nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù drosera burmanni vahl trong thu nhận anthraoquinone

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ƯNG DỤNG KY THUẬT NUÔI

CÂY MÔ SEO TAO DICH HUYÊN PHU CÂY

Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa : 2003-2007

Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU

Thành phố Hồ Chí Minh

Thang 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************************

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ƯNG DỤNG KY THUẬT NUÔI

CÂY MÔ SEO TAO DICH HUYÊN PHU CÂY

Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. BUI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU

TS. PHAN PHƢƠC HIÊN

ThS. QUÁCH NGÔ DIÊM PHƢƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh

Thang 9/2007

iii

LƠI CAM ƠN

Khoa luân này đƣơc hoàn thành vơi s ư quan tâm giup đơ rất nhiêu cua cac

thây cô, cac anh chi và cac ban . Em xin gƣi lơi cam ơn chân thanh đên:

PGS.TS Bui Văn Lê , ngƣơi đa tân tinh hƣơng dân va tao moi điêu kiên đê

em thƣc hiên khoa luân nay.

Thac sĩ Quach Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trưc tiếp hƣơng dẫn, chỉ day và

luôn động viên em trong những hoàn cảnh kho khăn nhất. Đê tài này đƣơc hoàn

thành vơi rất nhiêu nhiệt tình và tâm huyết cua chi. Cảm ơn chi vì tất cả.

Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣơc Hiên, những chỉ day và giup đơ cua thầy đã

giup em rất nhiêu trong qua trình thưc hiện đê tài.

Thac sĩ Kiêu Phƣơng Nam, ngƣời luôn gơi ý và cho em những lời khuyên bổ

ích.

Em cam ơn anh Điên , anh Hoang , anh Cƣơng va cac anh chi phong săc ky ,

Viên Công nghê Sin h hoc va Công nghê Môi trƣơng , ĐH Nông Lâm TP . HCM.

Cảm ơn vì những giup đơ nhiệt tình cua cac anh chi trong suốt thời gian chung em

thƣc tâp.

Cảm ơn anh Bình cung toàn thê cac ban sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa

hoc Tư nhiên , ĐH Mơ luôn săn sang giup đơ va đông viên tôi nhƣng luc găp kho

khăn trong đê tai.

Cảm ơn lơp CNSH 29 thân yêu va cac ban thân đa cung tôi chia se tât ca

nhƣng nôi buôn vui suôt bôn năm đai hoc.

Và trên hết , con cam ơn bô m e, chi gai và em trai yêu quý đã luôn chăm lo ,

ung hộ, tin tƣơng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chô dưa vững chăc nhất trong

cuôc sông.

Thang 9/2007

Hoàng Thi Thu

iv

TÓM TẮT

Đê tai nghiên cƣu “Khao sat kha năng ƣng dung ky thuât nuôi cây mô

sẹo, tao dịch huyền phu cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhân hơp chât

anthraquinone” đƣơc tiên hanh tai trai thưc nghiệm sinh hoc, Đai hoc Khoa hoc

Tư nhiên , Đai hoc Quôc gia thành phố Hồ Chí Minh va phòng săc ky , Viên Công

nghê Sinh hoc va Công nghê Môi trƣơng , Đai hoc Nông Lâm, thành phố Hồ Chí

Minh tƣ thang 3/2007 đến hết thang 8/2007.

Kêt qua thu đƣơc:

- Mô seo tƣ mâu lơp mong tê bao cây D. burmanni Vahl đƣơc hinh thanh

trên môi trƣơng khoang cơ ban Gamborg’s B5 bô sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2

mg/l), đƣơng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điêu kiên u tôi.

- Cac ky thuât săc ký cột , săc ky ban mong đƣơc sƣ dung nhăm cô lâp va ly

trích hơp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơp chât nay đ ƣơc sư

dung nhƣ chất tham chiếu đê đinh lƣơng anthraquinone trong cac thành phần khac

nhau cua cây Drosera burmanni Vahl.

- Kêt qua đinh lƣơng anthraquinone băng ky thuât HPLC cho thây : hàm

lƣơng anthraquinone trong rê la 3,03% so vơi trong lƣơng khô, nhiêu hơn trong thân

la (2,78%); ở cây không co săc tố đo là 2,8% trong khi ơ cây co săc tô đo la 0,78%;

trong sinh khôi huyên phu tê bao la 0,02% ( so vơi trong lƣơng tƣơi ), trong khi

không thây co sƣ hiên diên cua anthraquinone trong dich môi trƣơng .

v

SUMMARY

The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in

Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out

at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography

room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology,

University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007.

Results:

- Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using

Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l),

2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to

5,8 before autoclaving.

- Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to

purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was

used as authentic sample for HPLC technique.

- Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone,

larger than 2,78% in leaves.

- Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW,

compared with 2,78% DW in green-leaf trees.

- Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of

anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been

found in spent medium.

Ho Chi Minh city, September, 2007.

Hoang Thi Thu

vi

MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG

Trang tƣa ..................................................................................................................... .i

Lơi cam ơn ................................................................................................................. iii

Tom tăt ..................................................................................................................... iv

Summary ..................................................................................................................... v

Muc luc ..................................................................................................................... vi

Danh sach cac chƣ viêt tăt .......................................................................................... ix

Danh sach cac hinh ..................................................................................................... x

Danh sach cac sơ đồ và biêu đồ ................................................................................ xii

Danh sach cac bang .................................................................................................. xiii

Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1

1.1. Đặt vấn đê ....................................................................................................... 1

1.2. Muc tiêu .......................................................................................................... 2

1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2

1.4. Ý nghĩa đê tài .................................................................................................. 2

Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

2.1. Tổng quan vê Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3

2.1.1. Vi trí phân loai................................................................................................ 3

2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3

2.1.3. Mô tả hình thai ............................................................................................... 4

2.1.4. Đặc tính sinh hoc ............................................................................................ 6

2.1.5. Đặc điêm sinh thai .......................................................................................... 7

2.1.6. Thành phần hoa hoc ....................................................................................... 8

2.1.7. Phƣơng phap nhân giống .............................................................................. 11

2.1.8. Tầm quan trong ............................................................................................ 12

2.1.8.1. Ý nghĩa vê sinh thai ...................................................................................... 12

2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hoa thưc vât ................................................. 12

2.1.8.3. Gía tri dƣơc tính ........................................................................................... 12

2.1.8.4. Ứng dung trong công nghiệp ........................................................................ 14

2.1.8.5. Gía tri kinh tế................................................................................................ 15

2.1.9. Cac nghiên cứu trong và ngoài nƣơc ............................................................ 16

2.2. Tổng quan vê ky thuât nuôi cấy huyên phu tế bào đê thu nhân

hơp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17

2.2.1. Khai niệm hơp chất thứ cấp ......................................................................... 17

2.2.2. Nuôi cấy mô seo ........................................................................................... 18

2.2.2.1. Khai niệm mô seo ......................................................................................... 18

2.2.2.2. Ứng dung cua nuôi cấy mô seo .................................................................... 19

2.2.3. Nuôi cấy dich huyên phu .............................................................................. 19

2.2.3.1. Khai niệm huyên phu tế bào ......................................................................... 19

2.2.3.2. Nguyên tăc tao huyên phu ............................................................................ 19

vii

2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sư tao huyên phu tế bào ............................... 20

2.2.3.4. Cac phƣơng phap nuôi cấy huyên phu hiện nay ......................................... 20

2.2.3.5. Cac điêu kiện nuôi cấy dich tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất

cac hơp chất thứ cấp .................................................................................................. 22

2.2.4. Cac phƣơng phap gia tăng sư sản xuất hơp chất thứ cấp trong nuôi

cấy huyên phu ........................................................................................................... 22

2.2.4.1. Tối ƣu hoa điêu kiện nuôi cấy ..................................................................... 22

2.2.4.2. Chon loc dòng tế bào co khả năng sản xuất cao ......................................... 22

2.2.4.3. Bổ sung tiên chất ......................................................................................... 22

2.2.4.4. Cố đinh tế bào ............................................................................................. 23

2.2.4.5. Cảm ứng sư phân hoa mô ............................................................................ 23

2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23

2.3. Cac ky thuât sư dung trong bài luân văn .................................................... 24

2.3.1. Phƣơng phap ly trích – thu nhân hơp chất .................................................. 24

2.3.1.1. Săc ký cột .................................................................................................... 24

2.3.1.2. Săc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26

2.3.1.3. Săc ký lơp mong điêu chế ........................................................................... 27

2.3.2. Ky thuât săc ký long cao ap HPLC trong đinh lƣơng hơp chất thứ cấp ..... 28

Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31

Thời gian và đia điêm thưc hiện ................................................................................ 31

3.1. Nuôi cấy mô seo, tao dich huyên phu ......................................................... 31

3.1.1. Vât liệu ........................................................................................................ 31

3.1.2. Phƣơng phap ................................................................................................ 33

3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sat ảnh hƣởng cua thành phần khoang và

nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong .......................................... 33

3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone thích hơp cho

việc kích ứng tao mô seo ........................................................................................... 34

3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp

vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo ............................................................. 35

3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy lên sư

tăng sinh khối mô seo và tao dich huyên phu ........................................................... 36

3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sat sư ảnh hƣởng cua anh sang lên sư

hình thành săc tố đo cua mô seo................................................................................ 37

3.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38

3.2.1. Vât liệu ........................................................................................................ 38

3.2.2. Phƣơng phap ................................................................................................ 39

3.3. Đinh lƣơng hơp chất anthraquinone trong cac nguyên liệu

nuôi cấy in vitro khac nhau bằng phƣơng phap săc ký long cao ap HPLC .............. 40

3.3.1. Vât liệu ........................................................................................................ 40

3.3.2. Phƣơng phap ............................................................................................... 40

3.3.2.1. Xac đinh điêu kiện, thông số ky thuât thích hơp......................................... 40

3.3.2.2. Xây dưng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41

viii

3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sat ảnh hƣởng cua cach xư lý mẫu trong

đinh lƣơng hơp chất anthraquinone ........................................................................... 41

3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong

cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro .................................................................... 43

3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong

cac mẫu cây co săc tố đo và mẫu không co săc tố đo ............................................... 44

3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xac đinh hàm lƣơng anthraquinone trong mẫu

dich huyên phu đã tao đƣơc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45

3.4. Xư lý thống kê ............................................................................................. 45

Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46

4.1. Nuôi cấy mô seo tao dich huyên phu ........................................................... 46

4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sat ảnh hƣởng cua thành phần khoang và

nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong .......................................... 46

4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone thích hơp cho

việc kích ứng tao mô seo ........................................................................................... 48

4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp

vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo ............................................................. 49

4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy lên sư

tăng sinh khối mô seo và tao dich huyên phu ........................................................... 54

4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sat sư ảnh hƣởng cua anh sang lên sư

hình thành săc tố đo cua mô seo................................................................................ 56

4.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58

4.3. Đinh lƣơng hơp chất anthraquinne trong cac nguyên liệu nuôi cấy

in vitro khac nhau bằng phƣơng phap săc ký long cao ap HPLC ............................. 59

4.3.1. Xây dưng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59

4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sat ảnh hƣởng cua cach xư lý mẫu trong đinh

lƣơng hơp chất anthraquinone ................................................................................... 61

4.3.3. Thí nghiệm 7: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong

cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro .................................................................... 62

4.3.4. Thí nghiệm 8: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong

cac mẫu co săc tố đo và mẫu không co săc tố đo ...................................................... 64

4.3.5. Thí nghiệm 9. Xac đinh hàm lƣơng anthraquinnone trong mẫu

dich huyên phu đã tao đƣơc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66

Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68

5.1. Kết luân ....................................................................................................... 68

5.1.1. Nuôi cấy mô seo tao dich huyên phu .......................................................... 68

5.1.2. Đinh lƣơng hơp chất anthraquinone bằng săc ký long cao ap HPLC ......... 68

5.2. Đê nghi ........................................................................................................ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70

PHỤ LỤC

ix

DANH SACH CAC CHƢ VIÊT TĂT

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

BAP : 6-benzylaminopurine

CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên)

ctv : cộng tac viên

HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Săc ky long ao ap)

IAA : 3-indolyl-acetic acid

IBA : 3-indolebutyric acid

MS : Murashige & Skoog, 1962

NAA : naphthalene acetic acid

PVP : poly vinyl pyrrolidone

TCL : Thin Cell Layer (Lơp mong tê bao)

TLC : Thin Layer Chromatography (Săc ky ban mong)

x

DANH SACH CÁC HINH

TRANG

Hình 2.1. Khu vưc phân bố cua Drosera burmanni Vahl trên thế giơi .................. 4

Hình 2.2. Hình thai cua Drosera burmanni Vahl .................................................... 4

Hình 2.3. La D. burmanni ........................................................................................ 5

Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tư nhiên. ........................................................... 7

Hình 2.5. Cấu truc hoa hoc cua một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10

Hình 2.6. Môt sô loai Drosera co gia tri kinh tế cao trên thế giơi ......................... 15

Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gian đoan qui mô nho trên cac may lăc ................... 21

Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................... 21

Hình 2.9. Săc ky côt ............................................................................................... 24

Hình 2.10. Mô hinh săc ky nhanh côt khô ............................................................. 26

Hình 2.11. Săc ký lơp mong ................................................................................... 27

Hình 2.12. Sơ đô hoat đông cac bô phân cua may HPLC ...................................... 29

Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro ................................................ 31

Hình 4.1. Mô seo đƣơc hinh thanh tƣ mâu lơp mong cây D.burmanni trên

môi trƣơng Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D vơi

nông đô thay đôi ..................................................................................................... 52

Hình 4.2. Mô seo đƣơc hinh thanh tƣ mâu lơp mong long thân cây

D. burmanni trên môi trƣơng Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D

vơi nông đô thay đôi ............................................................................................... 53

Hình 4.3.A. Mô seo nuôi trong môi trƣờng long lăc .............................................. 55

Hình 4.3.B. Cum tế bào quan dƣơi kính hiên vi 40X. ........................................... 55

Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dƣơi kính hiên vi 40X .............................................. 55

Hình 4.4. Anh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành săc tố đo cua

mô seo cây D. burmanni ........................................................................................ 57

Hình 4.5. Săc ký đồ HPLC cua anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm ................... 60


xi



Hình 4.9. Săc ký đồ HPLC cua anthraquinone tham chiếu ở ơ 70 ppm ................ 60

Hình 4.10. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo

quy trình A. ............................................................................................................ 61

Hình 4.11. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo

quy trình B .............................................................................................................. 61

Hình 4.12. Săc ký đồ HPLC cua mẫu rễ cây D. burmanni Vahl ........................... 63

Hình 4.13. Săc ký đồ HPLC cua mẫu thân la cây D. burmanni Vahl .................... 63

Hình 4.14. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl co săc tố đo. .......... 65

Hình 4.15. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl không

co săc tố đo. ............................................................................................................ 65

Hình 4.16. Săc ký đồ HPLC cua mẫu dich môi trƣờng sau khi loc

sinh khối tế bào ...................................................................................................... 66

Hình 4.17. Săc ký đồ HPLC cua sinh khối tế bào từ dich huyên phu. ................... 66

xii

DANH SACH CAC SƠ ĐÔ VÀ BIÊU ĐÔ

TRANG

SƠ ĐÔ

Sơ đô 2.1. Con đƣơng tông hơp cac hơp chât thƣ câp ơ thƣc vât ........................ 18

Sơ đô 3.1. Quy trình ly trích và cô lâp hơp chất anthraquinone .......................... 39

Sơ đô 3.2. Quy trinh xƣ ly mâu ............................................................................ 42

Sơ đô 3.3. Quy trinh xƣ ly dich huyên phu .......................................................... 45

Sơ đô 3.4. Quy trinh ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone (kêt qua) ........... 58

BIÊU ĐÔ

Biêu đô 4.1. Tỷ lệ mẫu lơp mong sống trên cac loai môi trƣờng khac

nhau sau 14 ngày nuôi cấy ................................................................................... 46

Biêu đô 4.2. Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy .... 54

ĐÔ THI

Đồ thi 4.1. Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone

tham chiếu và gia tri diện tích peak ..................................................................... 59

xiii

DANH SACH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Cac loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và

7-methyljuglone ..................................................................................................... 8

Bảng 2.2. Cac Naphthoquinone vi lƣơng đƣơc tach chiết từ Drosera ................... 9

Bảng 2.3. Dƣơc tính và một số hoat tính ứng dung khac cua

dich chiết Drosera ............................................................................................... .13

Bảng 3.1. Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng thành phần khoang

và nồng độ đƣờng lên sư phat triên mẫu cấy lơp mong ....................................... 33

Bảng 3.2. Bố trí nghiệm thức khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone

thích hơp cho việc kích ứng tao mô seo ............................................................... 34

Bảng 3.3. Bố trí nghiệm thức khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D

khi kết hơp vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo ..................................... 35

Bảng 3.4. Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy

lên sư tăng sinh khối mô seo ................................................................................ 36

Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sat ảnh hƣởng cua anh sang

lên sư hình thành săc tố đo ở mô seo ................................................................... 37

Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong

cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro ............................................................... 43

Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong mẫu

cây co săc tố đo và không co săc tố đo ................................................................ 44

Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu sống ở cac nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy ................... 46

Bảng 4.2. Anh hƣởng cua thành phần khoang lên sư phat triên cua

mẫu cấy lơp mong ................................................................................................ 47

Bảng 4.3. Anh hƣởng cua nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy

lơp mong ............................................................................................................. 48

Bảng 4.4. Tỷ lệ tao mô seo trên cac môi trƣờng sư dung kết hơp 2

loai hormone khac nhau ....................................................................................... 48

xiv

Bảng 4.5. Tỷ lệ mẫu tao seo trên cac môi trƣờng khac nhau sau 21

ngày nuôi cấy ....................................................................................................... 49

Bảng 4.6. Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg mô seo ban đầu sau 21 ngày

nuôi cấy trên cac kiêu nuôi cấy khac nhau ......................................................... 54

Bảng 4.7. Kết quả ảnh hƣởng anh sang lên sư hình thành săc tố đo ở mô seo .... 56

Bảng 4.8. Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak ............. 59

Bảng 4.9. Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac bộ phân khac

nhau cua cây in vitro ............................................................................................ 62

Bảng 4.10. Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac mâu co va

không co săc tô đo ................................................................................................ 64

Bảng 4.11. Kêt qua đinh lƣơng anthraquinnone trong mẫu dich huyên phu ....... 66

1

Chƣơng 1

MƠ ĐÂU

1.1. Đặt vấn đề

Ngay từ buổi sơ khai, con ngƣời đã biết sư dung thưc vât không chỉ làm

nguồn thưc phẩm mà còn cho nhiêu muc đích khac, đặc biệt là trong y hoc. Ngƣời

ta sư dung một số loai thưc vât tƣơi đê đăp lên vết thƣơng hoặc thưc vât khô đê săc

thuốc tri bệnh. Cach đây hơn một thế kỷ, dưa vào y hoc cổ truyên cac nhà khoa hoc

đã phat triên cac quy trình cho phép tao ra nhiêu loai thuốc từ cac hơp chất thứ cấp

chiết xuất từ cây trồng. Vơi tiến bộ khoa hoc, cac phân tư hoa hoc trong cây đã

đƣơc tổng hơp nhân tao đê sản xuất dƣơc phẩm. Tuy nhiên việc tổng hơp nhân tao

còn gặp nhiêu kho khăn do con đƣờng tổng hơp cac chất này vẫn chƣa đƣơc làm

sang to.

Từ những năm đầu thâp niên 70 cua thế kỷ XX đến nay, cac nhà khoa hoc đã

công bố hàng loat cac công trình nghiên cứu vê nuôi cấy tế bào đơn cua nhiêu loài

thưc vât nhằm thu nhân sản phẩm thứ cấp. Nhƣ vây việc ap dung cac ky thuât công

nghệ sinh hoc dưa trên cac phƣơng phap nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro

không những gop phần vào việc sản xuất và thu nhân mà còn giup ta đảm bảo đƣơc

một cach chu động số lƣơng cac hơp chất co gia tri tri liệu.

Ở Việt Nam, ngƣời ta đã thu thâp đƣơc 3 loài Drosera trong đo Drosera

burmanni Vahl gần đây đã đƣơc nghiên cứu vê việc thu nhân hơp chất quinone từ

nuôi cấy in vitro, khảo sat hoat tính sinh hoc cua hơp chất này cũng nhƣ nhân giống

thành công bằng tao chồi trưc tiếp.

2

Do đo đê hƣơng tơi tư động hoa việc thu nhân và chu động tăng sinh lƣơng

chất quinone đã đƣơc nghiên cứu thành công, đê tài:

“KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ƯNG DỤNG KY THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO

TẠO DỊCH HUYỀN PHU CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN

HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ”

đã ra đời.

1.2. Mục tiêu

Khảo sat khả năng tao mô seo từ cây Drosera burmanni Vahl.

Khảo sat khả năng tao dich huyên phu tế bào cây Drosera burmanni Vahl.

Khảo sat hàm lƣơng hơp chất quinone thu đƣơc từ nuôi cấy dich huyên phu.

1.3. Yêu cầu

Tao đƣơc mô seo và khởi đầu tao dich huyên phu cây D. burmanni Vahl.

Phân tích đinh tính và đinh lƣơng đƣơc hàm lƣơng anthraquinone trong từng

thành phần khac nhau và trong dich huyên phu cây D. burmanni bằng may

HPLC.

1.4. Ý nghĩa của đề tài:

Ý nghĩa khoa hoc: đây là một bƣơc tiến quan trong và cần thiết trong qui

trình ứng dung ky thuât nuôi cấy tế bào D. burmanni Vahl đê thu nhân hơp

chất quinone.

Ý nghĩa thưc tiễn: cung cấp quy trình tao mô seo, dich huyên phu D.

burmanni Vahl cho muc tiêu thu nhân quinone

3

Chƣơng 2

TÔNG QUAN TAI LIÊU

2.

2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl

2.1.1. Vị trí phân loai

Theo hệ thống phân loai thưc vât cua Takhtajan [14]:

Giơi: Plantae (Thưc vât).

Ngành: Magnoliophyta (Ngoc lan).

Lơp: Magnoliopsida (Ngoc lan).

Phân lơp: Rosidae (Hoa hồng).

Bộ: Nepenthales.

Ho: Droseraceae.

Giống: Drosera.

Loài: Drosera burmanni Vahl.

Tên tiếng Anh: burmese sundew.

Tên thông thƣờng: cây băt ruồi, co troi gà, bèo đất, trƣờng lệ burman.

2.1.2. Phân bố

Drosera burmanni Vahl đƣơc tìm thấy ở đông băc nƣơc Úc, Ấn Độ, Trung

Quốc, Nhât, Sri Lanka và Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Myanmar, Thai Lan,Việt

Nam . . .(Hình 2.1) [33], [34].

Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl đƣơc tìm thấy ở Thai Nguyên, Thanh

Hoa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣơc Bưu tỉnh Bà

Ria Vũng Tàu [1] và ở khu du lich sinh thai Băc Bình, Bình Thuân.

4

h

Hình 2.1: Khu vưc phân bố cua Drosera burmanni Vahl trên thế giơi [30].

2.1.3. Mô tả hình thái

Drosera burmanni Vahl là loài cây co, cao 5 - 30 cm, co nhiêu màu săc khac

nhau: xanh la, xanh đâm, xanh co anh vàng vơi lông tuyến màu đo hay toàn cây

màu đo [6], [15], [33], [35].

Hình 2.2: Hình thai cua Drosera burmanni Vahl [33], [35].

Thân (Hình 2.2 A, B, C)

Thân không phân nhanh, rất ngăn, co khi chỉ cao 1 cm khi tăng trƣởng trong

bong râm, không hình thành thân cu dƣơi đất. Thân mang nhiêu phat hoa [31].

Ghi chú

Khu vưc phân bố cua

Drosera burmanni Vahl

Khu vưc không co sư hiện

diện cua Drosera burmanni

Vahl

A

F E D

C B

5

Lá (Hình 2.3)

La hình muông, xếp thành hình hoa thi quanh thân, phiến la dài khoảng 1,2

cm, rộng khoảng 0,4 cm, mặt la phu đầy lông tuyến.

La co tua cuốn vơi những giot keo ở đầu goi là dich nhầy, côn trung dính vào

và bi bẫy trong dich này. Sau đo chất này sẽ tiêu hoa côn trung măc bẫy. Tua cuốn

trên la uốn cong vê phía con mồi bằng tính hƣơng tiếp xuc cua no. Drosera

burmanii Vahl là một trong những loài co chuyên động tua cuốn nhanh nhất [37].

Hình 2.3: La D. burmanni [42].

A: La; B: Cac tua cuốn.

C, D: Cấu truc một tua cuốn.

Tua cuốn là lông tiết đƣơc tao bởi một cuống dài, nho, co cấu truc đa bào và

đầu mut tua cuốn đƣơc tao bởi 2 lơp tế bào tuyến. Chất keo dính đƣơc tiết ra từ cac

tuyến xuyên qua lơp biêu bì gian đoan.

Rễ

Hệ thống rễ tƣơng đối đơn giản: rễ chum nhƣng chỉ co một vài nhanh. Chung

đƣơc goi là rễ giả vì chỉ co cơ quan hut nƣơc, cung cấp nƣơc cho cây.

Hoa (Hình 2.2 D, E)

Cây ra hoa thang 3 - 4. Hoa đêu, lƣơng tính, nho, co nhiêu màu săc từ tím

nhat tơi vàng nhat, màu đo, hồng và trăng. Hoa nằm trên một cuống chung dài, moc

A

D C

B

6

thẳng goc từ chồi nach hay chồi đỉnh goi là phat hoa. Phat hoa cao 5 - 6 cm, môi

phat hoa co từ 5 đến 25 hoa, hop thành chum hình bò cap. Hoa đối xứng tròn, la đài

5, canh hoa 5, tiêu nhuy 5, noãn sào một buồng, đính phôi trăc mô, bầu 5 la noãn

hàn liên nhau bởi mép bên [9], [14].

Hoa nở nhiêu thời điêm khac nhau, tuy thuộc vào từng giai đoan phat triên

cua cây. Hoa thƣờng nở vào buổi sang. Môi ngày nở một bông băt đầu từ nu thấp

nhất (nu đƣơc hình thành sơm nhất). Hầu hết hoa tư thu phấn nhờ côn trung. Nếu sư

thu phấn không diễn ra, hat phấn và nhuy sẽ tư thu phấn khi hoa khép canh.

Hat (Hình 2.2 F)

Hat thu đƣơc sau một tuần từ khi hoa nở. Hat nằm trong nang hat. Nang hat

tròn, gồm 5 mảnh, chứa nhiêu hat. Nang hat còn non co màu xanh, nang hat chín co

màu đen. Hat màu đen, đƣờng kính 0,1 mm.

2.1.4. Đặc tính sinh học

Hình thức sinh sản

Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng

cach nảy chồi con từ chồi bên hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hat.

Phƣơng thức bắt mồi

Hình thức: Sư dung dich nhầy đê băt dính con mồi (flypaper traps).

Cơ chế: Cac lông tuyến bao phu khăp bê mặt la co vai trò nhƣ một cai bẫy

nho. Cac keo dính tiết ra từ lông tuyến nhìn nhƣ những giot sƣơng và không bi khô

đi trong anh mặt trời (vì vây mà loài cây này còn đƣơc goi là “sundew”). Giot keo

dính này tac động nhƣ những giấy băt mồi (flypaper). Cac giot keo thƣờng không

độc và co hƣơng thơm, nhờ vây no thu hut con mồi đâu xuống bê mặt la và băt dính

chung. Khi đo những lông tuyến nhay cảm vơi protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con

mồi lai và đẩy no vào giữa la. Tuyến tiết trên bê mặt la luc này sẽ ngừng tiết keo

dính mà tiết nhiêu enzyme thuy phân tiêu hoa con mồi. La sẽ hấp thu chất dinh

dƣơng mà cây không thê lấy từ môi trƣờng nghèo dinh dƣơng [25], [34], [35].

7

2.1.5. Đặc điểm sinh thái

Hình 2.4: D. burmanni Vahl ngoài tư nhiên [3], [40].

Đất đai

Cây co thê sống đƣơc ở hầu hết cac điêu kiện: đất đầm lầy, soi, cat, đất acid

[37].

Đất trồng Drosera: hôn hơp ¾ đất mun + ¼ cat, cat sach hoặc cat trộn bột

than gô.

Độ ẩm

Độ ẩm từ trung bình đến cao (50 - 80%). Độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giot

keo dính đầu lông tiết.

Nhiệt độ

Cây sống đƣơc ở nhiệt độ 5 - 35OC, nhiệt độ thích hơp nhất 18 - 25

OC. Dƣơi

5 O

C cây ngừng phat triên.

Ánh sáng

Cây thích hơp vơi anh sang trưc tiếp, tối thiêu từ 6 - 8 giờ chiếu sang một

ngày. Khi cây sống ở nơi co cƣờng độ anh sang cao thì toàn bộ cây sẽ chuyên sang

màu đo. Nếu cây không nhân đu anh sang thì tua cuốn sẽ co màu xanh.

8

2.1.6. Thành phần hóa học

Nhiêu hơp chất naphthoquinone và cac flavonoid đã đƣơc cô lâp, xac đinh

cấu truc và đinh lƣơng trong cây Drosera ngoài thiên nhiên cũng nhƣ in vitro.

Naphthoquinone

Cac loai Drosera thƣờng sản sinh 2 loai naphthoquinone chính là plumbagin

và 7-methyljuglone (Bảng 2.1) [21]. Ngoài ra còn co cac naphthoquinone vi lƣơng

khac nhƣ droserone, hydroxydroserone và nhiêu naphthoquinone glucoside (Bảng

2.2) mà không thê tìm thấy trong cac loài cây khac [29].

Bảng 2.1: Cac loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [21]

Plumbagin 7 Methyljuglone

D. andersoniana

D. auriculata

D. binata

D. bulbosa

D. capensis

D. capillaris

D. cistiflora

D. dichotoma

D. erythrorhiza

D. intermedia

D. longifolia

D. lunata

D. macrophylla

D. madagascariensis

D. microphylla

D. modesta

D. natalensis

D. peltata

D. adelae

D. aliciae

D. aliciae x capensis

D. anglica

D. auriculata

D. burkeana

D. burmanii

D. capensis

D. cistiflora

D. cuneifolia

D. dielsiana

D. filiformis

D. hamiltonii

D. hilaris

D. indica

D. intermedia

D. longifolia

D. longifolia x rotundifolia

9

D. platypoda

D. prolifera

D. pygmaea

D. regia

D. rotundifolia

D. slackii

D. stolonifera, spp. Rupicola

D. venusta

D. villosa

D. madagascariensis

D. ramentacea

D. regia

D. rotundifolia

D. spathulata

D. stolonifera, spp. Stolonifera

D. tracii

D. trinervia

D. villosa

Bảng 2.2: Cac Naphthoquinone vi lƣơng đƣơc tach chiết từ Drosera [21]

Naphthoquinone Loài Kiêu nuôi cấy

Droserone

Hydroxydroserone

Biramentaceonea

Droserone-5-glucoside

Rossoliside

Hydroxydroserone-5-glucoside

2-Methylnaphtazarin-5-O-

glucosideb

D. whittakeri

D. rotundifolia

D. whittakeri

D. rotundifolia

D. ramentaceae

D. rotundifolia

D. rotundifolia

D.spatulata

D.rotundifolia

D.rotundifolia

D.spatulata

In vivo

In vivo

In vivo

In vivo

In vivo

In vivo

In vivo

In vitro

In vitro

In vivo

In vitro

In vitro

a: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi hữu cơ.

b: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiêt với dung môi methanol.

10

Cấu truc hoa hoc cua cac naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tach

chiết từ cac loài Drosera [21].

R1 R2 R3 R4 R5

[1] CH3 H H H OH 7-Methyljuglone

[2] H H CH3 H OH Plumbagin

[3] H H CH3 OH OH Droserone

[4] OH H CH3 OH OH Hydroxydroserone

[5] H H CH3 OH OGlc Droserone-5-glucoside

[6] OH H CH3 OH OGlc Hydroxydroserone-5-gluside

R6 R7

[7] CH3 H Rossoliside

[8] H CH3 2-Methyl-hydrojuglone-4-glucoside

Flavonoid

Drosera chứa phổ rất rộng cac flavonoid, flavonoid glucoside nhƣ quercetin,

isoquercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin và gossypitrin [20].

Quercetin Kaempferol

Myricetin Hyperin

Hình 2.5: Cấu truc hoa hoc cua một số flavonoid và flavonoid glucoside [29].

R4

O

O

R2

R3

R5

R1

OH

OGlc

R7

OH

R6

11

2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống

Nhân giống tự nhiên [3]

Nhân giống bằng cách gieo hạt

Thời gian gieo hat tốt nhất là cuối mua đông. Hat đƣơc gieo trên hôn hơp đất

trồng thích hơp. Tốt nhất nên giữ hat trong điêu kiện mat và ẩm khoảng 6 tuần. Sau

đo cho hat vào châu đất co boc tui nhưa và đê trong điêu kiện sang. Đến khi hat nảy

mầm thì bo tui nhưa ra và trồng cac cây con vào châu lơn.

Nhân giống bằng cách cắt rễ

Cây băt ruồi co thê đƣơc nhân giống từ cac rễ dày. Lấy những rễ khoe từ cây

me, căt thành đoan dài 5 cm và đặt nằm ngang trên hôn hơp đất dày 6 cm, phu

chung vơi l lơp đất dày 1 cm. Boc những châu đất này lai và đặt trong điêu kiện

sang. Khi cây mơi băt đầu moc lên thì không boc nữa. Nhân giống bằng phƣơng

phap căt rễ tốt nhất vào đầu mua tăng trƣởng cua cây.

