SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA

V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA1130939

NÁZOV FAKULTYNÁZOV VYSOKEJ ŠKOLY

UPLATNENIE PROGRESÍVNYCH ANALYTICKÝCH

METÓD PRI DETEKCII FALŠOVANIA SYROV

2011 Juraj Paulov

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA

V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

UPLATNENIE PROGRESÍVNYCH ANALYTICKÝCH

METÓD PRI DETEKCII FALŠOVANIA SYROV Bakalárska práca

Študijný program: Bezpečnosť a kontrola potravín

Študijný odbor:ŠO4170700 Spracovanie poľnohospodárskych

produktov

Školiace pracovisko: Katedra hygieny a bezpečnosti potravín

Školiteľ: Lucia Zeleňáková, Ing., PhD.

Konzultant: Radoslav Židek, Ing., PhD.

Nitra 2011 Juraj Paulov

Čestné vyhlásenie

Podpísaný Juraj Paulov vyhlasujem, že som záverečnú prácu na tému

„Uplatnenie progresívnych analytických metód pri detekcii falšovania syrov“

vypracoval samostatne s použitím uvedenej literatúry.

Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, ak uvedené údaje nie sú pravdivé.

V Nitre 12. mája 2011

....................................

podpis

Poďakovanie

Chcel by som touto cestou poďakovať vedúcej bakalárskej práce Ing. Lucii

Zeleňákovej, PhD. za cenné rady a odbornú pomoc pri vypracovaní zadanej práce.

Abstrakt

Hlavným cieľom bakalárskej práce bolo získanie poznatkov zaoberajúcich sa

aktuálnou problematikou falšovania syrov. Práca má kompilačný charakter, pričom

poskytuje ucelené informácie zahrňujúce zloženie kravského a ovčieho mlieka a opisuje

jeho pozitívny vplyv na ľudské zdravie. Zároveň sa zameriava na zložky mlieka, ktoré

slúžia ako indikátor falšovania mlieka a syrov. Osobitná pozornosť je venovaná

analytickým metódam PCR a ELISA, ktorými možno nežiaduce falšovanie detegovať.

Medzidruhové falšovanie mlieka vzniká pridaním kravského mlieka do drahšieho

ovčieho mlieka. V dôsledku toho zloženie syrov a syrových výrobkov nezodpovedá

údajom uvedených na obale. Konzumácia takýchto výrobkov môže pri určitej skupine

ľudí vyvolať alergické reakcie. Ochranu spotrebiteľa zabezpečujú legislatívne normy a

predpisy. Obsahujú základné informácie týkajúce sa označovania a zloženia syrov a

syrových výrobkov. Kontrolu a dodržiavanie právnych predpisov zabezpečuje ŠVPS

SR, ktorá uskutočňuje pravidelné odbery vzoriek syrov a syrových výrobkov

dostupných na trhu.

Kľúčové slová: falšovanie, kravské mlieko, ovčie mlieko, ELISA, PCR

Abstrakt

The main objective of thesis was to gain knowledge concerning “adulteration of

cheeses”. Compilation work has character, providing comprehensive information,

including the composition of cow and sheep milk. Describes a positive impact on

human health. It also focuses on the components of milk, which serve as indicator of

adulteration of milk and cheeses. Particular attention is devoted to analytical methods

of PCR and ELISA. These analytical methods can detect adulteration of milk.

Interspecific adulteration created by adding cow's milk to sheep's milk. Consequently,

the composition of cheese and cheese products are not correctly written on the

packaging. Consumption of such products may cause in certain group of people allergic

reactions. Legislative standards and regulations provide consumer protection. Contain

basic information regarding the labeling and composition of cheeses and cheese

products. Control and compliance legislative standards ensures ŠVPS SR. It carrying

out regular sampling of cheeses and cheese products available on the market.

Keywords: adulteration, cow's milk, sheep's milk, ELISA, PCR

Obsah

Obsah .....................................................................................................................................6

Zoznam ilustrácií ...................................................................................................................8

Zoznam tabuliek ..................................................................................................................9

Zoznam skratiek a značiek...................................................................................................10

Úvod.....................................................................................................................................11

1 Cieľ práce ........................................................................................................................12

2 Metodika práce a metódy skúmania ...............................................................................13

3 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí ................................................14

3.1 Charakteristika kravského mlieka.................................................................................14

3.1.1 Bielkoviny v kravskom mlieku..............................................................................14

3.1.1.1 Kazeíny v kravskom mlieku.............................................................................15

3.1.1.2 Srvátkové bielkoviny v kravskom mlieku........................................................15

3.1.2 Tuk v kravskom mlieku..........................................................................................16

3.1.3 Sacharidy v kravskom mlieku................................................................................17

3.1.4 Minerálne látky v kravskom mlieku.......................................................................18

3.1.5 Vitamíny v kravskom mlieku.................................................................................19

3.2 Charakteristika ovčieho mlieka.....................................................................................21

3.2.1 Bielkoviny v ovčom mlieku....................................................................................22

3.2.1.1 Kazeíny v ovčom mlieku...................................................................................22

3.2.1.2 Srvátkové bielkoviny v ovčom mlieku..............................................................23

3.2.2 Tuk v ovčom mlieku................................................................................................23

3.2.3 Laktóza v ovčom mlieku.........................................................................................23

3.2.4 Minerálne látky v ovčom mlieku................................................................................24

3.3 Charakteristika syrov a syrových výrobkov..................................................................25

3.3.1 Požiadavky na kvalitu syrov a syrových výrobkov.................................................26

3.3.2 Všeobecné požiadavky na označovanie potravín...................................................27

3.3.3 Označovanie syrov a syrových výrobkov...............................................................28

3.4 Medzidruhové falšovanie mlieka a syrov......................................................................29

6

3.5 Analytické metódy detekcie falšovania syrov...............................................................32

3.5.1 ELISA......................................................................................................................32

3.5.1.1 Princíp ELISA...................................................................................................32

3.5.1.2 Sandwich ELISA...............................................................................................34

3.5.1.3 Kompetetívna ELISA........................................................................................35

3.5.2 Izoelektrická fokusácia............................................................................................36

3.5.2.1 Voľná prietoková elektroforéza........................................................................37

3.5.3 Chromatografické metódy.......................................................................................37

3.5.3.1 Hydrofóbna interakčná chromatografia.............................................................37

3.5.4 PCR metóda.............................................................................................................38

3.5.4.1 Charakteristika PCR..........................................................................................38

3.5.4.2 Princíp PCR.......................................................................................................38

3.5.4.3 Imuno-PCR........................................................................................................40

Záver.....................................................................................................................................41

Zoznam použitej literatúry...................................................................................................42

