nuoi cay mo tv 12347

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347

http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-tv-12347 1/23

Bài 1 �Mở đầu

I. Các thiết bị của phòng thí nghiêm nuôi cấy mô và tế bào thực vât(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu)

1. Phòng rửa và cất nước+ Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ)+ Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ)- Máy sản xuất nước khử ion

2. Phòng sấy hấp+ Tủ sấy 60-300oC �+ Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L)- Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L)

3. Phòng chuẩn bị môi trường+ pHmeter + Máy khuấy từ+ Cân phân tích 10-4g

+ Cân kỹ thuât 10-2g+ Bếp điên- Microwave+ Tủ lạnh 100-200 L-80oC)÷ - Tủ lạnh sâu (-20

4. Phòng cấy vô trùng+ Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench)+ Quạt thông gió+ Đèn tử ngoại treo trần hoăc treo tường (1,2 m)- Thiết bị lọc không khí

5. Phòng ảnh- Máy ảnh kỹ thuật số

- Hệ thống đèn chiếu

6. Phòng kính hiển vi+ Kính hiển vi 2 mắt (đô phóng đại 1000 lần).+ Kính hiển vi đảo ngược (đô phóng đại 1000 lần) có gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số.+ Kính lúp 2 mắt (đô phóng đại 75 lần).- Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học.- Kính hiển vi huỳnh quang

7. Phòng nuôi+ Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có đô chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000lux.+ Máy điều hòa nhiêt đô

- Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút)+ Tủ ấm- Nồi phản ứng sinh học (bioreactor)

8. Phòng sinh hóa+ Máy sắc ký (HPLC, sắc ký côt, sắc ký lớp mỏng...)+ Thiết bị điên di gel (agarose và polyacrylamide)+ Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của DNA, RNA và protein (Gene documentationsystem)+ Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


- Môt số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh hóa của các tế bào và mô nuôi cấy.

II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế bào thực vâtCó 3 nhân tố chính:- Bảo đảm điều kiên vô trùng.- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách.- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.

1. Bảo đảm điều kiên vô trùng1.1. Y nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vâtMôi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vât có chứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thíchhợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc đô phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơnrất nhiều so với các tế bào thực vât, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm môt vài bào tử nấmhoăc vi khuẩn thì sau vài ngày đến môt tuần, toàn bô bề măt môi trường và mô nuôi cấy se phủ đầy môt hoăc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiêm phải bỏ đi vì trong điều kiên này mô nuôicấy se không phát triển và chết dần.Thông thường, môt chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mụcđích nuôi cấy), trong khi thí nghiêm vi sinh vât có thể kết thúc trong môt vài ngày. Nói cách khác,mức đô vô trùng trong thí nghiêm nuôi cấy mô và tế bào thực vât đòi hỏi rất nghiêm khắc, điềukiên này đăc biêt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào đơn thực vât trong các nồi phản ứng sinh

học (bioreactor), điều kiên vô trùng phải rất cao mới có hy vọng thành công được.

1.2. Nguồn nhiễm tạpCó 3 nguồn nhiễm tạp chính:- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đây không được vô trùng tuyêt đối.- Trên bề măt hoăc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoăc vi khuẩn.- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoăc vi khuẩn theo bụi lên bề măt môi trường.

1.3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đây và môi trườnga. Dụng cụ thủy tinhDụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vât phải là loại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.

Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông thường, chỉ cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate môt lần đầu khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy nhiều lần và cuối cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráonước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích) cần được vô trùng khô bằng cách sấyở 60-70oC/2 giờ. Sau khi nguôi được lấy ra cất vào chỗ ít bụi.

b. Nút đâyThường dùng nhất là các nút đây làm bằng bông không thấm nước. Nút phải tương đối chăt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàngtrong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhượcđiểm sau:+ Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoăc dính môi trường thì về sau se bị nhiễm nấm, nhất là ở các thí nghiêm nuôi cấy trong thời gian dài.

+ Thao tác làm nút bông châm, không thuân tiên khi nuôi cấy trên quy mô lớn.+ Chỉ dùng được môt vài lần, sau phải bỏ.Hiên nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đây khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụngcụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiêm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiêt có thể hấpvô trùng ở nhiêt đô 121oC (khoảng 1 atm) mà không bị biến dạng. Môt số phòng thí nghiêm dùngnắp ống nghiêm inox hoăc cao su rất thuân tiên cho viêc vô trùng khô hoăc ướt. Cung có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đây. Trong giáo trình này, chúng tôi sử dụng giấy nhôm làm nút đây.

c. Môi trườngNói chung, môi trường được pha chế và dự trữ trong điều kiên không vô trùng và đem hấp vô

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


trùng khi đã phân phối vào các dụng cụ thủy tinh đã đây nút hoăc nắp. Thời gian hấp từ 15-20phút ở áp suất khoảng 1 atm (121oC). Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiêm hoăcnút bông.Các dung dịch mẹ (stock solutions) dùng để pha chế môi trường (dung dịch muối khoáng,vitamine, chất kích thích sinh trưởng...) cần được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch mẹ của hỗnhợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên phamôt lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường chỉ nên dùng các lọ có dung tíchtừ 100 đến 200 mL.Ơ áp suất khoảng 1 atm hầu hết các vi sinh vât có trong môi trường đều bị diêt, kể cả các vi sinhvât ở dạng bào tử. Thời gian hấp thường từ 15 đến 20 phút ở 1 atm.Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vât phải dùng nước cất hoăc nước khử ion, tốt nhất là dùngnước cất 2 lần từ các máy cất hoàn toàn bằng thủy tinh.

Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế phẩm mẫn cảm với nhiêt, có thể bị phân hủykhi ta hấp ở 121oC. Trường hợp này cần tiến hành lọc vô trùng riêng các chế phẩm đó và sau đóđưa vào môi trường được khử trùng.

d. Lọc vô trùngPhương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore (Hình 1.1) do hãng Millipore sản xuấthoăc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5.

Hình 1.1. Môt số loại màng lọc vô trùng của hãng Millipore (disposable). Đây là loại màng lọc đãđược khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng một lần.Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: Hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đơ bằngnhựa chịu nhiêt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25 mm. Bô lọcgồm có giá đơ bằng loại nhựa chịu nhiêt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đăt màng lọc(có kích thước lỗ 0,25 μm) trên đế, đăt vòng cao su lên và văn chăt nắp vào đế. Gói toàn bô bô lọc vào trong môt tờ giấy nhôm và khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC trong 15-20 phút. Đồngthời vô trùng môt bình thủy tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bô lọc.

1.4. Vô trùng mô nuôi cấyMô nuôi cấy có thể là hầu hết các bô phân khác nhau của thực vât như: hạt giống, phôi, noãnsào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ... Tùy theo sự tiếp xúc với điều kiên môi trường

bên ngoài, các bô phân này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mônuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề măt.Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiên nay là dùng các hóa chất có hoạt tínhdiêt nấm khuẩn. Hiêu lực diêt nấm khuẩn của các chất này phụ thuôc vào thời gian xử lý, nồngđô và khả năng xâm nhâp của chúng vào các ke ngách lồi lõm trên bề măt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề măt mô nuôi cấy.

