UBND TỈNH THỪA THIÊN HUẾ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO KHOA HỌC

KẾT QUẢ ĐỀ TÀI KHCN CẤP TỈNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ

GẮN HAI MÀU (Dual-ISH) BẰNG MÁY NHUỘM HÓA

MÔ MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN

HER2 TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ

Mã số: TTH-2016-KC.12

Cơ quan chủ trì đề tài:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC - ĐẠI HỌC HUẾ

Chủ nhiệm đề tài:

PGS.TS. ĐẶNG CÔNG THUẬN

Huế, tháng 8 năm 2019

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú (UTV) là loại ung thư thường gặp nhất và là một trong

những nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư ở phụ nữ trên toàn thế

giới cũng như tại Việt Nam.

Tỷ lệ mắc bệnh UTV có xu hướng tăng trên toàn thế giới nhưng tỷ lệ

tử vong vẫn từng bước giảm dần nhờ những thành tựu đạt được trong

phòng bệnh, phát hiện sớm, chẩn đoán và điều trị.

HER2 (thụ thể yếu tố phát triển biểu bì người, Human Epidermal

Receptor) là một trong bốn thành viên của họ các thụ thể yếu tố phát

triển biểu mô (Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR). Chúng là các

thụ thể tyrosine kinase xuyên màng có liên quan chặt chẽ với nhau. Các

thụ thể tyrosine kinase giữ vai trò quan trọng trong điều hòa dẫn truyền

tín hiệu của yếu tố tăng trưởng. Sự rối loạn hoạt động của chúng sẽ ảnh

hưởng lên các quá trình tế bào như tăng sinh, tân sinh mạch máu, chu kỳ

tế bào, sự sống sót và quá trình tế bào chết theo chương trình làm cho tế

bào trở nên ác tính.

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 25-30% số bệnh nhân UTV

có khuếch đại gen HER2, một tiền gen nằm trên nhánh q của nhiễm sắc

thể thứ 17, dẫn đến biểu hiện quá mức thụ thể HER2 và điều này có liên

quan mật thiết đến diễn tiến xâm lấn và tiên lượng xấu trên lâm sàng,

bao gồm nguy cơ cao của tái phát, di căn, phát triển nhanh của khối u và

thời gian sống thêm của bệnh nhân giảm đi.

Ứng dụng lâm sàng quan trọng nhất của xét nghiệm HER2 là lựa

chọn bệnh nhân cho việc điều trị đích bằng trastuzumab (Herceptin) -

một loại kháng thể đơn dòng. Herceptin đã được Uỷ ban thuốc và thực

phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận dùng điều trị UTV giai đoạn muộn có

HER2 dương tính từ năm 1997.

Để xác định tình trạng HER2, kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang

(Fluorescent insitu hybridization - FISH) được xem như là tiêu chuẩn

vàng. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi phải có kính hiển vi huỳnh

quang trong phòng xét nghiệm chuyên biệt, hơn nữa là các tiêu bản

huỳnh quang không thể lưu trữ được lâu dài để xem xét lại vì tín hiệu

huỳnh quang sẽ mất dần và giá thành xét nghiệm khá đắt.

Hiện nay, kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu (Dual-ISH) bằng cách gắn

enzym có thể thay thế được kỹ thuật FISH để đánh giá cả sự khuếch đại

gen HER2 và của nhiễm sắc thể 17 trên cùng một tiêu bản. Phương pháp

2

này khắc phục được các nhược điểm của FISH. Tháng 6 năm 2011, FDA

đã cấp phép sử dụng kỹ thuật xét nghiệm Dual-ISH để xác định tình

trạng khuếch đại của gen HER2 trong UTV. Kỹ thuật này đã và đang

được sử dụng ngày càng rộng rãi trên thế giới.

Do kỹ thuật Dual-ISH là một kỹ thuật hiện đại và được phép sử dụng

trong thực hành lâm sàng từ năm 2011 nên chưa được đầu tư, triển khai

thực hiện rộng rãi ở Việt Nam.

Nhằm mục đích triển khai kỹ thuật chẩn đoán mới để phát hiện sự

khuếch đại gen HER2 trong UTV tại khu vực Miền Trung - Tây Nguyên

và góp phần nâng cao chất lượng điều trị đích phân tử và cải thiện tiên

lượng bệnh UTV trong khu vực; chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm 2

mục tiêu sau:

1- Hoàn thiện quy trình kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu để phát hiện

sự khuếch đại gen HER2 trong ung thư biểu mô tuyến vú tại Bệnh viện

Trường Đại học Y Dược Huế

2- Xác định sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn

hai màu, mối liên quan với sự biểu lộ protein HER2, tình trạng thụ

thể nội tiết và các yếu tố tiên lượng kinh điển trong ung thư biểu mô

tuyến vú.

Tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo của đề tài:

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở miền Trung - Tây Nguyên áp dụng

kỹ thuật Dual-ISH để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 trong UTV

với số lượng mẫu khá lớn.

Kỹ thuật này sẽ là minh chứng cho tính sáng tạo, năng động của

đội ngũ giảng viên, kỹ thuật viên của Trường ĐHYD Huế luôn đi đầu

trong ứng dụng công nghệ mới, kỹ thuật hiện đại trong đào tạo, chẩn

đoán và điều trị.

Nghiên cứu này cũng sẽ là minh chứng rằng việc ứng dụng kỹ

thuật Dual-ISH để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 sẽ cho kết quả

khách quan hơn, thuận tiện hơn và giá thành thấp hơn so với kỹ thuật

FISH nên sẽ là lựa chọn hàng đầu cho các cơ sở y tế muốn áp dụng

kỹ thuật lai tại chỗ trong tương lai.

Kết quả nghiên cứu này có thể được chuyển giao, áp dụng cho các

bệnh viện tuyến Trung ương, tuyến Tỉnh nhằm nâng cao năng lực

chẩn đoán, phát hiện sự khuếch đại gen HER2 và lựa chọn bệnh nhân

cho việc điều trị đích phân tử, góp phần cải thiện chất lượng sống và

tiên lượng bệnh cho bệnh nhân UTV.

3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. DỊCH TỄ HỌC VÀ YẾU TỐ NGUY CƠ BỆNH UTV

1.1.1. Dịch tễ học

Tại Việt Nam, theo ghi nhận ung thư giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc

UTV ở các tỉnh miền Bắc là 19,6/100.000 dân, đứng đầu trong các loại

ung thư ở nữ và ở các tỉnh phía Nam là 16,3/100.000 đứng hàng thứ 2

sau ung thư cổ tử cung. Cụ thể tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở Hà Nội

là 29,7/100.000, tại Thừa Thiên Huế là 9,4/100.000, tại TP Hồ Chí Minh

năm 2003 là 19,4/100.000. Theo Nguyễn Bá Đức nhìn chung tỷ lệ mắc

UTV ở Việt Nam từ 2001-2007 có xu hướng tăng rõ.

1.1.2. Yếu tố nguy cơ:

Các yếu tố nguy cơ của UTV nhìn chung được chia thành 2 loại: những

yếu tố nguy cơ có thể kiểm soát được và những yếu tố nguy cơ không

kiểm soát được.

1.1.2.1. Một số yếu tố nguy cơ không kiểm soát được:

- Giới nữ: Nữ giới có nguy cao mắc bệnh UTV gấp hơn 100 lần so

với nam giới.

- Tuổi cao: Hầu hết các trường hợp UTV được phát hiện ở phụ nữ

trên 55 tuổi.

- Gen: Khoảng 5-10% UTV liên quan tới gen.

- Chủng tộc: Phụ nữ da trắng có tỷ lệ mắc UTV cao hơn phụ nữ Mỹ

gốc Phi. Tỷ lệ mắc và chết vì UTV ở phụ nữ châu Á, Tây Ban Nha

thường thấp hơn.

- Tiền sử bản thân hay gia đình mắc UTV: Người có mẹ hoặc chị em

gái ruột mắc bệnh UTV có nguy cơ mắc bệnh UTV gấp hai lần phụ nữ

không có tiền sử gia đình.

- Mô vú đặc: Phụ nữ có vú với tỷ lệ mô tuyến và mô sợi nhiều, ít mô

mỡ có nguy cơ gấp 1,5-2 lần người có mật độ vú trung bình.

- Bệnh vú lành tính: Phụ nữ có u tăng sản biểu mô không điển hình

có nguy cơ mắc bệnh UTV cao hơn 4 - 5 lần so với những người không

có sự thay đổi tăng sinh ở vú.

- Tuổi có kinh lần đầu sớm (đặc biệt trước 12 tuổi) và mãn kinh chậm

(sau 55 tuổi) làm tăng nguy cơ UTV hơn do thời gian tiếp xúc với

estrogen, progesterone dài hơn.

- Nhiễm xạ khi <40 tuổi (khi tuyến vú còn đang phát triển) làm tăng tỷ lệ mắc UTV.

- Sử dụng thuốc Diethyl-stibestrol (DES): được dùng ngừa sẩy thai.

1.1.2.2. Một số yếu tố có thể kiểm soát:

4

- Rượu: Những người uống 2-3 ly rượu hàng ngày tăng nguy cơ mắc

UTV lên 20%.

- Thừa cân và béo phì trước mãn kinh làm tăng nguy cơ mắc UTV típ

bộ ba âm tính.

- Ít vận động: Có thể liên quan tới cân nặng, nhiễm trùng hoặc thay

đổi hoóc môn...

- Không có con hoặc có con muộn (sau 30 tuổi).

- Không nuôi con bằng sữa mẹ: Cho con bú 1-2 năm sau sinh làm

giảm nguy cơ UTV.

- Thuốc tránh thai và liệu pháp thay thế hormone sau mãn kinh.

1.2. PHÂN LOẠI, PHÂN ĐỘ, GIAI ĐOẠN UNG THƯ VÚ

1.2.1. Phân loại ung thư biểu mô tuyến vú

Kể từ phân loại mô bệnh học đầu tiên của WHO năm 1968, đến nay

đã có nhiều bản sửa đổi và bổ sung. Mới đây năm 2012, ấn bản lần 4 của

WHO về hệ thống phân loại mô bệnh học UTV có nhiều điểm thay đổi

và bổ sung quan trọng.

