enzyme và các chất chuyển hóa mà
thường sẽ không được sản xuất trong điều kiện lên men lỏng[99].
Ngoài vai trò trong sản xuất các thực phẩm truyền thống, nấm sợi A. oryzae
còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh tế
cao như glucoamylase, α-amylase và một số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo, đồ
uống. Glucoamylase và α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần 20%
tổng sản lượng enzyme được sản xuất, trong đóchủ yếu được sản xuất bởinấm sợiA.
oryzae[16, 81, 98, 113].Nguồn cung cấp enzyme protease cho công nghiệp sản xuất
thực phẩm và các chất tẩy rửa đến từ các loài nấm sợi thuộc chi Conidiobolus,
Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó phải kể đến loài sinh protease rất
cao là A. oryzae[1, 106].
Bên cạnh những lợi ích về kinh tế, A. oryzae còn được coi là vi sinh vật mô
hình dùng cho nghiên cứu về biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp. Ngoài ra nghiên
cứu chuyển gen còn hỗ trợ trong việctìm ra chức năng cũng như vai trò của các gen
mới[54].
1.1.4. Phân biệt Aspergillus oryzae vớiAspergillus flavussinh độc tố
aflatoxin
Hiện nay, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư tăng lên ngày một tăng cao. Một trong
những nguyên nhân chính là do ăn phải thực phẩm chứa các chất gây ung thư, trong
đó cóđộc tố nấm aflatoxin. Độc tố aflatoxin được sinh ra bởi nấmmốcAspergillus
flavusvà Aspergillus parasiticustrên các loại hạt nông sản quan trọng không được bảo
quản tốt như gạo,lạc, ngô, đậu tương... Hình thái củaA. flavusgần như giống hệtvới
loàiA. oryzaemà thường được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm[17, 26,
80].
A. flavusvà A. oryzaelà hai loài thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus.
Tương tự như A. oryzae, nấm sợi A. flavus có khả năng tồn tại ở nhiệt độ từ 12ºC đến
48ºC và sinh trưởng tối ưu nhất ở 28ºC đến 37ºC. Hầu hết trong chu trình sống A.
flavus tồn tại ở dạng hệ sợi và sinh sản bằng bào tử đính.Giống với một số chủng A.
oryzae, dưới điều kiện bất lợi, sợi nấm A. flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt gọi là
hạch nấm (sclerotia). Hạch nấm giúp chúng có thể tồn tại dưới các điều kiện khắc
nghiệt. Khi điều kiện trở nên thuận lợi, các hạch nấm sẽphát triển thành dạng sợi vàtừ
đó sinh ra các cuống mang bào tử đính, phát tán ra ngoài môi trường đất và không
khí [17, 26].
Trong tự nhiên, rất khó để có thể phân biệt hai loài A. oryzae và A. flavus bởi
hình thái rất giống nhau.Hơn nữa,khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài,
nhận thấy genome của chủng A. oryzae RIB40 và A. flavus NRRL 3357 có độ tương
đồng 99,5% DNA và 98% protein [85]. Phân tích tiến hóa trên một số chủng thuộc
hai chi này, nhận thấyA. flavus và A. oryzaecó mức độ tương đồng tùy thuộc vào
từng chủng. Ví dụ như hai chủngA. flavusSRRC 1357 và SRRC 2112có mối quan hệ
gần gũi với A. oryzae hơn các chủngA. flavus khác, do có nhiều đặc điểm của A.
oryzae hơn (Hình 1.2). Từ các dữ liệu về hệ gen, A. oryzaeđược cho rằng có nguồn
gốc phát sinh từ loài A. flavus[18].
Hinh 1.2.Mối quan hệ phát sinh loài và sự khác biệt trong hệ gen củaA. oryzae và
A. flavus (màu xanh lam là A. oryzae, màu xanh lá cây là A. flavus)[18]
A. oryzaekhác với A. flavus ở việc mất khả năng sinh độc tốaflatoxin trong quá
trình sinh trưởngdo trong quá trình tiến hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và đột biến
mất đoạn ở một số gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin[8]. Con đường sinh tổng
hợp aflatoxin bắt nguồn từ axit norsolorinic (NOR), trải qua ít nhất 23 quá trình chuyển hóa
trung gian, nhờ các enzyme được mã hóa bởi 25 gen nằm trong một vùng DNA kích thước
70 kb để tạo thành aflatoxin có độc tính cao nhất là aflatoxin B1 (AFB1)[47, 97, 112].
Các bước chuyển hóa được thực hiện bởi các enzyme có chức năng riêng biệt. Các
gen liên quan đến từng bước chuyển hóa trong quá trình sản xuất aflatoxin trong tế bào
nấm được liệt kê tại Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các gen liên quan trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin.
Các gen liên quan Quá trinh chuyển đổi
aflA (fas-2), aflB (fas-1), và aflC (pksA) Acetate -> NOR
aflD (nor-1), aflE (norA), và aflF (norB) NOR -> AVN
aflG (avnA) AVN -> HAVN
aflH (adhA) HAVN -> AVF
aflI (avfA) AVF -> VHA
aflJ (estA) VHA -> VAL
aflK (vbs) VAL -> VERB
aflL (verB) VERB -> VERA
aflM (ver-1) và aflN (verA) VERA -> DMST
aflO (omtB, dmtA) DMST -> ST; DMDHST -> DHST
aflP (omtA) ST -> OMST; DMST -> DHOMST
aflQ (ordA) OMST -> AFB1, AFG1
DMDHST -> AFB2, AFG2
Trong hai thập kỷ qua, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng để
phân biệt các loài thuộc phân nhóm Flavi như kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction)[10], RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)[38], AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism) [66], phân tích so sánh trình tự vùng
ITS (Internal Transcribed Spacer) của DNA ribosome[41] hoặc phân tích tính đa
hình nucleotide đơn SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [45]. Tuy nhiên, các
phương pháp kể trên vẫn còn những hạn chế nhất định trong việc phân biệtA.
oryzaevàA. flavus hoặc thiếu sự ổn định trong các lần lặp lại thí nghiệm[8]. Dựa trên
sự khác biệt về trình tự DNA của nhóm gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin ở
A. flavus và A. oryzae, một số cặp mồi PCR đặc hiệu cho các gen này đã được thiết
kế và sử dụng để phân biệt A. flavusvàA. oryzae[10].
1.2.Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi
Các nghiên cứu về di truyền học phân tử của nấm sợi đã có những đóng góp
đáng kể cho sự hiểu biết của con người về cơ chế gây bệnh và các con đường sinh
tổng hợp enzyme, protein. Chuyển gen là một công cụ không thể thiếu trong các
nghiên cứu này.
Hiện nay, nhiều phương pháp chuyển gen được sử dụng như chuyển gen thông
qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng súng bắn
gen và chuyển gen sử dụng vi sinh vật trung gian là vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng và tùy thuộc vào
từng loài mà hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phương pháp. Tuy nhiên
phương pháp được sử dụng phổ biến nhấtở nấm sợi làchuyển gen qua tế bào trần
(protoplast), chuyển gen bằng xung điện (electroporation)và chuyển gen trung gian
qua vi khuẩn A.tumefaciens[6, 51, 62, 63].
1.2.1. Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)
Ðể chuyển gen vào nấm thông qua tế bào trần, tế bào nấm cần được xử lý
enzyme nhằm loại bỏ thành tế bào, từ đó tạo protoplastgiúpDNA dễ dàng xâm nhập
vào tế bào. Phương phápnày có thể được sử dụng để chuyển trực tiếp các đoạn DNA
hoặc các vector mang gen mong muốn vào tế bào. Ðể nâng cao hiệu quả chuyển gen,
protoplast thường được xử lý với PEG (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện.
Phương pháp chuyển gen này khá hiệu quả, đặc biệt đối với những loài mà các
phương pháp chuyển gen kháckhông thể thực hiện được. Tuy nhiên, quá trìnhchuẩn
bị protoplast cũng như các bước chuyển genkhá phức tạp, tốn nhiều công sức, chi phí
cao và không ổn định, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm, không thể
áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ. Đặc biệt protoplast phải được
sử dụng ngay sau khi chuẩn bị[51, 57].
1.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện là phương pháp cơ học được sử dụng để
đưa các phân tử DNA vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp
này, một xung điện cao thế trong thời gian rất ngắn (vài phần nghìn giây) tạo ra các
lỗ thủng tạm thời giúp cho các phân tửDNA ngoại lai từ môi trường có thể xâm nhập
vào bên trong tế bào. Phương pháp xung điện đã được áp dụng thành công trên nhiều
loại tế bào, trong đó có tế bào nấm sợi[6, 7]. Trước khi xửlý với xung điện, bào tử
nấm nảy chồi sẽ được loại bỏ thành tế bào bằng một số enzyme để tạo tế bào trần.
Sau đó tế bào trần được trộn với DNA và được đưa vào máy tạo xung điện để chuyển
DNA vào trong tế bào nấm [7]. Phương pháp này mới chỉ áp dựng thành công với
một số loài nấm sợi và đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá trình
chuyển gen.
1.2.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
(ATMT)
1.2.3.1. Cơ chế chuyển gen vào tế bào chủ của A. tumefaciens
Vi khuẩn A. tumefacienslà một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc
chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae. Vi khuẩn A. tumefaciens là tác nhân gây khối u
trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u (Ti-
plasmid) của nó vào tế bào thực vật. Các gen nằm trên T-DNA mã hóa cho các
enzyme ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mất kiểm soát của tế bào thực vật là nguyên
nhân chính dẫn đến sự hình thành khối u[28, 108]. Quá trình chuyển gen gây khối u
nằm trên Ti-plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens được mô tả trên Hình 1.3.