7

Zoznam ilustrácií

Obr. 1 Vzorec laktózy 18

Obr. 2 Štruktúra protilátky 34

Obr. 3 Schéma Sandwich ELISA 35

Obr. 4 Schéma kompetetívnej ELISA 36

8

Zoznam tabuliek

Tab. 1 Zloženie mliečneho tuku 16

Tab. 2 Zastúpenie minerálnych látok v jednotlivých formách 19

Tab. 3 Zastúpenie vitamínov v ovčom a kravskóm mlieku 20

Tab. 4 Zloženie ovčieho a kravského mlieka 21

Tab. 5 Minerálne zloženie ovčieho a kravského mlieka 24

Tab. 6 Rozdelenie syrov podľa vody v beztukovej hmote syra 26

Tab. 7 Rozdelenie syrov podľa tuku v sušine 26

9

Zoznam skratiek a značiek

TCA kyselina trichlóroctová

NPN nebielkovinové dusikaté látky

Asn asparagín

Lys lyzín

Asp kyselina asparagová

Glu kyselina gluténová

Gln glutamín

Thr treonín

β-Lg β-laktoglobulín

α-La α-laktoalbumín

Tyr tyrozín

Arg arginín

Ca3(PO4)2. fosforečnan vápenatý

KM Michaelisova konštanta

TFA transportné mastné kyseliny

MCFA stredne dlhé mastné kyseliny

PCR polymerázová reťazová reakcia

ELISA enzýmová imunosorpčná analýza

EIA enzýmová imunoanalýza

HPLC vysokoúčinná kvapalinová

chromatografia

VBHS voda v beztukovej hmote syra

PDO ochranná značka originality

IEF izoelektrická fokusácia

(pl) izoelektrický bod

FFE voľná prietoková elektroforéza

HIC hydrofóbna interakčná

chromatografia

IPCR imunitná PCR

10

Úvod

Mlieko bolo už v minulosti súčasťou výživy ľudí. Mlieko v ľudskej výžive sa dá

považovať za najhodnotnejšiu potravinu, pretože obsahuje všetky živiny, nevyhnutné

pre zdravie a vývoj. Mlieko je vhodná potravina pre každodennú konzumáciu počas

celého života. Pravidelným pitím mlieka sa dopĺňa vápnik v kostiach a predchádza sa

úbytku kostrovej hmoty, osteoporóze. Spotreba mlieka a mliečnych výrobkov

na Slovensku klesá, čo ma za následok znižovanie produkcie mlieka. V mlieku

prevládajú pozitívne vlastnosti nad negatívnymi.

Mlieko je hlavným zdrojom vápnika. Obsahuje tiež fosfor, draslík, horčík, sodík,

chlór, síru a ďalšie stopové prvky. Mlieko má veľmi málo železa. Obsahuje aj množstvo

vitamínov, ako sú: B1, B2, B3, B6, E, K a taktiež malé množstvo vitamínov D a C.

Mlieko je ľahko stráviteľná potravina. Stráviteľnosť mlieka je závislá aj na obsahu tuku.

Ľahšie stráviteľné mlieko je s nižším obsahom tuku.

Ovčie mlieko je hustejšie a výživnejšie ako kravské, pretože obsahuje

dvojnásobok bielkovín, tuku a vitamínov B-komplexu. Taktiež vitamíny rozpustné

v tuku (A, D, E, K) i minerálne látky napr. vápnik, fosfor, horčík, železo, zinok, meď.

Ovčí tuk má vhodnejšie zloženie mastných kyselín ako kravský tuk. Je ľahšie

stráviteľný a zdravší. Z ovčieho mlieka sa na salašoch vyrába ovčí hrudkový syr. Je to

základná surovina na výrobu bryndze. Vzhľadom na cenu a množstvo ovčieho mlieka

na trhu, výrobcovia do ovčieho mlieka pridávajú kravské mlieko, aby tak redukovali

ceny bryndze. Pridanie kravského mlieka môže u citlivých jedincov vyvolať zdravotné

komplikácie (laktózová intolerancia, alergia na bielkoviny). Znížením nutričnej hodnoty

bryndze vzniká nedôvera medzi zákazníkmi.

V súčasnosti sú vypracované metódy na odhalenie nepovoleného pridávania

kravského mlieka do ovčieho. Medzi najpoužívanejšie analytické testy patrí ELISA

a PCR. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) pri detekcií využíva DNA. DNA

molekula mlieka je termostabilná. Táto metóda je vhodnejšia pri analýze vzoriek

tepelne upraveného mlieka alebo mliečnych výrobkov. ELISA (Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay) metóda, taktiež označovaná ako EIA (Enzyme Immunoassay)

je najpoužívanejšou imunologickou metódou na detekciu protilátok a antigénu.

11

1 Cieľ práce

Cieľom záverečnej práce bolo vypracovať tvorivú štúdiu poznatkov na

tému: ,,Uplatnenie progresívnych analytických metód pri detekcii falšovania syrov“.

Pre splnenie stanoveného cieľa bolo potrebné charakterizovať a porovnať fyzikálno-

chemické zloženie kravského a ovčieho mlieka, definovať a charakterizovať syry

a syrové výrobky, poukázať na dôvody falšovania mlieka a syrov a popísať princípy

vybraných analytických metód určených na stanovenie medzidruhového falšovania.

12

2 Metodika práce a metódy skúmania

Záverečná bakalárska práca je kompilačná tvorivá práca vypracovaná na

tému: ,,Uplatnenie progresívnych analytických metód pri detekcii falšovania syrov“.

Základným východiskom bola príprava literálneho prehľadu s využitím aktuálnych

databáz v knižniciach (knižnický a časopisecký fond SLPK) a v rámci rôznych

internetových zdrojov (elektronická knižnica vedeckých a odborných časopisov: Web of

Science, Springer LINK, Knovel, ScienceDirect a iné). V rámci kapitoly: ,,Súčasný stav

riešenej problematiky doma a v zahraničí” je práca rozdelená do týchto samostatných

na seba nadväzujúcich častí:

a) charakteristika kravského a ovčieho mlieka,

b) charakteristika syrov a syrových výrobkov,

c) medzidruhové falšovanie mlieka a syrov,

d) analytické metódy detekcie falšovania syrov.

13

3 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí

3.1 Charakteristika kravského mlieka

Mlieko je uznávaný ako takmer kompletný potravinársky výrobok ľudskej

stravy, pretože poskytuje všetky makroživiny (tuky, cukry, bielkoviny) a všetky stopové

prvky (minerálne látky, vitamíny a enzýmy). Táto skutočnosť platí najmä v prípade

ranného detstva, pretože mlieko je jediným zdrojom živín v priebehu prvých mesiacov

života dieťaťa. Strava rastúcich detí obsahuje vysoký podiel mlieka a mliečnych

produktov. Adekvátny príjem mlieka je tiež odporúčaný pre dospelých ako zdroj

vápnika, pre zachovanie kostnej hmoty, takže zlomeninám a osteoporóze sa dá

predchádzať (Kira, Maio, 2004).

Mlieko je veľmi komplexná tekutina, obsahuje niekoľko stoviek molekúl.

Navyše sa v mlieku nachádzajú početne stopové prvky, napr. minerálne látky, vitamíny,

hormóny, enzýmy a ďalšie zlúčeniny. Chémia týchto zlúčenín je všeobecne podobná

v rámci druhu, ale v mnohých prípadoch sa ich štruktúra líši, čo je odrazom evolučných

zmien. Zloženie mlieka sa líši v rámci každého druhu, medzi jednotlivými druhmi,

plemenami, vo fáze laktácie, krmivom, zdravotným stavom zvierat a v mnohých ďalších

faktoroch. Obsah tuku v mlieku dobytka vykazuje veľké rozdiely medzi plemenami a v

akomkoľvek plemene existuje široká škála obsahu tuku a bielkovín pre jednotlivé

zvieratá. Podobné rozdiely sa vyskytujú v mlieku oviec, kôz a byvolov (Fox, 2009).