1.2.2. Phân độ mô học ung thư biểu mô tuyến vú

Từ những ngày đầu nghiên cứu về bệnh học vi thể, người ta đã nhận

ra rằng, những u ác tính có sự khác nhau về mức độ ác tính và điều này

được biểu hiện trên hình thái (Hanseman 1890 và Dennis 1891).

Bảng 1.2. Đánh giá độ mô học UTBM ống xâm nhập theo hệ thống

phân độ Scaff-Bloom-Richardson (SBR) cải biên [13]

Đặc điểm Điểm

Sự tạo ống

Chiếm đa số của u (>75%)

Mức độ trung gian (10-75%)

Ít hoặc không (<10%)

1

2

3

Sự đa hình thái của nhân

Các tế bào đồng nhất, đều đặn, nhỏ

Gia tăng kích thước và biến đổi mức độ vừa

Biến đổi rõ rệt

1

2

3

Nhân chia (10 vi trường độ phóng đại lớn)

0-5

6-10

>11

1

2

3

Theo cách đánh giá của Elston, độ của u phụ thuộc vào tổng số điểm

được tính:

- Độ 1: 3-5 điểm, biệt hóa cao

5

- Độ 2: 6-7 điểm, biệt hóa vừa

- Độ 3: 8-9 điểm, biệt hóa kém

Hiện nay, hầu hết các cơ sở y tế trong nước đều phân độ mô học trong

chẩn đoán UTV.

1.2.3. Phân loại theo TNM và xếp nhóm giai đoạn

1.2.3.1. Phân loại theo TNM (TCYTTG 2003) 1.2.3.2. Xếp giai đoạn theo Tổ chức Y tế Thế giới 2003

1.3. HÓA MÔ MIỄN DỊCH VÀ HER2 TRONG UNG THƯ VÚ

1.3.1. Hóa mô miễn dịch trong ung thư vú

Trong thời gian gần đây, nhiều dấu chứng sinh học của tế bào u đã

được đề nghị sử dụng để bổ sung vào vào danh sách các yếu tố dự đoán

tiên lượng cũng như dự đoán đáp ứng hoá trị cho bệnh nhân UTV.

1.3.2. Gen Her-2/neu (c-erbB-2) trong ung thư vú

Sản phẩm của Her-2/neu là một loại glycoprotein thuộc màng tế bào

trong họ thụ thể của yếu tố phát triển thượng bì, được tổng hợp từ proto-

oncogen Her-2/neu nằm tại vị trí 21 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 17 (ký

hiệu 17q21).

Protein c-erbB-2 là sản phẩm của gen Her-2/neu, có trọng lượng

phân tử 185kd, được biểu hiện ở mức độ thấp ở các tế bào biểu mô và cơ

biểu mô của mô tuyến vú bình thường. Bên cạnh chức năng là một thụ

thể của yếu tố phát triển thượng bì, Her-2/neu còn có vai trò quan trọng

trong các cơ chế biệt hoá tế bào, sự kết dính và di chuyển của tế bào, vì

vậy có thể góp phần vào vào khả năng xâm lấn và di căn của tế bào ung

thư.

Hầu hết các nghiên cứu về vai trò của Her-2/neu trong UTV đều dựa

vào mức độ biểu hiện của sản phẩm gen Her-2/neu bằng phương pháp

HMMD. Một số nghiên cứu khác dựa vào sự khuếch đại gen và nhận

thấy rằng sự gia tăng số lượng bản sao của gen Her-2/neu có liên quan

với tăng mức độ biểu hiện của sản phẩm protein. Có khoảng 20-30% các

trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn có sự biểu hiện quá mức

của Her-2/neu.

Trong 48 nghiên cứu về vai trò tiên lượng của Her-2/neu thực hiện ở

15.000 bệnh nhân UTV, đa số nghiên cứu đều kết luận rằng sự khuếch

đại gen hoặc sự biểu hiện quá mức của Her-2/neu có liên quan với tiên

lượng xấu, nhất là ở bệnh nhân UTV có di căn hạch. Ở Châu Á, tháng 1 năm 2016, Tang MC và cộng sự của Đại học Y

Hồng Kông đã công bố một nghiên cứu trên 99 bệnh nhân UTBM vú

xâm nhập cho thấy tỷ lệ khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật Dual-ISH

6

là 19,2% và tỷ lệ tương hợp với kỹ thuật FISH là 96%, phù hợp với

khuyến cáo của ASCO/CAP 2013. Tác giả kết luận rằng: Dual-ISH là

một xét nghiệm HER2 đáng tin cậy và là lựa chọn hữu ích trong UTV.

Một số nghiên cứu cho rằng mức độ biểu hiện của Her-2/neu còn có

thể giúp dự đoán sự đáp ứng với liệu pháp nội tiết. Trong những trường

hợp UTV giai đoạn muộn, tế bào có Her-2/neu biểu hiện càng nhiều thì

đáp ứng với tamoxifen càng kém và kém hơn những trường hợp biểu

hiện Her-2/neu mức độ thấp.

1.4. NGHIÊN CỨU PHÂN NHÓM PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ

VÚ

1.4.1. Phân nhóm phân tử ung thư vú bằng hóa mô miễn dịch

Năm 2004, Nielsen và cs đưa ra bảng phân nhóm phân tử UTV gồm

3 nhóm phân tử, dựa vào 5 dấu ấn HMMD là thụ thể nội tiết, HER2,

CK5/6 và EGFR với tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng typ.

Năm 2006, theo Carey và cs chia UTV thành 4 nhóm phân tử dựa vào sự

bộc lộ của các dấu ấn HMMD.

Năm 2009, Tang P, Kristin A.S, David GH đã nghiên cứu và đưa ra

một bảng phân nhóm phân tử UTV theo các tiêu chuẩn HMMD.

Năm 2010, Hsiao Y.H và cs nghiên cứu dựa trên các kiểu hình miễn

dịch.

Hội nghị UTV Quốc tế lần thứ 12 năm 2011 tại St Gallen, Thụy Sĩ đã

đưa ra bảng tiêu chuẩn phân nhóm phân tử UTV.

Năm 2013, Engstrom và cs [22] sử dụng các dấu ấn HMMD: ER, PR,

HER2, Ki67, CK5/6 và EGFR để phân nhóm phân tử UTV.

1.4.2. Các typ phân tử ung thư biểu mô tuyến vú

1.4.2.1. Typ lòng ống A và B

1.4.2.2. Typ HER2

1.4.2.3. Ung thư biểu mô ba âm tính và typ dạng đáy 1.4.2.4. Typ lòng ống A và B lai HER2

1.4.3. Vai trò của typ phân tử trong điều trị và tiên lượng ung thư biểu

mô tuyến vú

Trong nhiều năm, khoảng 30% các bệnh nhân điều trị thất bại, do đó

cần tránh điều trị quá mức hoặc điều trị chưa đủ. Một số nghiên cứu đã

chỉ ra rằng, khi UTV được phân typ mô bệnh học và đánh giá theo các

thông số kinh điển sẽ có một tỷ lệ nhất định các bệnh nhân được điều trị

chưa chính xác. Hội nghị UTV Quốc tế lần thứ 12 năm 2011 tại St Gallen, Thụy Sĩ đã đề cập tới phân nhóm phân tử để đi đến các khuyến

nghị về điều trị UTV, như sau: LUMA chỉ cần điều trị nội tiết đơn thuần,

trong khi đó typ LUMB có thể kết hợp điều trị nội tiết và hóa chất; typ

7

dạng đáy chỉ điều trị bằng hóa chất và typ HER2 kết hợp giữa điều trị

hóa chất và nhắm trúng đích (trastuzumab), đối với typ LAHH và LBHH

được điều trị bằng sự kết hợp giữa nội tiết, hóa chất và nhắm trúng đích.

Trong một nghiên cứu lớn, đã chỉ ra rằng các khối u dạng đáy và HER2

nhạy cảm với hóa trị bổ trợ dựa vào anthracycline hơn các typ lòng ống.

Hơn 45% khối u dạng đáy đáp ứng hoàn toàn sau 12 tuần điều trị

paclitaxel tiếp theo bằng 5-fluorouracil, doxorubicin và

cyclophosphamide. Theo nghiên cứu này, các typ dạng đáy và HER2 kết

hợp với tỷ lệ đáp ứng bệnh học hoàn toàn cao nhất (cả 2 là 45%) và typ

lòng ống có tỷ lệ đáp ứng thấp hơn (6%). Ở typ giống vú bình thường,

không có sự đáp ứng hoàn toàn.

1.5. CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG KINH ĐIỂN TRONG UNG THƯ

VÚ

1.5.1. Kích thước u

Kích thước u là một trong những yếu tố tiên lượng độc lập quan

trọng nhất, kích thước u được sử dụng là một trong các yếu tố đánh giá

giai đoạn bệnh.

Đánh giá mối liên quan giữa kích thước u với tỷ lệ sống thêm của

bệnh nhân cũng được Rosen và cộng sự (1993) nghiên cứu trên 767 bệnh

nhân UTV giai đoạn T1N0M0/T2N0M0 và cho thấy bệnh nhân UTBM

thể ống xâm nhập hoặc tiểu thuỳ xâm nhập, hạch nách âm tính, kích

thước u ≤ 1 cm thì tỷ lệ sống thêm không tái phát sau 10 năm và 20 năm

là 91% và 87%, trong khi đó với các u > 1 cm tỷ lệ này giảm xuống còn

73% và 68%. Nghiên cứu của Carter và cộng sự (1989) cho thấy kích

thước u tương quan với số lượng hạch nách.

1.5.2. Di căn hạch

Tình trạng hạch là yếu tố tiên lượng độc lập có giá trị bậc nhất trong

UTV, có nhiều bằng chứng chứng minh thời gian sống giảm khi số

lượng hạch tăng. Trong nghiên cứu lớn trên dữ liệu 24.740 trường hợp

UTV (chương trình SEER của Viện ung thư Quốc gia) đưa ra kết quả

với u kích thước < 2cm và hạch âm tính hoặc từ 1-3 hạch hoặc trên 4

hạch thì tỷ lệ sống 5 năm tương ứng là 96,3%, 87,4% và 66,0%

1.5.2.1. Hạch nách Tình trạng hạch nách được coi là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất

liên quan đến tỷ lệ tái phát và thời gian sống thêm. Tỷ lệ sống thêm, tái

phát, thời gian tái phát, thất bại trong điều trị đều liên quan với số lượng hạch di căn. Tỷ lệ di căn hạch nách là khoảng 40,1% trong UTV giai

đoạn I, II; di căn hạch nách tương quan với kích thước u, độ mô học, loại

mô học, giai đoạn bệnh [6].