Hinh 1.3.Vi khuẩn A. tumefaciens gây khối u trên thực vật [95]
Ti plasmid có kích thước 200 kb-800 kb, bao gồm đoạn T-DNA được giới hạn
bởi biên trái (LB) và biên phải (RB), các biên có kích thước khoảng 25 bp.T-DNA
mang gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine. Các gen này sẽ tích hợp vào hệ gen
của thực vật ở một vị trí ngẫu nhiên. Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có vùng gen
độc, chứa các gen virmã hóa các protein (virA, virG, và một số protein khác)giúp vận
chuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật[28]. Các gen vir này chính là yếu tố quyết
địnhkhả năng chuyển T-DNA vào tế bào chủ của vi khuẩn Agrobacterium. Sự hoạt
động của các gen virđược cảm ứng bởi hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật,
có tên là acetosyringone (AS) [63]. Khi có mặt chất cảm ứng, gen vir hoạt động dẫn
tới quá trình chuyển T-DNA trên Ti plasmid vào tế bào.
1.2.3.2. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Trong điều kiện có chất cảm ứng, vi khuẩnA. tumefaciens sẽ chuyển một phần
DNA trên Ti plasmid (còn gọi là T-DNA) của nó vào tế bào thực vật. T-DNA sau đó
được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen [24, 28]. Lợi dụng cơ chế này, vi khuẩn A.
tumefaciens được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ
những năm 1980, sau đó vào năm 1998 vi khuẩn này lần đầu tiên được ứng dụng
thành công để chuyển gen vào nấm[12].
Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được coi là
phương pháp đơn giản nhất để chuyển gen vào nấm sợi. Phương pháp ATMT chuyển
gen vào nấm dựa trên cơ chế chuyển đoạn T-DNA trên Ti-plasmid có mặt trong tế
bào vi khuẩn sau đó tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen nấm. Các gen cần chuyển sẽ
được gắn vào vùng T-DNA, sau đó được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciensdùng
cho chuyển vào nấm. Phương pháp chuyển gen này đã được thực hiện thành công
trên nhiều loài nấm sợi khác nhau[12, 23, 62, 63, 93].
Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens cần một hệ thống
gồm hai plasmid là plasmid trợ giúp (vir helper)có chứacác gen vir (virulence) giúp
vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ, và một vector nhị thể(binary vector)chứa đoạn T-
DNA đã được cải biến cho mục đích chuyển gen[63]. Trên vectornhị thể cóchứa gen
kháng kháng sinh dùng để chọn lọc vi khuẩn mang vector và vùng T-DNA giới hạn
bởi hai biên LB (left border) và RB (right border) có chứa marker chọn lọc thể
chuyển gen và một vùng DNA có thể được cải biến tùy vào mục đích chuyển gen[27,
74]. Mô hình hệ thống vector nhị thể hiện trong Hình 1.4.
Hinh 1.4.Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể cho chuyển gen vào nấm
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens[46]
Một trong những ưu điểm lớn nhất của phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn
A. tumefaciens là có thể tạo ra một loạt các thể đột biến ngẫu nhiên do T-DNA từ
tế bào vi khuẩn chèn ngẫu nhiên vào hệ gen của vi nấm. Một số nghiên cứu chỉ ra
rằng A. tumefaciens chèn T-DNA vào hệ gen của nấm chủ yếu chỉ ở dạng một bản
đơn và đoạn T-DNA này có thể phá hủy một gen duy nhất ở thể biến nạp tương ứng.
Từ việc nghiên cứu các thể đột biến chèn ngẫu nhiên có thể giúp xác định chức năng
của gen.Ngoài chức năng biểu hiện và tạo các thể đột biến ngẫu nhiên, phương pháp
chuyển gen bằng A. tumefaciens còn được sử dụng trong việc xóa các gen nhờ cơ chế
trao đổi chéo tương đồng trong tế bào nấm[49].
Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã được ghi nhận
chuyển thành công ở một số loài nấm sợithuộc chi Aspergillus (A. fumigatus, A.
awamori, A. japonicas, A. niger), tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến
việc chuyển gen vào A. oryzae thông qua vi khuẩn A. tumefaciens[12, 23, 62, 63, 93].
1.2.3.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens thực hiện đơn giản
hơn nhiều so với các phương pháp khác, tuy nhiênthời gian tiến hành dài hơn do cần
thời gian đồng nuôi cấy cảm ứnggiữa nấm và vi khuẩn [62]. Nguyên liệu của chuyển
gen có thể sử dụng hệ sợi hoặc bào tử nấm mà không cần bất cứ khâu xử lý bổ xung
nào như chuyển gen qua protoplast hay chuyển gen bằng xung điện. Thậm chí, chỉ sử
dụng phương pháp này mới khả thi đối với một số loài nấm[90, 102]. Hiệu quả
chuyển gen vàonấm sợikhi sử dụng vi khuẩn Agrobacterium thu được số thể chuyển
cao hơn nhiều lần so với chuyển gen bằng tế bào trần nhờ PEG [61, 86]. Bên cạnh
đó, các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng việc xóa gen ở nấm nhờ cơ chế trao đổi
DNA tương đồng nhờ A. tumefaciens đạt hiệu quả cao hơn so với xóa gen bằng các
phương pháp khác. Hiệu quả xóa gen khi sử dụng protoplast chỉ đạt 1%-50%, nhưng
khi sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens hiệu quả có thể đạt đến 97% [11].
1.2.3.4. Ứng dụng của phương pháp ATMT trong cải biến di truyền
Phương pháp chuyển gen vào nấm bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã được
chứng minh lợi thế hơn các phương pháp chuyển gen thông thường. Nguyên liệu ban
đầu có thể được sử dụng như sợi nấm, tế bào trần hoặc bào tử. Chuyển gen bằng
phương pháp ATMT tạo một tỷ lệ cao các thể đột biến ngẫu nhiên do T-DNA chèn
vào hệ gen vật chủ[12, 61, 68]. Ngoài ra, chuyển gen bằng phương pháp này có thể
tạo ra các trao đổi chéo tương đồng. Do đó là công cụ hữu ích để xóa và xác định các
chức năng của gen [63].
Để xác định chức năng của một gencụ thể, phương pháp hữu hiệu nhất là gây
đột biến xóa hoặc làm hỏng gen đó. Xóa một gen cụ thể ởSaccharomyces
cerevisiaeđạt hiệu quả cao và chỉ cần hai đoạn tương đồng nhỏ (50 bp) ở hai phía
trình tự mã hóa[91].Tuy nhiên, ở nấm sợi cần hai đoạn tương đồng kích thước lớn
hơn.Xóa gen sử dụng phương pháp ATMT được ghi nhận là có hiệu quả cao hơn so
các phương pháp chuyển gen khác. Hiệu quả xóa gen dao động từ 14% đến 75%, cao
hơn hẳn so với các phương pháp chuyển gen thông thường[63].
1.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen
Hiện nay, marker dùng trong chọn lọc các thể chuyển gengồm 2 loại là gen
kháng kháng sinhvà các gen liên quan đến sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất
thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của nấm.
1.2.4.1. Gen kháng kháng sinh dùng trong chuyển gen ở nấm
Các loại kháng sinh kháng nấm thông dụng nhất được sử dụng trong chọn lọc
thể chuyển gen là hygromycin B, phleomycin và nourseothricin. Hygromycin B là
một loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, được sản xuất từxạ khuẩn
Streptomyces hygroscopicus. Chúng có thể tiêu diệt vi khuẩn, nấm và các tế bào nhân
chuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein[76]. Phleomycin được sản xuất bởi xạ
khuẩn Streptomyces verticillus, là một kháng sinh phổ rộng có hiệu quả chống lại hầu
hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, thực vật và tế bào động vật. Kháng sinh
phleomycin thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide, gây chết tế bàobằng cách bám vào
DNA và làm phá vỡ sợi kép của DNA dẫn đến các hoạt động của tế bào bị ngừng và
chết[9]. Nourseothricin, với tên thương mại là clonNAT, thuộc nhóm kháng sinh
aminoglycoside có nguồn gốc từ loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Kháng sinh
nàyhoạt động bằng cách gây lỗi mã hóa trong quá trình dịch mã dẫn tới không tổng
hợp được protein. ClonNAT được dùng rất phổ biến làm marker chọn lọc thể chuyển
gen gồm cả vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tế bào thực vật [39].
1.2.4.2. Gen trợ dưỡng dùng làm marker cho chuyển gen
Chủng nấm đột biến trợ dưỡng là các chủng mất khả năng sinh tổng hợp một
loại axit amin hoặc một hợp chấtcần thiết trong quá trình sinh trưởng, việc mất khả
năng tự tổng hợp khiến chúng không còn khả năng sinh trưởng trên môi trường tối
thiểu mà cần phải bổ sung thêm axit amin hoặc hợp chất tương ứng. Gen trợ dưỡng
được sử dụng nhiều nhất trong chọn lọc thể chuyển gen là gen pyrG (mã hóa protein
tham gia quá trình tổng hợp uridine/uracil)[49, 59, 94]. Ngoài ra còn có các gen trợ
dưỡng khác cũng được sử dụng nhưadeA(gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp
adenine), met(gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp methionine), trp(gen mã hóa
enzyme tham gia quá trình tổng hợp tryptophan), argB (gen mã hóa enzyme tham gia
quá trình tổng hợp arginine)…[30, 116].