Nhân giống bằng cách cắt lá

Thời gian nhân giống tốt nhất là vào đầu mua tăng trƣởng cua cây. La đƣơc

căt ở cuống la rồi đặt lên trên hôn hơp đất và cat sao cho lông tuyến hƣơng lên. Giữ

cuống la ngâp trong đất nhƣng không phu lên cac lông tuyến. Boc châu đất lai và

giữ trong điêu kiện sang. Sư phat triên cua cây xảy ra trong vài tuần.

Nhân giống bằng cây mầm

Vào mua thu, cây sẽ sản sinh ra những cây bé xíu (cây mầm). Thu thâp

những cây mầm này và trồng thành những cây mơi. Một cach đê thu thâp cây mầm

là giữ những châu chứa cây trut ngƣơc xuống 1 tờ giấy và dung tăm gat cây mầm ra

khoi cây me. Gieo chung trên hôn hơp đất. Cây sẽ moc rễ và phat triên thành cây

trƣởng thành.

Nhân giống in vitro

Hầu hết những nghiên cứu trên thế giơi vê nuôi cấy mô Drosera đêu cho

thấy nhiêu loài Drosera co tiêm năng nhân giống rất cao khi đƣơc nuôi cấy trong

điêu kiện in vitro thích hơp. Cho đến nay, rất nhiêu loài Drosera đã đƣơc nuôi cấy

12

in vitro thành công. Hầu hết hat, la kết cum nhƣ hoa, la tach biệt, đôi khi cả rễ, hoa

và mầm cũng đƣơc sư dung làm mẫu cấy đê thiết lâp quy trình nuôi cấy mô.

Trong nƣơc và trên thế giơi đã co nhiêu nghiên cứu vê nhân giống in vitro

cây D. burmanni Vahl. Cây sinh trƣởng tôt nhất trên môi trƣờng MS 1/2

(Murashige Skoog, vơi lƣơng khoang cơ bản giảm một nưa), bổ sung than hoat tính

và casein hydrosylate 100 mg/l [3].

2.1.8. Tầm quan trọng

2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái

Drosera burmanni Vahl thƣờng moc ở đất chua, vung bac màu nên là loài

chỉ thi cho vung đất chua, bac màu [14], [37].

2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật

Ho Droseraceae là một đối tƣơng điên hình cho cac nghiên cứu vê qua trình

tiến hoa ở thưc vât, bao gồm những thí nghiệm vê phat triên và sinh lý hoc nhằm

nghiên cứu vai trò chuyên biệt cua cac chất điêu hòa sinh trƣởng thưc vât trong tiến

hoa hình thai ở mức vĩ mô. Bên canh đo, giống Drosera bao gồm rất nhiêu loài

thích nghi vơi từng điêu kiện môi trƣờng khac nhau nên rất thích hơp cho những

nghiên cứu vê sư thích nghi cấu truc và chức năng (bao gồm dinh dƣơng từ côn

trung và sư sản sinh mầm) trong cac điêu kiện môi trƣờng khac nhau. Ngoài ra, hat

phấn cua giống cây này đƣơc tổ chức cố đinh thành bộ bốn, là trang thai chuyên tiếp

từ hình thức giao phấn sang tư thu phấn trong qua trình tiến hoa cua hệ thống thu

phấn ở thưc vât.

2.1.8.3. Giá trị dƣợc tính

Cho đến nay đã co nhiêu nghiên cứu chứng minh tiêm năng vê gia tri dƣơc

tính cua Drosera (Bảng 2.3). Trong đo quan trong nhất là cac quinone, đặc biệt là

plumbagin, 7-methyljuglone và cac flavonoid.

Cac hơp chất quinone đƣơc tìm thấy co khả năng chữa cac căn bệnh hô hấp ở

ngƣời nhƣ: hen suyễn, viêm phổi, ho gà và lao. Chung cũng co khả năng chống lai

cac virus, nấm, khuẩn và chống ung thƣ. Tiêu biêu trong nhom này là plumbagin và

7-methyljuglone [29].

13

Ngoài quinone, cac flavonoid ly trích từ Drosera cũng co gia tri dƣơc tính

cao nhƣ khả năng ức chế enzyme và chống oxi hoa. Một số flavonoid co ảnh hƣởng

lơn đến chức năng cua hệ miễn dich. Tiêu biêu nhom này co thê kê đến quercetin và

myricetin. Chung là những chất ức chế hiệu quả cac enzyme glyoxylase mà những

enzyme này giữ vai trò rất quan trong trong việc điêu hòa sư phân chia tế bào bằng

cach giải độc -ketoaldehyde. Trong y dƣơc, quercetin đƣơc sư dung đê ngăn ngừa

và điêu tri ung thƣ, no cũng co khả năng ức chế hoat tính gây đột biến gen cua

benzopyrene, một hydrocacbon nhiêu nhân thơm gây ung thƣ tiêu biêu.

Bảng 2.3: Dƣơc tính và cac hoat tính ứng dung khac cua dich chiết Drosera [29]

HOẠT TÍNH TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chống lão hoa và xơ cứng động mach Grieve (1959)

Ức chế độc tô Harborne (1982)

Chống hen suyễn Frenzer (1980)

Chống ung thƣ Kreher và ctv (1990); Fujii và ctv (1992)

Ngừa thai, pha thai Bhargava (1984); Bhagava và ctv (1985)

Chống nhiễm nấm Békésiova (1997)

Ngừa hui, phong Bokemo (1984)

Chống vi khuẩn Lloyd và ctv (1994); Fujii và ctv (1992)

Chống đột biến Farr và ctv (1985); Durga và ctv (1992)

Ngừa giun lãi Fetterer và ctv (1991)

Chống co thăt Juniper và ctv (1989)

Chống virut Walt (1972)

Tim mach Itoigawa và ctv (1991)

Dung làm my phẩm Slack (1980)

Miễn nhiễm Kreher và ctv (1990)

Diệt côn trung Gujar và ctv (1988); Joshi và ctv (1989)

Chống vi trung lao Gundidza và ctv (1990)

Chống ho gà Weiss (1991); Ragazzi và ctv (1993)

14

Ở Vân Nam (Trung Quốc) Drosera burmanni Vahl (tên thông thƣờng là cẩm

đia la) đƣơc dung đê chữa bệnh viêm ruột, li, sƣng, đau hong, ho do phổi nong,

khac ra mau, đổ mau mũi và trẻ em bi cam tích. Ở Quảng Tây, cây dung đê tri đòn

ngã, tổn thƣơng và bệnh mê đay [15].

Năm 1958 - 1959, bệnh viện Vinh dung D. burmanni Vahl dƣơi nhiêu dang

khac nhau (rƣơu thuốc, xi-rô, thuốc hãm, thuốc cao) đê chữa bệnh ho gà [2].

Drosera burmanni Vahl cũng đƣơc công nhân là co gia tri trong việc chữa

cac bệnh kiết li, lao hach, cam tích (suy dinh dƣơng nhƣng bung chƣơng to ở trẻ

em) [9], [10].

2.1.8.4. Ưng dụng trong công nghiệp

Ở một số nơi trên thế giơi, dich chiết Drosera đƣơc dung làm đông tu sữa do

giàu hàm lƣơng acid hữu cơ và enzyme. Ngoài ra săc tố cua một số loài Drosera

còn đƣơc dung đê nhuộm vải [39].

15

2.1.8.5. Giá trị kinh tế

Sư đa dang vê giống loài, sư la măt vê hình thai khiến Drosera đem lai gia tri

kinh tế rất cao trong thi trƣờng hoa cảnh thế giơi (Hình 2.6) [42].

Hình 2.6: Môt sô loai Drosera co gia tri kinh tế cao trên thế giơi [42].

D. brevicornis D. aliciae D. capensis D. capensis

D. paleacea D. sewelliae D. pulchella D. pulchella

D. villosa D. villosa D. fimbriata

D. fimbriata

D. binata

D. binata

D. falconeri

D. erythrorhiza

16

2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc

Trong nƣớc

Đô Đăng Gia p (2003) đã khảo sat, thu thâp, thuần dƣơng và thư nghiệm in

vitro những loài cây băt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣơc Bưu [1].

Trần Thi Bích Chiêu (2004) khảo sat vòng đời và tai tao chồi từ phat hoa cây

Drosera burmanni Vahl [13].

Quach Ngô Diễm Phƣơng (2006) hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây

Drosera indica L và khảo sat hoat tính sinh hoc cua hơp chất naphthoquinone co

hoat tính sinh hoc đƣơc tach chiết từ cây [12].

Hồ Thuy Bích Tuyên (2006) ly trích và khảo sat hoat tính sinh hoc cua hơp

chất quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấy in vitro [3].

Nguyên Đai Hai (2006) đa n uôi cây mô cây băt ruôi (Drosera burmanni

Vahl) và khảo sat hoat tính khang khuẩn cua hơp chất chiết thô plumbagin [5].

Thế giới

K. Javaram và M. N .V Prasad (2005) đã công bố nhân nhanh chồi cây

Drosera burmanni Vahl trong môi trƣờng MS co bổ sung 2 mg/l Kn và 1 mg/l BA.

Sư tai sinh cây hoàn chỉnh từ phat hoa cũng đƣơc quan sat trên môi trƣờng vơi nồng

độ Kinetin thấp hơn (1 mg/l). Sư ra rễ cũng đƣơc thưc hiện thành công trên môi

trƣờng MS cơ bản [24].

Mejia Hersikorpi và cac cộng sư (2002) đã nhân giống thành công cây

Drosera rotundifolia từ la cua no và tao ra đƣơc cum chồi đat 20 - 30 chồi trên môi

trƣờng MS co bổ sung 0,45 mg/l BA và 0,37 mg/l NAA [5].

Kawiak A., Krolika A. và Lojokowska E. tai sinh D. anglica, D. binata đat

số chồi lơn nhất trên môi trƣờng Vacin và Went không co chất điêu hòa sinh

trƣởng, đối vơi D. anglica là môi trƣờng Fast bổ sung 0,05 M 6-benzyladenine

(BA) và 0,005 M -napthaleneacetic acid (NAA), còn môi trƣờng nhân chồi tối ƣu

cho D. cuneifolia MS 1/2 bổ sung 0,2 M BA và 0,2 M NAA. Môi trƣờng long

làm gia tăng đang kê khả năng nhân chồi cua mẫu cấy D. anglica và D. binata [25].

17

Ingrid L. I. Hook (2001) đã nuôi cấy D. binata, D. rotundifolia, D. capensis

trong cả môi trƣờng MS long và co agar; nuôi cấy dich huyên phu D. rotundifolia

trên môi trƣờng Gamborg’s B5; nuôi dich huyên phu D. capensis trong môi trƣờng

MS và McCowns Woody Plant (McC) [23].

Jozep Nahalka và cộng sư đã tao mô seo và nuôi cấy thành công dich huyên

phu đê thu nhân plumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum trên môi trƣờng MS

bổ sung 1 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA [28].

2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phu tế bào để thu nhận hợp chất

thứ cấp

2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp

Hơp chất thứ cấp hay sản phâm trao đổi bâc hai là những sản phẩm đƣơc tao

ra trong tế bào nhờ cac qua trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đo chung

thoat ra khoi tế bào đi ra môi trƣờng ngoài.

Phần lơn cac sản phẩm bâc hai thƣờng không co nhiêu ý nghĩa sinh lý đối

vơi bản thân tế bào . Qua trình tao ra cac sản phẩm bâc hai chỉ thông qua những cơ

chế chuyên hoa rất tư nhiên cua tế bào, cũng co thê do sư sai lệch vê thông tin di

truyên trong tế bào dẫn đến hiện tƣơng sinh tông hơp thừa [7].

Cac loai hơp chất thứ cấp bao gồm những nhom chính sau:

Cac hơp chất trao đổi thứ cấp chứa nitrogen gồm: alkaloid, cac độc

chất chứa nitơ đã đƣơc glycosyl hoa, cac amino acid không phải

protein,…

Cac chất trao đổi co phenol, isoprenoid, cac polyketide.

Con đƣờng tổng hơp ra chung đƣơc trình bày trong sơ đồ 2.1 [43].

18

Hình cac nhom hơp chất thứ cấp chính trong thưc vât

Sơ đồ 2.1: Con đƣờng tổng hơp cac nhom hơp chất thứ cấp chính ở thưc vât [43].

2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo

2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo

Mô seo là một khối tế bào không co tổ chức, hình thành từ cac mô hoặc cơ

quan đã phân hoa dƣơi điêu kiện đặc biệt (vết thƣơng, xư lý vơi cac chất điêu hòa

sinh trƣởng thưc vât…).

Mô seo co thê đƣơc kích thích tao ra trong ống nghiệm bằng cach đƣa một

mẫu nho cua cây lên môi trƣờng vô trung co bổ sung hormone. Dƣơi tac dung cua

cac hormone kích thích nội sinh hoặc cac hormone nhân tao, qua trình trao đổi chất

19

cua tế bào sẽ thay đổi và băt đầu hoat động phân bào. Vì vây khi co sư mất cân bằng

vê cac nồng độ hormone sinh trƣởng trong thưc vât thì mô seo hình thành. Khối mô

seo co khả năng tai sinh thành cây hoàn chỉnh trong điêu kiện môi trƣờng không co

chất kích thích tao mô seo [7].

2.2.2.2. Ưng dụng của nuôi cấy mô sẹo

- Nhân giống in vitro cac loài thưc vât mà phƣơng phap nhân giống đỉnh sinh

trƣởng ít hiệu quả hay kho thưc hiện.

- Nghiên cứu qua trình hình thành cơ quan.

- Làm nguồn nguyên liệu đê nuôi cấy tế bào đơn cho chon loc dòng tế bào.

- Thu nhân cac sản phẩm hoat chất thứ cấp co hoat tính sinh hoc cao.

- Nuôi cấy huyên phu tế bào.

2.2.3. Nuôi cây dich huyên phu

2.2.3.1. Khái niệm huyền phu tế bào

Huyên phu tế bào là một môi trƣờng long đƣơc lăc liên tuc, trong đo co sư

hiện diện cua cac tế bào soma cô lâp hoặc những cum nho cac tế bào co khả năng

sinh phôi co thê tai sinh thành một thưc vât nguyên ven [7].

2.2.3.2. Nguyên tắc tao huyền phu

Huyên phu đƣơc tao ra từ những mảnh mô seo trong một môi trƣờng long

đƣơc lăc liên tuc. Muốn cho huyên phu đƣơc tốt thì phải tao đƣơc mô seo tốt tức là

mô seo phải bao gồm cac tế bào co khả năng sinh phôi. Trong qua trình tao huyên

phu, những điêu kiện sinh trƣởng nhƣ môi trƣờng dinh dƣơng, anh sang, nhiệt độ

hay thành phần cac chất kích thích cũng tƣơng tư nhƣ luc tao mô seo hoặc nếu co

thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít.

Trong môi trƣờng long, từ mô seo co thê phong thích ra những tế bào riêng

lẻ hay những cum tế bào từ vài chuc đến cả trăm tế bào giup tăng diện tích hấp thu

cac chất dinh dƣơng trong môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài ra hoat động cua may lăc

cũng giup cho sư trao đổi khí giữa môi trƣờng và tế bào đƣơc thuân lơi hơn.

Một huyên phu tế bào đƣơc cho là lý tƣởng khi no là một dich min, hầu nhƣ

gồm những yếu tố co khả năng sinh phôi, noi cach khac là những tế bào cô lâp hay

20

hơp thành từng nhom nho từ vài đến khoảng 20 tế bào co khả năng duy trì tính toàn

năng và tiến hoa thành phôi soma trên môi trƣờng tai sinh trong điêu kiện thích hơp.

2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tao huyền phu tế bào [7]

- Hệ thống nuôi cấy.

- Ánh sang, nhiệt độ.

- Mât độ tế bào khởi đầu.

- Môi trƣờng nuôi cấy.

- Vai trò cua cac chất điêu hòa sinh trƣởng thưc vât

- Sư tăng trƣởng và cấy chuyên huyên phu tế bào.

- Điêu kiện môi trƣờng.

- Cum tế bào trong dich huyên phu.