8

1.5.2.2. Hạch vú trong

Các ung thư ở vị trí trung tâm và trên trong thường di căn hạch vú

trong hơn các hạch vị trí khác. Hạch vú trong ít được đánh giá nhưng di

căn vào hạch này đứng thứ hai sau di căn hạch nách và ý nghĩa tiên

lượng của nó cũng giống hạch nách. Hầu hết bệnh nhân có di căn hạch

vú trong cũng di căn hạch nách [33].

1.5.2.3. Hạch thượng đòn Di căn hạch thượng đòn có tiên lượng xấu, tỷ lệ sống 5 năm sau khi

di căn hạch thượng đòn chỉ 33,6% [26].

1.5.3. Giai đoạn bệnh

Giai đoạn UTV là yếu tố tiên lượng quan trọng liên quan đến tỷ lệ

sống thêm và phương pháp điều trị. Tỷ lệ sống sau 5 năm chẩn đoán

UTV dựa trên thống kê của Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ năm 2002 giảm

dần từ giai đoạn 0 (93%), giai đoạn I (88%), giai đoạn IIA (81%), giai

đoạn IIIA (67%) đến giai đoạn IV chỉ còn 5%; thống kê từ cơ sở dữ liệu

dựa vào số bệnh nhân chẩn đoán từ năm 2004 đến 2010, giai đoạn 0 và I

thì tỷ lệ sống sót sau 5 năm gần như 100%, giai đoạn II là 93%, giai

đoạn III là 72%, giai đoạn IV là 22% [18].

1.5.4. Độ mô học

Độ mô học là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng mặc dù

nó không được sử dụng như một thông số để đánh giá giai đoạn ung thư.

Có nhiều hệ thống phân độ mô học nhưng hiện nay phân độ của Scarff –

Bloom – Richardson, sửa đổi bởi Elston và Ellis được đánh giá là có

hiệu quả nổi bật trong tiên lượng bệnh, được áp dụng rộng rãi. Đây có

thể coi là một yếu tố tiên lượng độc lập. Nghiên cứu trên 1244 trường

hợp UTV, Shetty đưa ra kết quả UTV có độ mô học I thì tỷ lệ hạch

dương tính 3%, độ mô học II và III là 11% và 19%[8].

1.5.5. Các yếu tố tiên lượng khác trong ung thư vú

1.5.5.1. Tuổi phát hiện

1.5.5.2. Loại mô học

1.6. CÁC XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH PROTEIN HER2 VÀ GEN

HER2

1.6.1. Hóa mô miễn dịch

Kỹ thuật này cho phép quan sát được sự hiện diện của kháng nguyên

(KN) trên tế bào và mô, nhờ đó có thể đánh giá được cả về hình thái học

và kiểu hình miễn dịch của tế bào u. Ngoài ra, HMMD còn giúp xác định sự biểu lộ của các dấu ấn KN quan trọng trên tế bào u, giúp lựa chọn

phương pháp điều trị thích hợp, đặc biệt là liệu pháp điều trị nhắm trúng

đích (target therapy), đồng thời giúp tiên lượng bệnh nhân tốt hơn...

9

Theo hướng dẫn của ASCO/CAP 2007 và 2013, để lựa chọn bệnh

nhân điều trị đích phân tử với trastuzumab (Herceptin), nhóm có kết quả

HER2 (2+) cần xác định lại những trường hợp có khuếch đại gen HER2

mới là nhóm đích, còn lại những trường hợp không có khuếch đại gen

thì không phải là nhóm đích của điều trị đích phân tử trong UTV [60].

1.6.2. Lai tại chỗ huỳnh quang (FISH- Fluorescent In Situ

Hybridization)

FISH sẽ phát hiện số lượng các bản sao gen HER2 trong tế bào ung

thư. FISH là một phương pháp nhạy và đặc hiệu, xác định số bản sao

gen HER2 thường kết hợp và xác định số bản sao trung đoạn trên nhiễm

sắc thể 17 (CEP17). Kỹ thuật FISH cũng sử dụng mẫu mô vùi nến, được

cố định bằng formol và lát cắt chuẩn 4 đến 5μm. Kết quả phép lai này

thường được biểu diễn dưới hai dạng là dương tính và âm tính, tương

đương với việc có sự khuếch đại của gen HER2 hay không. Nếu lượng

gen HER2 càng nhiều thì nguy cơ các tế bào UTV phát triển càng mạnh.

Hiện nay, FISH có 3 hạn chế: phải có kính hiển vi huỳnh quang. Thứ

hai, tiêu bản FISH không thể lưu được lâu do sự thoái hóa của các tín

hiệu huỳnh quang. Cuối cùng, kính hiển vi huỳnh quang giới hạn khả

năng quan sát cấu trúc của mô và đánh giá sự xâm nhập.

1.6.3. Kỹ thuật lai tại chỗ gắn màu (Chromogenic In Situ

Hybridization, CISH)

Kỹ thuật này tương đương với phép lai FISH, là kỹ thuật cải tiến của

phương pháp FISH, nó phát hiện việc có quá nhiều bản sao gen HER2

trong tế bào ung thư. Kỹ thuật mới sử dụng peroxidase enzyme để phát

hiện nhiễm sắc thể thay vì sử dụng huỳnh quang, cho phép đọc kết quả

bằng kính hiển quang học thông thường. Như vậy, hình thái, đặc điểm

mô bệnh học của tiêu bản có thể được đánh giá song song. Hơn nữa, tín

hiệu không phân hủy theo thời gian [38]. Kết quả của xét nghiệm thường

được ghi dưới dạng âm tính (không có sự khuếch đại gen HER2) và

dương tính (có sự khuếch đại gen HER2).

CISH để phát hiện khuếch đại gen HER2. Có 2 loại CISH:

+ CISH tiêu chuẩn: chỉ dùng một đầu dò HER2.

+ CISH hai màu (dual-color CISH: dc-CISH), sử dụng một đầu dò

HER2 và một đầu dò CEP17.

1.6.4. Xét nghiệm lai tại chỗ gắn hai màu DISH (Dual In Situ

Hybridization)

Tương tự như hai xét nghiệm ở trên, xét nghiệm này phát hiện sự

khuếch đại của gen HER2 và cũng được trả lời dưới dạng kết quả

khuếch đại và không khuếch đại.

10

Thực chất DISH chính là kỹ thuật CISH hai màu nhưng đầu dò

HER2 được gắn bạc nên sẽ nhuộm màu đen trong khi đầu dò CEP17

nhuộm màu đỏ. Kỹ thuật này thực hiện nhanh và dễ dàng hơn so với

FISH, cần một kính hiển vi quang học, làm cho nó đặc biệt phù hợp

với thói quen sử dụng trong các phòng thí nghiệm.

Kỹ thuật DISH có các ưu điểm sau so với kỹ thuật FISH:

- Ưu điểm lớn nhất của phương pháp DISH là có thể đánh giá

số lượng bản sao gen HER2, CEP17 và các đặc điểm mô bệnh học

cùng một lúc vì vậy việc xác định chính xác vùng tế bào ung

thư xâm lấn dễ dàng hơn

- Các tín hiệu không bị phân hủy theo thời gian, do đó tiêu bản

có thể được lưu trữ trong một thời gian dài ở nhiệt độ phòng, có

thể xem xét lại khi cần thiết và có thể nhiều người khảo sát cùng lúc

dưới kính hiển vi quang học

- DISH có giá thành rẻ hơn, thời gian thực hiện ngắn hơn.

1.7. NỘI DUNG CỦA HƯỚNG DẪN VÀ KHUYẾN CÁO DÀNH

CHO XÉT NGHIỆM HER2 CỦA ASCO/CAP 2013

1.7.1. Các khuyến cáo chính cho các chuyên gia ung thư

1.7.2. Các khuyến nghị chính cho BS Giải phẫu bệnh

1.7.3. Các lưu đồ sử dụng trong xét nghiệm HER2 dành cho ung thư

vú theo hướng dẫn của ASCO/CAP 2013

Sơ đồ 1.1. Lưu đồ thực hiện xét nghiệm HER2 bằng hoá mô miễn dịch

11

1.8. THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÍCH VÀ HÓA TRỊ BỔ TRỢ TRONG

UNG THƯ VÚ CÓ THỤ THỂ HER2 DƯƠNG TÍNH

1.8.1. Liệu pháp điều trị đích trong ung thư vú

1.8.1.1. Khái niệm về điều trị đích

1.8.1.2. Phân nhóm thuốc điều trị đích

1.8.1.3. Các thuốc điều trị đích trong ung thư vú

-Trastuzumab (Herceptin): Đây là một kháng thể đơn dòng. Nó

thường được phối hợp cùng với hóa chất, nhưng nó cũng có thể được sử

dụng đơn độc Trastuzumab có thể được sử dụng để điều trị cả UTV ở

giai đoạn sớm và giai đoạn muộn. Khi bắt đầu trước hoặc sau phẫu thuật

để điều trị UTV giai đoạn sớm, thuốc này thường được dùng trong một

năm. Đối với UTV tiến triển, điều trị thường được dùng cho tới khi bệnh

tiến triển. Thuốc này được đưa vào tĩnh mạch.

-Pertuzumab (Perjeta): kháng thể đơn dòng này có thể được sử

dụng cùng với trastuzumab và hóa trị, trước khi phẫu thuật để điều trị

UTV giai đoạn sớm, hoặc để điều trị UTV tiến triển. Thuốc này được

dùng bằng đường tĩnh mạch.

-Ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla, còn gọi là TDM-1): Đây

là một kháng thể đơn dòng gắn liền với một loại thuốc hóa trị liệu. Nó

XÉT NGHIỆM HER2 BẰNG Dual-ISH

Mẫu chứng bắt tín hiệu đúng

Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2

Trung bình tín hiệu

HER2≥ 4/TB

ISH(+)

Phải thực hiện IHC trên cùng mẫu, xét nghiệm ISH thay thế hoặc mẫu mới (IHC hoặc ISH)

Tỉ lệ HER2/CEP17 <2

Trung bình tín hiệu

HER2 ≥4 và <6/TB Trung bình tín hiệu

HER2 ≥ 6/TB

Trung bình tín hiệu

HER2 <4/TB Trung bình tín hiệu

HER2<4/TB

ISH(+) ISH(-/+) ISH(+) ISH(-)

Sơ đồ 1.2. Lưu đồ xét nghiệm lai tại chỗ gắn hai màu (đoạn dò kép)

12

được sử dụng để điều trị UTV tiến triển ở những phụ nữ đã được điều trị

bằng trastuzumab và hóa trị. Thuốc này cũng được cho trong tĩnh mạch.

-Lapatinib (Tykerb): Đây là chất ức chế kinase. Dùng bằng đường

uống. Lapatinib được sử dụng để điều trị UTV tiến triển, và có thể được

sử dụng cùng với một số loại thuốc hóa trị liệu, trastuzumab hoặc thuốc

nội tiết.

-Neratinib (Nerlynx): Đây là một chất ức chế kinase. Dùng bằng

đường uống. Neratinib được sử dụng để điều trị UTV giai đoạn sớm sau

khi một người phụ nữ đã hoàn thành một năm trastuzumab và thường

được cho một năm. Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy nó cũng có thể

có hiệu quả trong UTV tiến triển.

Trong các thuốc điều trị nhắm trúng đích kể trên, Trastuzumab là

thuốc đầu tiên được FDA cho phép áp ụng trong UTV có thụ thể Her2

dương tính vào năm 1998. Những tác nhân khác như pertuzumab,

lapatibin không cho thấy tác dụng miễn dịch đối với cơ chế đề kháng và

tác dụng phụ đáng kể đối với bệnh nhân.

1.8.2. Hóa trị bổ trợ trong ung thư vú có thụ thể her2 +

1.8.2.1. Các thử nghiệm bổ trợ trong trong ung thư vú có thụ thể HER2+ - Thử nghiệm NSABP-B31 và NCCTG N9831

- Thử nghiệm BCIRG 006

- Nghiên cứu Hera

- Nghiên cứu FinHer

- Thử nghiệm PACS04

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là 100 bệnh nhân đến khám và điều trị UTV tại

Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế

từ tháng 03 năm 2017 đến tháng 06 năm 2018.

2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh

- Có khối u tuyến vú với các triệu chứng nghi ngờ UTV khi khám

lâm sàng

- Có các đặc điểm nghi ngờ UTV trên hình ảnh siêu âm, chụp hình vú

- Có kết quả tế bào học hoặc mô bệnh học mảnh sinh thiết trước mổ

là UTBM tuyến vú.

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân được chẩn đoán MBH sau phẫu thuật là UTV tại chỗ

- Bệnh nhân UTV xâm nhập nhưng không có chỉ định phẫu thuật

(quá giai đoạn phẫu thuật)

13

- Bệnh nhân UTV đã điều trị trước đó (phẫu thuật, xạ trị, hóa trị...)

2.1.3. Cỡ mẫu:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn mẫu thuận tiện với số lượng là

100 bệnh nhân, lấy trong thời gian 16 tháng, từ tháng 3/2017 đến tháng

6/2018

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2. Các bước tiến hành nghiên cứu

- Chọn đối tượng nghiên cứu

- Ghi nhận các dữ kiện hành chính, bệnh sử và triệu chứng lâm sàng

- Siêu âm vú, chụp hình vú, xét nghiệm tế bào học, sinh thiết để xét

nghiệm mô bệnh học và ghi nhận kết quả

- Phẫu tích bệnh phẩm UTV sau phẫu thuật, đánh giá và ghi nhận

kích thước u, độ mô học, phân loại mô bệnh học, tình trạng di căn hạch

nách, phân loại TNM và phân giai đoạn bệnh

- Xét nghiệm các dấu ấn miễn dịch ER, PR, Ki67 và HER2 bằng kỹ

thuật HMMD

- Thực hiện thử nghiệm kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu cho một số

trường hợp UTV có HER2 âm tính, dương tính (2+) và (3+)

- Điều chỉnh thời gian và chuẩn hóa các hóa chất, chất đệm, sinh

phẩm... thống nhất quy trình kỹ thuật chuẩn cho máy BenchMark GX

của hãng Ventana, Roche tại Bộ môn/Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện

Trường Đại học Y Dược Huế

- Tiến hành kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu cho tất cả các trường hợp

UTV

- Khảo sát mối liên quan giữa sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật

lai tại chỗ gắn hai màu với sự biểu lộ protein HER2, tình trạng thụ thể

nội tiết, phân nhóm phân tử bằng kỹ thuật HMMD và với các yếu tố tiên

lượng kinh điển

- Phân tích số liệu, viết báo cáo.

2.2.3. Các kỹ thuật sử dụng và cách đánh giá

2.2.3.1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 trong UTBM tuyến vú

- Tham khảo quy trình chuẩn về lai tại chỗ của nhà sản xuất

- Đối chiếu các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị thực tế của đơn vị phục vụ cho kỹ thuật lai tại chỗ trên máy hiện có

- Tiến hành lai 1 tiêu bản Xenograff (Mẫu chứng của hãng, nhằm

kiểm tra sự hoạt động của máy móc và hóa chất)

14

- Tiến hành lai mẫu nghiên cứu có kết quả nhuộm HMMD với HER

âm tính, Her 2+, Her 3+ trên cùng một tiêu bản theo quy trình chuẩn,

đánh giá sau mỗi lần thực hiện, điều chỉnh thời gian của các bước dựa

trên thực tế kết quả sau mỗi lần lai, có tham khảo sự điều chỉnh của các

bệnh viện khác

- Sau khi đã điều chỉnh và hoàn thiện quy trình, tiến hành lai tại chỗ

cho 20 trường hợp mẫu nghiên cứu có kết quả HMMD với HER âm tính,

Her 2+, Her 3+

- Thu thập đủ số mẫu nghiên cứu còn lại (80 trường hợp) và tiến hành

lai tại chỗ theo quy trình đã hiệu chỉnh, hoàn thiện.

2.2.3.2. Kỹ thuật chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (Fine Needle Aspiration,

FNA)

2.2.3.3. Kỹ thuật sinh thiết lõi mô vú dưới hướng dẫn siêu âm để xét nghiệm mô bệnh học

2.2.3.4. Kỹ thuật xử lý bệnh phẩm để chẩn đoán mô bệnh học sau phẫu thuật

2.2.3.5. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch [3]:

Nguyên tắc kỹ thuật của xét nghiệm HMMD: Thời gian nhuộm trong máy là 6 giờ.

Đánh giá kết quả nhuộm HMMD theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất như sau:

Tiêu bản chứng:

- Mẫu chứng dương: Là các tiêu bản UTV đã được biết trước đó là

dương cho mỗi dấu ấn sinh học. Mỗi dấu ấn sinh học đều có mẫu chứng

dương riêng.

- Mẫu chứng âm: Cũng là mẫu UTV xâm lấn dùng cho chứng dương,

tuy nhiên không cho ủ với kháng thể thứ nhất.

* Cách đánh giá các dấu ấn sinh học trên tiêu bản HMMD: - Đánh giá ER, PR:

+ Cách nhuộm màu: Nhuộm nhân tế bào.

+ Cách đánh giá: theo thang điểm Allred, bảng 2.1 [3

Phản ứng dương tính khi tổng điểm ≥2

Âm tính <2 điểm 1+: 2-4 điểm 2+: 5-6 điểm 3+:7-8 điểm

- Đánh giá biểu hiện chỉ số phân bào Ki67:

+ Cách nhuộm màu: nhân tế bào u bắt màu nâu

+ Cách đánh giá: thấp (<14%), cao (≥14%) - Đánh giá thụ thể HER2 trên tiêu bản HMMD:

+ Cách nhuộm màu: nhuộm màng tế bào

+ Cách đánh giá:

15

Âm tính

0: màng tế bào u xâm lấn không bắt màu.

1(+): màng tế bào u xâm lấn bắt màu rải rác, nhạt.

Dương tính

2(+): màng tế bào u bắt màu hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥ 10% tế bào u

3(+): màng tế bào u bắt màu hoàn toàn, dày, đậm ≥ 10% tế bào u

2.2.3.6. Kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu [36],[37],[38]: Chọn mẫu mô đã xác định có vùng UTV xâm nhập rõ, kết quả

nhuộm HER2 đã biết khi nhuộm bằng kỹ thuật HMMD.

Cắt lát mỏng, trải lên trên tiêu bản chuyên dụng cho kỹ thuật này.

Ủ tiêu bản và tiến hành quy trình lai tại chỗ.

Nguyên tắc kỹ thuật của xét nghiệm HER2 Dual ISH:

Quy trình kỹ thuật xét nghiệm INFORM HER2 Dual ISH trên máy

nhuộm tự động BenchMark, Ventana của hãng Roche.

Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng và vai trò trong quy trình lai tại chỗ

STT Tên hóa chất Diễn giải vai trò

1

INFORM HER2

DUAL ISH DNA

PROBE CKTL

Hỗn hợp chứa đoạn dò gen HER2 và

CEP17, bắt cặp đặc hiệu với trình tự đặc

trưng cho gen HER2 và CEP17 tương ứng

2

ULTRAVIEW RED

ISH DIG

DETECTION KIT

Bộ kit tạo màu đỏ, gắn đặc hiệu với đoạn

dò CEP17 và cho phản ứng tạo tín hiệu

màu đỏ khi quan sát dưới kính hiển vi

3

ULTRAVIEW SISH

DNP DETECTION

KIT

Bộ kit tạo màu đen, gắn đặc hiệu với đoạn

dò gen HER2, và cho phản ứng tạo tín hiệu

màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi

4 HybReady Solution

Dung dịch đệm tạo môi trường tối ưu cho

phản ứng lai của đoạn dò với gen HER2

và CEP17

5 Cell Conditioning

Solution (CC2)

Dung dịch tiền xử lý mẫu ở màng tế bào

6 UltraView Silver

Wash II

Dung dịch rửa nghiêm ngặt sau phản ứng lai

7 ISH PROTEASE 3 Enzyme dùng trong tiền xử lý mẫu ở nhân

8 HER2 Dual ISH 3-in-

1

Mẫu mô chứng

9 LCS Dung dịch dầu khoáng bảo vệ mẫu mô

không bị khô trong quá trình phản ứng

10 10X EZ PREP Dung dịch khử paraffin

16

SOLUTION

11 Hematoxylin II Dung dịch nhuộm nhân

12 BLUING REAGENT Dung dịch làm xanh nhân sau khi nhuộm

hematoxylin II

Nguyên tắc kỹ thuật của xét nghiệm HER2 DISH:

Gen HER2 được phát hiện bằng đoạn dò có gắn dinitrophenyl (DNP)

kết hợp với kit tạo màu bạc UltraView Silver ISH DNP (SISH), cho tín

hiệu màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi. CEP17 được phát hiện

bằng đoạn dò có gắn digoxigenin (DIG), kết hợp với kit tạo màu đỏ

UltraView Red ISH DIG Detection kit, cho tín hiệu màu đỏ khi quan sát

dưới kính hiển vi. Với quy trình sử dụng 2 đoạn dò cùng lúc kết hợp với

2 kit tạo màu khác nhau, dưới kính hiển vi quang học bác sĩ Giải phẫu

bệnh có thể dễ dàng quan sát được gen HER2 và CEP17 kết hợp với

hình thái mô học một cách dễ dàng.

* Cách đánh giá HER2 bằng kỹ thuật Dual-ISH ( theo ASCO/CAP

2013) [60]

- Không biểu hiện rõ:

HER2/CEP17 < 2 và số lượng bản sao gen HER2 ≥ 4 và < 6 tín

hiệu/TB

- Âm tính:

HER2/CEP17 < 2 và số lượng bản sao gen HER2 < 4 tín hiệu/TB

- Dương tính:

HER2/CEP17 ≥ 2 và số lượng bản sao gen HER2 ≥4 tín hiệu/tế bào

HER2/CEP17 ≥ 2 và số lượng bản sao gen HER2<4 tín hiệu/TB

HER2/CEP17 < 2 và số lượng bản sao gen HER2 ≥6 tín hiệu/TB

2.2.4. Các biến số nghiên cứu

2.2.4.1. Đặc điểm chung - Nhóm tuổi: <30, 30-39, 40-49, 50-59, ≥60

- Tình trạng kinh nguyệt: còn kinh nguyệt, mãn kinh/tiền mãn kinh

- Vị trí u: trái, phải, hai bên

- Định khu: ¼ trên ngoài, ¼ dưới ngoài, ¼ trên trong, ¼ dưới trong,

vùng trung tâm

2.2.4.2. Giải phẫu bệnh - Kích thước u: ≤2cm, >2-5cm, >5cm

- Phân loại tế bào học:

+ Quá sản biểu mô tuyến không điển hình, khả năng ác tính

+ UTBM tuyến vú

- Độ mô học: độ I, độ II, độ III theo Scaff-Bloom-Richardson cải biên

- Phân loại mô học: theo phân loại WHO 2012

17

- Phân loại TNM theo UICC và AJCC (2003)

- Phân giai đoạn theo TNM: theo Tổ chức Y tế Thế giới (2003)

2.2.4.3. Hóa mô miễn dịch, phân nhóm phân tử, kỹ thuật lai tại chỗ gắn

hai màu

- HMMD: ER, PR, HER2: (-), (+), (++), (+++); Ki-67: thấp, cao.

- Phân nhóm phân tử: phân nhóm lòng ống A, phân nhóm lòng ống

B, phân nhóm HER2, phân nhóm giống đáy; điểm cắt Ki-67 là 14%.

- Lai tại chỗ gắn hai màu: HER2: không khuếch đại, khuếch đại

2.2.4.4. Mối liên quan giữa tình trạng HER2 bằng kỹ thuật DISH với

HMMD, với phân nhóm phân tử và các yếu tố tiên lượng kinh điển

- Tương quan của sự khuếch đại gen HER2/DISH với sự bộc lộ thụ

thể HER2/HMMD

- Tương quan giữa phân nhóm phân tử dựa trên HMMD và lai tại chỗ

với một số yếu tố tiên lượng kinh điển

2.2.5. Xử lý số liệu

2.2.5.1. Thống kê mô tả

2.2.5.2. Khảo sát mối liên quan

Lập bảng thống kê tần suất, tỷ lệ và liên quan với mức ý nghĩa p<0,05.

2.3. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Đề cương nghiên cứu của đề tài đã được hội đồng khoa học của Sở

Khoa học Công nghệ Tỉnh Thừa Thiên Huế phê duyệt.

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LAI TẠI CHỖ GẮN HAI MÀU

TRÊN MÁY BENCHMARK GX TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG

ĐHYD HUẾ

3.1.1. Quy trình lai tại chỗ của nhà sản xuất khuyến cáo

Bảng 3.1. Quy trình lai tại chỗ của nhà sản xuất khuyến cáo

STT Các bước Thời gian

1 Cell Conditioning 2

Mild 8 phút

Standard 12 phút

Extended 8 phút

2 ISH-Protease 3 8 phút (mẫu Xenograft) 16 phút (mẫu mô)

3 Denaturation 20 phút

4 Hybridization 6 giờ

5 Stringency wash 72 độ C (mẫu mô người)

76 độ C (mẫu Xenograft)

18

6 SISH Multimer 16 phút

7 Silver Chromogen 4 phút

8 Red ISH Multimer 24 phút

9 Red Chromogen 8 phút

10 Counterstain Hematoxyllin II-8 phút

11 Post Counterstain Bluing Reagent-4 phút

3.1.2. Quá trình chuẩn hóa các bước kỹ thuật lai tại chỗ Dual ISH

Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình chuẩn hóa các bước kỹ thuật lai tại chỗ

Dual ISH

Ngày Mẫu Tiến

trình Số test

Kết quả

24/7/ 2017

Xenograff slide (Mẫu chứng của

hãng, nhằm để

kiểm tra sự hoạt động của máy móc và

hóa chất)

CC2: 8-12-8

Protease 2: 2 phút

Stringency Washs: 76ºC

1

Kết quả tốt, tín hiệu đen đỏ rõ nét chứng tỏ hóa chất và máy móc hoạt động tốt. Thảo luận: Dựa trên khuyến cáo của hãng cho mẫu Xenograft, Protease 2 mạnh hơn protease 3 là 4 lần vì vậy bộc lộ 2 phút với protease 2 sẽ tương đương 8 phút với protease 3.

25/7/ 2017

Mẫu Her âm tính, Her 2+, Her 3+

trên cùng một slide

CC2: 12’-12’-12’ Protease

2: 6’ Extend paraffin (khử hết paraffin trên mẫu

mô)

1

Tín hiệu đen và đỏ rõ nét, khử paraffin tốt, nhưng màu nhân mờ nhạt, không phân biệt rõ giữa các nhân. Thảo luận: Nhờ có sự tham khảo từ các bệnh viện khác: “Nếu sử dụng quy trình khuyến cáo từ hãng thì mẫu mô người sẽ bộc lộ không đủ tốt để cho tín hiệu tối ưu” nên chúng tôi đã sử dụng CC2: 12’-12’-12’, protease 2: 6’ thay vì phải bắt đầu chạy thử nghiệm dựa trên quy trình khuyến cáo của hãng CC2: 8’-12’-8’ và protease 3: 16’. Màu nhân mờ nhạt là do xử lý màng nhân hơi quá mức nên giảm thời gian protease xuống.

19

26/7/ 2017

Mẫu Her âm tính, Her 2+, Her 3+

trên cùng một slide

CC2: 12’-12’-12’ Protease

2: 4' Extend paraffin

1

Kết quả tốt, tín hiệu đen và đỏ đều rõ nét, nhân tế bào xanh, không bị nhuộm nền, khử paraffin tốt.

27/7 và

28/7/ 2017

20 mẫu bệnh có Her âm

tính, Her 2+, Her 3+

CC2: 12-12-12

Protease 2: 4'

Extend paraffin

10

Kết quả: 95% số mẫu đạt yêu cầu: bắt tín hiệu đều, đẹp, tín hiệu đen đõ rõ nét, nhân bộc lộ vừa đủ, không có tín hiệu nền. Tuy nhiên 5% số mẫu (1 trên 20 mẫu) vẫn chưa được tối ưu, tín hiệu vẫn chưa được rõ nét (chủ yếu tín hiệu đỏ). Đối với trường hợp này, sau khi kiểm tra lại mẫu mô vẫn đảm bảo các yêu cầu về thời gian bảo quản, thời gian cố định; Chúng tôi đã lấy mẫu mô UTV vị trí khác cũng của bệnh nhân này để tiến hành kỹ thuật lai lần 2, cho kết quả tốt tương tự như trên.

3.1.3. Quy trình lai tại chỗ đã được hoàn thiện sau khi thử nghiệm

và tối ưu hóa

Bảng 3.3. Quy trình lai tại chỗ đã được hoàn thiện sau khi thử

nghiệm và tối ưu hóa

STT Các bước quy trình Thời gian

1 Cell Conditioning 2

Mild 12 phút

Standard 12 phút

Extended 12 phút

2 ISH-Protease 2 4 phút

3 Denaturation 20 phút

4 Hybridization 6 giờ

5 Stringency wash 72 độ C

6 SISH Multimer 16 phút

7 Silver Chromogen 4 phút

8 Red ISH Multimer 24 phút

20

3.2. CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bệnh nhân mắc bệnh UTV trẻ nhất là 32 tuổi, bệnh nhân lớn tuổi

nhất là 91 tuổi. Tuổi phát hiện trung bình là 55,43 ± 13,12 tuổi. Nhóm

tuổi mắc bệnh cao nhất là 50-59 tuổi (33,0%) và ≥ 60 tuổi (31,0%).

Đa số bệnh nhân mắc bệnh UTV đã mãn kinh (59,0%). Vị trí tổn thương

thường ở vú phải (54,0%) và ¼ trên ngoài chiếm 53,0%.