Các marker dùng cho chọn lọc các thể chuyển gen giữ vai trò hết sức quan
trọng, quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen. Phần lớn các nghiên cứu
chuyển gen vào nấm sợi sử dụng các chất kháng sinh diệt nấm. Tuy nhiên, các kháng
sinh này thường có giá thành rất cao, khiến việc chuyển gen bị hạn chế. Bên cạnh đó,
nhiều loài nấm sợi (tiêu biểu là A. oryzae) có khả năng kháng tự nhiên với nhiều loại
kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh rất cao.Do đó việc sử dụng
kháng sinh trong chọn lọc thể chuyển gen là không khả thi[96]. Để khắc phục nhược
điểm này, một số loài nấm sợi đã được cải biến di truyền để có thể sử các gen trợ
dưỡng dụng làm các marker chuyển gen. Chuyển gen vào các chủng trợ dưỡng giúp
giảm chi phí, an toàn đối với môi trường và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực
tiễn.
1.2.4.3. Marker pyrG
Uridine 5’-monophosphate (UMP) và uracil là những hợp chất quan trọng
trong quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, bởi chúng liên quan đến sự tổng
hợp các axit nucleic cần thiết cho mọi tế bào sống. Sinh tổng hợp UMP được thực
hiện bởi enzyme orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase)
được mã hóa bởi gen pyrG ở nấm sợi hoặc gen URA3 ở nấm men [13, 49]. Gen pyrG
giúp tế bào nấm tự tổng hợp UMP trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên với những
chủng đột biến hỏng gen pyrG, chúng chỉ có thể sinh trưởng được trong điều kiện
môi trường ngoại bào có bổ sung uridine hoặc uracil. Khi gen pyrG được đưa trở lại
các chủng đột biến này, chúng có thể sinh trưởng bình thường. Chính vì lý do đó
nhiều nghiên cứu trước đây đã sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc trong quá
trình chuyển gen [13, 58, 73, 104, 107].
Với chủng tự nhiên (wild type), hoạt động của enzyme OMP decarboxylase
mã hóa bởi gen pyrGsẽ chuyển hóa hợp chất 5-fluoroorotic acid (5-FOA) không độc
thành chất gây độc tế bào là 5-fluorouracil. Ngược lại, các chủng bị đột biến sai hỏng
về gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa hợp chất 5-FOA và các chủng này có thể sinh
trưởng bình thường trên môi trường chứa 5-FOA.Chính vì vậy 5-FOA thường được
bổ sung vào môi trường trong quá trình chọn lọc các chủng vi nấm đột biến hỏng
hoặc mất gen pyrG. Việc đưa gen pyrGquay trở lại thể đột biến tương ứng sẽ giúp thể
đột biến tự tổng hợp uridine/uracil và sinh trưởng được trên môi trường tối thiểu
(không bổ sung uridine/uracil)[116].
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hànhnhằm tạo ra các chủngnấm sợi trợ dưỡng
uridine/uracil, trong đó có các loài thuộc chi Aspergillus. Phương pháp phổ biến nhất
để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil là chiếu tia UV sau đó sàng lọc trên
môi trường chọn lọc có chứa hợp chất 5-FOA, uridine và uracil[34, 49, 104]. Ngoài
cách chiếu UV, thể đột biến trợ dưỡng uridine/uracil còn được tạo ra nhờ phương
pháploại bỏ trực tiếp gen pyrG thông qua việc chuyển cấu trúc xóa gen pyrGvào tế
bào nấm. Nhờ cơ chế trao đổi chéo tương đồng, gen pyrG trong hệ gen của nấm có
thể được loại bỏ để tạo ra thể đột biến mất khả năng tổng hợp uridine/uracil[25, 49,
116].
1.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm
Gen chỉ thị mã hóa các protein tương ứng được sử dụngtrong đánh giá hiệu
quả chuyển gen hoặc dùng như dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen. Sự có mặt
của gen chỉ thịkhiến các tế bào/khuẩn lạc của thểchuyển gen có kiểu hình khác biệt
và dễ dàng phân biệt với các chủng tự nhiên.Gen chỉ thị không gây ảnh hưởng đến
chức năng sinh lý cũng như sinh trưởng của các thể chuyển gen[33].
Ngược lại với marker chọn lọc bảo vệ thể chuyển gen trên môi trường chọn
chọn lọc và gây chết hoặc ngăn chặn sự phát triển của chủng tự nhiên, gen chỉ thị
được sử dụng để sàng lọc các chủng chuyển gen làm cho các tế bào/khuẩn lạc chứa
gen chỉ thịcó đặc điểm có thể quan sát trực quan bằng mắt. Các gen chỉ thị có thể
được gắn liền với gen đích và được điều khiển dưới cùng một promoter hoặc biểu
hiện độc lập mà không có gen đích đi kèm.Một số các gen chỉ thị hay được sử dụng
như: GFP, DsRed, GUS, lacZ…[40, 69, 72]. Các gen chỉ thị được dùng phổ biến
trong chuyển genở nấm sợi là gen mã hóa protein huỳnh quang xanhGFP và gen mã
hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed.
1.2.5.1. Gen mã hóa huỳnh quang xanh (GFP)
Gen GFPcó chiều dài 720 bp được phân lập lần đầu tiên từ sứa
Aequoreavictoria bởi Osamu Shimomura năm 1962.GFP mã hóa protein có kích
thước 238 axit amin (26,9 kDa). Protein này phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh lá
cây khi tiếp xúc với ánh sáng bước sóng 509 nm (Hình 1.5)[78, 89].
Trong lĩnh vực sinh học phân tử, genGFP thường được sử dụng như một gen
chỉ thịtrong chuyển gen và biểu hiện gen. GFPthường được đưa vào tế bàothông qua
các kỹ thuật chuyển gen vàsự tích hợp của GFP trong hệ gen của tế bào có thể đủ
bền vững qua các thế hệ sau. Đến nay, GFP đã được biểu hiện ở nhiều loài, bao gồm
cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, trong đó có nấm sợi[52].
Hinh 1.5.Biểu hiện genGFPởnấm sợiAspergillus fumigatus[35]
Gen huỳnh quang GFPrất hữu ích trong việc nghiên cứu xác định vị trí của
protein hoặc kiểm tra mức độ biểu hiện của một gen mong muốn. Trong nghiên cứu
phát triển các phương pháp chuyển gen, biểu hiện gen chỉ thị GFPđã được chứng
minh là thành công trên nhiều loài nấm sợi như Aspergillus fumigatus [35],
Aspergillus oryzae[56], Aspergillus nidulans[5], Aspergillus niger[21], Fusarium
oxysporum[48]…
1.2.5.2. Gen mã hóa huỳnh quang đỏ (DsRed)
Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRedcó chiều dài 678 bp được phân lập
từ một loài san hô thuộc chi Discosoma. Protein DsRed gồm 226 axit amin với kích
thước 28 kD, phát huỳnh quang màu đỏ và tín hiệu huỳnh quang mạnh nhất khi được
quan sát dưới ánh sáng bước sóng 583 nm[3].Do đặc tính tương tự như gen huỳnh
quang GFP nên DsRed cũng được sử dụng làm gen chỉ thị trong nghiên cứu ở nhiều
loài sinh vật khác nhau. Riêng với nấm sợi, gen DsRed được biểu hiện thành công
trên nhiều loài như Sordaria macrospora[15], Fusarium oxysporum[70],Acremonium
chrysogenum[32], Aspergillus fumigatus[44]…Các tế bào nhận được gen DsRed sẽ
có màu đỏ dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng phù hợp (Hình 1.6).
Hinh 1.6. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợiFusarium oxysporum[70]
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Chủngvi sinh vật
Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu
STT Tên chủng Phân loại Nguồn gốc
1 RIB40 A. oryzae National Research Institute of Brewing
(Nhật Bản)
2 AUT1-PlD A. oryzae Bộ mônCông nghệ Sinh học, Đại học
Tokyo, Nhật Bản
3 VTCCF 032 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệSinh
học, ĐHQGHN
4 VTCCF 040 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN
5 VTCCF 047 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN
6 VTCCF 048 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN
7 VTCCF 051 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN
8 VTCCF 053 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN
STT Tên chủng Phân loại Nguồn gốc
9 VTCCF 912 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN
10 VTCCF 914 A. oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN
11 VS1 A. oryzae Phòng Genomic- Phòng thí nghiệm Trọng
điểm Công nghệ Enzyme và Protein,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
12 NRRL 3357 A. flavus ARS (NRRL) Culture Colection (Mỹ)
13 VTCCF 013 A. flavus Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh
học, ĐHQGHN
14 N402 A. niger CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan)
15 VTCCF 015 A. fumigatus Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh
học, ĐHQGHN
16 VTCCF
1414
A. fumigatus Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh
học, ĐHQGHN
17 FGSC A4 A. nidulans Fungal Genetics Stock Center (Mỹ)
18 DH5α E. coli [22]
19 AGL1 A. tumefaciens [43]
ChủngA. tumefaciens AGL1 là chủng đã được cải biến di truyền và được
sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào nấm. Chủng AGL1 mang gen
kar kháng kháng sinh kanamycin sử dụng trong chọn lọc các chủng mang vector
nhị thể.
Chủng A. oryzae AUT1-PlD có nguồn gốc từ chủng RIB40. Chủng n{yđ~
bị xóa gen pyrG trong hệ gen v{ được sử dụng trực tiếp để chuyển gen sử
dụng marker pyrG.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật và trong các thí nghiệm
sinh học phân tử gồm: glucose, sucrose, KCl, NaCl, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4,
FeSO4, MnSO4, glycerol, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl,
SDS…Các hóa chất với độ tinh khiết cao được mua từ những hãng uy tín như
Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Biozym.