2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phu hiện nay [6], [20]

Co nhiêu phƣơng phap nuôi cấy huyên phu tế bào khac nhau đã đƣơc phat

triên, nhƣng co hai phƣơng phap chính :

Nuôi cấy gián đoan

Tế bào thưc vât đƣơc nuôi trong một thê tích (100 ml - 10 lít) hôn hơp môi

trƣờng. Trong giai đoan phat triên cua tế bào, số lƣơng tế bào ban đầu gia tăng cho

đến khi dinh dƣơng trong môi trƣờng can kiệt hoặc co sư tích lũy chất trao đổi đến

mức kìm hãm. Cac môi trƣờng nuôi cấy quy mô nho đƣơc chuyên động liên tuc trên

may lăc hay trong bình phản ứng đƣơc phối trộn đêu. Môi trƣờng trong bình chứa

thƣờng chiếm 1/5 thê tích. May lăc đƣơc điêu chỉnh ở vân tốc 30 - 180 vòng/phut

biên độ 3 cm. Phƣơng phap này đƣơc sư dung rộng rãi trong phòng thí nghiệm.

Nhƣơc điêm cua phƣơng phap là không sư dung trong nghiên cứu dài han vê

sư phat triên tế bào và sư trao đổi chất, kho nhân đƣơc sư ổn đinh trong sản xuất.

Cac tế bào nuôi cấy gian đoan không đồng nhất vê kích thƣơc và cấu tao. Đê

đảm bảo yêu cầu nuôi cấy phải cấy chuyên thƣờng xuyên quần thê tế bào vào môi

trƣờng mơi sau những khoảng thời gian bằng nhau.

21

Hình 2.7: Hệ thống nuôi cấy gian đoan qui mô nho trên cac may lăc [44].

Nuôi cấy liên tục

Đây là một phƣơng phap quan trong đƣơc dung đê sản xuất hơp chất sơ cấp

hay thứ cấp trên quy mô lơn. Ky thuât này đòi hoi phải co hệ thống thiết bi phức

tap. Sư chuyên động cua môi trƣờng nuôi cấy lơn trong cac bồn phản ứng sinh hoc

đƣơc thưc hiện bằng cach khuấy vơi một turbin và (hoặc) suc không khí vô trung

vào môi trƣờng từ dƣơi đay. Phƣơng phap nuôi cấy này cho phép giữ vô trung cả hệ

thống trong một thời gian dài.

Hình 2.8: Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm [45].

22

2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các

hợp chất thứ cấp

- Chất điêu hòa sinh trƣởng (hormone thưc vât) bao gồm cac auxin nhƣ:

IAA, NAA, 2,4-D ; cac cytokinin nhƣ: BAP, kinetin…

- Nguồn đam.

- Nguồn carbon.

- Ánh sang.

- Cac yếu tố khac: pH môi trƣờng, nồng độ phosphate, cac loai khí (O2, CO2, …)

2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy

huyền phu [22]

Cac phƣơng phap gia tăng sư sản xuất hơp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyên

phu co thê kê đến:

2.2.4.1. Tối ƣu hoá điều kiện nuôi cấy

Khả năng tổng hơp cac hơp chất thứ cấp cua tế bào co thê chiu ảnh hƣởng

bởi nhiêu yếu tố vât lý (nhƣ nhiệt độ, độ thông khí, tốc độ lăc, anh sang, pH…) và

hoa hoc (nhƣ chất điêu hoà tăng trƣởng thưc vât), thành phần cac chất trong môi

trƣờng nuôi cấy…Tuỳ từng loai tế bào mà sư đap ứng vơi cac yếu tố kê trên sẽ khac

nhau. Khi xac đinh đƣơc điêu kiện nuôi cấy tối ƣu thì sư sản xuất và tích luy cac

hơp chất thứ cấp trong tế bào in vitro sẽ cao hơn so vơi cây trồng ngoài thiên nhiên.

Phƣơng phap này đã đat đƣơc thành công lơn trong trƣờng hơp cua shikonin

và berberine [31].

2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao

Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thê tế bào co nhiêu kiêu gen khac

nhau, do đo cac đặc tính sinh lý cua tế bào sẽ khac nhau. Phƣơng phap chon loc

dòng tế bào là một ky thuât hữu hiệu đê tăng sản lƣơng cac hơp chất thứ cấp.

2.2.4.3. Bổ sung tiền chất

Sư bổ sung cac tiên chất hữu cơ xuất phat từ quan niệm cho rằng những hơp

chất này co thê là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu cua một con đƣờng sinh

tổng hơp cac sản phẩm thứ cấp nào đo. Sư bổ sung cac tiên chất cua qua trình sinh

23

tổng hơp cac hơp chất thứ cấp mong muốn vào môi trƣờng nuôi cấy giup nâng cao

hiệu quả sản xuất cua tế bào trong một số trƣờng hơp xac đinh. Phƣơng phap này sẽ

co gia tri khi gia thành cua cac tiên chất không qua đăt.

2.2.4.4. Cố định tế bào

Trong li nh vưc nuôi cấy tế bào thưc vât đê thu nhân cac sản phẩm thứ cấp,

việc cố đinh tế bào giup kéo dài thời gian sư dung, đặc biệt là trong cac hệ thống

phản ứng sinh hoc. Mặt khac, những tế bào cố đinh ít bi tac động bởi điêu kiện môi

trƣờng hơn so vơi tế bào tư do. Tế bào cố đinh thƣờng là những tế bào co khả năng

tiết cac sản phẩm thứ cấp ra môi trƣờng ngoài. Tế bào ở trang thai cố đinh đôi khi

tao ra đƣơc cac hơp chất thứ cấp co sản lƣơng cao hơn tế bào ở trang thai lơ lững tư

do. Cac chất đƣơc sư dung đê cố đinh tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar,

cac sơi propylen,… Sư cố đinh tế bào giup tăng sản xuất cac hơp chất thứ cấp

nhƣng cũng không loai trừ khả năng chính những chất cố đinh lai là tac nhân kích

thích sư sản xuất cac hơp chất thứ cấp.

2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hoá mô

Dich treo tế bào thƣờng đƣơc sư dung đê thu nhân cac sản phẩm thứ cấp.

Tuy nhiên, gần đây, nhiêu nghiên cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô

đã phân hoa nhƣ nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ,…nhằm thu nhân hơp chất thứ cấp.

Cac nghiên cứu chứng minh rằng co mối quan hệ mât thiết giữa sư sản xuất cac hơp

chất thứ cấp vơi sư phân hoa tế bào và sư phat sinh hình thai cua thưc vât.

2.2.4.6. Nhân tô cam ƣng (elicitor)

Theo Rhoberts và Shuler (1999), tiến trình cảm ứng biêu hiện gene cua cac

enzyme xuc tac tổng hơp cac chất biến dƣơng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thưc vât

đƣơc biết đến nhƣ là sư cảm ứng (elicitation) [26]. Elicitation trong sản suất hơp

chất thứ cấp cua tế bào thưc vât xảy ra do sư tiếp xuc giữa tế bào thưc vât vơi cac

biotic và abiotic elicitor. Thuât ngữ “elicitor” đƣơc sư dung đầu tiên cho cac tac

nhân kích thích bất kỳ dang phản ứng phòng vệ nào cua cây vơi cac bệnh lý xuất

hiện trên đồng ruộng. Thưc vât co thê sản xuất ra cac chất khang sinh biến dƣơng

thứ cấp nhƣ cac phytoalexin trong cac phản ứng chống lai sư tấn công cua vi khuẩn.

24

Hình 2.9: Săc ky côt [47].

Do đo, cac vi sinh vât (đặc biệt là nấm và cac thành phần cua chung) đã đƣơc sư

dung rộng rãi đê cảm ứng sản xuất hơp chất thứ cấp trong tế bào thưc vât [18].

2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn

2.3.1. Phƣơng pháp ly trích - thu nhận hợp chất [8]

2.3.1.1. Sắc ký cột

Luân văn sư dung hệ thống săc ký cột hở vơi chất hấp thu là silica gel trong

qui trình ly trích và thu nhân hơp chất anthraquinone (Hình 2.9).

Khái niệm

Săc ký cột hở là một hệ thống vât lý trong đo co một cột đƣơc nap chặt chẽ

bởi một chất hấp thu và co một pha long di động chảy xuyên ngang qua. Tuy thuộc

và loai chất hấp thu đê nap cột và pha động, ngƣời ta phân biệt một số cơ chế tach:

săc ký hấp thu, săc ký phân chia, săc ký trao đổi ion, săc ký loc gel, săc ký ai lưc…

Nguyên tắc của sắc ký cột

Săc ký cột căn cứ trên khả năng mà phân tư chất tan co thê tƣơng tac vơi

pha tĩnh. Những tƣơng tac này sẽ lần lƣơt làm châm sư di chuyên cua những chất

tan khac nhau, khi chung di chuyên xuyên qua chất hấp thu đê ra khoi cột. Cac

25

tƣơng tac giữa chất tan vơi pha động và pha tĩnh co thê là nối hydrogen, nối Val der

Waal, tƣơng tac lƣơng cưc - lƣơng cưc, tƣơng tac acid - bazơ, sư tao phức. . .

Chất hấp thụ silica gel

Silica gel là polimer ba chiêu cua những tứ diện oxid silicon SiO2.H2O. Đây

là những nguyên liệu co lô rông. Hat silica gel sư dung cho săc ký cột co diện tích

bê mặt khoảng 100 - 800 m2/g, đƣờng kính hat trung bình là 40 - 200 m và cac lô

rông trên bê mặt co đƣờng kính trung bình 40 - 300 A0.

Trên bê mặt cac hat silica gel co mang những nhom silanol-OH. Đây là trung

tâm hoat động co thê tao nên những nối hydrogen manh vơi những hơp chất đƣơc

săc ký. Vì thế, những hơp chất nào co khả năng tao nối hydrogen manh hơp chất đo

sẽ bi silica gel giữ manh lai trong cột. Nhƣ vây những hơp chất phân cưc manh co

chứa nhom chức acid carboxilic, amin, amid sẽ hấp thu manh vào silica gel trong

khi những hơp chất kém phân cưc nhƣ alkan, terpen (những hơp chất không chứa

cac nhom chức co thê tao nối hydrogen) sẽ ít bi giữ. Ngoài ra một hơp chất co thê bi

silica gel giữ lai manh hay yếu còn phu thuộc vào độ phân cưc cua dung môi ly giải.

Nguyên tắc cơ bản khi sử dụng sắc ký cột

Lưa chon dung môi giải ly: trong loai săc ký cột hấp thu, hơp chất không

phân cưc sẽ đƣơc ly giải khoi cột trƣơc, hơp chất phân cưc đƣơc giải ly sau. Thông

thƣờng ngƣời ta băt đầu bằng dung môi không phân cưc đê loai tƣơng đối cac hơp

chất không phân cưc ra khoi cột và tăng dần độ phân cưc cua dung môi giải ly đê

đuổi cac hơp chất co tính phân cưc manh hơn. Nhƣng nếu thay đổi dung môi phân

cưc hơn một cach đột ngột sẽ làm gãy cột.

Kích thƣơc cột và lƣơng mẫu chất: Kích cơ cua cột tuy thuộc vào số lƣơng

mẫu chất cần phân tach. Kích thƣơc cột cần đat tỷ lệ vê chiêu cao – đƣờng kính là

8:1. Trong lƣơng chất hấp thu và trong lƣơng mẫu phải tuân theo một tỷ lệ tƣơng

ứng. Trung bình thì trong lƣơng chất hấp thu phải lơn hơn 25 - 50 lần trong lƣơng

cua mẫu cần săc ký (tính theo trong lƣơng). Tuy nhiên, vơi những hôn hơp mà cac

hơp chất không dễ dàng tach riêng thì cần sư dung cột lơn hơn vơi số lƣơng chất

hấp thu nhiêu hơn (lơn hơn 100 - 500 lần).

26

Hình 2.10: Mô hinh săc ky nhanh côt khô [8].

2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry – Column Flash Chromatography) [8]

Khái niệm

Săc ký nhanh cột khô là một biến đổi cua săc ký cột nhanh, sư dung ap suất

kém đê gia tăng vân tốc ly giải cua pha động. Ky thuât này khac vơi săc ký nhanh là

cột săc ký đƣơc rut khô sau môi phân đoan thu đƣơc.

Chất hấp thụ

Sư dung silica gel loai dung cho săc ký lơp mong (Merk 60H hoặc 60 G; tức

40 - 15 m hoặc alumina loai dung cho săc ký lơp mong (10 m, diện tích bê mặt

riêng lơn: 500 m2.g

-1).

Mô tả hệ thống

- Phễu loc xốp bằng thuy tinh. Độ xốp cua lô thuộc loai 3 hoặc loai D. Phễu

co đu kích cơ lơn nho (loai 100; 150; 250; 500 ml…) thích hơp vơi lƣơng mẫu cần

săc ký (Bảng 1.4).

- Bình tam giac.

- Hệ thống tao ap suất bằng vòi nƣơc (20 - 70 mmHg; chỉ cần ap suất vừa

phải).

27

2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế [8]

Khái niệm

Săc ký lơp mong còn goi là săc ký phẳng (planar chromatography), là ky

thuât phân bố răn - long, trong đo pha động là chất long đƣơc cho đi ngang qua một

lơp chất hấp thu trơ (ví du silica gel hay alumina) chất hấp thu này đƣơc trang thành

một bản mong, đêu, phu lên một nên phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm

plastic.

Do chất hấp thu đƣơc trang thành một lơp mong nên phƣơng phap này goi là

săc ký bản mong.

Một hơp chất tinh chất khi săc ký bản mong sẽ cho một vết, vơi gia tri Rf

không đổi trong một hệ dung môi ly giải xac đinh, bởi bảng săc ký cua một lô sản

xuất nhất đinh.

Vơi: Khoảng cach di chuyên cua hơp chất

Rf =

Khoảng đƣờng di chuyên cua dung môi

Gia tri Rf không bao giờ lơn hơn 1 và thay đổi tuy theo: loai chất hấp thu

dung đê trang bản mong, thành phần dung môi giải ly, độ bão hòa dung môi, ky

thuât ly giải.

Hình 2.11: Săc ký lơp mong [46].

28

Ƣu điểm

Ƣu điêm cua săc ký bản mong điêu chế vơi săc ký cột là: nhanh, dễ tìm đƣơc

dung môi thích hơp đê giải ly tach tốt cac chất; cac vung co chứa chất cần thiết sẽ tu

lai thành lơp mong dễ dàng phat hiện, dễ dàng cô lâp chất. Sở dĩ săc ký lơp mong

tach tốt là nhờ tỷ lệ lơn giữa “chất tach : chất hấp thu silica gel” (1:1000 đến 1:

10.000) trong khi tỷ lệ này ở săc ký cột là 1:50.

Nhƣợc điểm

Chỉ sư dung đƣơc săc ký điêu chế khi hôn hơp chất cần tach chỉ chứa khoảng

4 thành phần chính và co trong lƣơng nho vài trăm miligram; còn nếu co một mẫu

chất vài gram thì nên sư dung săc ký cột vì cac bảng săc ký điêu chế rất đăt tiên.

2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp

Nguyên tắc

Nguyên tăc cua ky thuât săc ký long cao ap HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) dưa trên sư phân bố cua chất tan giữa hai chất long không trộn

lẫn vào nhau khi cho một chất long di chuyên (pha động) qua một chất long đứng

yên (pha tĩnh). Pha tĩnh bi hấp thu trên bê mặt chất răn (chất mang). Thông thƣờng

pha tĩnh là dung môi phân cưc, pha động thƣờng là nƣơc hoặc dung môi hữu cơ.

Đôi khi pha tĩnh là cac chất long ít phân cưc luc đo pha động phải là dung môi ít

phân cưc hơn.

29

Các bộ phận chính của máy HPLC

Ưng dụng của sắc ký lỏng cao áp

Phƣơng phap HPLC co khả năng tach cac chất đặc thu nhƣ:

- Cac hơp chất cao phân tư, ion thuộc đối tƣơng nghiên cứu y hoc, sinh hoc.

- Cac hơp chất tư nhiên không bên, cac chất kém bên nhiệt, cac chất dễ nổ.

- Tach cac acid nucleic, dƣơc phẩm, steroit, vitamine, chất bảo quản thưc

phẩm, chất bảo vệ thưc vât, cac phenol, cac hydrocacbon trong dầu mo…

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ hoat động cac bộ phân cua may HPLC

30

Ƣu điểm

Ngoài những ứng dung rộng rãi đã nêu ở trên, HPLC còn co những ƣu điêm

hơn săc ký long cổ điên nhƣ tốc độ nhanh, độ tach tốt, độ nhay cao, cột tach dung

đƣơc nhiêu lần, mẫu chất thu lai dễ dàng vì hầu hết cac detector không pha huy

mẫu.

Nhƣợc điểm

Xét vê đầu tƣ trang thiết bi lẫn phí tổn vân hành, HPLC là một ky thuât đăt tiên.

31

Chƣơng 3

3. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP

Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: từ thang 3/2007 đến hết thang 8/2007.

Đia điêm: cac thí nghiệm nuôi cấy mô đƣơc thưc hiện tai trai thưc nghiệm

sinh hoc, Đai hoc Khoa hoc Tư nhiên, Đai hoc Quôc gia thành phố Hồ Chí Minh.