Để tăng tính linh đông và khả năng xâm nhâp của chất diêt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70% sau đó mới xử lý trong dung dịch diêt khuẩn.Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triêt để và có ảnh hưởng xấungay lên sự sinh trưởng của mô cấy.Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngâp hoàn toàn trong dung dịch diêt khuẩn. Đối với các bô phân thực vât có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy.Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên

mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đăt mô cấy lên môitrường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại môtlớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diêt khuẩn. Lớp cuối cùng này se được cắt bỏ hoăcbóc đi trước khi đăt mô cấy lên môi trường.Vô trùng mô cấy là môt thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vây, nếu kiên trì tìmđược nồng đô và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắc chắn se đạt kết quả.Bảng 1.1. Nồng đô và thời gian sử dụng môt số chất diêt khuẩn để xử lý mô �

cấy thực vât��

Stt Tác nhân vô trùng Nồng đô Thời gian xử lý

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


(phút) Hiêu quả1 Calcium hypochlorite 9-10% 5-30 Rất tốt2 Sodium hypochlorite 2% 5-30 Rất tốt3 Nước Bromine 1-2% 2-10 Rất tốt4 H2O2 10-12% 5-15 Tốt5 HgCl2 0,1-1% 2-10 Khá6 Kháng sinh 4-50 mg/L 30-60 Khá

1.5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùngNguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môitrường trong khi mở nắp hoăc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biên pháp khácnhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này.Buồng cấy thường là buồng có diên tích hẹp, rông từ 10-15 m2, có hai lớp cửa để tránh khôngkhí chuyển đông từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lauchùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cáchrót formaldehyde (formalin) 4% ra môt số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơitự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehydethừa bằng dung dịch NH3 25% cung trong 24 giờ. Măt bàn cấy, trước khi làm viêc phải lau mătbàn bằng cồn 90%.Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mu vải, khẩu trang của

người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy thường xuyên có môt đèn cồn (hoăc đèn gas) để sử dụng trong khi cấy và môt cốc đựng cồn 90% để nhúng cácdụng cụ làm viêc.Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuyu tay bằng cồn 90%.

Để đảm bảo mức đô vô trùng cao trong phòng cấy cần có môt đèn tử ngoại 40W treo trên trần.Chỉ cho đèn này làm viêc khi không có người trong phòng cấy. Nên bât đèn tử ngoại 30 phúttrước khi cấy. Cần giảm sự chuyển đông của không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vâytất cả các dụng cụ phục vụ viêc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại, ra vàobuồng cấy nhiều lần.

Hình 1.2. Tủ cấy vô trùng

2. Chọn môi trường dinh dươngXem bài 2

3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấyKhông có những hướng dẫn cụ thể trong viêc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vât đều có thể dùng làm mô cấy. Tuy vây, có thể nhân xétchung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh... khi đătvào môi trường có chứa môt lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa (Bảng 1.2). Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính môt cây nhất định, trước tiênngười ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn.Cần biết rằng tuy mang môt lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng môtcây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác

nhau.Vì vây, khi khởi sự chọn giống, nhân giống môt cây cụ thể bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vât, trước hết cần thí nghiêm tìm hiểu phản ứng các bô phân khác nhau của cây trongnuôi cấy ở các nồng đô chất sinh trưởng khác nhau.Sau khi cấy, mô cấy cần được đăt trong điều kiên nhiêt đô và ánh sáng ổn định. Tùy vào cácmục đích nghiên cứu mà có các chế đô chiếu sáng khác nhau, chăng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoăc chiếu sáng nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cầnánh sáng. Nhiêt đô phòng nuôi nên giữ ổn định từ 25 2oC bằng máy điều hòa nhiêt đô. Cường� đô chiếu sáng khoảng từ 2000-3000 lux.

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


4. Môt số điểm cần lưu ý- Các dụng cụ dùng cho thí nghiêm nuôi cấy mô sau khi tiêt trùng ở nồi khử trùng đều phải đượctiêt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90% rồi hơ lên ngọn lửa đèn cồn.- Trước khi cấy phải vê sinh toàn bô khu vực cấy bằng cồn 90%.- Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4-5 mẫu, tránh trường hợp để nhiều không cấy kịp mẫu se bị khô.- Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi đợt cấy.

Bảng 1.2. Các cơ quan của thực vât sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào

Stt Nguồn gốc mẫu vât nuôi cấy Kích thước Mẫu nuôi cấy1 Mô phân sinh đỉnh(meristem) 0,5-1 mm Đỉnh sinh trưởng2 Chồi đỉnh(shoot tip) 0,5-1 cm Chóp đỉnh có chứa môt phần thân3 Chồi nách(axillary bud) 0,5-1 cm Chồi bên có chứa môt phần thân, lá và chồi nách4 Cuống lá(leaf petiole) 0,2-0,3 cm Cuống lá được cắt nhỏ, phân nửa được cấy chìm vào môi trường5 Phiến lá

(leaf blade) 0,2-1 cm Phiến lá non đăt trên môi trường, măt dưới đăt trên măt thạch6 Rễ(root) 0,5-1 cm Mẫu rễ được đăt trên măt thạch7 Dạng hành(bulds, scale) 1-2 cm Mẫu được đăt trên bề măt hay cấy chìm phân nửa vào môi trường8 Cây mầm(seedling) 2-3 mm Chồi non9 Hạt phấn(pollen, microspore) 0,1-0,5 mm Hạt phấn trong bao phấnBài 2Môi trường dinh dương

Thành công chính trong các thí nghiêm nuôi cấy mô và tế bào thực vât là tìm ra thành phần vât

chất của môi trường dinh dương cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng và phát triển được. Thànhphần của môi trường dinh dương thay đổi tùy theo loài và bô phân nuôi cấy, tùy theo sự pháttriển và phân hóa của mô cấy, tùy theo viêc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạomầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh.Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí nghiêm nuôi cấy mô. Đa số chúng có tính đăc hiêu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu ra để nuôi cấy những mô đăcbiêt nào đó. Môt số môi trường khác có ứng dụng rông hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt chonhiều loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho rằng môi trường nào trongchúng bảo đảm sinh trưởng tốt hơn. Để bắt đầu, cần phải thử trong những môi trường thôngdụng nào đó, chăng hạn môi trường Murashige-Skoog (1962) nếu không thành công thì sau đó thử trên các môi trường khác.Tuy vây, tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cung gồm năm thành phần chính:�- Đường cung cấp nguồn carbon.

- Các muối khoáng đa lượng.- Các muối khoáng vi lượng.- Các vitamin.- Các chất điều khiển sinh trưởng.Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm môt số chất hữu cơ có thành phần hóa học xácđịnh (các amino acid, EDTA...) hoăc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiếtcà chua ...).

I. Thành phần chính của môi trường1. Đường

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô và tế bào thực vât tổng hợp nên các chất hữu cơgiúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà dođường có trong môi trường dinh dương.Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose. Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng đô saccharose biến đổi từ 1-12%, thôngdụng là 2-3%.