Các mồi dùng cho phản ứng PCR do công ty IDT (Singapore) tổng hợp. Danh
sách mồi được liệt kê ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Mồi PCR dùng trong nghiên cứu
Tên mồi Trinh tự (5’-3’) Enzyme
giới hạn
Kích
thƣớc
Tham
khảo
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
486-
599 bp
[114]
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC [114]
Aof-ITS-F ATGGCCGCCGGGGGCTCT [10]
AFB-F AAGCAAACCAAGACCAACAAG
116 bp [10]
AFB-R AACAAGTCTTTTCTGGGTTCTA [10]
P1 GGGGAATTCGAGCTCTGAAATCAAATC
CTGCCTACC
EcoRI
1,41 kb
P2 AAAGGGCCCCTCGAGTGCACTAGCCAC XhoI
ACGTTTCT
P3 GGGCTCGAGCAGGGTCAAGGGTCATGT
TT
XhoI
1,33 kb
P4 GGGAAGCTTCCCGCCTCTATCGACAAA
TA
HindIII
P5 GGGAATTCATGCGAAGGTAAGTGCTTC
T
EcoRI 0,54-
1,82 kb
P6 GGACTAGTTGGCTAGGCTCTGACTCG SpeI
Tên mồi Trinh tự (5’-3’) Enzyme
giới hạn
Kích
thƣớc
Tham
khảo
P5
P7
GGGAATTCATGCGAAGGTAAGTGCTTCT
TGTAAGGTGATGTGTGCCAG
1,70-
2,98 kb
pyrG-orf-F ATGTCTTCCAAGTCGCAATT
0,9 kb
pyrG-orf-R TATTGCGCACCAACACG
DsRed- F AACTCGAGCACGTGCTTAAGGATATC
ATGGCCTCCTCCGAGG
XhoI, PmlI,
AflII,
EcoRV 730 bp
DsRed- R AAGGATCCCCGCGGGAGCTCGATATC
CTACAGGAACAGGTGGTGGC
EcoRV,
SacI, SacII,
BamHI
GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAG
720 bp
GFP-R TCACTTGTACAGCTCGTCCATGC
phyA-F GGGCACGTGATGAAAAAGCTATATAAT
GGCCGG
PmlI
1,51 kb
phyA-R GGGGATCCTCAACTAAAGCACTCTCCC
CA
BamHI
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng tại Phòng Genomic,
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên.
Tên thiết bị Hãng sản xuất/ Xuất xứ
Tủ cấy vi sinh an toàn cấp 2 Nuaire/Mỹ
Máy ly tâm lạnh Eppendorf /Đức
Máy ly tâm ống falcon 3K30 Sigma/Mỹ
Máy vortex Cyclone/Anh
Kính hiển vi quang học CX21 Olympus/Nhật Bản
Bể ổn nhiệt Julabo/Đức
Tủ nuôi cấy ổn nhiệt Memmert/Đức
Tủ sấy Memmert/Đức
Máy lắc THZ-103B Trung Quốc
Máy PCR MyCycler Bio-Rad/Mỹ
Lò vi sóng Panasonic/Nhật Bản
Nồi khử trùng ALP/Nhật Bản
Bể điện di DNA Bio-Rad/Mỹ
Máy soi gel Bio-Rad/Mỹ
Máy cô quay chân không Thermo Scientific/Mỹ
Máy chuyển genxung điện Bio-Rad/Mỹ
Các thiết bị khác
2.1.3. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
Môi trƣờng PDA (potato dextrose agar, Himedia) dùng để nuôi cấy và thu
bào tử của các chủng nấm.
Môi trƣờng CD (Czapek-Dox) dùng để nuôi các chủng nấm sợi: 2%
sucrose; 0,2% NaNO3; 0,1% KH2PO4; 0,05% MgSO4; 0,05% KCl; 0,05% NaCl;
0,002% FeSO4; 2% agar; pH 5,5. Môi trường CD dùng khi nuôi cấy các chủngA.
oryze trợ dưỡng uridine/uracil cần bổ sung thêm 0,1% uridine và 0,1% uracil.
Môi trƣờng LB dùng để nuôi vi khuẩn: 1% peptone; 0,5% cao nấm men;
0,5% NaCl.
Môi trƣờng DPYdùng để nuôi và thu bào tử chủng A. oryzae AUT1-PlD trợ
dưỡng uridine/uracil[116]: 2% glucose; 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5%
KH2PO4; 0,05% MgSO4; 0,1% uridine; 0,1% uracil; pH 5,5.
Môi trƣờng M+ Met dùng để chọn lọc các thể chuyển gen [116]: 0,2%
NH4Cl; 0,1% (NH4)2SO4; 0,05% KCl; 0,05% NaCl; 0,1% KH2PO4; 0,05% MgSO4;
0,002%FeSO4;2% glucose;0,15% methionine;pH 5,5.
Môi trƣờng PSMkích thích sinh enzyme phytase[29]: 1% glucose; 0,4%
Na-phytate; 0,2% CaCl2; 0,5% NH4NO3; 0,05% KCl; 0,05% MgSO4; 0,001%
FeSO4; 2% agar.
Môi trƣờng cảm ứng IM lỏng: 8 ml MES 1M; 80 ml MM salts 2,5x; 0,36 g
glucose; 1 ml glycerol; 200 ml nước cất.
MM salts 2,5x: 2,05gK2HPO4;1,45 g KH2PO4;0,15g NaCl;0,5 g
MgSO4.7H2O;0,1g CaCl2.6H2O;0,5 g (NH4)2SO4;0,0025 gFeSO4.7H2O, 1000 ml
H2O
Môi trƣờng cảm ứng IM rắn: 8 ml MES 1M; 80 ml MM salts 2,5x; 0,18 g
glucose; 1 ml glycerol; 3g agar; 200 ml nước cất.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các kĩ thuật về sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu như PCR, nhân
dòng gen, tạo vector, xử lý enzyme giới hạn,… được thực hiện tham khảotheo cẩm
nangMolecular Cloning củatác giả Sambrook, xuất bản năm 1989 [87].Một số
phương pháp như tách chiết DNA, tách chiết plasmid,… được phát triển bởi Phòng
Genomic-Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein hoặc sử dụng
các kit tách chiết thương mại.
2.2.1. Thu nhận bào tử nấm
Các chủng nấm được nuôi trên đĩa môi trườngCzapek-Dox. Với chủngA.
oryzaeVS1 trợ dưỡng uridine/uracil cần bổ sung thêm 0,1% uridine và 0,1% uracil
vào môi trường nuôi. Chủng AUT1-PlD được nuôi trên đĩa môi trường DPY. Sau
khoảng 3-5 ngày nuôi cấy ở 30ºC, nước cất vô trùng được bổ sung lên bề mặt đĩanuôi
cấy, dùng que gạt bằng thủy tinh vô trùng gạt nhẹ để bào tử nấm rời khỏi hệ sợi và
hòa vào nước. Dùng pipet hút dịch và lọc qua màng Miracloth (Calbiochem, Đức).
Dịch lọc được ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu bào tử. Bào tử được rửa
bằng nước cấtvô trùng 2 lần trước khi hòa trở lại vào nước cất vô trùng. Nồng độbào
tử được điều chỉnh đến 107 bào tử/mlvàdịch bào tử được bảo quản ở 4ºC. Đối với các
chủng nấm trợ dưỡng uridine/uracil, bào tử sau khi thu được cần kiểm tra để tránh
nhiễm bằng cách nhỏ 20- 50µl dịch bào tử trên đĩa môi trường tối thiểu Czapek-Dox
(CD) và ủ đĩa khoảng 1- 2 ngày ở 30ºC. Nếu hệ sợi nấm không xuất hiện, chứng tỏ
bào tử là thuần khiết và đáp ứng được yêu cầu dùng cho chuyển gen.
2.2.2. Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA
Tách chiết DNA tổng số: 1 ml bào tử nấm được bổ sung vào bình tam giác
250 ml chứa 100 ml môi trường CD lỏng. Bình được nuôi lắc trong máy lắc tốc độ
200 vòng/phút, ở 30ºC trong 3 ngày. Hệ sợi nấm được thu bằng cách lọc qua màng
Miracloth và được thấm khô bằng giấy lọc trước khi chia vào ống eppendorf 2 ml.
Khoảng 200 mg sợi nấm được nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày sứ
hoặc được giã trực tiếp trong ống eppendorf sử dụng đũa thủy tinh. Bổ sung 600µl
đệm chiết GX (2,5% SDS; 200 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA;
0,2% β-mercaptoethanol) và 0,1 mg proteinase K. Ống được vortex đều sau đó ủ ở
nhiệt độ 60- 65ºC trong 15- 30 phút. Thêm vào ống 300 µl natri acetate 3M (pH
5,2)trộn đều và ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Hút khoảng
700 µl dịchtrong ở phía trên chứa DNAvà chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml. Ống
được bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh, trộn đều sau đó ly tâm ở 12000
vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC. Tủa chứa DNA được rửa bằng 500 µl ethanol 70% và
được làm khô bằng máy cô quay chân không SpeedVac trước khi hòa vào 50 µl đệm
TE 1x (Tris-EDTA, pH 8). Bổ sung 2 µl RNase (10 mg/ml) và ủ ở 60ºC trong 30
phút để loại bỏ RNA. Sản phẩm DNAtổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose
1% và được bảo quản ở -20ºC.
Tách chiết RNA tổng số: Sợi nấm 2 ngày tuổi được thu bằng cách lọc dịch
nuôi qua màng Miracloth và được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng. Bột sợi nấm
nhanh chóng được chia vào ống eppendorf 2 ml (20-50 mg/ống) và đặt trên nước đá.