Cac thí nghiệm đinh lƣơng hơp chất anthraquinone trong cây D. burmanni

Vahl đƣơc thưc hiện tai phòng săc ky, Viên Công nghê Sinh hoc và Công nghệ môi

trƣơng, Đai hoc Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh.

3.1. Nuôi cây mô seo, tao dịch huyền phu

3.1.1. Vật liệu

Nguồn giống

Nguyên liệu dung cho thí nghiệm là cây Drosera burmanni Vahl, do phòng

công nghệ sinh hoc thưc vât, Đai hoc Khoa hoc Tư nhiên thành phố Hồ Chí Minh

cung cấp. Cac mẫu thí nghiệm đồng nhất vê mặt di truyên (Hình 3.1).

Hình 3.1: Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro.

32

Môi trƣờng

- Môi trƣờng muối khoang MS (Murashige Skoog, 1962) (Phu luc 1) vơi

thành phần khoang đa lƣơng giảm 1/2 (ký hiệu là MS 1/2) bổ sung:

- Đƣờng: 30 g/l.

- Agar: 7 g/l.

- Than hoat tính: 1 g/l.

- Casein hydrosylate: 100 mg/l.

- pH = 5,8 ± 0,1 (trƣơc khi hấp khư trung).

- Hấp khư trung bằng autoclave ở 1210 C, 1 atm, 20 phut.

- Môi trƣờng muối khoang Gamborg’s B5 (phu luc) bổ sung :

- Vitamin B1= 0,4 mg/l.

- Vitamin B6 = 0,5 mg/l.

- Vitamin PP = 0,5 mg/l.

- PVP = 1,25 mg/l.

- Casein hydrosylate: 100 mg/l.

- Hormone tăng trƣởng thưc vât: NAA, 2,4-D, BA, IBA co nồng độ thay đổi.

Điều kiện nuôi cấy

- Thời gian chiếu sang: 16 giờ/ngày.

- Cƣờng độ chiếu sang: 3000 lux.

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22 – 250 C.

- Độ ẩm trung bình: 70 %.

Trang thiết bị và dụng cụ

- Trang thiết bi: tu cấy vô trung, nồi hấp vô trung, may đo pH, cân phân tích.

- Dung cu: chai nƣơc biên, đĩa petri, dao, kep cấy,…

33

3.1.2. Phƣơng pháp

3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ

đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng

Mục đích thí nghiệm

Xac đinh thành phần khoang và nồng độ đƣờng thích hơp đê duy trì sư phat

triên cua mẫu cấy lơp mong TCL.

Bố trí nghiệm thức

Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, gồm 12

nghiệm thức, môi nghiệm thức gồm 20 mẫu và đƣơc lâp lai ba lần. Kết quả là tri số

trung bình cua 3 lần lâp lai.

Bảng 3.1: Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng thành phần khoang và nồng độ

đƣờng lên sư phat triên mẫu cấy lơp mong

Loai môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l)

5 10 20 30

MS A1 A2 A3 A4

MS 1/2 A5 A6 A7 A8

Gamborg’s B5 A9 A10 A11 A12

Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi kết quả sau 14 ngày dưa trên chỉ tiêu là tỷ lệ (%) số mẫu còn sống.

Chỉ tiêu này đƣơc xac đinh theo công thức:

Số mẫu còn sống

Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100

Tổng số mẫu cấy

Phƣơng pháp tiến hành

Cac bộ phân gồm thân, la non (lơp la thứ nhất hay thứ hai) và phat hoa cua

cây Drosera burmanni Vahl in vitro đƣơc căt thành cac lơp mong (từ 0,2 - 0,5 mm),

cấy vào cac nghiệm thức nhƣ đã bố trí.

34

3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loai hormone thích hợp cho việc

kích ứng tao mô sẹo


Tìm sư kết hơp cua cac loai hormone thích hơp nhất cho việc tao mô seo.


Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố,

gồm 3 nghiệm thức. Môi nghiệm thức tiến hành trên 45 mẫu và đƣơc lâp lai 3 lần,

kết quả là tri số cua 3 lần lâp lai.

Bảng 3.2: Bố trí nghiệm thức khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone thích hơp cho

việc kích ứng tao mô seo

Cac loai hormone

kết hơp (mg/l)

NAA (0,2)

2,4-D (0,1)

[12], [23]

NAA (0,5)

IBA (1)

[28]

NAA (1)

BA (0,2)

[5]

Nghiệm thức

B1 B2 B3


Theo dõi kết quả sau 14 ngày nuôi cấy dưa trên chỉ tiêu là tỷ lệ mẫu cấy tao

mô seo, vơi:

Tỷ lệ mẫu cấy tao mô seo

Tỷ lệ mẫu tao mô seo (%) = x 100


Cách thực hiện

- Mẫu căt lơp mong cây D. burmanni Vahl đƣơc đƣa vào cac nghiệm thức

trong đo môi trƣờng co thành phần khoang và nồng độ đƣờng tối ƣu vơi mẫu cấy

lơp mong đã tìm đƣơc từ thí nghiệm 1.

- Ủ tối trong cac thung carton.

35

3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp của 2,4-D khi kết hợp với

NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tao mô sẹo


Tìm nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm

ứng tao mô seo bằng phƣơng phap lơp mong tế bào TCL.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 6

nghiệm thức trên môi loai vât liệu, môi nghiệm thức thưc hiện trên 12 mẫu và đƣơc

lâp lai 3 lần. Kết quả là tri số cua 3 lần lặp lai.

Bảng 3.3: Bố trí nghiệm thức khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp

vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo

Vât liệu đầu Nồng độ 2,4-D (mg/l)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Phat hoa TCL C1 C2 C3 C4 C5 C6

Thân TCL C1’ C2’ C3’ C4’ C5’ C6’

La TCL C1” C2” C3” C4” C5” C6”


Ghi nhân kết quả sau 21 ngày nuôi cấy vơi cac chỉ tiêu sau:

- Tỷ lệ mô seo tao thành

- Hình thai mô seo

Vơi Số mẫu tao seo

Tỷ lệ mẫu tao seo (%) = x 100



Mẫu căt lơp mong cua phat hoa, thân, la non đƣơc đƣa vào môi trƣờng co

nồng độ 2,4-D thay đổi và u tối 21 ngày trong cac thung carton.

36

3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng

sinh khối mô sẹo

Mục đích

Tìm kiêu nuôi cấy thích hơp cho việc tăng sinh khối mô seo.


Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố và

gồm 3 nghiệm thức. Môi nghiệm thức tiến hành trên 1 bình, 3 lần lâp lai. Kết quả là

gia tri trung bình cua 3 lần lâp lai.

Bảng 3.4: Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy lên sư tăng

sinh khối mô seo

Kiêu nuôi cấy Răn Ban răn Long tĩnh Long lăc

Nghiệm thức D1 D2 D3 D4


Chỉ tiêu theo dõi là khối lƣơng mô seo gia tăng sau 21 ngày nuôi cấy quy vê

1 mg. Chỉ tiêu này đƣơc tính bằng công thức:

Δm = [(m21 - m0)/m0] (mg)

Trong đo :

Δm: khối lƣơng mô seo tăng từ 1mg ban đầu.

m0: khối lƣơng mô seo ban đầu.

m21: khối lƣơng mô seo sau 21 ngày nuôi cấy.


Mô seo đƣơc cấy vào môi trƣờng vơi cac kiêu nuôi cấy khac nhau, bổ sung

hormone tăng trƣởng là 2,4-D và NAA vơi sư kết hơp hai nồng độ tối ƣu ở thí

nghiệm 3. Cac mô seo này đêu đƣơc cân khối lƣơng trƣơc khi cấy. Sau 21 ngày

nuôi cấy cân lai khối lƣơng mô seo và ghi nhân kết quả.

Cac kiêu nuôi cấy gồm:

- Kiêu nuôi cấy dang răn: môi trƣơng co bổ sung agar (7 g/l).

37

- Kiêu nuôi cấy ban răn: môi trƣờng long, co bông gòn làm gia thê, không

lăc.

- Kiêu nuôi cấy long tĩnh: môi trƣờng long, không lăc.

- Kiêu nuôi cấy long lăc: môi trƣơng long, lăc vơi tốc độ 150 vòng/phut.

3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hinh thanh săc

tô đo của mô sẹo

Mục đích: Bƣơc đầu ghi nhân ảnh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành săc

tố đo ở mô seo.


Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố

gồm 2 nghiệm thức. Môi nghiệm thức thưc hiện trên 10 mẫu mô seo, lâp lai 3 lần.

Kết quả là tri số trung bình cua 3 lần lâp lai.

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sat ảnh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành

săc tố đo ở mô seo

Điêu kiện nuôi cấy Chiếu sang 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn

Nghiệm thức E1 E2

Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhân tỷ lệ hình thành săc tố đo ơ mô se o sau 21 ngày

nuôi cây.

Số mô seo hình thành săc tố đo

Tỷ lệ mô seo hình thành săc tố đo (%) = x 100



Cac mô seo đƣơc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung hormone NAA và 2,4-D

ở nồng độ kết hơp tối ƣu (Thí nghiệm 3) trong hai điêu kiện u tối hoàn toàn và chiếu

sang 16 giờ/ ngày.

38

3.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl

3.2.1. Vật liệu

Nguồn mẫu

- Cây D. burmanni Vahl in vitro.

Hóa chất

- Silica gel (Merck)

- Benzene (Trung Quốc)

- Chloroform (Trung Quốc)

- Ether dầu hoa (Trung Quốc)

- Diethyl ether (Trung Quốc)

- Methanol (Trung Quốc)

- Thuốc thư Borntraeger ( KOH 5% trong methanol).

Trang thiết bị và dụng cụ

- Thiêt bi: may cô quay chân không , tu hut hoa chất, tu sấy, côt săc ky, săc

ký bản mong (Merck) …

- Dung cu: giấy loc, ống vi quản, chai bi, đũa thuy tinh, bao tay, khẩu trang,..

39

3.2.2. Phƣơng pháp tiến hành

Hơp chất anthraquinone đƣơc ly trích và cô lâp theo quy trình cua Hồ Thi

Bích Tuyên (2006) [3].

Sơ đô 3.1: Quy trình ly trich va cô lâp hơp chât anthraquin one.

Hơp chât anthraquinone sau khi ly trich va tinh chê đƣơc sƣ dung lam chât

tham chiêu trong cac thi nghiêm đinh lƣơng băng HPLC .

Cây tƣơi

Cây khô

Bột cây

Cao thô ethanol

Sấy ở 500C

Nghiên

Ngâm dầm trong ethanol ít nhất 24 giờ,

Loc, cô quay chân không.

Săc ký nhanh cột khô vơi đơn dung

môi benzene

Săc ký cột ƣơt

vơi hệ dung môi

ether dầu hoa:chloroform (95:5)

Phân đoan cao benzene

Phân đoan chứa hơp chất

anthraquinone

Săc ký bản mong điêu chế nhiêu lân

Hệ dung môi benzene:chloroform (3:7)

Hơp chất anthraquinone

tinh khiết tƣơng đối

40

3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in

vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC

3.3.1. Vât liêu

Nguôn mâu

- Cây D. burmanni Vahl cac loai.

- Dich huyên phu cây D. burmanni Vahl tao đƣơc từ thí nghiệm 4.

Hóa chất

- Methanol (Prolabo)

- Acid acetic (Merck)

- Triethylamine (Merck)

- Anthraquinone (đa đƣơc ly trích va tinh chê trong phần 3.2.)

Trang thiêt bi va dung cu

- Thiêt bi : may săc ký long cao ap (HPLC), may đanh song siêu âm, may

nghiên mẫu khô, tu sấy, may ly tâm , cân phân tich,…

- Dung cu: giấy loc, đầu loc 0,2 m, cối sứ, bao tay, khẩu trang,…

3.3.2. Phƣơng phap

So sanh trưc tiếp diện tích peak cua mẫu thư vơi diện tích peak cua mẫu

anthraquinone tham chiếu tƣơng ứng co nồng độ xac đinh. Yêu cầu cua phƣơng

phap này là việc tiến hành săc ký HPLC mẫu tham chiếu và mẫu thư phải tiến hành

trong cung điêu kiện săc ký và vê nguyên tăc thời gian thưc hiện hai mẫu không

cach xa nhau.

3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp

Dưa trên cac thông số , điêu kiện mà Qua ch Ngô Diễm Phƣơng (2006) [12]

đã sư dung đê khảo sat hàm lƣơng plumbagin trong cây D. indica L bằng HPLC,

chung tôi đã chon cac điêu kiện thông số thích hơp đê chay HPLC nhƣ sau:

- Cột C18 ODS-Hypersil (25 cm x 4 mm).

- Pha động: 55% methanol, 45% acid acetic (0,02 M) đƣơc điêu chỉnh đến

pH 6 bằng triethylamine [17].

- Tốc độ dòng 0,4 ml/l.

41

- Nhiệt độ cột bằng nhiệt độ phòng.

- Detector phat hiện ở bƣơc song ở 254 nm.

3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn

Cân chính xac khối lƣơng anthraquinone và pha loãng trong methanol tuyệt

đối thành cac nồng độ sau 14 ppm, 28 ppm, 42 ppm, 56 ppm, 70 ppm. Tiến hành

săc ký đê thu đƣơc cac peak chuẩn ở cac nồng độ trên. Xây dưng đƣờng chuẩn

tuyến tính biêu hiện sư biến thiên cua nồng độ anthraquinone theo diện tích peak.

3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định

lƣợng hợp chất anthraquinone

Mục đích

- Tìm cach xư lý mẫu thích hơp cho qui trình chay HPLC.


- Hai mẫu đƣơc xư lý theo hai cach A và B (Sơ đồ 3.2) đƣơc đem đinh lƣơng

bằng HPLC.


- Theo dõi khả năng tao tín hiệu trong săc ký đồ cua 2 mẫu đƣơc xư lý theo

quy trình A và B.


- Cây D. Burmanni Vahl in vitro đƣơc chia thành hai nhom.

- Một nhom đƣơc xư lý theo quy trình A, một nhom xư lý theo qui trình B

trƣơc khi chay HPLC (Sơ đồ 3.2).

42

u

Sơ đồ 3.2. Quy trình xư lý mẫu [32].

43

3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các

bộ phận khác nhau của cây in vitro

Mục đích

- Xac đinh bộ phân cho lƣơng anthraquinone nhiêu nhất.


Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong

cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro


- Ghi nhân săc ky đô và so sanh hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong

lƣơng khô) trong mẫu thân la và mẫu rễ, theo công thƣc:

m1

Hàm lƣơng anthraquinone (%) = x 100

m2

Vơi:

m1: trong lƣơng hơp chất anthraquinone trong dung dich mẫu đem đo (mg).

m2: trong lƣơng khô mẫu đem đo (mg).


- Cây in vitro đƣơc chia thành hai phần: phần thân la và phần rễ.

- Cây tƣơi môi loai đƣơc xư lý theo quy trình thích hơp tìm đƣơc từ thí

nghiệm 6.

- Tiến hành đinh lƣơng bằng HPLC.

Mẫu đinh lƣơng Mẫu thân la Mẫu rễ

Nghiêm thƣc X1 X2

44

3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các

mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ

Mục đích

- Bƣơc đầu tìm hiêu mối liên hệ giữa săc tố đo cua cây và hàm lƣơng hơp

chất quinone.


Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong mẫu cây

co săc tố đo và không co săc tố đo

Mẫu phân tích Mẫu co săc tố đo Mẫu không co săc tố đo

Nghiêm thƣc Y1 Y2


- Ghi nhân săc ký đồ và so sanh diện tích peak, hàm lƣơng anthraquinone cua

hai mẫu cây co và không co săc tố đo.


- Cây D. burmanni đƣơc chia làm 2 loai: loai co săc tố đo và không co săc tố

đo.

- Cây tƣơi môi loai đƣơc xư lý theo quy trình xư lý mẫu thích hơp tìm đƣơc

từ thí nghiệm 6.

- Tiến hành đinh lƣơng bằng HPLC

45

3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch

huyền phu đã tao đƣợc từ thí nghiệm 4

Mục đích.

- Đinh lƣơng sơ bộ anthraquinone trong mẫu dich huyên phu.

Cách xử lý mẫu

Sơ đồ 3.3: Quy trình xư lý dich huyên phu.

3.4. Xử lý thống kê

Số liệu thu đƣơc từ tất cả cac thí nghiệm đƣơc xư lý thống kê bằng phần

mêm Stagraphic 7.0.

Dich huyên phu

Sinh khối tế bào

và mô seo

Dich môi trƣờng

Xac tế bào và

mô seo Dich chiết

Đinh lƣơng bằng

HPLC

Loc qua đầu loc

0,2 m

Đinh lƣơng bằng

HPLC

Loc qua đầu loc

0,2 m

Đanh song siêu âm

30 phut

Nghiên trong

methanol tuyệt đối

3 lần

Ly tâm

46

Chƣơng 4

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

4.