Ročná celková produkcia mlieka v súčasnosti sa pohybuje okolo 600 miliónov

ton. Produkcia kravského mlieka predstavuje viac ako 80 %. Mlieko je často

popisované ako koloidná suspenzia, obsahujúca emulgované tukové častice. Zatiaľčo sú

jednotlivé zložky podobné pre mlieko od väčšiny druhov, existujú značné rozdiely

medzi druhmi, a to kvalitatívne (charakter zložiek) a kvantitatívne (množstvo

jednotlivých zložiek na liter) (Huppertz, Kelly, 2009).

3.1.1 Bielkoviny v kravskom mlieku

Kravské mlieko obsahuje približne 3,5 % bielkovín. Koncentrácia sa výrazne

mení počas laktácie, a to najmä počas prvých niekoľkých dní po pôrode. Najväčšia

zmena nastáva v srvátkovej zložke bielkovín. Prirodzenou funkciou mliečnych

bielkovín je dodávanie esenciálnych aminokyselín mláďatám. Aminokyseliny sú

potrebné pre rozvoj svalového tkaniva a iných tkanív obsahujúcich biologicky aktívne

14

proteíny, napr. imunoglobulíny, vitamíny a hormóny bielkovinovej povahy. Vlastnosti

mnohých mliečnych výrobkov v skutočnosti závisia od vlastností bielkovín. Hoci

významný vplyv na výsledný produkt má tuk, laktóza a obzvlášť anorganické soli (Fox,

McSweeney, 1998).

Existujú dva hlavné typy bielkovín v mlieku, ktoré môžu byť oddelené na

základe ich rozpustnosti pri pH 4,6 a 20 ºC. Bielkoviny, ktoré za týchto podmienok

vytvárajú zrazeniny, sa nazývajú kazeíny. Bielkoviny, ktoré zostanú rozpustné

pri pH 4,6 sú známe ako srvátkové bielkoviny (Fox, Kelly, 2004).

3.1.1.1 Kazeíny v kravskom mlieku

Približne 80 % celkového dusíka u hovädzieho dobytka, oviec, kôz a byvolieho

mlieka je kazeín. Kazeín predstavuje len 40 % bielkovín z celkového množstva.

Asi 3 % celkového dusíka v kravskom mlieku sú rozpustné v 12 % kyseline

trichlóroctovej (TCA) a jeho názov je nebielkovinový dusík (NPN). Hlavnou zložkou je

močovina. Tuk v globulínových membránach obsahuje niekoľko špecifických

proteínov, vrátane mnohých enzýmov, v stopových úrovniach, približne 1 % z bielkovín

v mlieku (Fox, Kelly, 2004).Proteíny kazeínu sú rozdelené do 5 tried, αs1-kazeín, αs2-kazeín, β-kazeín, γ-

kazeín, κ-kazeín. Kazeíny sú globulárne proteíny s fosfoserínovým zvyškom, ktorý ma

výnimočné vlastnosti. Molekuly obsahujú tiež hydrofóbne zvyšky. β-kazeín obsahuje

najviac hydrofóbnych komponentov. Afinitný charakter kazeínov a ich fosforylácia

uľahčuje interakciu medzi kazeínom s Ca3(PO4)2. Vytvára vysoko hydratované

komplexy známe ako micely. Kazeínové micely sa skladajú z veľkého počtu sub-micél,

ktoré sa skladajú z viacerých agregátov molekúl kazeínu (Kailasapathy, 2008).

3.1.1.2 Srvátkové bielkoviny v kravskom mlieku

Srvátkové bielkoviny obsahujú β-laktoglobulín a α-laktoalbumín, sérový

albumnín, imunoglobulíny a malé množstvá krvných bielkovín. Srvátkové bielkoviny

majú typický globulárny charakter s pomerne jednoduchou sekvenciou (Kailasapathy,

2008).

3.1.2 Tuk v kravskom mlieku

15

Lipidy v kravskom mlieku sú prítomné v mikroskopických kvapôčkach ako

olejové vodné emulzie. Hlavným účelom týchto lipidov je poskytnúť zdroj energie pre

novonarodené teľa. Obsah tuku a mastných kyselín sa môže líšiť v dôsledku rozličných

faktorov ako sú plemeno, poradie a štádium laktácie, krmivo, zdravotný stav. Obsah

tuku môže kolísať od 3,0 do 6,0 %. Priemerné hodnoty sa pohybujú v rozmedzí 3,5 až

4,7 %. Zmeny v zložení mastných kyselín môžu viesť k zmenám fyzikálnych vlastností

tuku. Z praktického hľadiska, mliečne tuky sú veľmi dôležité ako nutričná výživa,

ovplyvňuje textúrne a senzorické vlastnosti mliečnych výrobkov, ako sú smotana,

maslo, sušené plnotučné mlieko a syry. Mliečne lipidy hovädzieho dobytka sú podobné

mliečnym lipidom ostatných druhov. Existujú rozdiely v množstve diacylglycerolov,

monoacylglycerolov, voľných mastných kyselín, fosfolipidov a sterolov.

Triacylglyceroly tvoria asi 98 % celkového tuku, majú priamy vplyv na

vlastnosti mliečneho tuku, napr. hydrofóbnosť, hustotu mlieka, teplotu tuhnutia.

Triacylglyceroly sa značne líšia v molekulovej hmotnosti a v stupni nasýtenia. Po dojení

čerstvé mlieko obsahuje iba malé množstvo diacylglycerolov a monoacylglycerolov

a voľných mastných kyselín.

Fosfolipidy tvoria asi 0,8 % mliečnych tukov. Avšak, zohrávajú významnú

úlohu v mlieku kvôli ich amfolitickým vlastnostiam. Asi 65 % sa nachádza

v globulárnych membránach, zatiaľčo zvyšok zostáva vo vodnej fáze. Steroly patria

k minoritným zložkám, zahŕňajú približne 0,3 % tuku. Hlavným sterolom je cholesterol,

predstavuje 95 % z celkového množstva sterolov. Mliečny tuk je prítomný v guľových

kvapkách. Ich veľkosť sa pohybuje od 0,2 do 15,0 µm v priemere. Globulárna

membrána tukových kvapiek pozostáva asi zo 40 peptidov (MacGibbon et al, 2006).