2. Các muối khoáng đa lượngNhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vât tách rời không khác nhiều so với cây trồngtrong điều kiên tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: N, P, K, Ca, Mg và S(Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô

Stt Nguyên tốđa lượng Dạng sử dụng Nồng đô(mM)1 N Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3, NH4NO3, [NO3-, NH4+]∑ (NO3-, NH4+) (NH4)2SO4 khoảng 202 P NaH2PO4.7H2O, KH2PO4 khoảng 13 K KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4 khoảng 104 Ca Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O hoăc khoảng 2CaCl2.6H2O5 Mg MgSO4.7H2O 0,5-36 S (NH4)2SO4 khoảng 1

3. Các muối khoáng vi lượngNhu cầu muối khoáng của mô thực vât trong nuôi cấy là lĩnh vực ít được nghiên cứu. Rất ít cácnguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, nó đã được sinh lý học thực vât chứng minh đối với cây hoàn chỉnhdo đó có thể sử dụng được hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với cây cho mô và tế bào nuôi cấy trong môi trường nhân tạo. Vì vây, sự cung cấp này có tính kinh nghiêm trongnhững trường hợp cụ thể có thể là không cần thiết (Bảng 2.2).

4. Các vitaminBảng 2.3 trình bày các vitamin thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy (chủ yếu là bốnloại đầu). Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vây cần giữ trongđiều kiên lạnh dưới 0oC (trong ngăn đá tủ lạnh).

Bảng 2.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô

Stt Nguyên tốvi lượng Dạng sử dụng Nồng đô(mg/L)1 Mn MnSO4.4H2O 15-1002 B H3BO3 6-100

3 Zn ZnSO4.7H2O 15-304 Cu CuSO4.5H2O 0,01-0,085 Mo Na2MoO4.2H2O 0,007-16 Co CoCl2.6H2O 0,1-0,47 I KI 2,5-208 Fe FeSO4.7H2O 15-27,9

Bảng 2.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Stt Tên vitamin Nồng đô(mg/L)1 myo-inositol 1002 Nicotinic acid 0,5-13 Pyridoxine.HCl (Vit B6) 0,05-0,54 Thiamine.HCl (Vit B1) 10-505 Panthotenate calcium (Vit B5) 1-56 Riboflavin (Vit B2) 1-57 Biotin 0,1-18 Folic acid 0,1-1

5. Các chất điều khiển sinh trưởngMôt số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng cầnchú ý:- Đối với 2,4-D, NAA, IAA, IBA và GA3: cân môt lượng chất sinh trưởng đủ pha trong 50 mL dungdịch mẹ vào môt ly khô, thêm 2-3 mL cồn 90% rồi lắc đến khi tan hết, sau đó mới thêm nước cấtđến 50 mL.- Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài giọt HCl 1 N, lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha.

- Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi pha đến thể tích cần thiết.Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA bảo quản trong lọ màu nâu), cấtgiữ tủ lạnh. 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vây trong môt năm. BAP, IBA, KIN,và GA3 bảo quản được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính.

Bảng 2.4. Chữ viết tắt của môt số chất kích thích sinh trưởng

Chữviết tắt Chất kích thích sinh trưởng Chữ�viết tắt Chất kích thích sinh trưởngBA Benzyladenin KIN KinetinBAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acidGA3 Gibberellic acid 2hZ Dihydrozeatin

IAA Indoleacetic acid TDZ ThidiazuronIBA Indolebutyric acid Zea Zeatin2-iP 2-Isopentenyl adenin 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acidNOA Naphthoxyacetic acid Pic Picloram

Chú ýCác chất sinh trưởng có thể tác đông lên mô nuôi cấy ở nồng đô rất thấp (10-8). Cần dùngpipette riêng cho từng loại chất sinh trưởng môt. Và chú ý rửa cẩn thân các ly, cốc, chai lọc đã dùng để đựng và pha các chất sinh trưởng ở nồng đô cao. Ngoại trừ IAA và GA3, các chất sinhtrưởng còn lại được coi là bền vững trong quá trình hấp vô trùng.IAA sau khi pha dung dịch stock, được lọc qua màng lọc millipore (xem bài trước) sau đó chứatrong các tube eppendof được bọc giấy nhôm bên ngoài, bảo quản lạnh sâu. Môi trường sau khihấp khử trùng để nhiêt đô giảm xuống còn khoảng 50-60oC khi đó mới cho IAA đã lọc vào (các

thao tác thực hiên trong tủ cấy vô trùng).6. Các chất hữu cơ khác6.1. Nước dừaChất có hoạt tính trong nước dừa hiên đã được chứng minh là myo-inositol và môt số amino acidkhác. Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao, từ 10-20% thể tích môitrường. Lấy nước dừa già, lọc trong, cho vào các túi nilon và bảo quản trong lạnh sâu cho đếnkhi dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng. Tốt nhất là nên sử dụng tươi.

6.2. Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vât, mô và tế bào đông vât đã được tiêuchuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ. Dung dịch thủy phâncasein cung cấp môt số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường.

II. Vấn đề lựa chọn môi trườngKhi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào môt số đối tượng nhất định, vấn đề đăt ra là chọn môi trườngnào và trên cơ sở nào để phối hợp ty lê các chất dinh dương. Cách thường làm là qua các tàiliêu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoăc các đối tượng gần guivề măt phân loại đã dùng loại môi trường gì. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tácgiả đó hoăc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua môt số thí nghiêm thăm dò.Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiềumục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm ba loại:- Môi trường nghèo chất dinh dương: điển hình là môi trường White, Knop và Knudson C.- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg.- Môi trường giàu chất dinh dương: Điển hình là môi trường Murashige-Skoog và Linsmaier-Skoog.Vì vây, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô môt số đối tượng mới, chưa có tài liêu trước thì nênthăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với loại môi trườngnào nhất. Sau đó, cần tìm ty lê NO3-/NH4+ thích hợp. Viêc sử dụng mang tính kinh nghiêm đốivới môt số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bô trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế

bào thực vât.Hiên nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như là môt môi trường thích hợp với nhiều loạicây do giàu và cân bằng về chất dinh dương. Vì vây, những người mới tâp sự nuôi cấy môthường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình.

III. Chuẩn bị các dung dịch làm viêc Để thuân tiên cho viêc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm viêc), người ta không cânhóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đâm đăc (stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các dung dịch đâm đăc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnhthường hoăc tủ lạnh sâu. Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì se giảm môt số thời gian đáng kể chocông tác nuôi cấy.

1. Chuẩn bị môi trường Murashige-Skoog (MS, 1962). Chia làm 5 phần:

Bảng 2.5. Thành phần môi trường MS

Dung dịch stock Nồng đô(mg/L) Nồng đô trong dung dịch mẹ (g/200 mL) Dung tích dùng cho 1 L môi trườngMS1: KNO3 1900 19��

KH2PO4 170 10) 1,7�� × ( 20 mL��NH4NO3 1650 16,5��MgSO4.7H20 370 3,7��MS2: CaCl2.2H2O 440 20) 8,8�� × ( 10 mLMS3: H3BO3 6,2 0,124��

MnSO4.4H2O 22,3 0,446��

CoCl2.6H2O 0,025 0,5 mg��CuSO4.5H2O 0,025 20) 0,5 mg�� × ( 10 mLZnSO4.4H2O 8,6 0,172��Na2MoO4.2H2O 0,25 5 mg��KI 0,83 16,6 mg��MS4: FeSO4.7H2O 27,8 20) 0,556�� × (�10 mLNa2-EDTA 37,3 0,746��

MS5: myo-inositol 100 2

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Thiamine.HCl 0,1 2 mgPyridoxine.HCl 0,5 20) 10 mg�� × ( 10 mLNicotinic acid 0,5 10 mgGlycine 2 40 mg

2. Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956). Chia làm 5 phần:Bảng 2.6. Thành phần môi trường Nitsch