4.1. Nuôi cấy mô sẹo tao dịch huyền phu

4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng

độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng

Tỷ lệ sống cua cac mẫu lơp mong từ cây D. burmanni trên cac môi trƣờng

khac nhau sau 14 ngày nuôi cấy đƣơc ghi nhân ở bảng 4.1, và biêu đồ 4.1.

Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu sống ở cac nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy

Loai môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l)

5 10 20 30

MS 16,67 11,67 11,67 10

MS 1/2 8,33 18,33 11,67 18,33

Gamborg’s B5 13,33 20 36,67 13,33

Kêt qua trich tư phu luc 2.1

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu lơp mong sống trên cac loai môi

trƣờng khac nhau sau 14 ngày nuôi cấy.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12

Nghiêm thưc

Ty lê

mâ

u s

ôn

g (

%)

47

Nhận xét

Từ kết quả ở bảng 4.1, chung tôi tiến hành phân tích thống kê cho từng yếu

tố nhƣ sau:

Về thành phần khoáng

Thống kê bảng 4.2 cho thấy co sư khac biệt co ý nghĩa giữa việc sư dung môi

trƣờng Gamborg’s B5 vơi 2 loai môi trƣờng MS và MS 1/2. Môi trƣờng Gamborg’s

B5 cho tỷ lệ mẫu sống trung bình cao nhất (20,83%) và thấp nhất là môi trƣờng MS,

vơi tỷ lệ mẫu sống trung bình là 12,5%. Kết quả này cũng phu hơp vơi một số

nghiên cứu trên thế giơi chon môi trƣờng Gamborg’s B5 là môi trƣờng cơ bản đê

tao mô seo ở một số loài Drosera [12], [23].

Bảng 4.2: Anh hƣởng thành phần khoang lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong

Loai môi trƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng

MS

MS 1/2

Gamborg’s B5

1, 2, 3, 4

5, 6, 7, 8

9,10,11, 12

12,50 a

14,17a

20,83 b

Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống

nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).

Về nồng độ đƣờng

Qua bảng 4.3, chung tôi nhân thấy ở nồng độ đƣờng 20 g/l mẫu lơp mong

sống và phat triên đƣơc (20% mẫu sống) trong khi ở nồng độ đƣờng qua cao và qua

thấp mẫu mô đêu chết. Một đặc điêm thƣờng gặp ở phƣơng phap lơp mong tế bào là

mẫu mô kha nhay cảm vơi ap suất thẩm thấu. Ghi nhân thưc tế cho thấy, khi sư

dung nồng độ đƣờng cao cac mẫu mô sẽ bi chết đen và co xu hƣơng hơi co lai do

mất nƣơc.

Bên canh đo, kết quả bảng 4.1 và biêu đồ 4.1 cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sống

thấp nhất ở nghiệm thức A5 (8,33%) (khi kết hơp sư dung loai môi trƣờng MS 1/2

vơi nồng độ đƣờng 5 g/l); trong khi tỷ lệ mẫu sống cao nhất ở nghiệm thức A11

(36,67 %) (Môi trƣờng Gamborg’s B5 vơi nồng độ đƣờng 20 g/l).

48

Bảng 4.3: Anh hƣởng cua nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong

Nồng đồ đƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng

5

10

20

30

1, 5, 9

2, 6, 10

3, 7, 11

4, 8, 12

12,78 a

16,67 b

20,00 c

13,89 ab

Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau

không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).

Nhƣ vây khi kết hơp cả hai yếu tố ảnh hƣởng đến mẫu mô chung tôi chon

đƣơc môi trƣờng tốt nhất cho mẫu cấy lơp mong cây băt ruồi là môi trƣờng

Gamborg’s B5 vơi nồng độ đƣờng 20 g/l.

4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loai hormone thích hợp cho việc

kích ứng tao mô sẹo

Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả sư hình thành mô seo từ lơp mong tế bào cây D.

burmanni vahl trên môi trƣờng co nồng độ đƣờng và thành phần khoang chon từ thí

nghiệm 1, bổ sung cac loai hormone khac nhau đƣơc ghi nhân và trình bày trong

bảng 4.4.

Bảng 4.4: Tỷ lệ tao mô seo trên môi trƣờng co kết hơp 2 loai hormone khac nhau

Cac loai hormone

kết hơp (mg/l)

NAA (0,2)

2,4-D (0,1)

NAA (0,5)

IBA (1)

NAA (1)

BA (0,2)

Tỷ lệ mẫu tao seo 25,17 c 2,93

b 0

a

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về

mặt thống kê (p < 0,05).

Nhận xét

Kết quả từ bảng 4.4 cho thấy co sư khac biệt rất co ý nghĩa vê mặt thống kê

giữa cac nghiệm thức sư dung hormone NAA/2,4-D; NAA/IBA; NAA/BA. Trong

đo sư kết hơp 2 loai NAA/BA cho kết quả thấp nhất (không co sư tao thành mô seo

mà chỉ co sư hình thành chồi trưc tiếp từ cac mẫu thân) và sư kết hơp 2 loai

hormone NAA/2,4-D cho kết quả tao mô seo tốt nhất (25,56%).

49

Sư kết hơp cung luc 2 loai auxin đê tao mô seo ở một số loài Drosera đã

đƣơc ghi nhân trong một số nghiên cứu cả trong và ngoài nƣơc [12], [23], [28].

Thông thƣờng mô seo đƣơc tao thành khi co sư tac động đồng thời cua cả 2 loai

hormone auxin và cytokinin, trong đo hàm lƣơng auxin nhiêu hơn. Tuy nhiên ở một

số đối tƣơng, lƣơng auxin nội sinh thấp, mẫu mô cần lƣơng lơn hơn auxin đê cảm

ứng hình thành mô seo.

Tổng hơp cac ghi nhân và phân tích, chung tôi chon sư kết hơp 2 loai

hormone NAA/2,4-D cho việc cảm ứng hình thành mô seo từ lơp mong cac bộ phân

cây D. burmanni Vahl.

4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp của 2,4-D khi kết hợp với

NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tao mô sẹo

Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu tao seo trên cac môi trƣờng khac nhau sau 21 ngày nuôi cấy

Loai vât

liệu đầu

Nghiệm

thức

Nồng độ

2,4-D

(mg/l)

Tỷ lệ

mẫu tao

seo

Hình thai mô seo

Phát

hoa

C1 0 5,53 Mô seo hơi phình, đặc.

(Hình 4.1A)

C2 0,1 22,23 Mô seo xôp, đo, ít.

(Hình 4.1B)

C3 0,2 52,77 Mô sẹo xôp, vàng xanh, phình

to (Hình 4.1C).

C4 0,3 36,10 Mô seo xôp, vàng xanh.

C5 0,4 19,47 Mô seo hơi chai.

C6 0,5 22,23 Mô seo chai cứng (Hình 4.1D).

Thân

C1’ 0 0 Mẫu cấy hoa nâu.

C2’ 0,1 38,90 Mô seo vàng xanh, phần mẫu

cảm ứng ít (Hình 4.2A).

50

C3’ 0,2 72,23

Mô sẹo xôp , vàng trăng có ít

đốm đỏ, phình to (Hình 4.2 B,

E).

C4’ 0,3 55,53 Mô seo xôp, vàng xanh vài mẫu

co đốm đo

C5’ 0,4 50 Mô seo vàng trăng, co đốm đo

hơi đặc . (Hình 4.2C).

C6’ 0,5 22,23 Mô seo vàng xanh, hơi chai cứng

(Hình 4.2D).

Lá

C1” 0 8,30 Mô seo đo, phần mâu cam ƣng it

(Hình 4.1E)

C2” 0,1 16,70 Mô seo xôp, màu vàng xanh

nhƣng ít.

C3” 0,2 27,77 Mô sẹo xôp, màu vàng xanh,

phình to (Hình 4.1F).

C4” 0,3 22,23 Mô seo đăc, màu vàng xanh xen

đôm đo (Hình 4.1G)

C5” 0,4 13,90 Mô seo vàng xanh co đốm đo ,

hơi chai cứng.

C6” 0,5 13,90 Mô seo đo, chai cứng.

(Hình 4.1H)

Kêt quả được trich từ phu luc 2.3

Nhận xét

Kết quả bảng 4.5 cho thấy, đối vơi cả 3 loai vât liệu đầu tỷ lệ mẫu tao mô seo

đêu thấp nhất ở nghiệm thức co môi trƣờng chỉ bổ sung NAA (0,2 mg/l). Trong khi

ở nghiệm thức bổ sung NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l) tỷ lệ tao seo lơn nhất ở cả

3 loai mẫu: 52,77% ở mẫu phat hoa TCL, 72,23% ở mẫu thân TCL, 27,77% ở mẫu

la TCL.

51

Cac auxin đƣơc biết đến là co khả năng kích thích manh sư phân chia tế bào,

nên chung thƣờng đƣơc sư dung nhƣ loai hormone sơ cấp đê sản xuất mô seo. Cac

auxin thông dung hiện nay bao gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D co mức độ ảnh hƣởng

tăng dần, trong đo 2,4-D là chất sư sung hiệu quả nhất trong trong việc hình thành

mô seo [16]. Cac kết quả thưc nghiệm cũng cho thấy 2,4-D thƣờng cảm ứng tao mô

seo xốp hơn là NAA. Điêu này co lẽ là do 2,4-D cảm ứng sư phân chia tế bào manh,

cac tế bào phân chia liên tuc trong thời gian ngăn không kip đê tổng hơp vât chất

nên no thƣờng long lẻo. Vì muc đích thí nghiệm là tao mô seo đê nuôi dich huyên

phu vê sau (cần mô seo xốp) và do không đu thời gian đê dò nồng độ cua cả hai loai

hormone, chung tôi chon 2,4-D là loai hormone chính đê tao mô seo.

Bên canh đo bảng kết quả 4.5 cũng cho thấy, cac mẫu lơp mong từ long thân

cho tỷ lệ tao seo lơn nhất trong khi cac mẫu la thấp nhất. Kết quả này co lẽ là do đặc

điêm hình thai cua cây D. burmanni Vahl: bê mặt la cua chung mang nhiêu tua cuốn

khiến chung kho tiếp xuc vơi môi trƣờng; cac tua cuốn này lai chứa chất nhầy và

nhiêu loai enzyme thƣờng gây ảnh hƣởng không tốt đến cac mẫu mô.

Vơi những nhân xét trên, chung tôi chon nồng độ kết hơp tối ƣu cho việc tao

mô seo là NAA 0,2 mg/l và 2,4-D 0,2 mg/l cho moi loai vât liệu đầu từ lơp mong

cây D. burmanni Vahl.

52

Phat hoa TCL

A: 2,4-D (0 mg/l)

B: 2,4-D (0,1 mg/l)

C: 2,4-D (0,2 mg/l)

D: 2,4-D (0,5 mg/l)

La TCL

E: 2,4-D (0 mg/l)

F: 2,4-D (0,2 mg/l)

G: 2,4-D (0,3 mg/l)

H: 2,4-D (0,5 mg/l)

Hình 4.1: Mô seo đƣơc hình thành từ mẫu lơp mong cây

D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ

sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi:

53

Hình 4.2: Mô seo đƣơc hình

thành từ mẫu lơp mong long thân

cây D. burmanni Vahl trên môi

trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung

NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng

độ thay đổi:

A: 0,1 mg/l

B: 0,2 mg/l

C: 0,4 mg/l

D: 0,5 mg/l

E: 0,2 mg/l (quan sat dƣơi

KHV 10 X)

54

4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng

sinh khối mô sẹo và tao dịch huyền phu

Bảng 4.6: Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg mô seo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy

trên cac kiêu nuôi cấy khac nhau

Kiêu nuôi cấy Răn Ban răn Long tĩnh Long lăc

Độ tăng khối lƣơng

mô seo (mg) 2,01

a 2,35

b 1,97

a 2,91

c

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự

khác biệt về mặt thống kê (p > 0.05)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

D1 D2 D3 D4

Kiêu nuôi cây

Đô

tăn

g k

hô

i lư

ơn

g m

ô s

eo

(m

g)

Nhận xét

Bảng 4.6 và biêu đồ 4.2 cho thấy co sư khac biệt rất co ý nghĩa vê mặt thống

kê ở độ tăng khối lƣơng mô seo trên 4 kiêu nuôi cấy khac nhau. Độ tăng khối lƣơng

mô seo ở kiêu nuôi cấy long lăc là tốt nhất 291% khối lƣơng ban đầu, kế đến là

kiêu nuôi cấy ban răn 235%, môi trƣờng răn 201%, cuối cung là môi trƣờng long

tĩnh 197%.

Biểu đồ 4.2: Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21

ngày nuôi cấy.

55

Hình 4.3. A: Mô seo nuôi trong môi trƣờng long lăc.

B: Cum tế bào quan sat dƣơi kính hiên vi 40X.

C: Tế bào đơn quan sat dƣơi kính hiên vi 40X.

Nhƣ vây, ở cac môi trƣờng dang long mô seo dễ hấp thu chất dinh dƣơng

hơn môi trƣờng dang răn. Tuy nhiên môi trƣờng ở dang long tĩnh do cac mẫu mô

seo hoàn toàn ngâp trong dich môi trƣờng, thiếu oxi nên sau một thời gian chung

ngừng tăng trƣởng và co dấu hiệu bi hoa đen. Trai lai, ở kiêu nuôi cấy long lăc, mô

seo vừa hấp thu chất dinh dƣơng dễ dàng vừa co sư trao đổi khí tốt hơn nên trong

lƣơng mô seo tăng lơn nhất.

Bên canh đo, nhân thấy rằng khi mô seo đƣơc nuôi cấy trong môi trƣờng

long mà co thêm chuyên động lăc liên tuc, cac mô seo xốp sẽ bi tach rời, tao cac

cum tế bào và tế bào đơn trong dich nuôi cấy. Đây chính là dang khởi đầu cua dich

huyên phu tế bào (Hình 4.3). Tuy nhiên do giơi han vê thời gian thưc hiện chung tôi

chƣa nghiên cứu đƣơc những yếu tố khac đê tối ƣu hoa dich huyên phu này mà mơi

chỉ ở bƣơc đầu tao đƣơc dich huyên phu.

Tom lai qua thí nghiệm trên chung tôi chon kiêu nuôi cấy long lăc là kiêu

nuôi cấy tốt nhất đê tăng sinh khối mô seo cũng nhƣ tao dich huyên phu tế bào.

.

A

C B

56

4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hinh thành

săc tô đo của mô sẹo

Bảng 4.7: Kết quả ảnh hƣởng anh sang lên sư hình thành săc tố đo ở mô seo

Điêu kiện nuôi cấy Chiếu sang 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn

Tỷ lệ mẫu mô seo co săc tố đo 100 a 0

b

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về

mặt thống kê (p < 0.05).

Nhận xét

Kết quả ở bảng 4.7 và hình 4.4 cho thấy 100% cac mẫu mô seo đƣơc nuôi

trong điêu kiện chiếu sang đêu co săc tố đo trong khi nuôi hoàn toàn trong tối thì

không thấy co sư hình thành săc tố đo.

Kết quả này bƣơc đầu cho thấy mối liên hệ giữa anh sang vơi săc tố đo ở cây

băt ruồi và giải thích đƣơc một phần lý do ngoài tư nhiên cây D. burmanni thƣờng

co màu đo hơn so vơi cây nuôi cấy mô.

Cac loai săc tố ở thưc vât ngày càng đƣơc sư dung rộng rãi trong nhiêu lĩnh

vưc nhƣ công nghiệp nhuộm, màu thưc phẩm và cả dƣơc phẩm. Do vây, việc tìm ra

điêu kiện hình thành săc tố đo trên mô seo cây băt ruồi sẽ là tiên đê cho những

nghiên cứu sau trong việc điêu khiên săc tố đo ở cây băt ruồi vơi nhiêu ứng dung

hữu ích.

57

Hình 4.4: Anh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành săc tố đo

cua mô seo cây D. burmanni.

A, C, E: Mô seo đƣơc nuôi trong điêu kiện chiếu sang 16 giờ/ngày.

B, D, F: Mô seo nuôi trong điêu kiện u tối hoàn toàn.

A B

C D

E F

B

B

58

Săc ký cột ƣơt

Hệ dung môi

ether dầu hoa:chloroform (95:5)

4.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl

Sơ đô 4.1: Quy trinh ly trích và cô lâp hơp chất anthraquinone.

Thuốc thư

Borntraeger

Săc ký cột khô vơi

dung môi benzene

Đinh tính anthraquinone trong cac

phân đoan bằng săc ký bản mong

-Sấy ở 500C, xay thành bột min

-Ngầm dầm trong ethanol

-Cô quay

Cây D. burmanni

in vitro

Cao thô ethanol

Phân đoan

cao benzene

Săc ký điêu chế nhiêu lân

vơi hệ dung môi

benzene:chloroform (3:7)

Hơp chất anthraquinone

59

Hơp chất anthraquinone sau khi đƣơc cô lâp từ sơ đô 4.1, sẽ đƣơc sư dung

nhƣ chất tham chiếu cho cac thí nghiệm đinh lƣơng bằng HPLC vê sau, vơi độ tinh

khiết ƣơc tính đat khoảng 70%.