Tab. 1 Zloženie mliečneho tuku (MacGibbon et al, 2006)

Skupina lipidov Podiel z celkového obsahu lipidov (%)Triacylglyceroly 98,3

Diacylglyceroly 0,3

Monoacylglyceroly 0,03

Voľné mastné kyseliny 0,1

Fosfolipidy 0,8

Steroly 0,3

3.1.3. Sacharidy v kravskom mlieku

16

Laktóza je hlavným sacharidom v mlieku všetkých cicavcov. Mlieko obsahuje

len stopové množstvá ostatných sacharidov ako sú glukóza, fruktóza, glukozamín,

galaktozamín. Koncentrácia laktózy v mlieku závisí od živočíšneho druhu i od plemena

zvieraťa. Na množstvo pôsobia aj individuálne faktory, infekcia vemena a najmä fázy

laktácie. Mastitída spôsobuje zvýšenie hladiny NaCl v mlieku a následne NaCl

vyvoláva pokles sekrécie laktózy. Laktóza spolu so sodíkom, draslíkom a iónmi

chloridu sa podieľa na udržiavaní osmotického tlaku v prsnom systéme. Každe zvýšenie

alebo zníženie obsahu laktózy je kompenzované zvýšením alebo znížením obsahu

rozpustných solí v mlieku. Laktóza je disacharid zložený z galaktózy a glukózy,

prepojených β (1-4) glykozidovými väzbami. Systémový názov je β-D-galaktóza-(1-4)-

α-D-glukóza. V štruktúre vzorca hydroxyluje skupina na prvom uhlíku

C1 k hydroxylovej skupine C2 orientovanej smerom dole. Laktóza je unikátny sekrét.

Je syntetizovaná z glukózy, ktorá sa vstrebáva z krvi. Jedna molekula glukózy

je izomerizovaná na UDP-galaktózu cez 4 kroky prostredníctvom Leloir enzýmu. UDP-

galaktóza je následne spojená s ďalšou molekulou glukózy (Fox, McSweeney, 1998).

Laktóza je syntetizovaná v epitelových bunkách mliečnych žliaz. V metabolizme

sacharidov má významnú úlohu kontrola a modifikácia α-laktoalbumínu (α-La). Jedna

z úloh mliečnych bielkovín je redukcia Michaelisovej konštanty (KM) pre glukózu až

1000-krát. Existuje pozitívna korelácia medzi obsahom α-La a obsahom laktózy

v mlieku. Syntéza laktózy si vyžaduje osmotické čerpanie vody do vezikúl Golgiho

aparátu. Laktóza ovplyvnuje objem mlieka a koncentráciu kazeínu. Laktóza slúži ako

primárny zdroj energie pre novorodencov. Poskytuje 30 % kalórií kravského mlieka

a slúži ako alternatíva energeticky bohatších lipidov. Mlieko s vysokou koncentráciou

laktózy má nižšiu hladinu lipidov. Laktóza zodpovedá za 50 % osmotického tlaku, ktorý

je v izotonickom pomere s krvou. V mlieku s nízkou koncentráciou laktózy je zvýšená

koncentrácia anorganických solí. Počas mastitídy je poškodená celistvosť bunkových

membrán. Rastie prenikanie zložiek z krvi do mlieka. Osmotický tlak sa zvyšuje.

Následne klesá koncentrácia laktózy. Vlastnosti laktózy sú všeobecne podobné iným

cukrom, ale laktóza sa v niektorých dôležitých technických vlastnostiach líši. Patrí

medzi redukujúce cukry, čo znamená, že ma voľnú karbonylovú skupinu. Aldehydovú

skupinu v prípade laktózy. Môže tvoriť pomocou aldehydových skupín hemiacetálovú

štruktúru. Vznik hemiacetálu je v dôsledku chirálneho uhlíka. Laktóza sa môže

podieľať na Maillardovom neenzymatickom hnednutí. Štandardné metódy na

kvantitatívne určenie laktózy sú polarometrické, spektrofotometrické stanovenia, alebo

17

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Rozpustnosť laktózy sa pohybuje

od 70 g do 500 g na liter. Rozpustné množstvo závisí od teploty. Laktóza je dôležitá pri

výrobe fermentovaných mliečnych výrobkov. Slúži ako zdroj uhlíka pre baktérie

mliečneho kvasenia, ktoré produkujú kyselinu mliečnu (Fox, 2009).

Obr. 1 Vzorec laktózy (URL 1)

3.1.4 Minerálne látky v kravskom mlieku

Minerálne látky v mlieku sú tvorené hlavne hydrogén uhličitanmi, chloridmi,

citrátmi, hydrogén uhličitanmi vápnika, horčíka, draslíka a sodíka. Väčšina minerálov je

rozdelená medzi rozpustnú fázu a koloidnú fázu. 60 % vápnika a 50 % fosforu môže

byť v koloidnej fáze. Distribúcia vápnika, citrátu, horčíka a fosfátov medzi rozpustnou

a koloidnou fázou a ich vzájomné interakcie s mliečnymi proteínmi majú významný

vplyv na stabilitu mlieka a mliečnych výrobkov. Minerály sú prítomné v rovnovážnom

komplexe. Zmena v pomere zastúpenia minerálnych látok v koloidnej a rozpustnej fáze

môže mať vplyv na tieto vlastnosti:

a) tepelná stabilita a alkoholová koagulácia surového mlieka,

b) kvalita a stabilita pri skladovaní koncentrovaných, sušených výrobkov,

c) množstvo kvapiek tuku počas homogenizácie mliečneho tuku,

d) množstvo vápnika v mlieku ovplyvňuje pevnosť tvarohu pri výrobe syrov

a viskozitu fermentovaných výrobkov.

Koncentrácia citrátu mlieka sa líši počas sezóny a zmenou krmiva. Vysoké

množstvo citrátu môže mať vplyv na obsah rozpustného vápnika a stabilitu mlieka.

Minerály ako sodík, draslík a chloridy sú väčšinou v pravých roztokoch v iónovej

forme. Ľahko sa šíria cez membrány počas ultrafiltrácie a elektrodialýzy. Vápnik,

horčík, fosfor a citrát sú čiastočne v roztoku a čiastočne v koloidnej suspenzii,

18

v závislosti od pH mlieka. Približne 20 – 30 % difúzneho vápnika a horčíka

je prítomného vo forme voľných iónov a zvyšok ako soli citrátu a fosfátu. Klesaním pH

mlieka pri výrobe jogurtov a fermentovaného mlieka sa koloidná forma prevádza

na iónovú formu. Minerálne látky sa podieľajú na udržiavaní osmotického tlaku

(Kailasapathy, 2008).

Tab. 2 Zastúpenie minerálnych látok v jednotlivých formách (Kailasapathy, 2008)

Minerálne látky Koloidná forma (%) Rozpustná forma (%)

Vápnik 67 33Horčík 36 64Sodík 4 96

Draslik 6 94Fosór 55 45Citrát 6 94

Chloridy 0 100Síra 0 100

3.1.5 Vitamíny v kravskom mlieku

Vitamíny sú organické látky, ktoré telo potrebuje v stopových množstvách.

Nedokáže si ich syntetizovať v metabolizme. Vitamíny potrebné pre rast a udržiavanie

zdravia sú rozličné medzi druhmi. Vitamíny pre jeden druh môžu byť syntetizované

v primeraných množstvách v metabolizme iných druhov. V chemickej štruktúre

vitamínov neexistuje žiaden vzájomný vzťah. Hlavná klasifikácia vitamínov

je na základe rozpustnosti. Do prvej skupiny patria vitamíny rozpustné vo vode.