Dung dịch stock Nồng đô(mg/L) Nồng đô trong dung dịch mẹ (g/200 mL) Dung tích dùng cho 1 L môi trườngNt1: KNO3 950 9,5

KH2PO4 68 10) 0,68�� × ( 20 mL��NH4NO3 720 7,2MgSO4.7H20 185 1,85Nt2: CaCl2.2H2O 166 20) 1,66�� × ( 10 mLNt3: H3BO3 10 0,2��

MnSO4.4H2O 25 0,5��CuSO4.5H2O 0,0025 20) 0,05 mg�� × ( 10 mL�ZnSO4.4H2O 10 0,2��Na2MoO4.2H2O 0,25 0,5 mg��Nt4: FeSO4.7H2O 27,8 20) 0,556�� × (�10 mLNa2-EDTA 37,3 0,746��Nt5: myo-inositol 100 2�

Thiamine.HCl 0,5 10 mg�Pyridoxine.HCl 0,5 10 mg�Nicotinic acid 5 20) 100 mg�� × ( 10 mLGlycine 0,05 40 mg�Biotin 2 1 mg�Acid folic 0,5 10 mg�3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast (theo Trigiano & Gray, 2000)- Môi trường phân lâp (Protoplast Isolation medium PI)�Bảng 2.7. Thành phần môi trường phân lập PI

Stt Thành phần Nồng độ(mg/L)1 CaCl2.H2O 14802 KH2PO4 27,23 KNO3 1014 MgSO4.7H2O 2465 CuSO4.5H2O 0,025

6 KI 0,16pH môi trường 5,8

- Môi trường nuôi cấy (Protoplast Culture medium PC)�Bảng 2.8. Thành phần môi trường PC

Dung dịch stock Nồng đô(mg/L) Nồng đô trongdung dịch mẹ

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


(g/200 mL) Dung tích dùng cho 1 L môi trườngPC1: Ca(H2PO4)2.2H2O 100 20) 2�� × (10 mLCaCl2.2H2O 450 9��PC2: KNO3 2500 50��

NaH2PO4.2H2O 170 20) 3,4�� × ( 10 mL(NH4)2SO4 134 1,68��MgSO4.7H20 250 5��PC3: H3BO3 3 60 mg��

MnSO4.4H2O 13,2 132 mgCoCl2.6H2O 0,025 0,5 mgCuSO4.5H2O 0,025 20) 0,5 mg�� × ( 10 mLZnSO4.7H2O 2 40 mgNa2MoO4.2H2O 0,25 5 mgKI 0,75 15 mgPC4: myo-inositol 100 20) 2�� × (10 mLNicotinic acid 1 20 mg

Lấy mỗi loại stock PC (PC1, PC2, PC3 và PC4) 10 mL. Bổ sung thêm:+ Sequestrene 330 28 mg/L+ Sucrose 10 g/L+ Glucose 18 g/L+ Mannitol 100 g/L

Bài 3Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

I. Mục đích và yêu cầuMôt phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô và tế bào thực vât là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Môi trường thích hợp thayđổi tùy theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản là môi trường chứa đầy đủ

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


chất dinh dương khoáng vô cơ và hữu cơ, được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp.Từ môt đỉnh sinh trưởng sau môt thời gian nuôi cấy nhất định se phát triển thành môt chồi haynhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ trở thành môt cây hoàn chỉnh.Cây con được chuyển ra đất có điều kiên sinh trưởng phát triển bình thường. Đây là môt chutrình ngắn nhất và tiên lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường, được thực hiên bằngkỹ thuât nhân giống vô tính in vitro thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.Khi chọn đỉnh sinh trưởng để nhân giống cần lưu ý, nếu dùng đỉnh sinh trưởng nhỏ quá thì nuôicấy khó thành công, nếu dùng đỉnh sinh trưởng lớn quá thì nuôi cấy dễ thành công nhưng cungdễ bị nhiễm trùng. Kích thước của đỉnh sinh trưởng thay đổi tùy theo từng loài cây, tuy nhiên môtđỉnh sinh trưởng có kích thước 5-10 mm là thích hợp hơn cả.Con đường phát triển của đỉnh sinh trưởng để thành cây có thể trực tiếp hoăc thông qua giaiđoạn protocorm (de hành).

II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất1. Dụng cụ- Bình tam giác (100 mL, 250 mL)- Giấy nhôm- Giấy thấm vô trùng- Lọ thủy tinh khử trùng mẫu vât nuôi cấy- Forceps, kéo, dao mổ

- Đĩa petri vô trùng- Cốc chịu nhiêt, ống đong, micropipette các loại

2. Thiết bị- Nồi khử trùng- Tủ sấy- Laminar - Tủ lạnh- Microwave- Cân phân tích 10-4g- Cân kỹ thuât 10-2g- Máy cất nước 2 lần

3. Hóa chất- Dung dịch stock môi trường MS (MS1, MS2, MS3, MS4 và MS5)- Dung dịch HgCl2 0,1%- Cồn 90%- Agar - Saccharose- Nước cất vô trùng- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: BAP và NAA.- Nước dừa

III. Phương pháp tiến hành1. Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếpa. Nguyên liệu thực vật

- Đỉnh sinh trưởng của cây hông (Paulownia fortunei)- Đỉnh sinh trưởng cây keo lai (Acasia hybrid)

b. Môi trường nuôi cấy- MS đầy đủ - Saccharose 3%- Agar 0,8%- BAP 2 mg/L- NAA 1 mg/L5,8∼ - pHmôi trường

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


c. Tiến hành Pha môi trường dinh dương (1 L). Chia môi trường vào trong 20 hoặc 40 bình tam giác loại 250hoặc 100 mL, tương ứng. Nút miêng bình bằng giấy nhôm, sau đó đem khử trùng ở 121oC (1atm)/15-30 phút (môi trường chuẩn bị trước từ 2 ngày trở lên). Rửa sạch đỉnh sinh trưởng bằng xà phòng dưới dòng nước chảy, cắt bỏ những lá chung

quanh chỉ để lại môt vài lá, cho vào lọ thủy tinh vô trùng để chuẩn bị khử trùng mẫu vật. Trước khi cấy, laminar phải được bât đèn khử trùng 30 phút. Các dụng cụ cần thiết cho quá trình cấy (forceps, kéo, dao, bình khử trùng, cồn, giấy thấm...) được đăt trong laminar trước khibât đèn. Khử trùng sơ bô bằng cồn 90% từ 30 giây đến 1 phút, sau đó bằng HgCl2 0,1 % trong 5 phút,cuối cùng rửa sạch HgCl2 bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần (các thao tác này thực hiên tronglaminar). Lấy mẫu vât ra thấm khô trên giấy thấm vô trùng bóc bỏ những lá chung quanh, chỉ giữ lạiđỉnh sinh trưởng (những phần mô thấm dung dịch khử trùng cung cần phải cắt bỏ). Sau đó, cấymẫu vào các bình tam giác chứa môi trường dinh dương đã được chuẩn bị săn. Các bình môitrường đã cấy mẫu được đặt trong phòng nuôi với nhiệt độ 25 2oC, thời gian chiếu sáng 8-10� giờ/ngày với cường độ 2000-3000 lux.Sau 3-4 tuần, đỉnh sinh trưởng se phát triển thành cây nhờ quá trình kéo dài chồi (shoot

elongation).2. Nuôi cấy phát triển cây thông qua giai đoạn protocorma. Nguyên liệu thực vật- Đỉnh sinh trưởng hoăc chồi nách của hoa lan Dendrobium- Đỉnh sinh hoăc dứa (Ananas comusus)

b. Môi trường nuôi cấy- Lan: MS đầy đủSaccharose 2%Agar 0,8%Nước dừa 15%NAA 0,1 mg/LBAP 1,0 mg/L5,8∼ pHmôi trường