RNA tổng số được chiết bằng kit tinh sạch RNA của hãng ANABIO R&D JSCtheo
hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA sau khi tinh sạch được xử lý 20 phút ở 37ºC bằng
enzyme DNase I để loại bỏ hoàn toàn DNA.DNase I sau đó được bất hoạt ở 75ºC
trong 15 phút và mẫu được chuyển ngay lên nước đá. Sản phẩm RNA thu được được
kiểm tra bằng PCR để đánh giá mức độ tinh sạch, sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 để
khuếch đại đoạn ITS của DNA ribosome. RNA được coi là sạch và không nhiễm
DNA hệ gen chỉ khi phản ứng PCR kiểm tra không xuất hiện băng ITS. RNAsau khi
tinh sạch được sử dụng ngay cho tổng hợp cDNA hoặc được bảo quản ở -30ºC.
Tổng hợp cDNA: RNA tổng số sau khi tinh sạch được sử dụng ngay để tổng
hợp cDNA. Một lượng 800-1000ng RNAđược sử dụng cho một phản ứng tổng hợp
cDNA với mồi oligo dT và enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase. Toàn bộ
quy trình được thực hiện với ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit của hãng
New England Biolabs theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm cDNA được sử
dụng ngay cho các thí nghiệm tiếp theo hoặc được bảo quản ở -30ºC.
2.2.3. Quan sát hinh thái và kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa
Quan sát hình thái các chủng A. oryzae: Các chủng nấm được cấy điểm hoặc
nhỏ 10 µl bào tử trên môi trường đĩa thạch PDA hoặc CD đối với các chủng tự nhiên
và M+ Met hoặc CD bổ sung thêm uridine/uracil với chủng AUT1-PlD và những
chủng trợ dưỡng uridine/uracil. Đĩa nuôi cấy được ở 30ºC-37ºC trong 2-3 ngày. Hình
thái bào tử và cuống mang bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học
Olympus hoặc kính hiển vi huỳnh quang Axioplan(Carl Zeiss, Đức).
Kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng A. oryzae: 10 µl
dịch bào tử các chủng A. oryzae được nhỏ trên môi trường CD pH7 có bổ sung kháng
sinh với các nồng độ 100mg/l, 200 mg/l và 300 mg/l. Đĩa nuôi cấy được đặt ở 30ºC
trong 3 ngày để quan sát sự sinh trưởng của nấm.
Kiểm tra khả năng sinh enzyme phytase[29]: 10 µl bào tử nấm được nhỏ lên
đĩa môi trường PSM. Đĩa nuôi cấy được đặt ở 30ºC trong 3 ngày. Enzyme phytase sẽ
phân giải phytate tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Vòng phân giải
càng lớn thì mức độ sinh enzyme và hoạt tính enzyme càng mạnh.
Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase[100]:10 µl bào tử nấm được nhỏ lên
đĩa môi trường CD+ 1% tinh bột tan (pH 6,5). Sau 3 ngày sinh trưởng ở 30ºC, vòng
phân giải tinh bột xung quanh khuẩn lạc nấm được nhận biết bằng cách nhỏ dung
dịch thuốc thử lugol.
Xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin trên môi trường CAM[82]:Các
chủngA. oryzae RIB40, A. oryzae VS1, A. flavus NRRL 3357 được nuôi cấy trên môi
trường thạch dừa(môi trường CAM)ở 28ºC, trong tối 5 ngày. Quan sát đĩa nuôi cấy
dưới ánh sáng cực tím UVA bước sóng 365 nm của máy soi UV để kiểm tra sự phát
quang màu xanh lá cây của aflatoxin B1. Môi trường CAM được chuẩn bị như sau:
100 g dừa tươi thái nhỏ đun sôi 15 phút trong 300 ml nước, lọc thu dịch, bổ sung 2%
agar, pH 7.
2.2.4. Phân biệt A. oryzae và A. Flavusbằng các kỹ thuật sinh học phân
tử
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4:Cặp mồi ITS1/ITS4 được sử
dụng để khuếch đại vùng ITS (gồm một phần gen 18S rRNA + ITS1 + gen 5,8S
rRNA + ITS2 + một phần gen 28S rRNA) của DNA ribosome. Phản ứng PCR cặp
mồi này được dùng để kiểm tra chất lượng DNA của A. oryzae và A. flavus trước khi
sử dụng cho phản ứng phân biệt với mồi đặc hiệu. Chu trình nhiệt như sau: 94ºC (3
phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (40 giây); 72ºC (5 phút).
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra.
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Aof-ITS-F/ITS4:Mồi Aof-ITS-F được
thiết kế dựa trên trình tự ITS1 đặc hiệu chỉ với A. oryzae và A. flavus. Mồi Aof-ITS-F
kết hợp với mồi ITS4 được dùng để nhận biết nhóm bao gồm A. oryzae và A. flavus.
Chu trình PCR tương tự như PCR sử dụng cặp ITS1/ITS4.
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi AFB-F/AFB-R:Sản phẩm PCR có băng
đặc trưng và chỉ xuất hiện ở nấm sợi A. flavus mà không xuất hiện ở A. oryzae. Do
đó, cặp mồi này được sử dụng để phân biệt hai loài này. Chu trình nhiệt như sau:
94ºC (3 phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (20 giây); 72ºC (5
phút). Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR): cũng tương tự như phản ứng PCR
thường nhưng được thực hiện với 5 mồi đặc hiệu (ITS1, ITS4, Aof-ITS-F, AFB-F,
AFB-R). Các thành phần trong tổng thể tích 10 µl phản ứng bao gồm: 5 µl GoTaq®
Mastermix 2X; 0,5 µl mỗi mồi; 100-200 ng DNA tổng số; 2 µl nước cất khử ion. Chu
trình nhiệt như sau: 94ºC (3 phút), 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 60ºC (30 giây), 72ºC
(1 phút 30 giây); 72ºC (10 phút). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% để
kiểm tra.
2.2.5. Tạocác vector nhị thể dùng cho chuyển gen
PCR các đoạn DNA: Trình tự các đoạn DNA được lấy từ cơ sở dữ liệu của
ngân hàng GenBank, các cặp mồi khuếch đại gen hoặc DNA được thiết kế trên phần
mềm Primer3 và được tổng hợp hóa học bởi công ty IDT. Các đoạn DNA được PCR
từDNA tổng số hoặc cDNA sử dụng enzyme Phusion® High-Fidelity DNA
polymerase của hãng Thermo Scientific. Thành phần trong 25µl hỗn hợp phản ứng
như sau: buffer 5x HF 5µl, enzyme Phusion DNA polymerase 1µl, dNTP 1µl, mồi
xuôi 1µl, mồi ngược 1µl, DNA khuôn 1µl, nước cất khử ion 15µl. Chu trình nhiệt
như sau: 94ºC (3 phút); 35 chu kỳ của 94ºC (30 giây), 50-60ºC (30 giây), 72ºC (30
giây đến 1 phút); 72ºC (7 phút). Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel
agarose 1% sau đó được tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA của hãng Promega
hoặcAnabio R&D JSC theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Xử lý vector và đoạn DNA với enzyme giới hạn: Các vector và đoạn DNA
được cắt với enzyme giới hạn dạng FastDigest của hãng Thermo Scientific. Quy trình
xử lý enzyme theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm xử lý enzyme giới hạn
được điện di trên gel agarose 0,8%. Đoạn DNA trên gel được cắt và chuyển sang ống
eppendorf 1,5ml. Quy trình tinh sạch được thực hiện với kit tinh sạch DNAthương
mạitheo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm sau tinh sạch được điện di kiểm
tra trên gel agarose 0,8%.
Nối đoạn DNA vào plasmid (ligation): Plasmid và đoạn DNAsau khi xử lý
enzyme giới hạn và tinh sạch được trộn với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, sử dụng enzyme
nối T4 DNA ligase của hãng Thermo Scientific. Các thành phần trong 20µl hỗn hợp
phản ứng như sau: T4 ligase buffer 10x 2µl, enzyme T4 DNA ligase 1µl, plasmid
4µl, đoạn DNA4µl, nước cất khử ion 9µl. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 4ºC-10ºC qua
đêm, sau đó được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.
Quá trình biến nạp như sau: ống chứa tế bào vi khuẩn E. coli DH5α được giữ trên
nước đá 5-10 phút cho tới khi rã đông. Hút hỗn hợp laivào ống tế bào khả biến, trộn
nhẹ bằng pipet và đặt trên đá 20 phút. Sau đó sốc nhiệt 40 giây ở 42ºC vàđặt trên
nước đá 2 phút. Bổ sung 800 µl LB lỏng và ống được lắc 1 giờ ở 37ºC. Tế bào được
thu bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 20 giây và được trải trên đĩa môi trường
chọn lọc LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Đĩa được ủ ở 37ºC trong 24 giờ.
Các khuẩn lạc nhận được từ đĩa chọn lọc được kiểm tra bằng colony-PCR(PCR từ
khuẩn lạc) với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA. Phản ứng colony-PCR sử dụng
GoTaq® Green Master Mix của hãng Promega.Những khuẩn lạc cho kết quả PCR
đúng với kích thước của đoạn chèn sẽ được sử dụng để tách chiết plasmid và cắt
kiểm tra bằng enzyme giới hạn.
Tách plasmid: Khuẩn lạc chọn được cấy vào bình tam giác 100ml chứa 10-20
ml môi trường LB lỏng (1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl) bổ sung thêm
kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Bình nuôi cấy được lắc qua đêm ở 30- 37ºC.Ly
tâm 4ml dịch nuôi ở 12000 vòng/phút trong 20 giây (ly tâm 2 lần, mỗi lần 2ml). Bổ
sung 250µl buffer B1 (50 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 7,6) và 3µl RNase (10
mg/ml).Cặn tế bào được hòa tan vào đệm bằng vortex. Bổ sung thêm 250 µl buffer
B2 (200 mM NaOH, 1% SDS) sau đó đảo ống nhẹ nhàng 5 lần. Tiếp đó bổ sung
thêm 350 µl buffer N3 (kali acetate 3M; pH 5,5) và đảo ống nhẹ 5 lần. Ly tâm ống ở
12000 vòng/phút ở 4ºC trong 20 phút. Hút khoảng 700 µl dịch trong có chứa plasmid
chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml và bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh.Ống
được trộn đều bằng vortex đều và được ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 20
phút ở 4ºC. Đổ bỏ dịch trong và rửa cặn bằng 500 µl ethanol 70%.Ly tâm 5 phút và
đổ bỏ dịch. Cặn chứa DNA được làm khô bằng máy cô quay chân không SpeedVac
và hòa vào 50 µl đệm TE 1x. Plasmid được bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh hoặc ở -30ºC.