Vitamíny skupiny B sú tiamín, riboflavín, niacín, biotín, kyselina pantoténová, kyselina

listová, pyridoxín, kobalamín. Taktiež do tejto skupiny patrí kyselina askorbová

(vitamín C). Druhá skupina pozostáva z vitamínov rozpustných v tukoch: retinol

(vitamín A), kalciferol (vitamín D), tokoferol (a príbuzné zlúčeniny, vitamín E),

fylochinón (a príbuzné látky, vitamín K). Vo vode rozpustné vitamíny a vitamín K majú

funkciu ako koenzýmy pri metabolických reakciách. Vitamín A je dôležitý v procese

videnia, vitamín D funguje ako hormón a vitamín E je primárny antioxidant.

Mlieko je jediným zdrojom živín pre novorodenca v priebehu rannej fázy života.

Musí zabezpečiť dostatok vitamínov na podporu rastu novorodenca. Ľudia by mali

19

konzumovať mlieko počas celého života. Mlieko sa spracováva v menšej alebo

vo väčšej miere pred spotrebou. Pri jeho spracovaní by sa malo dbať na zachovanie

vitamínov v mlieku a v mliečnych výrobkoch (Fox, McSweeney, 1998).

Tab. 3 Zastúpenie vitamínov v ovčom a kravskóm mlieku (Raynal-Ljutovac, 2008)

Vitamíny Ovčie mlieko Kravské mlieko

Vitamin A (mg) 0,08 0,04

Vitamin C (mg) 5 1

Vitamin D (µg) 0,18 0,08

Vitamin E (µg) 0,11 0,11

Vitamin B1 (mg) 0,08 0,04

Vitamin B2 (mg) 0,35 0,17

Vitamin B3 (mg) 0,42 0,09

Vitamin B5 (mg) 0,41 0,34

Vitamin B6 (mg) 0,08 0,04

Vitamin B8 (µg) - 2

Vitamin B9 (µg) 5 5,3

Vitamin B12 (µg) 0,71 0,35

3.2 Charakteristika ovčieho mlieka

Chov oviec je dôležitou súčasťou v národnom hospodárstve v mnohých

krajinách, najmä v oblastiach Stredomoria a Stredného východu. Chov oviec je veľmi

20

dobre rozvinutý vo Francúzsku, Taliansku, Španielsku a Grécku. (Park, Haenlein,

2006).

Avšak, vo veľkom meradle je produkcia ovčieho mlieka a mliečnych výrobkov

obmedzená nízkym objemom v sezónnych cykloch, v objeme okolo 50 kg ročne.

Informácie o zložení a fyzikálno-chemických vlastnostiach ovčieho mlieka sú

rozhodujúce pre úspešný vývoj ovčieho priemyslu. Medzi jednotlivými druhmi mlieka

existujú zreteľné rozdiely v chemickom zložení. V produkcii kravského mlieka sa

vyskytujú minimálne zmeny v priebehu celého roka. Na druhej strane, kravské mlieko

sa odlišuje od ovčieho a kozieho mlieka, ktoré je prevažne vyrábané v sezónnych

chovoch oviec. Počas obdobia produkcie ovčieho mlieka nastávajú zmeny v zložení.

Ku koncu laktácie sa obsah tuku, bielkovín, pevných látok a minerálov zvyšuje, avšak

obsah laktózy klesá. Ovčie mlieko má vyššiu viskozitu, index lomu, titračnú kyslosť

a nižší bod mrazu, ako je priemer kravského mlieka (Haenlein, Wendorff, 2006).

Tab. 4 Zloženie ovčieho a kravského mlieka (Park et al., 2007)

Zloženie Ovčie mlieko Kravské mlieko

Tuk (%) 7,9 3,6Netukové pevne látky ( %) 12 9

Laktóza (%) 4,9 4,7Bielkoviny (%) 6,2 3,2

Kazeín (%) 4,2 2,6Albumín, Globulín (%) 1 0,6Nebielkovinový N (%) 0,8 0,2

Popol (%) 0,9 0,7Kalórie/100ml 105 69

3.2.1 Bielkoviny v ovčom mlieku

Priemerný obsah bielkovín v ovčom mlieku je 5,8 %, oproti kravskému (3,3 %).

Zloženie bielkovín sa mení v rámci druhu, plemena, štádia laktácie, kŕmenia,

klimatických podmienok a zdravotného stavu vemena. Ovčie mlieko obsahuje asi

0,4 až 0,8 % dusíka. Proteíny v ovčom mlieku tvoria približne 95 % celkových

dusíkatých látok a 5 % patrí k nebielkovinovým dusíkatým látkam (Park et al., 2007).

21

Bielkoviny v mlieku sa veľmi dobre zrážajú. Hlavné proteíny ovčieho mlieka sú

približne rovnaké ako v kravskom mlieku. Mliečne bielkoviny sa vyskytujú v dvoch

odlišných fázach. Jedna z nich je stabilná fáza micélií zložená z kazeínov. Micélia majú

v priemere 190 nm. Sú prepojené Ca3(PO4)2 a malým množstvom horčíka, sodíka,

draslíka a citrátu, ktorý rozptyľuje svetlo a spôsobuje nepriehľadný biely vzhľad mlieka.

Druhú fázu bielkovín tvoria rozpustné srvátkové bielkoviny (Ramos, Juarez, 2003).

3.2.1.1 Kazeíny v ovčom mlieku

Kazeíny ako αs1-kazeíny, αs2-kazeíny, β-kazeíny, γ-kazeíny patria medzi

majoritné bielkoviny v ovčom mlieku 76 – 83 % z celkového množstva. Rôznorodosť

kazeínov sa určuje podľa prítomnosti genetických variant, alebo inými faktormi, ako je

fosforylácia, zmeny v rozsahu glykozylácie. Existuje päť polymorfných variant αs1-

kazeínu (A až E variant). Jedným zo skupiny je D variant αs1-kazeínu. Je to najmenej

fosforylovaný genetický variant. Obsahuje menší počet fosfátových skupín. αs1-kazeín

D prechádza dlhšiu dobu cez alkalický polyakrylamidový gel pri kapilárnej

elektroforéze v kyslom pH. Variant αs1-kazeín C sa líši od variantu

αs1-kazeín A aminokyselinami serotonín a prolín na pozícii C13. Určuje straty fosfátovéj

skupiny na C12 z proteínu. Dva varianty αs1-kazeínu A a B, ktoré boli popísané, sa líšia v

nahradení aminokyselín Asn49 a Lys200 za Asp49 a Asn200. Ovčí kazeín β-kazeín je

tvorený 209 aminokyselinami. Negenetickému polymorfizmu dochádza v dôsledku

rôznych stupňov fosforylácie. Existujú tri genetické varianty (A až C). Zistený

sekvenčný rozdiel medzi variantmi A a C bol v substitúcii aminokyseliny Glu z varianty

A na Gln vo variante C. Štruktúra varianty B nie je zatiaľ popísaná. Dostupnosť

a distribúcia vápnika je ovplyvnená rozsahom fosforylácie kazeínov. Sekvencia

ovčieho γ-kazeínu bola určená 171 aminokyselinami. Žiadne genetické varianty neboli

zistené. Negenetické polymorfizmy nastali kvôli rôznym stupňom glykolyzácie. Thr sa

nachádza na pozícii C135, C137,C138. (Park et al., 2007).