- Dứa: MS đầy đủSaccharose 2%Agar 0,8%NAA 0,5 mg/LBAP 0,2 mg/L5,8∼ pHmôi trường �

c. Tiến hànhCác bước tiến hành tương tự như trường hợp nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp. Nhưng lưuý thêm:- Đỉnh sinh trưởng của các loài lan hoăc dứa thường rất bẩn nên phải rửa thât kỹ bằng xà phòng

dưới dòng nước chảy.- Lan và dứa là những cây có khả năng sinh trưởng khá mạnh nên thời gian khử trùng đỉnh sinhtrưởng của chúng có thể lâu hơn các đối tượng khác (khoảng 7-10 phút) để đảm bảo ty lê nhiễmbẩn thấp.Các bình môi trường đã cấy mẫu được đăt trong phòng nuôi với thời gian chiếu sáng 8-10 giơ

/ngày, cường đô ánh sáng 2000-3000 lux, nhiêt đô phòng 25 2oC.�

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Bài 4Nuôi cấy đơn bôi in vitro

I. Mục đích và yêu cầuTrong công tác giống cây trồng, kỹ thuât tạo dòng thuần chủng luôn luôn giữ vai trò quan trọng.Có nhiều phương pháp tạo dòng thuần chủng khác nhau, nhưng thông thường nhất là tiến hànhchọn lọc và kiểm tra qua nhiều thế hê tự phối. Cách làm này mang lại kết quả chắc chắn, nhưngđòi hỏi chi phí lớn về trồng trọt và mất nhiều thời gian.

Bằng con đường đơn bôi, nghĩa là chọn ra những cá thể 1n rồi sau đó lương bôi hóa chúng,trong môt thời gian ngắn se thu được những cá thể đồng hợp tử tuyêt đối, đó là những dòngthuần rất lý tưởng. Hai biên pháp truyền thống để thu được cây đơn bôi là:- Chọn lọc đơn bôi xuất hiên ngẫu nhiên.- Lai xa và chọn lọc sau khi bô nhiễm sắc thể của môt trong hai giao tử mất đi (thoái biến) se thuđược thể đơn bôi, hiên tượng này chỉ mới phát hiên được ở môt số căp lai khác loài của đạimạch.Tuy nhiên, vấn đề đăt ra là làm sao để có được môt số lượng cây đơn bôi lớn. Phương pháp nàyhầu như không thể giải quyết vấn đề nói trên.Năm 1964, Guha và Maheshawari đã đưa ra môt phương pháp tạo cây đơn bôi mới, đó là tạocây đơn bôi từ hạt phấn thông qua nuôi cấy in vitro. Trên nhiều đối tượng cây trồng, phươngpháp này đã tạo được hàng loạt cá thể đơn bôi trong môt thời gian ngắn (chỉ môt vài tháng).Chính vì vây, đã có nhiều chương trình tạo giống cây trồng ra đời trên cơ sở áp dụng kỹ thuât

đơn bôi in vitro và đã thu được kết quả tốt.Có hai trường hợp tạo cây đơn bôi từ hạt phấn: hạt phấn tạo trực tiếp cây đơn bôi (thường găp ở thuốc lá) hay hạt phấn tạo gián tiếp cây đơn bội thông qua giai đoạn phát triển callus (ở lúa). Đểtạo cây đơn bội kép có thể sử dụng hai phương thức: cây đơn bội kép tạo từ cây đơn bội đượcxử lý colchicine hay cây đơn bội kép tái sinh từ callus của cây đơn bội (trường hợp này thườngchỉ đạt hiệu suất khoảng 60 %).

II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất1. Dụng cụ - Ống nghiêm (1,5 cm 20 cm)�- Giấy thấm vô trùng- Giấy nhôm- Lọ khử trùng mẫu vât nuôi cấy

- Forceps, kéo, dao mổ, kim nhọn- Đĩa petri vô trùng- Cốc chịu nhiêt, ống đong, micropipette

2. Thiết bị - Nồi khử trùng- Tủ lạnh- Laminar - Tủ sấy- Microwave

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


- Cân phân tích 10-4g- Cân kỹ thuât 10-2g- Máy cất nước 2 lần- Kính hiển vi

3. Hóa chất- Dung dịch stock môi trường Nt (Nt1, Nt2, Nt3, Nt4 và Nt5)- Dung dịch HgCl2 0,1%- Cồn 90%- Agar - Saccharose- Nước cất vô trùng- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: IAA, BAP, KINvà 2,4-D

III. Phương pháp tiến hành1. Nguyên liệu thực vậtSử dụng bao phấn của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) đế nuôi cấy đơn bội.

2. Môi trường nuôi cấy

Bảng 4.1. Thành phần các môi trường nuôi cấy bao phấn thuốc lá

Thành phần môi trường(1) Tạo cây 1n(2) Tạo callus 1n(3) Tạo chồi 1n(4) Tạo rễ 1n(5)Nitsch đầy đủ (Nt1, Nt2, Nt3, Nt4 và Nt5) + + + +Saccharose (%) 2 2 2 2Agar (%) 0,8 0,8 0,8 0,8IAA (mg/L) 0,1 - - 0,1

2,4-D (mg/L) - 0,1-0,5 - -KIN (mg/L) 0,1 0,1 0,1-1 -BAP (mg/L) - - 0,1-1 -

Chú ýMôi trường được chuẩn bị trong ống nghiệm (làm thạch nghiêng).

3. Nuôi cấy bao phấnNụ thuốc lá hái ở giai đoạn cánh hoa sắp ló ra khỏi lá đài (nụ dài khoảng 10-15 mm) được khử trùng theo thứ tự: 2 phút trong cồn 70%, 5 phút trong dung dịch HgCl2 0,05% và rửa bằng nướccất vô trùng từ 4-5 lần. Trong điều kiên vô trùng, dùng forceps và dao mổ tách nụ lấy các baophấn cấy vào ống nghiêm chứa môi trường dinh dương đã chuẩn bị săn (Bảng 4.1, côt 2). Mỗiống nghiệm cấy 5-10 bao phấn và đăt ở nhiêt đô 25-27oC, chiếu sáng từ 10-12 giờ/ngày với

cường đô chiếu sáng 2000-3000 lux.Sau 6-8 tuần nuôi, vỏ bao phấn se nứt ra và xuất hiên các cây thuốc lá đơn bôi, cấy chuyểnnhững cây thuốc lá này sang những bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL của cùng môt loạimôi trường để cây đơn bội phát triển.

Chú ý: Các thí nghiêm nuôi cấy đơn bôi chỉ thành công với điều kiên hạt phấn phải ở giai đoạn tứ tử hoăc đơn nhân, do đó thường người ta phải làm tiêu bản hiển vi để quan sát sự phát triển củahạt phấn, chọn giai đoạn thích hợp rồi mới tiến hành nuôi cấy.