3.3. ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU BỆNH, HÓA MÔ MIỄN DỊCH,

PHÂN NHÓM PHÂN TỬ VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN HER2

3.3.1. Kết quả xét nghiệm tế bào học và mô bệnh học

96,0% UTBM tuyến vú được chẩn đoán đúng bằng xét nghiệm tế bào

học. Với xét nghiệm mô bệnh học, UTBM xâm nhập loại không đặc biệt

chiếm đa số (68,0%), UTBM tiểu thùy xâm nhập chiếm 15,0% là loại

mô học thường gặp thứ hai.

3.3.2. Các đặc điểm giải phẫu bệnh

Đa số UTV đến khám và điều trị khi u đã lớn, hơn 80,0% kích thước

u trên 2cm; trong đó 71,0% các trường hợp ở giai đoạn T2 (>2-5cm). Di

căn hạch nách cùng bên chiếm 60,0%; giai đoạn bệnh thường gặp là giai

đoạn II (77,0%). Độ mô học của 68 trường hợp UTBM xâm nhập loại

không đặc biệt cho thấy độ II chiếm ưu thế (66,2%).

3.3.3. Kết quả xét nghiệm HMMD ER, PR, Ki67 và HER2

Tỷ lệ ER, PR dương tính và chỉ số phân bào Ki67 cao lần lượt là

54,0%; 50,0% và 61,0%. Dương tính với HER2 trên HMMD là 31,0%;

trong đó dương tính mạnh (3+) chiếm 17,0%.

3.3.4. Kết quả lai tại chỗ gắn hai màu xác định sự khếch đại gen

HER2 và phân nhóm phân tử

3.3.4.1. Xác định tình trạng HER2 trên HMMD và DISH

Tất cả các trường hợp HER2(-) và (3+) trên HMMD đều phù hợp với

kết quả lai tại chỗ. 7/17 trường hợp có HER2(2+) trên HMMD thì có

khuếch đại gen khi lai tại chỗ (41,2%).3.3.4.2. Phân nhóm phân tử dựa trên HMMD và lai tại chỗ gắn hai màu

Nhóm lòng ống A chiếm tỷ lệ cao nhất (31,0%), sau đó là nhóm lòng

ống B (28,0%) và nhóm bộ ba âm tính (23,0%), nhóm HER2 thấp nhất,

chiếm 18,0%.

9 Red Chromogen 8 phút

10 Counterstain Hematoxyllin II-8'

11 Post Counterstain Bluing Reagent-4'

21

3.4. MỐI LIÊN QUAN GIỮA PHÂN NHÓM PHÂN TỬ VÀ CÁC

YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG KINH ĐIỂN

Phân nhóm phân tử của UTV có sử dụng lai tại chỗ để xác định sự

khuếch đại gen HER2 cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê với

độ mô học (độ ác tính của tế bào u, p<0,05) và sự phân chia nhân tế bào

(sự phân bào, p<0,01).

Chương 4

BÀN LUẬN

4.1. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LAI TẠI CHỖ GẮN HAI MÀU

TRÊN MÁY BENCHMARK GX TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG

ĐHYD HUẾ

Hai sự điều chỉnh có sự khác biệt rõ nhất của quy trình đã hoàn thiện

của chúng tôi so với quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất đó là Cell

Conditioning 2 (CC2) và ISH-Protease.

CC2: là hóa chất tiền xử lý, giúp làm tan màng sinh học tế bào để tạo

thuận lợi cho các đoạn dò gen đi vào tiếp cận với nhân tế bào. Quá trình

thường diễn ra qua 3 bước với thời gian theo quy trình khuyến cáo như

sau: Mild (8 phút), Standard (12 phút) và Extended (8 phút). Tuy nhiên,

nhờ có sự tham khảo từ các bệnh viện khác: “Nếu sử dụng quy trình

khuyến cáo từ hãng thì mẫu mô người sẽ bộc lộ không đủ tốt để cho tín

hiệu tối ưu” (Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện K Hà Nội) nên chúng tôi

đã sử dụng quy trình CC2 với thời gian được khuyến cáo nên thay đổi là

12’-12’-12’ để đảm bảo các màng tế bào biểu mô được bộc lộ tối đa. Do

đó, chúng tôi không phải mày mò từng bước, thử các tổ hợp thời gian

khác nhau… mà chọn phương án tối ưu đã được áp dụng trên các máy

cùng thương hiệu, cùng nguồn hóa chất sinh phẩm của một công ty và đã

mang lại hiệu quả thiết thực cho việc thực hiện thành công kỹ thuật này.

ISH-Protease: là enzym giúp bộc lộ nhân của tế bào, tạo thuận lợi cho

các đoạn dò gen HER2 và CEP17 dễ dàng di chuyển và gắn vào trong vị

trí thích hợp tương ứng.

Đầu tiên, khi thực hiện trên mẫu Xenograft (là mẫu mô chứng của

hãng, nhằm để kiểm tra sự hoạt động của máy móc và hóa chất), dựa

trên khuyến cáo của hãng cho mẫu Xenograft, Protease 2 mạnh hơn

protease 3 là 4 lần vì vậy chúng tôi để 2 phút với protease 2 vì nó sẽ

tương đương 8 phút với protease 3 theo khuyến cáo. Kết quả rất tốt, các tín hiệu đen của gen HER2 và đỏ của CEP17 rõ nét, điều này chứng tỏ

rằng máy móc và hóa chất, sinh phẩm của chúng tôi hoạt động tốt.

22

Khi thực hiện lai tại chỗ trên mẫu mô bệnh ung thư vú, chúng tôi đã

tham khảo quy trình điều chỉnh từ các bệnh viện và đã thử nghiệm với

thời gian ủ Protease 2 là 6 phút. Kết quả cho thấy tín hiệu đen và đỏ rõ

nét, khử paraffin tốt, nhưng màu nhân mờ nhạt, không phân biệt rõ giữa

các nhân nếu tế bào có nhiều nhân hay 2 nhân của 2 tế bào đứng cạnh

nhau. Sau khi thảo luận, chúng tôi nhận định rằng: Màu nhân mờ nhạt là

do xử lý màng nhân hơi quá mức, và nên giảm thời gian protease 2

xuống còn 4 phút, như vậy cũng tương đương với khuyến cáo của hãng

là ủ protease 3 trong 16 phút. Kết quả lai tại chỗ: Kết quả tốt, tín hiệu

đen đỏ rõ nét, nhân xanh, không bị nhuộm nền, khử paraffin tốt.

Sau đó, chúng tôi tiến hành lai tại chỗ cho 20 mẫu mô ung thư vú với

quy trình đã hoàn thiện gồm CC2: 12’-12’-12’; Protease 2: 4' và Extend

paraffin. Kết quả: 95% số mẫu đạt yêu cầu: bắt tín hiệu đều, đẹp, tín hiệu

đen đõ rõ nét, nhân bộc lộ vừa đủ, không có tín hiệu nền. Tuy nhiên 5% số

mẫu (1 trên 20 mẫu) vẫn chưa được tối ưu, tín hiệu vẫn chưa được rõ nét

(chủ yếu tín hiệu đỏ của nhiễm sắc thể 17).

Đối với trường hợp này, sau khi kiểm tra lại mẫu mô vẫn đảm bảo các

yêu cầu về thời gian bảo quản, thời gian cố định; Chúng tôi đã lấy mẫu mô

UTV vị trí khác cũng của bệnh nhân này để tiến hành kỹ thuật lai lần 2, cho

kết quả tốt tương tự như trên.

Sau khóa huấn luyện, với quy trình kỹ thuật đã được hoàn thiện như

ở bảng 3.3, các KTV của Bộ môn/Khoa giải phẫu bệnh chúng tôi đã tiếp

tục thực hiện các đợt lai cho 80 bệnh nhân ung thư vú khác vào cuối năm

2017 và giữa năm 2018.

4.2. CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đa số bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú đã mãn kinh (59,0%). Nghiên

cứu của Nguyễn Văn Chủ (2015) cũng cho thấy rằng ung thư vú gặp ở

nhóm đã mãn kinh chiếm tỷ lệ cao hơn (51,7%). Rối loạn nội tiết là yếu tố

nguy cơ cao cho ung thư vú nhưng cũng là cứu cánh hiện nay cho phụ nữ bị

ung thư vú với hiệu quả cao của thuốc điều trị ức chế nội tiết cho nhóm

bệnh nhân dương tính với nội tiết tố (ER, PR) trên kết quả nhuộm hóa mô

miễn dịch. Hầu như tất cả phụ nữ có ung thư vú ER(+) nên xem xét điều trị

nội tiết. Ngay cả các khối u nhỏ (<1 cm) nếu chưa di căn hạch sẽ có nguy cơ

tái phát thấp hơn với việc sử dụng điều trị nội tiết.

4.3. ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU BỆNH, HÓA MÔ MIỄN DỊCH,

PHÂN NHÓM PHÂN TỬ VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN HER2

4.3.1. Kết quả xét nghiệm tế bào học và mô bệnh học

Xét nghiệm tế bào học trong chẩn đoán ung thư vú có độ chính xác,

độ nhạy cao với 96% các trường hợp phù hợp hoàn toàn và 4% phù hợp

23

1 phần. Các nghiên cứu và y văn có tỷ lệ khác nhau về giá trị của tế bào

học, tỷ lệ chính xác chung khoảng 75-85%, cho chẩn đoán ung thư vú

thường cao hơn 85-95% tùy theo nghiên cứu.

Về mô bệnh học, loại ung thư vú thường gặp nhất là UTBM xâm

nhập loại không đặc biệt chiếm 68,0%, UTBM tiểu thùy xâm nhập

chiếm 15,0% là khá phù hợp với y văn cũng như các kết quả nghiên cứu

trong nước của Nguyễn Thế Dân (2007), UTBM ống xâm nhập (loại

không đặc biệt) chiếm tỷ lệ 77,9% ; Đoàn Thị Phương Thảo (2012) là

93,7% [9]; Đoàn Phước Thi (2015) cho kết quả thể ống xâm nhập chiếm

77,99%, UTBM thể thùy xâm nhập chiếm 12,13%, UTBM thể nhầy xâm

nhập chiếm 3,73%.