3.2.1.2 Srvátkové bielkoviny v ovčom mlieku

Srvátkové bielkoviny v ovčom mlieku predstavujú 17– 22 % z celkových

bielkovín. Medzi srvátkové bielkoviny zaraďujeme β-laktoglobulín (β-Lg) a α-

laktoalbumín (α-La), imunoglobulíny, sérový albumín, proteázové peptóny, ktoré sú

prítomné v menších koncentráciách. Toto sú produkty rozkladu β-kazeínu na plazmín.

Ďalšou rozpustnou bielkovinou v malých množstvách prezentujúcou antibakteriálne

22

vlastnosti je laktoferín. Sérový albumín a imunoglobulíny nie sú špecifické pre mlieko

a sú považované za látky pochádzajúce z krvi. Hlavnou srvátkovou bielkovinou je

β-laktoglobulín. V ovčom mlieku sa skladá z polypeptidového reťazca obsahujúceho

162 aminokyselín. Tri genetické varianty, β-Lg A až C boli popísané. Ovčí β-Lg B

sa odlišuje od β-Lg A v jednej aminokyseline Tyr na pozícii C20. β-Lg C je podtypom β-

Lg A s jednou výmenou (Arg za Gln na pozícii C14). Tieto tri varianty môžu byť

izolované izoelektrickou fokusáciou alebo pomocou kapilárnej elektroforézy. Ovčie β-

Lg alely A a B sú prítomné takmer u všetkých plemien, kým alela C je pomerne

zriedkavejšia a obmedzená na niekoľko konkrétnych plemien (Park et al., 2007).

3.2.2 Tuk v ovčom mlieku

Tuk je kvantitatívna i kvalitatívna pohyblivá zložka mlieka, v závislosti na fáze

laktácie, sezóny, plemena, genotypu a kŕmenia. Rozborom mliečneho tuku bolo

zistené, že krmivo má významný vplyv na zloženie tukov a ich kvalitatívne

a kvantitatívne vlastnosti (Sanz Sampelayo et al., 2007).

Hlavnou charakteristikou mliečneho tuku je vysoký obsah krátkych a stredne

dlhých reťazcov mastných kyselín (MCFA). Tieto mastné kyseliny majú rôzny

metabolizmus v závislosti od dĺžky reťazca. MCFA môžu byť uvoľnené z triglyceridov

v žalúdku žalúdočnou lipázou a  pankreatickou lipázou, vstrebávane priamo črevnými

bunkami (Raynal-Ljutovac, 2008).

3.2.3 Laktóza v ovčom mlieku

Laktóza v ovčom mlieku je zastúpená 4,9 %. Jej koncentrácia sa príliš nemení.

Oligosacharidy s dĺžkou uhlíkového reťazca C3 až C10 podporujú rast bifidobaktérií,

ktoré zohrávajú klúčovú úlohu ako bunky črevnej sliznice v ochrane proti patogénom

(Raynal-Ljutovac, 2008).

3.2.4 Minerálne látky v ovčom mlieku

Ovčie mlieko predstavuje najvyššiu hodnotu sušiny. Rozdelenie vápnika,

fosforu a horčíka medzi rozpustnú a koloidnú fázu mlieka je podobné pre oba typy

mlieka (Holt, Jenness, 1984). Čo sa týka koncentrácie kontaminujúcich kovov výsledky

sú veľmi variabilné v závislosti od určitých faktorov (kŕmenie, zemepisné oblasti,

znečistenie životného prostredia). Preto sa ťažko porovnávajú koncentrácie kovov

23

medzi druhmi a plemenami. Priame informácie o biologickej dostupnosti minerálnych

látok chýbajú. Väčšina doterajších štúdií bola vykonaná v podmienkach in vitro,

s výnimkou vápnika, u ktorých biologická dostupnosť bola dokázan na myšiach

(Buchowski et al., 1989).

Podľa Guéguen et al. (2000) obsah železa je najvyšší v ovčom mlieku.

Vyšší obsah nukleotidov prispieva k lepšiemu vstrebávaniu železa v čreve (Schlimme

et al., 2000). Pokiaľ sa jedná o biologickú dostupnosť zinku (Shen et al., 1995), vyššie

hodnoty má ovčie mlieko a priemerné hodnoty má kravské mlieko.

Tab. 5 Minerálne zloženie ovčieho a kravského mlieka (Raynal-Ljutovaca, 2008)

Prvok Ovčie mlieko Kravské mlieko

Vápnik (mg) 1950 – 2000 1200Fosfor (mg) 1240 – 1580 920Draslík (mg) 1360 – 1400 1500Sodík (mg) 440 – 580 450

Chlorid (mg) 1100 – 1120 1100Horčík (mg) 180 – 210 110Zinok (µg) 5200 – 7470 3800Železo (µg) 720 – 1222 460Meď (µg) 400 – 680 220

Mangán (µg) 53 – 90 60Jód (µg) 104 70

3.3 Charakteristika syrov a syrových výrobkov

Legislatívne požiadavky na mlieko a výrobky z mlieka ošetruje Výnos

Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva zdravotníctva

Slovenskej republiky zo 14. augusta 2006 č. 2143/2006-100.

Syr je zrejúci alebo nezrejúci mäkký, polotvrdý, tvrdý alebo extra tvrdý

výrobok, v ktorom pomer srvátkových bielkovín ku kazeínu nepresahuje pomer

24

bielkovín v mlieku, vyrába sa úplným alebo čiastočným vyzrážaním bielkovín z mlieka

kravského, ovčieho alebo kozieho o rôznom množstve tuku alebo z cmaru, alebo ich

vzájomnou kombináciou pôsobením syridla alebo iných vhodných koagulačných

činidiel, alebo kyseliny mliečnej, vzniknutej biologickým kysnutím mliečneho cukru

a čiastočným oddelením srvátky, uvoľnenej v procese spracovania, alebo inými

výrobnými technikami zahŕňajúcimi koaguláciu bielkovín mlieka, ktorých výsledok je

výrobok s obdobnými fyzikálnymi, chemickými a organoleptickými vlastnosťami.

Zrejúci syr je syr, ktorý nie je určený na konzumáciu krátko po výrobe, ale

ktorý sa musí uchovávať určitú dobu pri určitej teplote, aby došlo k nevyhnutným

biochemickým a fyzikálno-chemickým zmenám, charakterizujúcim príslušný druh

zrejúceho syra. Medzi tieto syry sa zaraďujú aj syry zrejúce pod mazom, ktorých

charakteristický znak je tvorba mazu na povrchu syra počas jeho zrenia.

Hrudkový syr je syr vyrábaný vyzrážaním bielkovín z kravského mlieka

pôsobením syridla a čiastočným oddelením srvátky uvoľnenej v procese jeho výroby.

Ovčí hrudkový syr je syr vyrábaný vyzrážaním bielkovín z ovčieho mlieka

pôsobením syridla a čiastočným oddelením srvátky uvoľnenej v procese výroby.