4. Nhị bôi hóa thông qua giai đoạn callus

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Thân của cây thuốc lá đơn bôi nuôi cấy trong ống nghiêm được cắt thành từng đoạn dài 5 mm và cấy lên môi trường tạo callus (Bảng 4.1, côt 3). Sau 7-10 ngày, từ đoạn thân cây thuốc lá 1n se hình thành môt khối callus nhỏ được gọi là callus sơ cấp. Tế bào callus sơ cấp thường dễ tái sinhthành chồi khi găp điều kiên thuân lợi. Các cây tái sinh từ tế bào callus nuôi cấy trên môi trườngở bảng 4.1, côt 4 có đô biến đông về số lượng nhiễm sắc thể rất lớn.

- Phương pháp kiểm tra nhiễm sắc thểMảnh lá non (1-2 mm) hoăc đầu rễ (2 mm) được tách ra từ cây thuốc lá đơn bôi nuôi cấy trongống nghiêm, cố định bằng hỗn hợp cồn: acetic (3:1) trong 24 giờ. Mẫu được bảo quản ở cồn70%, nhuôm nhiễm sắc thể bằng acetocarmin. Đếm số lượng nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi.Kết quả phân tích số lượng nhiễm sắc thể của các cây tái sinh từ quần thể tế bào callus đơn bôilà không đồng nhất, cho thấy: cây 1n chiếm ty lê khoảng 21,9 %, cây 2n khoảng 61,5 % và khoảng 11,5 % là những cây có mức bôi thể cao hơn nhị bôi.

Bài 5Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù

I. Mục đích và yêu cầuTrong nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng), dịch nuôi cấy chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng. Nuôi cấy tế bào dịch lỏng thường được khởi

đầu bằng cách đăt các khối mô callus dễ vơ vụn trong môi trường lỏng chuyển đông (lắc hoăckhuấy). Vì thế quá trình nuôi cấy này là sự tiến triển từ thực vât đến mẫu vât, tới callus, và cuốicùng tới tế bào dịch huyền phù. Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù thích hợp hơn cho viêc sản xuấtsinh khối của tế bào thực vât so với nuôi cấy callus do quá trình nuôi cấy này được thao táctương tự như nuôi cấy vi sinh vật trong nồi lên men.Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch huyền phù chủ yếu được sử dụng để sản xuất các hợp chất thứcấp (các hợp chất tự nhiên) với hiệu suất cao. Các sản phẩm thứ cấp như: các chất dùng làmdược liệu, các chất tạo mùi, các chất dùng làm gia vị, các sắc tố và các hóa chất dùng trongnông nghiệp, ngày nay đã được sản xuất thành công trong nhiều nuôi cấy in vitro tế bào thực vật.Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vât dựa trên cơ sở lập luận là sản phẩmcó cùng giá trị được sản xuất tự nhiên trong các cơ quan, quả, hoăc các mô khác nhau của câycó thể được kích thích để tích luy trong các tế bào chưa phân hoá rõ.Những đôt phá trong kỹ thuât nuôi cấy tế bào (ví dụ nuôi cấy rễ tơ) cho thấy trong tương lai gần

phần lớn những hóa chất công nghiêp nào có nguồn gốc thực vât cho dù đó là dược liêu, thuốcnhuôm hay chất màu thực vât đều có thể sản xuất trong các nồi phản ứng sinh học (bioreator)hay còn gọi là hệ lên men (fermenter).

Hình 5.1. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật trong bioreactor

II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất1. Dụng cụ

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


- Bình tam giác (250 mL)- Giấy nhôm- Giấy lọc vô trùng- Lọ khử trùng mẫu vât nuôi cấy- Forceps, kéo, dao mổ- Đĩa petri vô trùng- Cốc chịu nhiêt, ống đong, micropipette

2. Thiết bị - Nồi khử trùng- Tủ lạnh- Laminar - Tủ sấy- Microwave- Cân phân tích 10-4g- Cân kỹ thuât 10-2g- Máy cất nước- Máy lắc- Máy hút chân không- Phễu sứ Buchner

3. Hóa chất- Dung dịch stock: môi trường MS (MS1, MS2, MS3, MS4 và MS5)- Dung dịch HgCl2 0,1%- Cồn 90%- Agar - Saccharose- Nước dừa- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: KIN, BAP, NAA và 2,4-D.- Nước cất vô trùng

III Phương pháp tiến hành1. Nguyên liệu thực vật

- Hạt lúa (Oryza satica): nuôi cấy tạo callus.- Cây nghê đen (Curcuma zedoaria) in vitro: nuôi cấy tạo callus.

2. Môi trường nuôi cấy tạo callusa. Lúa- MS đầy đủ- Saccharose 3 %- Agar 0,8 %- 2,4-D 5 mg/L- KIN 0,1 mg/L- pHmôi trường ~ 5,8

b. Nghê đen

- MS đầy đủ- Saccharose 2 %- Agar 0,8 %- BAP 3 mg/L- 2,4-D 3 mg/L- pHmôi trường ~ 5,8

3. Môi trường nuôi cấy tế bào dịch lỏngThành phần môi trường tương tự môi trường tạo callus nhưng không bổ sung agar.

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


4. Tiến hànha. LÚA: chuẩn bị môi trường theo các bước tương tự các bài trước.- Tạo callus Hạt lúa bóc vỏ, rửa sạch bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Cho hạt lúa vào bình khử trùng, khử trùng sơ bô bằng cồn 70% trong 1 phút. Sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1 % trong 6phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần trước khi cấy.

Cấy hạt lúa đã khử trùng vào môi trường đã chuẩn bị và nuôi ở nhiệt độ 25 2oC, thời gian� chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux . Sau 4-5 tuần các callus màu trắng sữa xuất hiên trên các hạt lúa.- Nhân callusDùng dao mổ tách lấy các khối callus nhỏ có đường kính 1-2 mm cấy chuyển lên môi trườngnhân callus (thành phần môi trường tương tự như môi trường tạo callus). Sau 3-4 tuần, cáccallus se phát triển nhanh chóng thành các khối callus lớn (đường kính khoảng 3-5 mm).

- Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dịch huyền phù. Các bước tiến hành và khử trùng tương tự môitrường có agar. Mỗi bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường. Chọn các khối callus có màu trắng ngà, rắn từ môi trường nhân để chuyển vào môi trườnglỏng. Một gam callus cho vào 1 bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường (các thao tác

tiến hành trong điều kiên vô trùng). Đăt các bình môi trường chứa callus trên máy lắc ở trong phòng nuôi cấy (nhiệt độ 25 2oC)� với tốc đô khoảng 100-150 vòng/phútCứ 2 ngày lấy ra một bình nuôi cấy, lọc sinh khối tế bào bằng máy hút chân không, cân lượngmẫu tươi thu được. Sau đó, đem sấy mẫu ở 65oC trong 2 giờ để cân trọng lượng khô. So sánhvới kết quả ban đầu để theo dõi tốc đô sinh trưởng của callusXây dựng đường cong sinh trưởng (từng 2 ngày) cho trọng lượng tươi và trọng lượng khô của tếbào.

b. NGHÊ ĐENSử dụng các cây nghê đen in vitro, cắt các đoạn gốc lá cấy vào môi trường tạo callus. Sau 4-5tuần các callus màu vàng bắt đầu xuất hiên. Tách các callus này cấy lên môi trường nhân callus(thành phần môi trường nhân callus tương tự môi trường tạo callus).Các bước tiến hành nuôi cấy tế bào dịch huyền phù tương tự như đối với lúa.