4.3.2. Các đặc điểm giải phẫu bệnh

Hứa Thị Ngọc Hà (2004) nghiên cứu trên 300 trường hợp UTV cho

thấy đa số bệnh nhân đến khám ở T2 (49,7%), di căn hạch nách chiếm

42,0%, độ mô học II chiếm 51,7% [4]. Nghiên cứu của Đoàn Phước Thi

(2016) UTV ở giai đoạn T2 chiếm tỷ lệ cao nhất (56,16%), độ mô học II

chiếm 66,9%. Nguyễn Phúc Duy Quang (2011) cho thấy UTV ở giai

đoạn II chiếm đa số với 57,2%, giai đoạn IIIA chiếm 18,1%.

Như vậy các kết quả nghiên cứu trong nước đều cho kết quả tương đồng

nhau về kích thước u, độ mô học, di căn hạch và giai đoạn bệnh. Đây là

các yếu tố tiên lượng kinh điển trong UTV đã được công nhận qua nhiều

nghiên cứu và y văn trong nước và trên thế giới như trong phần tổng

quan tài liệu đã tổng hợp.

Độ mô học là sự kết hợp chi tiết các yếu tố về hình thái nhân, sự

biệt hóa và tăng sinh tế bào để phản ánh hình thái mô học, mặc dù

không sử dụng để đánh giá giai đoạn bệnh nhưng nó có ý nghĩa tiên

lượng quan trọng. Dù cách chia độ như thế nào hoặc đối tượng nghiên

cứu khác nhau giữa các tác giả khác nhau nhưng kết quả nghiên cứu đều

thống nhất, tỷ lệ sống thêm giảm dần theo độ mô học tăng dần với sự

khác biệt rất có ý nghĩa. Tầm quan trọng của độ mô học trong tiên lượng

ung thư vú đã được xác định và là thành phần bắt buộc trong chẩn đoán

giải phẫu bệnh.

Việc ghi nhận tình trạng di căn hạch là một trong những tiêu chí quan

trọng hàng đầu bởi vì nó là yếu tố tiên lượng có ý nghĩa nhất liên quan

đến tỷ lệ tái phát và thời gian sống thêm của bệnh nhân, hơn nữa hạch di căn

còn là yếu tố ảnh hưởng đến quyết định chọn lựa phương thức điều trị.

Những bệnh nhân giai đoạn I, II có thời gian sống thêm không bệnh

kéo dài hơn, ít tái phát hơn sau điều trị. Việc xác định giai đoạn bệnh và

24

loại mô học có ý nghĩa trong tiên lượng diễn biến lâm sàng.

4.3.3. Kết quả xét nghiệm hóa mô miễn dịch ER, PR, Ki67 và HER2

Bảng 3.7 cho kết quả: tỷ lệ ER, PR dương tính và chỉ số phân bào

Ki67 cao lần lượt là 54,0%; 50,0% và 61,0%. Dương tính với HER2 trên

HMMD là 34,0%; trong đó dương tính mạnh (3+) chiếm 17,0%.

Việc đánh giá ER, PR giúp cho việc tiên lượng khả năng đáp ứng điều trị

hormone liệu pháp, vì vậy hiện nay được thực hiện thường quy đối với

bệnh nhân có chẩn đoán mô bệnh học là ung thư vú.

Việc xác định sự bộc lộ của thụ thể Her-2/neu là rất quan trọng trong

việc tiên lượng và định hướng chỉ định các xét nghiệm chẩn đoán tiếp

theo hoặc lựa chọn bệnh nhân ung thư vú được điều trị đích phân tử.

4.3.4. Kết quả lai tại chỗ gắn hai màu xác định sự khuếch đại gen

HER2 và phân nhóm phân tử

4.3.4.1. Sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật DISH

Tỷ lệ khuếch đại gen HER2 của bệnh nhân UTV trong nghiên cứu

này là 24,0%. Có sự biến thiên khá rõ trong sự khuếch đại gen này từ

15,8% đến 44,2% qua các nghiên cứu khác nhau của các tác giả. Theo ASCO 2007 [59], tỉ lệ khuếch đại gen HER2 trong ung thư vú

trong khoảng 18-20%, tuy nhiên trong thực tế các nghiên cứu thì tỉ lệ có

khuếch đại gen HER2 có thể không nằm trong giới hạn này. Điều này có thể

khẳng định thêm tính chất khác biệt về sinh học tế bào ung thư vú giữa các

cộng đồng, chủng tộc được nghiên cứu.

4.3.4.2. Mối liên quan giữa khuếch đại gen HER2 với sự biểu lộ protein

HER2

Toàn bộ các trường hợp nhuộm HMMD có HER2(-) chiếm 66,0% và

HER2(3+) chiếm 17,0% đều có kết quả lai tại chỗ gắn hai màu tương

đồng. Trong số 17 trường hợp có HER2(2+) trên HMMD thì có 7 trường

hợp có khuếch đại gen HER2 khi lai tại chỗ, chiếm 41,2%.

Nghiên cứu của Layfield (2016) cũng cho kết quả tất cả các

trường hợp HER2 (-) đều không khuếch đại, HER2(3+) khuếch đại

hoàn toàn và HER2(2+) khuếch đại 9,5%, [36].

Nghiên cứu của Đoàn Thị Phương Thảo (2013) tại Đại học Y Dược tp Hồ

Chí Minh trên 46 trường hợp thực hiện kỹ thuật DISH, cho tỷ lệ khuếch đại

gen ở nhóm HER2 (2+) là 20%, HER2 (3+) là 100% và 0% cho nhóm HER2

âm tính [11].

Bên cạnh đó, một số yếu tố quan trọng khác cũng có thể làm giảm sự

bộc lộ các tín hiệu trong nhân tế bào đó là: 1/ Thời điểm xử lý mẫu mô,

tối ưu là trong vòng 30 phút sau khi khối bệnh phẩm ung thư vú đã cắt

25

bỏ phải được chuyển đến khoa Giải phẫu bệnh để phẫu tích, chọn mẫu.

2/ Dung dịch cố định phải là dung dịch formol 10% trung tính (pH=7).

3/ Mẫu mô phải được cố định, tốt nhất trong 12-72 giờ tùy theo kích

thước và số lượng mẫu.

Khi đọc kết quả lai tại chỗ cần tuân thủ theo hướng dẫn của

ASCO/CAP khi khảo sát 1 tiêu bản DISH: 1/ Các tín hiệu của gen

HER2, CEP17 phải hiện diện trên tế bào nội chứng; 2/ Chỉ khảo sát tín

hiệu HER2, CEP17 trên vùng tế bào ung thư xâm lấn; 3/ Nhuộm nền

phải được phân biệt rõ với các tín hiệu.

Nghiên cứu của Nunes (2013) khi thực hiện trên 184 cas để so sánh

tỷ lệ khuếch đại gen HER2 trong 5 trường hợp sử dụng 5 kháng thể khác

nhau để bộc lộ gen HER2 bằng hóa mô miễn dịch cho thấy với mỗi loại

kháng thể khác nhau thì tỷ lệ khuếch đại gen cũng khác nhau

Để tối ưu hóa kết quả lai tại chỗ phát hiện sự khuếch đại gen HER2

trong UTV, qua nghiên cứu này chúng tôi có 2 nhận xét và khuyến nghị

như sau: 1. Nên sử dụng hóa chất, kháng thể đồng bộ của cùng 1 hãng

cung cấp để thực hiện cả kỹ thuật HMMD và ISH; 2. Cần chuẩn hóa quy

trình xét nghiệm HMMD và ISH cho đồng bộ trên cùng 1 máy của cùng

hãng sản xuất.

4.3.4.3. Phân nhóm phân tử dựa trên hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ

gắn hai màu

Nhóm lòng ống A chiếm tỷ lệ cao nhất (31,0%), sau đó là nhóm lòng

ống B (28,0%) và nhóm bộ ba âm tính (23,0%), nhóm HER2 thấp nhất,

chiếm 18,0.

Nhìn chung sự phân bố các phân nhóm phân tử UTV có khác nhau

giữa các nghiên cứu nhưng đa phần các nghiên cứu đều cho kết quả phân

nhóm lòng ống A chiếm tỷ lệ cao nhất bao gồm cả nghiên cứu của chúng

tôi. Sự phân bố các phân nhóm có sự khác biệt như vậy, vì có sự khác

nhau về đối tượng nghiên cứu, cách đánh giá kết quả nhuộm các dấu ấn

và bảng phân nhóm phân tử sử dụng.

4.4. MỐI LIÊN QUAN GIỮA PHÂN NHÓM PHÂN TỬ UNG THƯ

VÚ VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG KINH ĐIỂN

Phân nhóm phân tử của ung thư vú có sử dụng lai tại chỗ để xác định

sự khuếch đại gen HER2 cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê

với độ mô học (độ ác tính của tế bào u, p<0,05) và sự phân chia nhân tế

bào (sự phân bào, p<0,01).

Ở NC này, kích thước u tăng dần theo độ ác tính của các nhóm phân

tử với đặc điểm là u có kích thước <2cm gặp nhiều ở nhóm lòng ống A

26

(40,0%) nhưng chỉ gặp ở 10% trong nhóm bộ ba âm tính; ngược lại, với

kích thước u >5cm không có ở nhóm lòng ống A (0%) nhưng chiếm 5/8

trường hợp (62,5%) ở nhóm bộ ba âm tính. Tuy nhiên sự khác biệt

không có ý nghĩa thống kê, có lẽ là do sự phân hóa chưa rõ ở 2 nhóm

còn lại là nhóm lòng ống B và nhóm HER2.