4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro

khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC

4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn

Bảng 4.8: Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak

Nồng độ chất tham chiếu

(ppm)

Diện tích peak

(mAU*S)

14 67,75

28 140,87

42 218,84

56 294,46

70 361,14

Kêt qua đươc trich từ phu luc 3

Đồ thị 4.1: Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone

tham chiếu và gia tri diện tích peak.

y = 5.2884x - 5.5029

R2 = 0.9994

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 20 40 60 80

Nồng độ (ppm)

Diệ

n t

ích

pea

k (

mA

U*

S)

60

Hình 4.9: Săc ký đồ HPLC cua

anthraquinone tham chiếu ở 70 ppm.


anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm

.ppm

Hình Error! No text of specified style in

document..1. Sắc ký đồ HPLC của




ppm






pm






pm




61

Đƣờng chuẩn đƣơc xây dưng co hệ số tƣơng quan giữa nồng độ chất tham

chiếu và diện tích peak là R2 ~ 1. Đây là một gia tri đang tin cây đê khẳng đinh rằng

nồng độ anthraquinone trong một mẫu chất co mối quan hệ tuyến tính vơi gia tri

diện tích peak trong điêu kiện chay HPLC nhất đinh. Mối quan hệ này đƣơc thê

hiện bằng phƣơng trình y = 5,2884x – 5,5029. Do đo đƣờng chuẩn này đƣơc sư

dung đê tính hàm lƣơng anthraquinone trong cac mẫu cần phân tích ở cac thí

nghiệm sau.

4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơng

hợp chất anthraquinone

Hình 4.10: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo quy trình A.

Hình 4.11: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo quy trình B.

anthraquinone

62

Qua ghi nhân săc ký đồ (Hình 4.10, 4.11) cua hai mẫu cây đƣơc x ư lý theo 2

cach A, B (Sơ đồ 3.2) chung tôi rut ra cac nhân xét sau:

Cac mẫu cây qua giai đoan sấy khô trƣơc khi xư lý mẫu sẽ cho cac tín hiệu

kết quả HPLC rõ ràng hơn cac mẫu cây tƣơi: ở cac mẫu cây tƣơi co xuất hiện tƣơng

peak đôi trong khi cac mẫu khô thì không. Nguyên nhân cua hiện tƣơng này là do

cac chất nhơt trong mẫu tƣơi tao độ nhơt cao cho dung dich săc ký. Độ nhơt này ảnh

hƣởng đến tốc độ ly giải cua cột cũng nhƣ độ hấp thu cua mẫu phân tích. Ở cac mẫu

khô giai đoan sấy đã làm mất đi phần lơn chất nhơt trong cây nên kết quả ghi nhân

cải thiện đang kê.

Do giơi han đê tài chƣa đu thời gian đê tối ƣu hơn nữa quy trình xư lý mẫu

nhằm loai bơt cac chất không quan tâm trong mẫu đinh lƣơng, kết quả săc ký đồ

còn lẫn nhiêu tap chất. Tuy nhiên, quy trình xư lý mẫu B sẽ làm tiên đê đê co thê

nghiên cứu hơn nữa cach loai tap sau này.

4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ

phận khác nhau của cây in vitro

Bảng 4.9: Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac bộ phân khac nhau

cua cây in vitro

Mẫu phân tích Mẫu thân la Mẫu rễ

Trong lƣơng khô (mg) 300 300

Thê tích dung dich phân tích (ml) 60 70

Y= gia tri diện tích peak (mAU*S) 728,70 682,27

X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 138,83 130,05

Hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong lƣơng khô) 2,78 3,03

63

Hình 4.12: Săc ký đồ HPLC cua mẫu rễ cây D. burmanni Vahl.

Hình 4.13: Săc ký đồ HPLC cua mẫu thân la cây D. burmanni Vahl.

Kêt qua ơ bang 4.9 và săc ký đồ hì nh 4.12, 4.13 cho thây hơp chât

anthraquinone hiên diên trong tât ca cac bô phân cua cây D. burmanni vơi ham

lƣơng tƣơng ứng là 2,78% (so vơi trong lƣơng khô ) ở mẫu thân la và 3,03% ở mẫu

rê. So sanh vơi nhƣng công bô trƣơc đây vê ham lƣơng cac hơp chât quinone ơ môt

sô loai Drosera thì hàm lƣơng này kha cao : theo Repcak và Galambosi (1994) [27],

hàm lƣơng 7-methyljuglone trong cây D. rotundifolia là 2,7% trong lƣơng khô và

trong cây D. anglica là 2,1%; Krenn (1995) [21] cũng cho biết hàm lƣơng

plumbagin trong 2 mẫu D. peltata là 0,569% và 0,305% so vơi trong lƣơng khô;

anthraquinone

anthraquinone

64

hàm lƣơng plumbagin trong 11 mẫu D. madagascariensis dao động trong khoảng

0,002 - 0,01% so vơi trong lƣơng cây khô.

Tom la i, kêt qua nay cho thây tiêm năng rât cao cua viêc nuôi cây in vitro

cây D. burmanni Vahl trong thu nhân hơp chât quinone.

Bên canh đo , bảng 4.9 cũng cho thấy hàm lƣơng anthraquinone trong rễ lơn

hơn trong thân la . Kêt qua nay đa mơ ra môt hƣơng nghiên cƣu co nhiêu tiêm năng

trong thu nhân hơp chât thƣ câp : nuôi cây rê . Ky thuât nuôi cấy rễ t hƣc vât , nhăm

thu nhân cac hơp chât co nhiêu trong rê , đa đƣơc ap dung kha thanh công trên thê

giơi, chăng han nhƣ năm 2001, Verma va ctv đa sƣ dung Agrobacterium rhizogenes

đê kích thích tao rễ khi nuôi cấy Plumbago zeylanica giup thu đƣơc hàm lƣơng

plumbagin cao gâp 2,5 lân so vơi khi nuôi cây ơ điêu kiên binh thƣơng [30].

4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các

mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ

Bảng 4.10: Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac mâu co va không

co săc tố đo

Mẫu phân tích Mẫu co săc tố

đo

Mẫu không co

săc tố đo

Trong lƣơng khô (mg) 300 300


Y= gia tri diện tích peak (mAU*S) 201,13 734,68

X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 39,07 139,96

Hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong lƣơng

khô)

0,78 2,80

65

Hình 4.14: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl co săc tố đo.

Hình 4.15: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl không co săc tố đo.

Bảng 4.10 và hình 4.14, 4.15 cho thấy, hàm lƣơng anthraquinone trong cac

mẫu cây co săc tố đo chỉ chiêm 0,78% so vơi trong lƣơng khô, trong khi ở cây

không co săc tố đo là 2,8%. Kết quả này cũng trung hơp vơi công bố cua Repcak và

Galambosi (1994) trên cây D. rotundifolia và D. anglica: ở những ca thê co nhiêu

săc tố đo hàm lƣơng cac quinone sẽ rất thấp [29]. Do vây nêu đƣơc nghiên cƣu tiêp

vê muc tiêu thu nhân hơp chât anthraquinone , chung ta nên tiến hành khảo sat điêu

khiên viêc ƣc chê tao săc tô đo trong cây.

anthraquinone

anthraquinone

66

4.3.5. Thí nghiệm 9: Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch

huyền phu đã tao đƣợc từ thí nghiệm 4

Bảng 4.11: Kêt qua đinh lƣơng anthraquinnone trong mẫu dich huyên phu

Mẫu phân tích Dich môi trƣờng Sinh khối tế bào

Trong lƣơng tƣơi (mg) 22.000 600


Y= gia tri diện tích peak (mAU*S) 0 21,70

X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 0 5,14

Hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong

lƣơng tƣơi)

0 0,02

Hình 4.16: Săc ký đồ HPLC cua mẫu dich môi trƣờng sau khi loc sinh khối tế bào.

Hình 4.17: Săc ký đồ HPLC cua sinh khối tế bào từ dich huyên phu.

anthraquinone

67

Ghi nhân từ bảng 4.11, hình 4.16, 4.17 cho thấy không co sư hiện diện cua

anthraquinone trong dich môi trƣờng mà chỉ co trong sinh khối tế bào, điêu này

chứng to anthraquinone co lẽ là một hơp chất thứ cấp nội bào.

So sanh vơi một số nghiên cứu trên thế giơi vê sản xuất cac hơp chất quinone

bằng nuôi cấy huyên phu tế bào, thì kết quả này kha thấp (chỉ chiêm 0,02% so vơi

trong lƣơng tƣơi) trong khi ở nuôi cấy huyên phu cây D. muscipula sư sản xuất

plumbagin đat 2,59%, và ở cây D. capensis sư sản xuất 7-methyljuglone cũng đat

0,33% [23]. Tuy nhiên , kêt qua nay la do chung ta chƣa ap dung cac điêu kiên tôi

ƣu trong nuôi cây huyên phu nhƣ : anh sang, nhiêt đô, tôc đô lăc, chƣa điêu khiên ƣc

chê hinh thanh săc tô đo,…

68

Chƣơng 5

KÊT LUÂN - ĐỀ NGHỊ

5.

5.1. KẾT LUẬN

Từ cac kết quả thu đƣơc, chung tôi rut ra một số kết luân sau:

5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tao dịch huyền phu

Môi trƣờng cơ bản thích hơp nhất đê tao mô seo từ mẫu căt lơp mong là môi

trƣờng khoang Gamborg’s B5 và nồng độ đƣờng là 20 g/l.

Sư kết hơp hai loai hormone NAA và 2,4-D sẽ thích hơp nhất đê cảm ứng tao

mô seo. Vơi nồng độ kết hơp tối ƣu là NAA (0,2 mg/l )/2,4-D (0,2 mg/l).

Cac mô seo xốp khi đƣơc nuôi trong môi trƣờng ở dang long kết hơp chuyên

động lăc liên tuc (long lăc) sẽ tao dich huyên phu tế bào, đồng thời là kiêu nuôi cấy

làm tăng sinh khối mô seo nhanh nhất.

Khi nuôi trong điêu kiện chiếu sang 16 giờ/ngày, cac mô seo đêu hoa đo.

5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC

Mẫu đinh lƣơng cho kết quả HPLC vơi cac tín hiệu tốt hơn nếu đƣơc sấy khô

khi xư lý.

Hàm lƣơng anthraquinone trong rễ là 3,03%, lơn hơn trong thân la: 2,78 %

so vơi trong lƣơng khô.

Hàm lƣơng anthraquinone trong cây co săc tố đo (0,78% so vơi trong lƣơng

khô) ít hơn trong cây không co săc tố đo (2,8%)

Lƣơng anthraquinone đƣơc tao ra bằng nuôi cấy dich huyên phu chiêm 0,02

% so vơi trong lƣơng khô và tâp trung trong sinh khối tế bào, không tiết hoặc tiết rất

ít ra môi trƣờng bên ngoài

69

5.2. ĐỀ NGHỊ

Khảo sat thêm cac điêu kiện điêu khiên việc tao săc tố đo trong nuôi cấy D.

burmanni Vahl.

Cảm ứng tao rễ D. burmanni Vahl nhăm nghiên cƣu tao nguôn nguyên liêu

co hàm lƣơng hơp chất anthraquinone cao .

Tôi ƣu hoa cac điêu kiên nuôi cấy dich huyên phu tế bào đê thu nhân lƣơng

lơn hơn anthraquinone bao gồm cac yếu tố: hormone, anh sang, tốc độ lăc…

Nghiên cƣu tƣ đông hoa nuôi cây sinh khôi tê bao D. burmanni Vahl trong

cac bình nuôi cấy điêu khiên tư động nhƣ bioreactor .

Thư nghiệm cac phƣơng phap tăng sinh hơp chât anthraquinone trong nuôi

cây dich huyên phu , tê bao đơn nhƣ:

- Chon loc dòng tế bào cho năng suất cao.

- Bổ sung tiên chất.

- Sƣ dung cac nhân tô cam ƣng (elicitor).

- Gây đôt biên,…

Tìm cac điêu kiện đê tối ƣu quy trình đinh lƣơng anthraquinone bằng ky

thuât HPLC

70

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

1. Đỗ Đăng Giap , 2003. Khảo sát, sưu tập, thuần dưỡng và thử nghiệm in vitro

trên những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước

Bửu. Khóa luận cử nhân khoa học, Đai học Khoa học Tự nhiên, Đai hoc

Quôc gia TP. Hồ Chí Minh.

2. Đỗ Tất Lợi , 1999. Cây thuôc va vi thuôc Viêt Nam . Nhà xuất bản Y học , TP.

Hô Chi Minh.

3. Hô Thuy Bich Tuyên , 2006. Ly trich va khao sat hoat tinh sinh hoc cua hơp

chât quinone tư cây Drosera burmanni Vahl nuôi cây in vi tro. Khóa luận cử

nhân khoa hoc . Đai hoc Khoa hoc Tƣ nhiên , ĐH Quôc gia TP. Hô Chi

Minh.

4. Lê Trân Đƣc. Cây thuôc Viêt Nam – trông, hái, chê biên, tri bệnh đau đầu.

5. Nguyên Đai Hai , 2006. Nuôi cây mô cây băt ruôi (Drosera burmanni Vahl),

khảo sát hoạt tinh kháng khuân cua hơp chât chiêt thô Plumbagin . Luân văn

tôt nghiêp ky sƣ công nghê sinh hoc, ĐH Nông Lâm, TP. HCM.

6. Nguyên Đƣc Lƣơng , 1998. Công nghê sinh hoc , Đai hoc Ky thuât , TP. Hô

Chí Minh.

7. Nguyên Đƣc Lƣơng , Lê Thi Thuy Tiên , 2002. Công nghê tê bao . Nhà xuất

bản Đai học Quôc gia, TP. Hô Chí Minh. 376 trang.

8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2001. Các phương pháp nhận danh, trich ly và cô

lập các hơp chât hữu cơ. Giáo trình cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ , Đai

học Khoa học Tự nhiên, TP. HCM.

71

9. Nguyễn Thanh Bảo, 2003. Vi khuân học, Bộ Y tế , ĐH Y-Dƣợc TP . Hô Chi

Minh, tr. 40-93.

10. Pham Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Giáo dục , TP. Hô

Chí Minh.

11. Pham Hoàng Hộ, 1994. Cây có vi thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Y học ,

TP. Hô Chi Minh.

12. Quách Ngô Diễm Phƣơng , 2006. Khảo sát hơp chât naphthoquinone có hoạt

tinh sinh học đươc tách chiêt tư cây bắt ruồi Drosera indica L . nuôi cây in

vitro. Luân văn thac sy khoa hoc. Đai hoc Khoa hoc Tƣ nhiên, Đai hoc Quôc

gia TP. Hô Chi Minh.

13. Trân Thi Bich Chiêu , 2004. Khảo sát vong đơi và tái tạo chồi tư phát hoa cây

băt ruôi in vitro (Drosera burmanni Vahl). Khóa luận cử nhân khoa học . Đai

học Khoa học Tự nhiên, TP. Hô Chi Minh.

14. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến, 1978. Phân loại thực vật bậc cao, Nhà xuất

bản Giáo dục, TP. HCM, tr. 342-346.

15. Võ Văn Chi, Trần Hợp, 1999. Cây cỏ có ich ở Việt Nam. Nhà xuất bản Giao

dục, TP. Hô Chi Minh, tr. 342-346.

16. Vu Văn Vụ, 1999. Sinh ly thưc vât ưng dung. Nhà xuất bản Giáo dục.

Tài liệu tiếng Anh:

17. Crouch I. J., Finnie J. F., van Staden J., 1990. Studies on the isolation of

plumbagin from in vivo and in vitro grown Drosera species. Plant Cell Tiss

Org Cult 21: 78-82.

72

18. Dicosmo F., Misawa M., 1985. Elicitation secondary metabolismin plant cell

cultures.Trends Biotechnol 3: 318-322.

19. Dipanjan G., 2003, Project Lifescape – 11: Hunter Plants. Resonance: 64 –

70.

20. George E. F., 1993. Plant propagation on by tissue culture, Biotechnology

exegietics Ltd: 14-25.

21. Harborne J. B., 1967. Comparative biochemistry of flavonoid-IV.

Phytochemistry 6: 1415-1428.

22. Hazra B., Sarma D. M., Sanyal U., 2004. Seperation methods of quinonoid

constituents of plants used in Oriental traditional medicines. Journal of

Chromatography B 812: 259-275.

23. Hook L. I. Ingrid, 2001. Naphthoquinone contents of in vitro cultured

plants and cell suspensions of Dionaea muscipula and Drosera species.

Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67 (3): 281-285.