Bài 6Nuôi cấy protoplast

I. Mục đích và yêu cầu

Kỹ thuât protoplast phát triển mạnh từ sau công trình của Takebe (1971) khi tái sinh cây hoànchỉnh từ protoplast của lá cây thuốc lá. Có ba phương thức phân lâp protoplast, đó là:- Cơ học (không dùng các enzyme)- Sử dụng ezyme tuần tự (xử lý qua hai bước)- Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời)Tùy theo đối tượng và từng loại mô mà thay đổi nồng đô của các enzyme cho thích hợp. Vì proplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khácnhau như các bô phân của cây (lá, rễ, hạt phấn), mô sẹo, tế bào đơn...Protoplast thực vât có ba ứng dụng chính sau:

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


- Chọn dòng tế bào biến dị soma.- Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vât.- Biến nạp di truyền: đưa các cơ quan tử, virus và DNA ngoại lai vào tế bào thực vât.

II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất1. Dụng cụ- Bình tam giác (100 mL), đĩa petri nhựa đã vô trùng (disposable)- Giấy thấm vô trùng- Forceps, kéo, dao mổ- Đĩa petri thủy tinh vô trùng- Giấy parafilm, giấy nhôm- Tube ly tâm loại 15 mL- Lưới lọc có đường kính lỗ lọc 65 m�- Cốc chịu nhiêt, ống đong, micropipette

2. Thiết bị- Nồi khử trùng- Tủ sấy- Laminar - Tủ lạnh

- Microwave- Cân phân tích 10-4g- Cân kỹ thuât 10-2g- Máy cất nước 2 lần- Máy ly tâm (tốc đô 6000-10000 rpm), rotor cho tube 15 mL- Máy lắc- Buồng đếm- Kính hiển vi đảo ngược

3. Hóa chất- Dung dịch enzyme tách protoplast- Môi trường phân lâp (PI), môi trường nuôi cấy protoplast (PC)- Cồn 90%

- Nước cất vô trùng

III. Phương pháp tiến hành1. Nguyên liêu thực vậtLá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liêu tách protoplast. Sử dụng các lá được tách trong ngày.

2. Chuẩn bị môi trườngDung dịch enzyme tách protoplast:+ Onozuka cellulase R10 0,5 %+ Onozuka macerozyme R10 0,1 %+ Mannitol 13,0 %+ pHmôi trường ~ 5,8

Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 m.�

3. Tiến hànha. Ngày thứ nhất Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đăt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng.Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá. Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 mL bổ sung 10 mL dung dịchenzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đăt trong tối qua đêm trênmáy lắc ở tốc đô thấp (khoảng 40 vòng/phút).

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


b. Ngày thứ hai = 65 m) đăt trong cốc loại 50 mL.� Φ Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vôtrùng ( Bổ sung thêm 3 mL dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắcmạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên. Bổ sung thêm 2 mL dung dịch rửa để rửa proptoplast hết khỏi lưới lọc (dùng forceps để giữ

lưới lọc trong lúc rửa). Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 mL) vào tube ly tâmloại 15 mL và ly g trong 10 phút.� × tâm 50 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10mL dung dịch tách (PI + 20%sucrose), thêm 1mL dung dịch rửa lên trên bề măt dung dịch tách và protoplast sao cho khônglàm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thành� tube tránh g trong 10 phút.× bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50 Các protoplast sốngsót se nằm ở trên bề măt dung dịch (thể nổi). Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang môttube ly tâm sạch, thêm 10 mL dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast se lắng xuống đáy tube và có dạng viên (cục tròn). Rửa protoplast thêm môt lần nữa trong 10 mL dung dịch rửa. (lần rửa này có thể bỏ qua nếucác hạt protoplast quá bé hay quá ít chỉ vừa đủ dùng). Loại bỏ phần nổi trên măt và tái� � huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 mL môi trường nuôi cấy protoplast (PC).

Đăt môt giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mât đô 10.000). Nuôicấy× protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/mLmôi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28oC.

c. Ngày thứ ba�Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 mol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn� hùynh quanh ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày.

d. Ngày thứ nămChuyển sang nuôi cấy ở cường đô ánh sáng cao hơn (50-75 mol/sec/m2) trong 2 ngày bằng� cách bỏ lớp vải thưa ra.

e. Ngày thứ bảyGhi lại kết quả của bài học nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế bào nuôi cấyban đầu, trong môt mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiêu của sự nhiễm bẩn không.

Chú thích: Nếu có thể tìm thấy tâp đoàn tế bào, protoplast có thể được pha loãng với môi trườngnuôi cấy sạch có lượng nhỏ mannitol để quan sát sự phát triển của callus có nguồn gốcprotoplast. Sau khoảng 8-10 tuần, callus này có thể được chuyển lên môi trường tạo chồi.

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Bài 7Chuyển gen thông quaAgrobacterium tumefaciens

I. Mục đích và yêu cầuCác thực vật chuyển gen đã được tạo ra bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Có hai phương thứcchính:- Chuyển gen trực tiếp: bắn gen, xung điên, vi tiêm, siêu âm, silicon carbide, thông qua ống phấn,điện di ...- Chuyển gen gián tiếp (nhờ vi sinh vât): Agrobacterium tumefaciens.Phương pháp được sử dụng thông dụng và ít tốn kém hơn cả là chuyển gen gián tiếp thông quaAgrobacterium. Agrobacterium tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm có trong đất, thườngđược sử dụng để tiến hành biến nạp di truyền trên đối tượng thực vât. Đoạn DNA muốn chuyểnvào môt cây nào đó có thể được thao tác dễ dàng trên E. coli và sau đó chuyển trở lại vàoAgrobacterium. Viêc chuyển gen vào thực vât qua Agrobacterium đã thực hiên thành công trênnhiều loại cây: thuốc lá, đâu tương, các cây họ đâu nhiêt đới, bông cải, khoai tây.

II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất1. Dụng cụ

- Bình tam giác (250 mL), ống nghiêm có nắp vặn- Giấy thấm vô trùng- Forceps, kéo, dao mổ- Que cấy vi sinh- Đĩa petri (plastic và thủy tinh) vô trùng- Giấy parafilm- Giấy nhôm- Tube eppendorf (1,5-2 mL)- Cốc chịu nhiêt, ống đong, micropipette

2. Thiết bị- Nồi khử trùng- Tủ sấy

- Laminar - Tủ lạnh- Microwave- Cân phân tích 10-4g- Cân kỹ thuât 10-2g- Máy cất nước 2 lần- Máy ly tâm lạnh (14000 rpm) cho tube 1,5-2 mL

3. Hóa chất- Môi trường cơ bản MS- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB- Các loại kháng sinh: kanamycin, rifampicin và cefotaxim- Agar

- MgSO4 10mM- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: NAA và BAP- Cồn 90%- Nước cất vô trùng

III. Phương pháp tiến hành1. Nguyên liêu- E. coli chủng TOP 10 có mang pRK 2013 (helper plasmid)- E. coli chủng TOP 10 có mang vector pBI 121+ insert DNA (gen ngoại lai mang tính trạng mongmuốn)

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


- Agrobacterium tumenfaciens chủng LBA 4404.- Cây thuốc lá in vitro.