Độ mô học chủ yếu trong phân nhóm lòng ống A và lòng ống B là độ

II (31,1% và 37,8%) trong khi ở phân nhóm HER2 và bộ ba âm tính thì

độ III chiếm chủ yếu (42,9% và 35,7%). Ở phân nhóm HER2 và bộ ba

âm tính chỉ có 1 trường hợp u biệt hóa tốt (độ I) và ngược lại trong phân

nhóm lòng ống A không có trường hợp nào biệt hóa kém (độ III). Nhìn

chung sự biệt hóa kém của tế bào u tăng dần trong các phân nhóm theo

thứ tự lòng ống A, lòng ống B, HER2 và bộ ba âm tính. Tương tự như

trong các nghiên cứu khác, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự khác

biệt này là có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

Tương tự như vậy, các yếu tố tiên lượng kinh điển khác là tình trạng

di căn hạch và giai đoạn bệnh cũng có sự liên quan thuận chiều khá chặt

chẽ với các phân nhóm phân tử tuy nhiên có thể là do số lượng mẫu chưa

đủ nhiều trong khi có đến 4 phân nhóm phân tử nên mối liên quan chưa

có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

Theo tác giả Bhargava (2010) phân nhóm phân tử không có mối liên

quan với giai đoạn bệnh (p=0,129) [19]. Theo tác giả Đoàn Thị

Phương Thảo (2012) thì tỷ lệ bệnh nhân giai đoạn III thường gặp

hơn ở phân nhóm HER2. Ngược lại, với giai đoạn sớm (giai đoạn I)

thì phân nhóm lòng ống A chiếm nhiều hơn với 52,5% và phân

nhóm HER2 là 29,2%.

Một trong các dấu ấn miễn dịch quan trọng liên quan đến sự phân

bào hay sự nhân lên của tế bào u là Ki67 cũng được coi là yếu tố tiên

lượng trong ung thư vú. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tìm thấy mối

liên quan có ý nghĩa thống kê giữa sự phân bào mức độ cao liên quan

với các phân nhóm phân tử có độ ác tính cao và tiên lượng xấu là nhóm

HER2 và nhóm bộ ba âm tính (p<0,01).

27

KẾT LUẬN

1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu để phát

hiện sự khuếch đại gen HER2 trong ung thư biểu mô tuyến vú tại

bệnh viện trường Đại học Y Dược Huế

Sau khi tiến hành thử nghiệm để tối ưu hóa chúng tôi đã hoàn thiện

được quy trình lai tại chỗ gắn hai màu để xác định sự khuếch đại gen

HER2 trên máy BenchMark GX của hãng Ventana, Roche tại Bệnh viện

Trường ĐHYD Huế như sau:

2. Xác định sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn

hai màu, mối liên quan với sự biểu lộ protein HER2 và tình trạng

thụ thể nội tiết với các yếu tố tiên lượng kinh điển trong ung thư

biểu mô tuyến vú

Sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu trong

ung thư vú là 24,0%. Tất cả các trường hợp biểu lộ protein HER2 dương

tính mạnh (3+) trên hóa mô miễn dịch, chiếm 17,0%, đều có khuếch đại

gen HER2 khi lai tại chỗ gắn hai màu (100%). Tất cả các trường hợp

HER2 âm tính trên hóa mô miễn dịch, chiếm 66,0%, đều không khuếch

đại gen này khi tiến hành lai tại chỗ (0%). Trong nhóm HER2(2+),

chiếm 17,0%, khi lai tại chỗ thì có 41,2% các trường hợp có khuếch đại

gen HER2. Phân nhóm phân tử ung thư vú dựa trên sự khuếch đại gen HER2, sự

biểu lộ protein HER2 và tình trạng thụ thể nội tiết với các yếu tố tiên

lượng kinh điển cho thấy có mối liên quan với độ mô học (p<0,05) và

Ki67 (p<0,01).

STT Các bước quy trình Thời gian

1 Cell Conditioning 2

Mild 12 phút

Standard 12 phút

Extended 12 phút

2 ISH-Protease 2 4 phút

3 Denaturation 20 phút

4 Hybridization 6 giờ

5 Stringency wash 72 độ C

6 SISH Multimer 16 phút

7 Silver Chromogen 4 phút

8 Red ISH Multimer 24 phút

9 Red Chromogen 8 phút

10 Counterstain Hematoxyllin II-8'

11 Post Counterstain Bluing Reagent-4'

28

KHUYẾN NGHỊ

1. Trước khi tiến hành lai tại chỗ gắn hai màu, nên chuẩn hóa và hoàn

thiện quy trình kỹ thuật lai phù hợp với dòng máy của mỗi nhà sản xuất

và nên sử dụng hóa chất, sinh phẩm, kháng thể đồng bộ của cùng 1 hãng

cung cấp để thực hiện cả kỹ thuật hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ.

2. Kiến nghị với bác sĩ ung bướu lâm sàng quan tâm, xem xét chỉ định

lai tại chỗ cho các bệnh nhân ung thư vú có xét nghiệm hóa mô miễn

dịch HER2(2+) để bệnh nhân có cơ hội được điều trị đích nhằm cải thiện

tiên lượng và chất lượng sống.

3. Đề xuất với các cơ quan quản lý y tế, bảo hiểm xã hội phổ biến và đưa

kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu (Dual-ISH) vào danh mục kỹ thuật của

các bệnh viện tuyến trên để cả bệnh nhân và bệnh viện đều được hưởng

lợi từ các ưu điểm của kỹ thuật này.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ,

CÁC SẢN PHẨM KHCN CÓ LIÊN QUAN ĐỀ TÀI NÀY

1. Nguyễn Trần Bảo Song, Đặng Công Thuận (2017), “Nghiên cứu

phân nhóm phân tử ung thư biểu mô tuyến vú xâm nhập dựa trên hóa

mô miễn dịch và lai tại chỗ”, Y học Việt Nam, tập 461, số đặc biệt,

trang 309-318.

2. Đặng Công Thuận, Lê Trọng Lân, Nguyễn Trần Bảo Song, Phan Thị

Thu Thủy, Trần Nam Đông, Lê Thị Thu Thảo, Ngô Cao Sách, Trần

Thị Hoàng Liên, Võ Thị Hồng Vân (2018), “Nghiên cứu tình trạng

HER2 và mối liên quan với một số yếu tố tiên lượng trong ung thư

biểu mô tuyến vú xâm nhập”, Tạp chí Y Dược học, trường Đại học Y Dược Huế, 8(4), trang 13-22.

3. Đặng Công Thuận, Cao Đình Huy, Lê Tuấn Anh, Nguyễn Trần Bảo

Song, Trần Nam Đông, Lê Thị Thu Thảo, Ngô Cao Sách, Trần Thị

Hoàng Liên (2018), “Nghiên cứu phân nhóm phân tử và mối liên

quan với độ mô học và giai đoạn bệnh trong ung thư biểu mô tuyến

vú xâm nhập”, Y học Việt Nam, 472(1), trang 57-61.

29

GIẢI THƯỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

GIẢI 3

Hội nghị Khoa học và Công nghệ Tuổi trẻ các trường Đại học, Cao đẳng

Y-Dược Việt Nam lần thứ XIX, tổ chức ngày 17-19/5/2018 tại Đại học

Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

Nhóm tác giả: Nguyễn Trần Bảo Song, Phạm Tăng Tùng

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Công Thuận

KHÓA HUẤN LUYỆN

“Lai tại chỗ gắn hai màu (Dual-ISH) phát hiện sự khuếch đại gen

HER2” Tại Trường Đại học Y Dược Huế, ngày 24-28/7/2017

Giảng viên: Chuyên gia và kỹ sư từ công ty Roche trực tiếp đào tạo

Học viên: 2 BS và 4 KTV của Bộ môn Khoa Giải phẫu bệnh

HỘI THẢO

“Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ trong chẩn đoán và điều trị ung thư

vú” Tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế, ngày 05 tháng 5 năm

2018

Báo cáo viên: PGS.TS. Đặng Công Thuận, PGS.TS. Phùng Phướng,

Trường Đại học Y Dược Huế, TS. Đoàn Thị Phương Thảo, Trường Đại

học Y Dược TP. Hồ Chí Minh

Hội thảo viên: 30 BS, KTV và học viên NCS, Cao học chuyên ngành

Giải phẫu bệnh, Y sinh học, ung bướu đến từ các Trường Đại học, Cao

đẳng và bệnh viện của cả nước

CHUYÊN MỤC TRUYỀN THÔNG

01 chương trình truyền thông dài 18 phút đã được phát nhiều lần trên

truyền hình TRT tháng 6/2018 về “Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ trong

chẩn đoán và điều trị ung thư vú”

CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC

07 chuyên đề khoa học đã được viết có liên quan đến các nội dung và

kết quả nghiên cứu của nhiệm vụ khoa học công nghệ này

30

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

I. Nghiên cứu sinh: 01

Nguyễn Phương Thảo Tiên - NCS kết đào tạo với Đại học Sassari,

Italy. Đã bảo vệ thành công luận án Tiến sĩ tại Đại học Sassari, tháng

2/2019. Đạt loại: Xuất sắc

II. Cao học: 04

1. Đặng Thị Hồng Nhạn - Cao học liên kết đào tạo với Đại học Sassari,

Italy. Đã bảo vệ thành công luận văn Thạc sĩ tại Đại học Y Dược Huế,

tháng 4/2018. Đạt loại: Giỏi

2. Nguyễn Thị Thùy Uyên -Cao học liên kết đào tạo với Đại học

Sassari, Italy. Đã bảo vệ thành công luận văn Thạc sĩ tại Đại học Y

Dược Huế, tháng 4/2017. Đạt loại: Giỏi

3. Phan Thị Thu Thủy - Cao học Y học chức năng khóa 2015-2017,

Trường Đại học Y Dược Huế. Đã bảo vệ thành công luận văn Thạc sĩ

tại Đại học Y Dược Huế, tháng 9/2017. Đạt loại: Giỏi

4. Phan Thị Quỳnh Anh - Cao học liên kết đào tạo với Đại học Sassari,

Italy. Đã bảo vệ thành công luận văn Thạc sĩ tại Đại học Y Dược Huế,

tháng 4/2019. Đạt loại: Xuất sắc

III. Đại học: 02

1. Nguyễn Thị Thanh Tâm - Bác sĩ đa khoa khóa 2011-2017, Trường

Đại học Y Dược Huế. Đã bảo vệ thành công luận văn Tốt nghiệp Bác sĩ

y khoa tại Trường Đại học Y Dược Huế, tháng 5/2017. Đạt loại: Giỏi

2. Lê Tuấn Anh - Bác sĩ đa khoa khóa 2012-2018, Trường Đại học Y

Dược Huế. Đã bảo vệ thành công luận văn Tốt nghiệp Bác sĩ y khoa tại

Trường Đại học Y Dược Huế, tháng 5/2018. Đạt loại: Giỏi