24. Jayaram K., Prasad M. N. V., 2005. Rapidly in vitro multipled Drosera as

reliable source for plumbagin bioprospection. Current science 89: 447-448.

25. Kawiak A., Krolicka A., LoJkowska E., 2003. Direct regeneration of

Drosera from leaf explants and shoot tips. Plant cell, Tissue and Organ

Culture 75: 211-214.

26. Ketchum R. E. B., Gibson D. M., Croteau R. B., Shuler M. L., 1999. The

kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of Taxus

following elicitation with methyljasmonate. Biotechnology Bioeng 62: 97-

105.

73

27. Kitanov G. M., Pashankov P. P., 1994. Quantitative investigation on the

dynamics of plumbagin in Plumbago europea L. roots and herb by HPLC.

Pharmazie 49 (6): 462.

28. Nahálka J ., Blanárik P ., Geimeiner P ., Matúsová E ., Partlová I ., 1996.

Production of plumbagin by cell suspension cultures of Drosophyllum

lusitanium Link. Journal of Biotechnology 49: 153-161.

29. Samaj J., Blehová A., Repcák M., Ovecka M., and Bobák M., 1999.

Drosera Species (Sundew): In vitro culture and the production of plumbagin

and other secondary metabolites. Biotechnology in Agriculture and Forestry 43:

105-135.

30. Verma P.C., Singh D., Rahman L.u., Gupta M.M., Banerjee S., 2002. In

vitro-studies in Plumbago zeylanica: rapid micropropagation and

establishment of higher plumbagin yielding hairy root cultures. Journal of

Plant Physiology 159: 547-552.

31. Verpoorte R., Van der Heijden R., Hoge J. H. C., and Hoopen H. J. G.,

1994. Plant cell biotechnology for production of secondary metabolites.

Pure & Appl. Chem 66: 2307-2310.

32. Wu-Che Weng and Shuenn-Jyi Sheu, 1999. Separation of Anthraquinones

by Capillary Electrophoresis and High-Performance Liquid

Chromatography. Journal of High Resolution chromatography 23: 134-148.

Tài liệu từ internet:

33. http://www.carnivorousplants.org/ICPS Seed Bank.html.

34. http://sea.unep-wcmc.org/isdp/Taxonomy/tax-species-

result.cfm?Genus=Drosera&Species=burmanni&source=plants&tabname=

all~main

http://www.carnivorousplants.org/ICPS%20Seed%20Bank.html

http://sea.unep-wcmc.org/isdp/Taxonomy/tax-species-result.cfm?Genus=Drosera&Species=burmanni&source=plants&tabname=all~main



74

35. http://dionee.gr.free.fr/bulletin/txt/d_45_d.htm&h=414&w=621&sz=71&tb

nid=6A16urs1FQA_hM:&tbnh=89&tbnw=134&hl=vi&start=10&prev=/im

ages%3Fq%3DDrosera%Burmanni%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%261r

%3D%26sa%3DG

36. http://www.efloras.org./florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=210000486

37. http://www.answers.com/main/ntquery?method=4&dsid=2222&dekey=Sun

dew&gwp=8&curtab=2222_1&linktext=Drosera

38. http://www.thegardenhelper.com/sundew.htm

39. http://www.rdrop.com/contents/descriptions.htm.

40. http://florabase.calm.wa.gov.au/science/timage/3093ic1.jpg&imgrefurl=http

://florabase.calm.wa.gov.au/browse/flora%3Ff%3D143%26level%3Ds%26i

d%3D3093&h=384&w=512&sz=36&hl=vi&start=2&um=1&tbnid=N4xmzI

41. http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch5(3).htm

42. http://www.plantarara.com/carnivoren_galerie/drosera/drosera.htm

43. http://www.uky.edu/~dhild/biochem/26/lect26.html

44. http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/shaker.gif

45. http://www.cf.gu.se/digitalAssets/736125_Bioreactor.jpg

http://dionee.gr.free.fr/bulletin/txt/d_45_d.htm&h=414&w=621&sz=71&tbnid=6A16urs1FQA_hM:&tbnh=89&tbnw=134&hl=vi&start=10&prev=/images%3Fq%3DDrosera%25Burmanni%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%261r%3D%26sa%3DG




http://www.efloras.org./florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=210000486

http://www.answers.com/main/ntquery?method=4&dsid=2222&dekey=Sundew&gwp=8&curtab=2222_1&linktext=Drosera

http://www.answers.com/main/ntquery?method=4&dsid=2222&dekey=Sundew&gwp=8&curtab=2222_1&linktext=Drosera

http://www.thegardenhelper.com/sundew.htm

http://www.rdrop.com/contents/descriptions.htm

http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch5(3).htm

http://www.plantarara.com/carnivoren_galerie/drosera/drosera.htm

http://www.uky.edu/~dhild/biochem/26/lect26.html

http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/shaker.gif

http://www.cf.gu.se/digitalAssets/736125_Bioreactor.jpg

75

46. http://www.waters.com/WatersDivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-

5LTGBH

47. http://www.uni-

regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/

Keusch/D-CC-e.htm

48. http://www.utricularia.de/bilder/drosera/burmanni_DROS63_004.html

http://www.waters.com/WatersDivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH

http://www.waters.com/WatersDivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH

http://www.utricularia.de/bilder/drosera/burmanni_DROS63_004.html

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Thành phần môi trƣờng nuôi cây thƣc vât

Đơn vi: mg/l

Phụ lục 2

Phụ lục 2.1: Thí nghiệm 1

Analysis of Variance for ASTTTHU.KETQUA - Type III Sums of Squares

Thành phần MS

(Murashige and Skoog,

1962)

Gamborg’s B5 (1968)

ĐA LƢỢNG

NH4NO3

(NH4 )2 SO4

KNO3

CaCl2.2H2 O

MgSO4.7H2 O

KH2PO4

NaH2PO4.H2O

VI LƢỢNG

FeSO4.7 H2O

NaEDTA

MnSO4. 4H2O

MnSO.H2O .

ZnSO4.7H2O

H3BO3

KI

Na2MoO4 .2H2O

CuSO4.5H2O

CoCl2.6H2O

VITAMINS

Myo-inositol

Nicotinic acid

Pyridoxine.HCl

Thiamine.HCl

Glycine

1.650

1.900

440

370

170

27,8

37,26

22,3

8,6

6,2

0,83

0,25

0,025

0,025

100

0,5

0,5

0,1

2,0

134

2.500

150

250

130,5

27,8

37,26

10

2,0

3,0

0,75

0,25

0,025

0,025

100

1,0

1,0

10

--------------------------------------------------------------------------------

Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:ASTTTHU.LOAIMOITRU 466.66667 2 233.33333 25.846 .0000

B:ASTTTHU.NONGDODUON 280.55556 3 93.51852 10.359 .0001

INTERACTIONS

AB 1111.1111 6 185.18519 20.513 .0000

RESIDUAL 216.66667 24 9.0277778

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 2075.0000 35

--------------------------------------------------------------------------------

0 missing values have been excluded.

All F-ratios are based on the residual mean square error.

Table of Least Squares Means for ASTTTHU.KETQUA

--------------------------------------------------------------------------------

95% Confidence

Level Count Average Stnd. Error for mean

--------------------------------------------------------------------------------

GRAND MEAN 36 15.833333 .5007710 14.799547 16.867120

A:ASTTTHU.LOAIMOITRU

1 12 12.500000 .8673608 10.709429 14.290571

2 12 14.166667 .8673608 12.376095 15.957238

3 12 20.833333 .8673608 19.042762 22.623905

B:ASTTTHU.NONGDODUON

1 9 12.777778 1.0015420 10.710204 14.845351

2 9 16.666667 1.0015420 14.599093 18.734240

3 9 20.000000 1.0015420 17.932426 22.067574

4 9 13.888889 1.0015420 11.821315 15.956463

AB

1 1 3 16.666667 1.7347217 13.085524 20.247809

1 2 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809

1 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809

1 4 3 10.000000 1.7347217 6.418857 13.581143

2 1 3 8.333333 1.7347217 4.752191 11.914476

2 2 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476

2 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809

2 4 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476

3 1 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476

3 2 3 20.000000 1.7347217 16.418857 23.581143

3 3 3 36.666667 1.7347217 33.085524 40.247809

3 4 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476

-------------------------------------------------------------------------------

Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.NONGDODUON

--------------------------------------------------------------------------------

Method: 95 Percent LSD

Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 9 12.777778 X

4 9 13.888889 XX

2 9 16.666667 X

3 9 20.000000 X

--------------------------------------------------------------------------------

contrast difference +/- limits

1 - 2 -3.88889 2.92399 *

1 - 3 -7.22222 2.92399 *

1 - 4 -1.11111 2.92399

2 - 3 -3.33333 2.92399 *

2 - 4 2.77778 2.92399

3 - 4 6.11111 2.92399 *

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference.

Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.LOAIMOITRU

--------------------------------------------------------------------------------


Level Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 12 12.500000 X

2 12 14.166667 X

3 12 20.833333 X

--------------------------------------------------------------------------------


1 - 2 -1.66667 2.53225

1 - 3 -8.33333 2.53225 *

2 - 3 -6.66667 2.53225 *

--------------------------------------------------------------------------------

* denotes a statistically significant difference.

Phụ lục 2.2: thí nghiệm 2 One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data: LOAIHOR.KETQUA

Level codes: LOAIHOR.LOAIHORMON

Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD

Analysis of variance

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 1136.2867 2 568.14333 504.767 .0000

Within groups 6.7533 6 1.12556

--------------------------------------------------------------------------------

Total (corrected) 1143.0400 8

0 missing value(s) have been excluded.

Table of means for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON

--------------------------------------------------------------------------------

Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD

Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean

--------------------------------------------------------------------------------

1 3 25.166667 .7666667 .6125236 24.106540 26.226793

2 3 2.933333 .7333333 .6125236 1.873207 3.993460

3 3 .000000 .0000000 .6125236 -1.060127 1.060127

--------------------------------------------------------------------------------

Total 9 9.366667 .3536407 .3536407 8.754602 9.978731

Multiple range analysis for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON

--------------------------------------------------------------------------------


Level Count Average Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

3 3 .000000 X

2 3 2.933333 X

1 3 25.166667 X

--------------------------------------------------------------------------------


1 - 2 22.2333 2.12025 *

1 - 3 25.1667 2.12025 *

2 - 3 2.93333 2.12025 *

--------------------------------------------------------------------------------

Muc luc 2.3: Thi nghiêm 3

One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data: PHATHOA.ketqua

Level codes: PHATHOA.nghiemthuc



--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 3922.5044 5 784.50089 22.714 .0000

Within groups 414.4533 12 34.53778

--------------------------------------------------------------------------------


Table of means for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 5.533333 2.7666667 3.3930212 .304514 10.762153

2 3 22.233333 2.7666667 3.3930212 17.004514 27.462153

3 3 52.766667 2.7666667 3.3930212 47.537847 57.995486

4 3 36.100000 2.8000000 3.3930212 30.871181 41.328819

5 3 19.466667 2.7666667 3.3930212 14.237847 24.695486

6 3 22.233333 5.5333333 3.3930212 17.004514 27.462153

--------------------------------------------------------------------------------

Total 18 26.388889 1.3851951 1.3851951 24.254232 28.523545

Multiple range analysis for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 5.533333 X

5 3 19.466667 X

2 3 22.233333 X

6 3 22.233333 X

4 3 36.100000 X

3 3 52.766667 X

--------------------------------------------------------------------------------


1 - 2 -16.7000 10.4576 *

1 - 3 -47.2333 10.4576 *

1 - 4 -30.5667 10.4576 *

1 - 5 -13.9333 10.4576 *

1 - 6 -16.7000 10.4576 *

2 - 3 -30.5333 10.4576 *

2 - 4 -13.8667 10.4576 *

2 - 5 2.76667 10.4576

2 - 6 0.00000 10.4576

3 - 4 16.6667 10.4576 *

3 - 5 33.3000 10.4576 *

3 - 6 30.5333 10.4576 *

4 - 5 16.6333 10.4576 *

4 - 6 13.8667 10.4576 *

5 - 6 -2.76667 10.4576

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

Data: THAN.ketqua

Level codes: THAN.nghiemthuc



--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 9890.8050 5 1978.1610 128.438 .0000

Within groups 184.8200 12 15.4017

--------------------------------------------------------------------------------


0 missing value(s) have been excluded.

Table of means for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 .000000 .0000000 2.2658087 -3.491727 3.491727

2 3 38.900000 2.8000000 2.2658087 35.408273 42.391727

3 3 72.233333 2.7666667 2.2658087 68.741606 75.725060

4 3 55.533333 2.7666667 2.2658087 52.041606 59.025060

5 3 50.000000 .0000000 2.2658087 46.508273 53.491727

6 3 22.233333 2.7666667 2.2658087 18.741606 25.725060

--------------------------------------------------------------------------------

Total 18 39.816667 .9250125 .9250125 38.391175 41.242158

Multiple range analysis for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 .000000 X

6 3 22.233333 X

2 3 38.900000 X

5 3 50.000000 X

4 3 55.533333 X

3 3 72.233333 X

--------------------------------------------------------------------------------


1 - 2 -38.9000 6.98345 *

1 - 3 -72.2333 6.98345 *

1 - 4 -55.5333 6.98345 *

1 - 5 -50.0000 6.98345 *

1 - 6 -22.2333 6.98345 *

2 - 3 -33.3333 6.98345 *

2 - 4 -16.6333 6.98345 *

2 - 5 -11.1000 6.98345 *

2 - 6 16.6667 6.98345 *

3 - 4 16.7000 6.98345 *

3 - 5 22.2333 6.98345 *

3 - 6 50.0000 6.98345 *

4 - 5 5.53333 6.98345

4 - 6 33.3000 6.98345 *

5 - 6 27.7667 6.98345 *

--------------------------------------------------------------------------------

denotes a statistically significant difference.


--------------------------------------------------------------------------------

Data: LA.ketqua

Level codes: LA.nghiem_thu


--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 714.60667 5 142.92133 9.224 .0008

Within groups 185.93333 12 15.49444

--------------------------------------------------------------------------------


Table of means for LA.ketqua by LA.nghiem_thu

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 8.300000 .0000000 2.2726229 4.797772 11.802228

2 3 16.700000 .0000000 2.2726229 13.197772 20.202228

3 3 27.766667 2.7666667 2.2726229 24.264438 31.268895

4 3 22.233333 2.7666667 2.2726229 18.731105 25.735562

5 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228

6 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228

--------------------------------------------------------------------------------

Total 18 17.133333 .9277944 .9277944 15.703555 18.563112

Multiple range analysis for LA.ketqua by LA.nghiem_thu

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 8.300000 X

5 3 13.900000 XX

6 3 13.900000 XX

2 3 16.700000 XX

4 3 22.233333 XX

3 3 27.766667 X

--------------------------------------------------------------------------------


1 - 2 -8.40000 7.00446 *

1 - 3 -19.4667 7.00446 *

1 - 4 -13.9333 7.00446 *

1 - 5 -5.60000 7.00446

1 - 6 -5.60000 7.00446

2 - 3 -11.0667 7.00446 *

2 - 4 -5.53333 7.00446

2 - 5 2.80000 7.00446

2 - 6 2.80000 7.00446

3 - 4 5.53333 7.00446

3 - 5 13.8667 7.00446 *

3 - 6 13.8667 7.00446 *

4 - 5 8.33333 7.00446 *

4 - 6 8.33333 7.00446 *

5 - 6 0.00000 7.00446

--------------------------------------------------------------------------------

Phụ lục 2.4: thí nghiệm 4 One-Way Analysis of Variance

--------------------------------------------------------------------------------

Data: SG4KIEU.ketqua

Level codes: SG4KIEU.nghiemthuc

Labels:



--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

Between groups 1.7196917 3 .5732306 42.858 .0000

Within groups .1070000 8 .0133750

--------------------------------------------------------------------------------


Table of means for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 2.0100000 .0208167 .0667708 1.9010937 2.1189063

2 3 2.3466667 .0676593 .0667708 2.2377604 2.4555729

3 3 1.9666667 .0726483 .0667708 1.8577604 2.0755729

4 3 2.9133333 .0868588 .0667708 2.8044271 3.0222396

--------------------------------------------------------------------------------

Total 12 2.3091667 .0333854 .0333854 2.2547135 2.3636198

Multiple range analysis for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

3 3 1.9666667 X

1 3 2.0100000 X

2 3 2.3466667 X

4 3 2.9133333 X

--------------------------------------------------------------------------------


1 - 2 -0.33667 0.21781 *

1 - 3 0.04333 0.21781

1 - 4 -0.90333 0.21781 *

2 - 3 0.38000 0.21781 *

2 - 4 -0.56667 0.21781 *

3 - 4 -0.94667 0.21781 *

--------------------------------------------------------------------------------


Phụ lục 3

nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù drosera burmanni vahl trong thu nhận anthraoquinone

Documents