Tạo vector xóa gen pyrG ở A. oryzae:Cấu trúc xóa gen pyrG ởA. oryzae đƣợc thiết
kế nằm trong vùng T-DNA trên một vector nhị thể(binary vector), cấu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Aluko R., McIntosh T., (2005) "Limited enzymatic proteolysis increases the
level of incorporation of canola proteins into mayonnaise",Innovative Food
Science & Emerging Technologies, 6(2), pp. 195-202.
2. Archer D.B., Dyer P.S., (2004) "From genomics to post-genomics in
Aspergillus",Current Opinion in Microbiology, 7(5), pp. 499-504.
3. Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y., (2000) "Biochemistry, mutagenesis,
and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from
coral",Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(22), pp. 11984-
11989.
4. Bhumiratana A., Flegel T., Glinsukon T., Somporan W., (1980) "Isolation
and analysis of molds from soy sauce koji in Thailand",Applied and
Environmental Microbiology, 39(2), pp. 430-435.
5. Breakspear A., Langford K.J., Momany M., Assinder S.J., (2007) "CopA: GFP
localizes to putative Golgi equivalents in Aspergillus nidulans",FEMS
Microbiology Letters, 277(1), pp. 90-97.
6. Chakraborty B., Electroporation Mediated DNA Transformation of
Filamentous Fungi, in Genetic Transformation Systems in Fungi, Volume 1.
2015, Springer. p. 67-79.
7. Chakraborty B., Kapoor M., (1990) "Transformation of filamentous fungi by
electroporation",Nucleic Acids Research, 18(22), pp. 6737.
8. Chang P.-K., Ehrlich K.C., (2010) "What does genetic diversity of Aspergillus
flavus tell us about Aspergillus oryzae?",International Journal of Food
Microbiology, 138(3), pp. 189-199.
9. Chankova S., Dimova E., Dimitrova M., Bryant P., (2007) "Induction of DNA
double-strand breaks by zeocin in Chlamydomonas reinhardtii and the role
of increased DNA double-strand breaks rejoining in the formation of an
adaptive response",Radiation and Environmental Biophysics, 46(4), pp. 409-
416.
10. Chiba T., Takahashi Y., Sadamasu K., Nakama A., Kai A., (2013)
"Discrimination of Aspergillus flavus group fungi using phylogenetic tree
analysis and multiplex PCR",Shokuhin eiseigaku zasshi (Journal of the Food
Hygienic Society of Japan), 55(3), pp. 135-141.
11. de Boer P., Bronkhof J., Dukiќ K., Kerkman R., Touw H., van den Berg M.,
Offringa R., (2013) "Efficient gene targeting in Penicillium chrysogenum
using novel Agrobacterium-mediated transformation approaches",Fungal
Genetics and Biology, 61(pp. 9-14.
12. De Groot M.J., Bundock P., Hooykaas P.J., Beijersbergen A., (1998)
"Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous
fungi",Nature Biotechnology, 16(pp.
13. Diez B., Alvarez E., Cantoral J., Barredo J., Martin J., (1987) "Selection and
characterization of pyrG mutants of Penicillium chrysogenum lacking
orotidine-5′-phosphate decarboxylase and complementation by the pyr4
gene of Neurospora crassaa",Current Genetics, 12(4), pp. 277-282.
14. Du Y., Xie G., Yang C., Fang B., Chen H., (2014) "Construction of brewing-
wine Aspergillus oryzae pyrG− mutant by pyrG gene deletion and its
application in homology transformation",Acta Biochimica et Biophysica
Sinica, pp. gmu022.
15. Elleuche S., Pöggeler S., (2008) "Visualization of peroxisomes via SKL-
tagged DsRed protein in Sordaria macrospora", pp.
16. Fujita J., Shigeta S., Yamane Y.-I., Fukuda H., Kizaki Y., Wakabayashi S., Ono
K., (2003) "Production of two types of phytase from Aspergillus oryzae
during industrial koji making",Journal of Bioscience and Bioengineering,
95(5), pp. 460-465.
17. Geiser D.M., Dorner J.W., Horn B.W., Taylor J.W., (2000) "The phylogenetics
of mycotoxin and sclerotium production in Aspergillus flavus and
Aspergillus oryzae",Fungal Genetics and Biology, 31(3), pp. 169-179.
18. Gibbons J.G., Salichos L., Slot J.C., Rinker D.C., McGary K.L., King J.G., Klich
M.A., Tabb D.L., McDonald W.H., Rokas A., (2012) "The evolutionary imprint
of domestication on genome variation and function of the filamentous
fungus Aspergillus oryzae",Current Biology, 22(15), pp. 1403-1409.
19. Gomi K., Iimura Y., Hara S., (1987) "Integrative transformation of
Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulansargB
gene",Agricultural and Biological Chemistry, 51(9), pp. 2549-2555.
20. Goosen T., van Engelenburg F., Debets F., Swart K., Bos K., van den Broek H.,
(1989) "Tryptophan auxotrophic mutants in Aspergillus niger: inactivation
of the trpC gene by cotransformation mutagenesis",Molecular and General
Genetics MGG, 219(1-2), pp. 282-288.
21. Gordon C., Archer D., Jeenes D., Doonan J., Wells B., Trinci A., Robson G.,
(2000) "A glucoamylase:: GFP gene fusion to study protein secretion by
individual hyphae of Aspergillus niger",Journal of Microbiological Methods,
42(1), pp. 39-48.
22. Grant S.G., Jessee J., Bloom F.R., Hanahan D., (1990) "Differential plasmid
rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-
restriction mutants",Proceedings of the National Academy of Sciences,
87(12), pp. 4645-4649.
23. Guo H., Yang Z., Xing L., Li M., (2011) "Transformation system of Aspergillus
japonicus mediated by Agrobacterium tumefaciens",Wei Sheng Wu Xue Bao
(Acta Microbiologica Sinica), 51(1), pp. 115-121.
24. Hamilton C.M., (1997) "A binary-BAC system for plant transformation with
high-molecular-weight DNA",Gene, 200(1), pp. 107-116.
25. Hartl L., Seiboth B., (2005) "Sequential gene deletions in Hypocrea jecorina
using a single blaster cassette",Current Genetics, 48(3), pp. 204-211.
26. Hedayati M., Pasqualotto A., Warn P., Bowyer P., Denning D., (2007)
"Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin
producer",Microbiology, 153(6), pp. 1677-1692.
27. Hoekema A., Hirsch P., Hooykaas P., Schilperoort R., (1983) "A binary plant
vector strategy based on separation of vir-and T-region of the
Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid",Nature, 303(pp. 179-180.
28. Hooykaas P., Beijersbergen A.G., (1994) "The virulence system of
Agrobacterium tumefaciens",Annual Review of Phytopathology, 32(1), pp.
157-181.
29. Howson S., Davis R., (1983) "Production of phytate-hydrolysing enzyme by
some fungi",Enzyme and Microbial Technology, 5(5), pp. 377-382.
30. Iimura Y., Gomi K., Uzu H., Hara S., (1987) "Transformation of Aspergillus
oryzae through plasmid-mediated complementation of the methionine-
auxotrophic mutation",Agricultural and Biological Chemistry, 51(2), pp.
323-328.
31. Imanaka H., Tanaka S., Feng B., Imamura K., Nakanishi K., (2010)
"Cultivation characteristics and gene expression profiles of Aspergillus
oryzae by membrane-surface liquid culture, shaking-flask culture, and
agar-plate culture",Journal of Bioscience and Bioengineering, 109(3), pp.
267-273.
32. Janus D., Hoff B., Hofmann E., Kück U., (2007) "An efficient fungal RNA-
silencing system using the DsRed reporter gene",Applied and Environmental
Microbiology, 73(3), pp. 962-970.
33. Jawed A., L C.J., (1990) "Reporter genes: application to the study of
mammalian gene transcription",Analytical Biochemistry, 188(2), pp. 245-
254.
34. Kanamasa S., Yamaoka K., Kawaguchi T., SUMITANI J.-i., ARAI M., (2003)
"Transformation of Aspergillus aculeatus using the drug resistance gene of
Aspergillus oryzae and the pyrG gene of Aspergillus nidulans",Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry, 67(12), pp. 2661-2663.
35. Khalaj V., Azizi M., Enayati S., Khorasanizadeh D., Ardakani E.M., (2012)
"NCE102 homologue in Aspergillus fumigatus is required for normal
sporulation, not hyphal growth or pathogenesis",FEMS Microbiology
Letters, 329(2), pp. 138-145.
36. Kitamoto K., (2015) "Cell biology of the Koji mold Aspergillus
oryzae",Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 79(6), pp. 863-869.
37. Kitamoto K., (2002) "Molecular biology of the Koji molds",Advances in
Applied Microbiology, 51(pp. 129-154.
38. Klich M.A., Mullaney E.J., (1987) "DNA restriction enzyme fragment
polymorphism as a tool for rapid differentiation of Aspergillus flavus from
Aspergillus oryzae",Experimental Mycology, 11(3), pp. 170-175.
39. Kochupurakkal B.S., Iglehart J.D., (2013) "Nourseothricin N-acetyl
transferase: a positive selection marker for mammalian cells",PLoS One,
8(7), pp. e68509.