Bryndza je prírodný syr, vyrábaný zo zrejúceho ovčieho hrudkového syra alebo

zo zmesi zrejúceho ovčieho hrudkového syra vykysnutého syra, alebo zo zmesi

skladovaného ovčieho syra a vykysnutého hrudkového syra. Bryndza musí obsahovať

najmenej 50 hmotnostných percent ovčieho syra zo sušiny výrobku.

3.3.1 Požiadavky na kvalitu syrov a syrových výrobkov

Podľa Výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky

a Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky zo 14. augusta 2006 č. 2143/2006-

100 sú syry charakterizované:

a) množstvom tuku

1. v celej hmote v hmotnostných percentách,

25

2. v sušine v hmotnostných percentách,

b) množstvom sušiny v hmotnostných perchtách

Syry sa podľa množstva vody v beztukovej hmote syra (VBHS) v hmotnostnýchpercentách členia na tieto skupiny:

Tab. 6 rozdelenie syrov podľa vody v beztukovej hmote syra (Výnos MP SR2143/2006-100)

Skupina syra VBHS (%)Extra tvrdý menej ako 47

Tvrdý 47 a menej ako 55Polotvrdý 55 a menej ako 62

Polomäkký 62 a menej ako 68Mäkký najmenej 68

Syry sa podľa spôsobu zrenia členiana na tieto skupiny: a) zrejúce

b) nezrejúce

c) v slanom náleve

Tab. 7 rozdelenie syrov podľa tuku v sušine (Výnos MP SR 2143/2006-100)

Skupina syra t. v s. hmotnostné (%)Vysokotučný 60 a viac

Plnotučný 45 a menej ako 60Polotučný 25 a menej ako 45

Nízkotučný 10 a menej ako 25Odtučnený menej ako 10

Na výrobu syrových výrobkov možno použiť syry vyrábané z mlieka kravského,

ovčieho alebo kozieho, mliečne výrobky z kravského mlieka, ovčieho alebo kozieho

mlieka, obsahujú zložky a prídavné látky len v technologicky nevyhnutne potrebnom

množstve podľa zásad správnej výrobnej praxe, následne ich možno tepelne ošetriť.

Syrové výrobky pomenované podľa niektorého druhu syra nesmú obsahovať

väčší podiel zložiek nemliečneho pôvodu ako 15,0 hmotnostného percenta. Pridávane

zložky možno používať len na dosiahnutie špecifickej chuti, nesmú nahrádzať mliečnu

zložku. Syrové výrobky s pridaním zložiek, ktoré nie sú pomenované podľa niektorého

druhu syra, musia obsahovať podiel syrov v množstve najmenej 51,0 hmotnostného

percenta zo surovín použitých na ich výrobu.

26

3.3.2 Všeobecné požiadavky na označovanie potravín

Požiadavky na označovanie potravín uvádzaných do obehu pre konečného

spotrebiteľa ustanovuje Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky

a Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky z 28. apríla 2004 č. 1187/2004-100

nasledovne:

a) slovné označenie potravín uvádzaných do obehu údajmi podľa Potravinového

kódexu SR musí byť v štátnom jazyku, označovanie v iných jazykoch nie je

zakázané, avšak nesmie byť prekážkou čitateľnosti údajov uvádzaných

v štátnom jazyku,

b) potraviny sa musia označovať tak, aby spotrebiteľ nemohol byť uvedený

do omylu, najmä:

- ak ide o ich vlastnosti, a to najmä druh, pôvod, miesto pôvodu,

zloženie, množstvo, trvanlivosť a spôsob výroby,

- pripisovaním takých účinkov a vlastností, ktoré potraviny nemajú,

- poukazovaním, že potraviny majú osobitné vlastnosti,

hoci v skutočnosti obdobné potraviny majú tiež takéto vlastnosti,

c) v označení potravín sa nesmú uvádzať také údaje, ktoré sa používajú

na označovanie prírodných minerálnych vôd a potravín na osobitné výživové

účely podľa osobitných predpisov, ktoré pripisujú potravine vlastnosť, že

pôsobí preventívne na zdravie ľudí alebo lieči chorobu, alebo sa odvoláva

na takéto vlastnosti,

d) potraviny možno uvádzať do obehu, len ak sú označené podľa hláv PK SR.

Na obale, na jeho súčastiach, ako aj v sprievodnej dokumentácii sa nesmú uvádzať

údaje:

a) potravina je zdrojom všetkých životne dôležitých živín,

b) bežné potraviny nedodajú potrebné množstvo živín, ktoré obsahuje ponúkaná

potravina,

c) potravina má zvýšenú alebo osobitnú výživovú hodnotu v dôsledku prídavku

prídavných látok alebo potravinových doplnkov, ak takúto vlastnosť nemá,

d) potravina má osobitné vlastnosti, aj keď vlastnosti vykazujú všetky

porovnateľné potraviny,

e) potravina je vhodná na prevenciu, zmiernenie, liečenie zdravotnej poruchy

27

alebo na lekárske účely, ak osobitné právne predpisy neustanovujú inak.

3.3.3 Označovanie syrov a syrových výrobkov

V názve syrov so špeciálnou úpravou, ako je údenie, parenie, strúhanie,

porciovanie, sušenie a pod., sa táto úprava musí uvádzať.

Názov ,, ovčia bryndza“ možno uvádzať, len ak ide o bryndzu, na výrobu ktorej

bol ako surovina požitý len ovčí hrudkový syr.

V Názve tepelne ošetrených výrobkov sa musí uvádzať aj spôsob ich tepelného

ošetrenia slovami „ termizované “ alebo „pasterizované”.

V názve mliečnych výrobkov možno používať slovo „bryndzová”, napr.

„bryndzová nátierka”, len ak mliečny výrobok obsahuje podiel bryndze väčší ako 50,0

hmotnostného percenta.

V označovaní syrov vrátane syrových výrobkov, tvarohov, bryndze a výrobkov

z nich, tavených syrov a tavených syrových výrobkov sa musí uvádzať množstvo tuku

niektorým z týchto spôsobov:

a) celkové množstvo tuku v hmotnostných percentách,

b) množstvo tuku v sušine v hmotnostných percentách (t. v s.), pričom množstvo

tuku (x) sa uvádza skratkou „x %” alebo „x % hmot.” (Výnos MP SR

2143/2006-100).

3.4 Medzidruhové falšovanie mlieka a syrov

Ochrana záujmov spotrebiteľa je legislatívne ošetrená v Nariadení (ES) č.

178/2002 Európskeho parlamentu a Rady z 28. Januára 2002.

Potravinové právo sa zameriava na ochranu záujmov spotrebiteľa a poskytuje

spotrebiteľovi podklady na informované rozhodnutia v súvislosti s potravinami, ktoré

konzumuje. Zameriava sa na:

28

a) podvodné alebo nekalé (klamlivé) postupy,

b) falšovanie potravín,

c) akýkoľvek iný postup, ktorý môže spotrebiteľa uviesť do omylu.