2. Chuẩn bị môi trường2.1. Môi trường LB- Bacto-tryptone 3 g- Yeast-Extract 1,5 g- NaCl 3 g- Nước cất đến đủ 300mL.

2.2. Môi trường LB đăcMôi trường LB bổ sung 1,5 % agar/100 mL.

2.3. Môi trường LB-RMôi trường LB bổ sung 100 g/mL rifampicin.�

2.4. Môi trường LB-KMôi trường LB bổ sung 50 g/mL kanamycin.�

2.5. Môi trường LB-RK

Môi trường LB bổ sung 100 g/mL rifampicin và 50 g/mL kanamycin.� �

2.6. Môi trường MSO- MS đầy đủ- Agar 0,8 %- Saccharose 3 %- pHmôi trường ~ 5,8

2.7. Môi trường nuôi cấy (MS 104)- MS đầy đủ- Agar 0,8 %- Saccharose 3 %- BAP 2 mg/mL

- NAA 0,2 mg/mL- pHmôi trường ~ 5,8

2.8. Môi trường chọn lọc (MS SEL)- MS đầy đủ- Agar 0,8 %- Saccharose 3 %- BAP 2 mg/mL- NAA 0,2 mg/mL- Kanamycin 1,5 mL- Cefotaxim 2 mL- pHmôi trường ~ 5,8

2.9. Môi trường tạo rễ (MSR)- MS đầy đủ- Agar 0,8 %- Saccharose 3 %- Kanamyin 1,5 mL- Cefotaxim 2 mL- pHmôi trường ~ 5,8

Môi trường có bổ sung cefotaxim cần được bảo quản trong điều kiên không có ánh sáng. Chấtkháng sinh được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường (để nhiêt đô môi trường hạ xuống

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


khoảng 55-60oC) ở điều kiên vô trùng của laminar.

3. Tiến hành3.1. Triparental mating (giao phối bộ ba)a. Nuôi cấy vi khuẩnCác môi trường LB lỏng được chuẩn bị trong các ống nghiêm có nắp vặn, khử trùng để tiến hànhnuôi cấy các vi khuẩn. Các bước như sau: Nuôi A. tumenfaciens trong môi trường LB-R trong tổi, ở 28oC, thời gian 48 giờ (nuôi trước khitiến hành triparental mating 2 ngày). Nuôi E. coli có mang plasmid helper (pRK 2013) và E. coli có mang vector pBI 121 + insertDNA trong môi trường LB-K (nuôi trước khi tiến hành lai bô ba 1 ngày).

b. Nuôi cấy chung 3 loại vi khuẩnCác bước tiến hành: Lấy mỗi ống nghiêm nuôi các loại vi khuẩn 1 mL, ly tâm tốc đô khoảng 10.000 rpm, trong 5giây. Loại bỏ thể nổi, thêm 1 mL môi trường LB, lắc nhẹ để trôn (để loại bỏ chất kháng sinh). Lâp lại 2 bước trên 2 lần. Thêm 300 l môi trường LB.� 3 loại vi khuẩn trên được cấy lên măt đĩa chứa môi trường LB đăc (đã được chuẩn bị trước

các đĩa petri chứa môi trường LB bổ sung 1,5 % agar) không bổ sung chất kháng sinh, mỗi loại vikhuẩn lấy 100 l. Dàn đều trên bề măt môi trường đến khi khô hoàn toàn.�Nuôi cấy từ 1-2 ngày tại 26-28oC, đến khi các thảm vi khuân được hình thành.� �

c. Chọn lọc vi khuẩn nuôi cấy bằng cách trôn 3 loại vi khuẩn, sử dụng chất kháng sinhCác bước tiến hành: Lấy 5 mL MgSO4 10 mM cho lên đĩa petri mới, lấy một ít vi khuẩn trong thảm đã nuôi cấy� � ở trên cho vào để có một dịch lỏng. Chuẩn bị 4 tube eppendorf vô trùng, cho vào mỗi tube 900 L MgSO4 10 mM.� Tiến hành pha loãng vi khuẩn thành các nồng đô pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4. Lấy 100 l mỗi loại vi khuẩn đã pha loãng dàn đều lên 5 đĩa petri chứa môi trường LB-RK bổ� sung 2 % agar. Nuôi trong 2-3 ngày tại 26-28oC trong điều kiên tối để phát triển khuẩn lạc.

Nuôi cấy 1 khuẩn lạc trong 5 mL môi trường LB-RK tại 26-28oC từ 1-2 ngày để thu được sinhkhối E. coli, xác định Agrobacterium đã được chuyển gen (nếu chưa sử dụng ngay, thêm vào15% glycerin và bảo quản ở -70oC).

3.2. Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua AgrobacteriumCác bước tiến hành: Lấy 1 khuẩn lạc ở trên cấy chuyển vào 5 mL môi trường LB-K lỏng, nuôi cấy lắc ở điều kiêntối, nhiệt độ từ 27-28oC trong 2-3 ngày. Thu tất cả các tế bào đã nuôi cấy ở trên bằng cách cho môi trường LB-K lỏng chứa khuẩn lạcvào tube eppendorf, ly tâm từ 0,5-1 phút, tốc đô 12.000 rpm. Lăp lại nhiều lần. Loại bỏ môi trường LB ở phía trên, các tế bào thu được hòa tan trong 1 mL môi trường MSOlỏng. Chuẩn bị 20 mL môi trường MSO trên đĩa petri.

Lá thuốc lá in vitro cắt thành các mảnh lá có kích thước 0,5-0,7 cm (loại bỏ các gân lá),× ướcchừng khoảng 0,5-0,7 cm chuyển lên đĩa petri chứa môi trường MSO. Tế bào Agrobacterium hòa trong 1 mL môi trường MSO được cấy chuyển sang môi trườngMSO có chứa các mảnh lá, lắc nhẹ bằng tay và ủ trong 10 phút. Sau khi đồng nuôi cấy, làm khô các mảnh lá bằng cách chuyển chúng lên giấy lọc vô trùngtrong 0,5-1 phút. Các mảnh lá đó được nuôi trên môi trường nuôi cấy (MS 104) trong 2 ngàytrong tối. Các mảnh lá sau đó được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc (MS SEL) và nuôi cấy trong 3tuần để tái sinh chồi ở điều kiên chiếu sáng.

8/8/2019 NUOI CAY MO TV 12347


Các chồi tạo thành được cấy chuyển lên môi trường MSR để tạo rễ. Các cây hoàn chỉnh đượcchuyển sang nuôi cấy trong các bình. Các cây này là các cây đã được tiến hành chuyển gen. Để biết viêc chuyển gen có thành công hay không cần phải tiến hành các thí nghiêm kiểm tra (táchchiết DNA của Agrobacterium, chạy PCR với căp primer đăc hiêu cho insert DNA và điên di sảnphẩm PCR trên agarose gel 1 %).

TAI LIÊU ĐỌC THÊM

- Murashige T and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays withtobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497.- Nistch JP and Nistch C. 1969. Haploid plants from pollen grains. Science 163:85-87.- Trigiano RN and Gray DJ. 2000. Plant tissue culture concepts and laboratory exercises.- Street HE. 1977. Plant tissue and cell culture. Blackwell Scientific Publication. Osney, Mead,Oxford, UK.- Nguyễn Văn Uyển. 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. T1 và T2. NXB� Nông nghiệp. TP Hồ Chí Minh.

nuoi cay mo tv 12347

Documents