40. Koo J., Kim Y., Kim J., Yeom M., Lee I.C., Nam H.G., (2007) "A GUS/luciferase
fusion reporter for plant gene trapping and for assay of promoter activity
with luciferin-dependent control of the reporter protein stability",Plant
and Cell physiology, 48(8), pp. 1121-1131.
41. Kumeda Y., Asao T., (2001) "Heteroduplex Panel Analysis, a Novel Method
for Genetic Identification of Aspergillus Section Flavi Strains",Applied and
Environmental Microbiology, 67(9), pp. 4084-4090.
42. Kunitake E., Tani S., Sumitani J.-i., Kawaguchi T., (2011) "Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus aculeatus for
insertional mutagenesis",AMB Express, 1(1), pp. 1.
43. Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A., (1991) "A DNA transformation–
competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium",Nature
Biotechnology, 9(10), pp. 963-967.
44. Leal Jr S.M., Cowden S., Hsia Y.-C., Ghannoum M.A., Momany M., Pearlman
E., (2010) "Distinct roles for Dectin-1 and TLR4 in the pathogenesis of
Aspergillus fumigatus keratitis",PLoS Pathogens, 6(7), pp. e1000976.
45. Lee C.-Z., Liou G.-Y., Yuan G.-F., (2006) "Comparison of the aflR gene
sequences of strains in Aspergillus section Flavi",Microbiology, 152(1), pp.
161-170.
46. Lee L.-Y., Gelvin S.B., (2008) "T-DNA binary vectors and systems",Plant
Physiology, 146(2), pp. 325-332.
47. Levin R.E., (2012) "PCR detection of aflatoxin producing fungi and its
limitations",International journal of food microbiology, 156(1), pp. 1-6.
48. Li C., Chen S., Zuo C., Sun Q., Ye Q., Yi G., Huang B., (2011) "The use of GFP-
transformed isolates to study infection of banana with Fusarium oxysporum
f. sp. cubense race 4",European Journal of Plant Pathology, 131(2), pp. 327-
340.
49. Ling S.O.S., Storms R., Zheng Y., Rodzi M.R.M., Mahadi N.M., Illias R.M., Abdul
Murad A.M., Abu Bakar F.D., (2013) "Development of a pyrG mutant of
Aspergillus oryzae strain S1 as a host for the production of heterologous
proteins",The Scientific World Journal, 2013(pp.
50. Liu W., Sun Y., Chen W., Liu W., Wan Z., Bu D., Li R., (2012) "The T788G
mutation in the cyp51C gene confers voriconazole resistance in Aspergillus
flavus causing aspergillosis",Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56(5),
pp. 2598-2603.
51. Liu Z., Friesen T.L., (2012) "Polyethylene glycol (PEG)-mediated
transformation in filamentous fungal pathogens",Plant Fungal Pathogens:
Methods and Protocols, pp. 365-375.
52. Lorang J., Tuori R., Martinez J., Sawyer T., Redman R., Rollins J., Wolpert T.,
Johnson K., Rodriguez R., Dickman M., (2001) "Green fluorescent protein is
lighting up fungal biology",Applied and Environmental Microbiology, 67(5),
pp. 1987-1994.
53. Machida M., Asai K., Sano M., Tanaka T., Kumagai T., Terai G., Kusumoto K.-
I., Arima T., Akita O., Kashiwagi Y., (2005) "Genome sequencing and
analysis of Aspergillus oryzae",Nature, 438(7071), pp. 1157-1161.
54. Machida M., Yamada O., Gomi K., (2008) "Genomics of Aspergillus oryzae:
learning from the history of Koji mold and exploration of its future",DNA
Research, 15(4), pp. 173-183.
55. Maruyama J.-I., Kitamoto K., (2008) "Multiple gene disruptions by marker
recycling with highly efficient gene-targeting background (ΔligD) in
Aspergillus oryzae",Biotechnology Letters, 30(10), pp. 1811-1817.
56. Maruyama J.-i., Nakajima H., Kitamoto K., (2001) "Visualization of nuclei in
Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each
conidium by FACS",Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 65(7), pp.
1504-1510.
57. Mathur J., Koncz C., (1998) "PEG-mediated protoplast transformation with
naked DNA",Arabidopsis Protocols, pp. 267-276.
58. Mattern I.E., Unkles S., Kinghorn J.R., Pouwels P.H., van den Hondel C.A.,
(1987) "Transformation of Aspergillus oryzae using the A. niger pyrG
gene",Molecular and General Genetics MGG, 210(3), pp. 460-461.
59. Mattern I.E., Unkles S., Kinghorn J.R., Pouwels P.H., van den Hondel C.A.,
(1987) "Transformation of Aspergillus oryzae using the A. niger pyrG
gene",Molecular and General Genetics, 210(3), pp. 460-461.
60. Meyer V., (2008) "Genetic engineering of filamentous fungi—progress,
obstacles and future trends",Biotechnology Advances, 26(2), pp. 177-185.
61. Michielse C., Ram A., Hooykaas P., Van den Hondel C., (2004) "Role of
bacterial virulence proteins in Agrobacterium-mediated transformation of
Aspergillus awamori",Fungal Genetics and Biology, 41(5), pp. 571-578.
62. Michielse C.B., Hooykaas P.J., van den Hondel C.A., Ram A.F., (2008)
"Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungus
Aspergillus awamori",Nature Protocols, 3(10), pp. 1671-1678.
63. Michielse C.B., Hooykaas P.J., van den Hondel C.A., Ram A.F., (2005)
"Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics
in fungi",Current Genetics, 48(1), pp. 1-17.
64. Mikkelsen L., Sarrocco S., Lübeck M., Jensen D.F., (2003) "Expression of the
red fluorescent protein DsRed-Express in filamentous ascomycete
fungi",FEMS Microbiology Letters, 223(1), pp. 135-139.
65. Mizutani O., Kudo Y., Saito A., Matsuura T., Inoue H., Abe K., Gomi K., (2008)
"A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining
significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus
oryzae",Fungal Genetics and Biology, 45(6), pp. 878-889.
66. Montiel D., Dickinson M.J., JEENES D.J., ROBERTS I.N., JAMES S., FULLER L.J.,
MATSUCHIMA K., ARCHER D.B., (2003) "Genetic differentiation of the
Aspergillus section Flavi complex using AFLP fingerprints",Mycological
Research, 107(12), pp. 1427-1434.
67. Mora-Lugo R., Zimmermann J., Rizk A.M., Fernandez-Lahore M., (2014)
"Development of a transformation system for Aspergillus sojae based on the
Agrobacterium tumefaciens-mediated approach",BMC Microbiology, 14(1),
pp. 1.
68. Mullins E.D., Chen X., Romaine P., Raina R., Geiser D., Kang S., (2001)
"Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an
efficient tool for insertional mutagenesis and gene
transfer",Phytopathology, 91(2), pp. 173-180.
69. Murphy M., Wilson Y.M., Butler C., (2013) "Genetic Marker Mice and Their
Use in Understanding Learning and Memory",World's largest Science,
Technology & Medicine, Open Access book publisher, pp.
70. Nahalkova J., Fatehi J., (2003) "Red fluorescent protein (DsRed2) as a novel
reporter in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici",FEMS Microbiology
Letters, 225(2), pp. 305-309.
71. Nguyen K.T., Ho Q.N., Pham T.H., Phan T.-N., Tran V.-T., (2016) "The
construction and use of versatile binary vectors carrying pyrG auxotrophic
marker and fluorescent reporter genes for Agrobacterium-mediated
transformation of Aspergillus oryzae",World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 32(12), pp. 204.
72. Nordgren I.K., Tavassoli A., (2014) "A bidirectional fluorescent two-hybrid
system for monitoring protein–protein interactions",Molecular BioSystems,
10(3), pp. 485-490.
73. Oakley B.R., Rinehart J.E., Mitchell B.L., Oakley C.E., Cannona C., Gray G.L.,
May G.S., (1987) "Cloning, mapping and molecular analysis of the pyrG
(orotidine-5'-phosphate decarboxylase) gene of Aspergillus nidulans",Gene,
61(3), pp. 385-399.
74. Park S., Lee B.-M., Salas M., Srivatanakul M., Smith R., (2000) "Shorter T-
DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated
transformation",Theoretical and Applied Genetics, 101(7), pp. 1015-1020.
75. Pasamontes L., Haiker M., Wyss M., Tessier M., Van Loon A., (1997) "Gene
cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the
fungus Aspergillus fumigatus",Applied and Environmental Microbiology,
63(5), pp. 1696-1700.
76. Pittengbr R., WOLFE E., Hoehn M., MARKS P.N., Daily W., McGuire J., (1953)
"Hygromycin. I. Preliminary studies on the production and biologic activity
of a new antibiotic",Antibiotics & Chemotherapy, 3(12), pp. 1268-78.
77. Pöggeler S., Masloff S., Hoff B., Mayrhofer S., Kück U., (2003) "Versatile
EGFP reporter plasmids for cellular localization of recombinant gene
products in filamentous fungi",Current Genetics, 43(1), pp. 54-61.
78. Prendergast F.G., Mann K.G., (1978) "Chemical and physical properties of
aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea
forskalea",Biochemistry, 17(17), pp. 3448-3453.
79. Punt P.J., van den Hondel C.A., (1992) "Transformation of filamentous fungi
based on hygromycin b and phleomycin resistance markers",Methods in
Enzymology, 216(pp. 447-457.
80. Rank C., Klejnstrup M.L., Petersen L.M., Kildgaard S., Frisvad J.C., Held
Gotfredsen C., Ostenfeld Larsen T., (2012) "Comparative chemistry
ofAspergillus oryzae (RIB40) and A. flavus (NRRL 3357)",Metabolites, 2(1),
pp. 39-56.
81. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V., (1998) "Molecular
and biotechnological aspects of microbial proteases",Microbiology and
Molecular Biology Reviews, 62(3), pp. 597-635.
82. Rodrigues F., van Hemert M., Steensma H.Y., Côrte-Real M., Le~o C.l., (2001)
"Red Fluorescent Protein (DsRed) as a Reporter in Saccharomyces
cerevisiae",Journal of Bacteriology, 183(12), pp. 3791-3794.
83. Rodrigues P., Venancio A., Kozakiewicz Z., Lima N., (2009) "A polyphasic
approach to the identification of aflatoxigenic and non-aflatoxigenic strains
of Aspergillus Section Flavi isolated from Portuguese almonds",Int J Food
Microbiol, 129(2), pp. 187-93.
84. Rodriguez E., Mullaney E.J., Lei X.G., (2000) "Expression of the Aspergillus
fumigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the
recombinant enzyme",Biochemical and Biophysical Research
Communications, 268(2), pp. 373-378.
85. Rokas A., Payne G., Fedorova N., Baker S., Machida M., Yu J., Georgianna
D.R., Dean R.A., Bhatnagar D., Cleveland T., (2007) "What can comparative
genomics tell us about species concepts in the genus Aspergillus?",Studies in
Mycology, 59(pp. 11-17.
86. Ruiz‐Díez B., (2002) "Strategies for the transformation of filamentous
fungi",Journal of Applied Microbiology, 92(2), pp. 189-195.
87. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning. Vol. 2. 1989: Cold
spring harbor laboratory press New York.
88. Séron K., Blondel M.-O., Haguenauer-Tsapis R., Volland C., (1999) "Uracil-
induced down-regulation of the yeast uracil permease",Journal of
Bacteriology, 181(6), pp. 1793-1800.
89. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y., (1962) "Extraction, purification and
properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous
hydromedusan, Aequorea",Journal of Cellular and Comparative Physiology,
59(3), pp. 223-239.
90. Singh S., Braus-Stromeyer S.A., Timpner C., Tran V.T., Lohaus G., Reusche
M., Knüfer J., Teichmann T., von Tiedemann A., Braus G.H., (2010)
"Silencing of Vlaro2 for chorismate synthase revealed that the
phytopathogen Verticillium longisporum induces the cross-pathway control
in the xylem",Applied Microbiology and Biotechnology, 85(6), pp. 1961-
1976.
91. Steever A.B., Wach A., PHILIPPSEN P., Pringle J.R., (1998) "Heterologous
modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in
Schizosaccharomyces pombe",Yeast, 14(pp. 943-951.
92. Sudini H., Srilakshmi P., Vijay Krishna Kumar K., Njoroge S.M., Osiru M.,
Seetha A., Waliyar F., (2015) "Detection of aflatoxigenic Aspergillus strains
by cultural and molecular methods: A critical review",African Journal of
Microbiology Research, 9(8), pp. 484-491.
93. Sugui J.A., Chang Y.C., Kwon-Chung K., (2005) "Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient tool for
insertional mutagenesis and targeted gene disruption",Applied and
Environmental Microbiology, 71(4), pp. 1798-1802.
94. Sun X., Zhu J., Bao L., Hu C., Jin C., Harris S.D., Liu H., Li S., (2013) "pyrG is
required for maintaining stable cellular uracil level and normal sporulation
pattern under excess uracil stress in Aspergillus nidulans",Science China Life
Sciences, 56(5), pp. 467-475.
95. Suzuki D.T., Griffiths A.J., Miller J.H., Lewontin R.C., An introduction to
genetic analysis. 1986: WH Freeman and Company.
96. Suzuki S., Tada S., Fukuoka M., Taketani H., Tsukakoshi Y., Matsushita M.,
Oda K., Kusumoto K.-I., Kashiwagi Y., Sugiyama M., (2009) "A novel
transformation system using a bleomycin resistance marker with
chemosensitizers for Aspergillus oryzae",Biochemical and Biophysical
Research Communications, 383(1), pp. 42-47.
97. Tao L., Chung S.H., (2014) "Non-Aflatoxigenicity of Commercial Aspergillus
oryzae Strains Due to Genetic Defects Compared to Aflatoxigenic
Aspergillus flavus",J. Microbiol. Biotechnol, 24(8), pp. 1081-1087.
98. Te Biesebeke R., Record E., Van Biezen N., Heerikhuisen M., Franken A.,
Punt P., Van Den Hondel C., (2005) "Branching mutants of Aspergillus
oryzae with improved amylase and protease production on solid
substrates",Applied Microbiology and Biotechnology, 69(1), pp. 44-50.
99. Te Biesebeke R., Ruijter G., Rahardjo Y.S., Hoogschagen M.J., Heerikhuisen
M., Levin A., van Driel K.G., Schutyser M.A., Dijksterhuis J., Zhu Y., (2002)
"Aspergillus oryzae in solid-state and submerged fermentations",FEMS
Yeast Research, 2(2), pp. 245-248.
100. Teodoro C.E.d.S., Martins M.L.L., (2000) "Culture conditions for the
production of thermostable amylase by Bacillus sp",Brazilian Journal of
Microbiology, 31(4), pp. 298-302.
101. Toffaletti D.L., Rude T.H., Johnston S.A., Durack D., Perfect J., (1993)
"Gene transfer in Cryptococcus neoformans by use of biolistic delivery of
DNA",Journal of Bacteriology, 175(5), pp. 1405-1411.
102. Tran V.T., Braus‐Stromeyer S.A., Kusch H., Reusche M., Kaever A., Kühn
A., Valerius O., Landesfeind M., Aßhauer K., Tech M., (2014) "Verticillium
transcription activator of adhesion Vta2 suppresses microsclerotia
formation and is required for systemic infection of plant roots",New
Phytologist, 202(2), pp. 565-581.
103. Unkles S.E., Campbell E.I., de Ruiter-Jacobs Y.M., Broekhuijsen M., Macro
J.A., Carrez D., Contreras R., van den Hondel C.A., Kinghorn J.R., (1989) "The
development of a homologous transformation system for Aspergillus oryzae
based on the nitrate assimilation pathway: a convenient and general
selection system for filamentous fungal transformation",Molecular and
General Genetics MGG, 218(1), pp. 99-104.
104. Van Hartingsveldt W., Mattern I.E., van Zeijl C.M., Pouwels P.H., van den
Hondel C.A., (1987) "Development of a homologous transformation system
for Aspergillus niger based on the pyrG gene",Molecular and General
Genetics, 206(1), pp. 71-75.
105. Wang D., He D., Li G., Gao S., Lv H., Shan Q., Wang L., (2014) "An efficient
tool for random insertional mutagenesis: Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus
terreus",Journal of Microbiological Methods, 98(pp. 114-118.
106. Ward O., (2011) "Industrial Biotechnology and Commodity Products.
Proteases",In Comprehensive Biotechnology, 3(pp. 571-582.
107. Weidner G., d'Enfert C., Koch A., Mol P.C., Brakhage A.A., (1998)
"Development of a homologous transformation system for the human
pathogenic fungus Aspergillus fumigatus based on the pyrG gene encoding
orotidine 5′′-monophosphate decarboxylase",Current Genetics, 33(5), pp.
378-385.
108. Winans S.C., (1992) "Two-way chemical signaling in Agrobacterium-
plant interactions",Microbiological Reviews, 56(1), pp. 12-31.
109. Wyss M., Pasamontes L., Friedlein A., Rémy R., Tessier M., Kronenberger
A., Middendorf A., Lehmann M., Schnoebelen L., Röthlisberger U., (1999)
"Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol
hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation
pattern, and engineering of proteolytic resistance",Applied and
Environmental Microbiology, 65(2), pp. 359-366.
110. Wyss M., Pasamontes L., Rémy R., Kohler J., Kusznir E., Gadient M., Müller
F., van Loon A.P., (1998) "Comparison of the Thermostability Properties of
Three Acid Phosphatases from Molds: Aspergillus fumigatus Phytase, A.
niger Phytase, and A. niger pH 2.5 Acid Phosphatase",Applied and
Environmental Microbiology, 64(11), pp. 4446-4451.
111. Xu Y., (1990) "Advances in the soy sauce industry in China",Journal of
Fermentation and Bioengineering, 70(6), pp. 434-439.
112. Yu J., Chang P.-K., Ehrlich K.C., Cary J.W., Bhatnagar D., Cleveland T.E.,
Payne G.A., Linz J.E., Woloshuk C.P., Bennett J.W., (2004) "Clustered
pathway genes in aflatoxin biosynthesis",Applied and Environmental
Microbiology, 70(3), pp. 1253-1262.
113. Zambare V., (2010) "Solid state fermentation of Aspergillus oryzae for
glucoamylase production on agro residues",International Journal of Life
Sciences, 4(pp. 16-25.
114. Zelaya-Molina L.X., Ortega M.A., Dorrance A.E., (2011) "Easy and efficient
protocol for oomycete DNA extraction suitable for population genetic
analysis",Biotechnology Letters, 33(4), pp. 715-720.
115. Zhong Y., Yu H., Wang X., Lu Y., Wang T., (2011) "Towards a novel
efficient T-DNA-based mutagenesis and screening system using green
fluorescent protein as a vital reporter in the industrially important fungus
Trichoderma reesei",Molecular Biology Reports, 38(6), pp. 4145-4151.
116. Zhu L., Maruyama J.-i., Kitamoto K., (2013) "Further enhanced
production of heterologous proteins by double-gene disruption (ΔAosedD
ΔAovps10) in a hyper-producing mutant of Aspergillus oryzae",Applied
Microbiology and Biotechnology, 97(14), pp. 6347-6357.
51