Podľa Popelku et al. (2002) sa falšovanie potravín spája so zhoršujúcou sa

kvalitou potravín. Cieľom falšovania potravín je vlastne oklamať spotrebiteľa alebo štát

a získať ekonomický prospech, pričom falšovanie môže predstavovať v niektorých

prípadoch aj závažné zdravotné následky (Hamr, Cuhra, 2004).

Vo svete dopyt po ovčích syroch vzrastá, pretože vzrastá záujem o zdravé

potraviny, získané z ekologického prostredia bez „chémie”, čo posúva ovčie syry na

kvalitatívne vyššiu úroveň. Na Slovensku má svoju tradíciu i ovčie mliekarstvo.

Predurčujú ho k tomu klimatické a pôdne podmienky, členitosť terénu, najmä na

severnom a strednom Slovensku. Pohoria s dostatočným množstvom pasienkov, ktoré

sa ťažšie dajú využiť pre hovädzí dobytok. Zloženie ovčieho mlieka sa výrazne líši od

zloženia kravského mlieka. Ovčie mlieko má v porovnaní s kravským mliekom

približne o 60 – 75 % vyšší obsah bielkovín, z ktorých kazeín tvorí 80 – 85 % a takmer

dvojnásobný obsah tuku. Pri analýze tuku v kravskom a ovčom mlieku potvrdili viacerí

autori bohatšie zastúpenie mastných kyselín v ovčom mlieku, čo mu dáva osobitné

vlastnosti, prejavujúce sa najmä charakteristickou chuťou a vôňou ovčích syrov.

V súčasnosti sa u nás ovčie mlieko spracováva hlavne na hrudkový syr na salašoch

s následným spracovaním na bryndzu v bryndziarňach (Kontová, 2003).

Kvalita mlieka ako suroviny je veľmi široký pojem, ktorý v sebe zahŕňa súbor

výživových, zdravotných, zoohygienických, technologických, ekonomických

i estetických požiadaviek. Mlieko a mliečne výrobky zaujímajú v správnej výžive

ústredné postavenie vďaka typickým organoleptickým vlastnostiam. Originálnemu

a vyváženému zloženiu, či širokému spektru esenciálnych zložiek, ktoré sú nevyhnutné

z hľadiska správnej a preventívnej výživy. Mlieko sa stáva dôležitou surovinou aj pre

ďalšie technologické spracovanie. Pričom kvalita zohráva aj v tomto prípade podstatnú

úlohu. Bielkoviny ovčieho mlieka a výrobkov z neho sa vyznačujú vysokou biologickou

hodnotou a ich obsah a zloženie sú považované za hlavné faktory determinujúce

výťažnosť syrov a kvalitu konečných výrobkov. Základnou technologickou vlastnosťou

mlieka je jeho syriteľnosť. Dobrá syriteľnosť závisí na jeho neporušenom zložení, na

obsahu kazeínových bielkovín, ich zložení, genetickom typ, na obsahu minerálnych

látok a na prirodzenom pH mlieka, ktoré s týmito faktormi súvisia. Množstvo mlieka

29

u oviec sa mení počas dňa, v priebehu laktácie i s poradím laktácie. Na produkciu

mlieka vplýva plemeno, početnosť vrhu, výživa, klimatické podmienky, ako i mnohé

ďalšie činitele. To nabáda spracovateľov ovčieho mlieka k jeho falšovaniu. Dôvody na

falšovanie mlieka sú v prvom rade ekonomické (Zeleňáková et al., 2008).

Dôvody, prečo je odhalenie falšovania mlieka dôležité pre spotrebiteľa:

a) pri miešaní drahšieho ovčieho a kozieho mlieka s kravským dochádza

k redukcii výrobných nákladov a zníženiu produkcie kvalitných výrobkov,

b) chrániť konzumentov, ktorí si neprajú konzumovať mlieko iných druhov;

isté percento obyvateľstva sa vyznačuje alergiou na zložky niektorých druhov

mliek.

V mnohých krajinách má detekcia falšovania syrov mimoriadny význam najmä

z hľadiska zachovania tradícií ich výroby. Z uvedeného dôvodu získali mnohé syry tzv.

ochrannú značku originality (PDO), čo znamená že sú vyrábané z jedného druhu mlieka

a v označení je táto skutočnosť deklarovaná (Zeleňáková et al., 2010b).

V minulých rokoch sa stala druhová identifikácia živočíšnych produktov

dôležitou otázkou týkajúcou sa autentifikácie potravín (Sawyer et al., 2003). Pre

zaručenie originality potravín je potrebný vývoj analytických techník umožňujúcich

úradom a producentom kontrolovať, či produkty sú správne popísané a označené

(Santos et al., 2003).

Mlieko, syry a ďalšie mliečne výrobky sú konzumované na celom svete a majú

veľký obchodný význam v rámci potravinárskeho priemyslu. Mlieko používané pri

výrobe týchto produktov je získané z niekoľkých druhov, vrátane kráv, oviec, kôz a

byvolov. Hoci syr vyrábaný z kravského mlieka dominuje trhu vo väčšine krajín,

významný podiel na trhu tvoria aj syry vyrobené z mlieka iných druhov. Stredomorské

krajiny boli dlhodobo výrobcami vysoko-kvalitných tradičných syrov, ktoré sú

vyrobené z kozieho, ovčieho alebo byvolieho mlieka (napr. Feta, Roquefort,

Mozzarella). Zloženie mlieka jednotlivých živočíšnych druhov ovplyvňuje

charakteristickú chuť a senzorické vlastnosti každého syra. Falšovanie mlieka určeného

na výrobu syra je nežiadúca praktika, ktorá vedie nielen k technologickým

manipuláciam počas spracovania, ale vyvoláva aj zdravotné problémy u spotrebiteľa.

Výrobcovia syra podvodne falšujú drahšie ovčie mlieko za kravské mlieko, aby sa

dosiahlo zníženie výrobných nákladov a zvýšenie zisku. Výrobcovia potravín sú

30

povinní uviesť pôvod mlieka v označení syrov alebo na iných mliečnych výrobkoch.

Niektorí spotrebitelia sa vyhýbajú konzumácii kravského mlieka z dôvodov

neznášanlivosti, alergií, náboženských, etických alebo kultúrnych dôvodov. Preto

z právnych dôvodov týkajúcich sa ochrany spotrebiteľa a zachovania dôvery, by mali

byť syry autentické a správne označené. Problematika autentizácie existuje vo všetkých

oblastiach potravinárskeho priemyslu. Existuje veľa analytických metód, ktoré môžu

odhaliť falšovanie. Referenčná metóda detekcie falšovania kravského mlieka je

založená na izoelektrickej fokusácií γ-kazeínu. Detekčné limity pre všetky nové testy

musia byť rovnaké alebo nižšie ako 1 obj. % kravského mlieka. Stále viac metód

využíva genetické rozdiely medzi druhmi pomocou analýzy DNA alebo

imunologických testov. PCR metódy boli úspešne aplikované na detekciu falšovania

mlieka a syrov. Hoci kvantifikácie sa dosiahlo iba v jednom prípade. Väčšina

imunologických testov využíva na detekciu mliečnych bielkovín (kazeíny,

α-laktoalbumíny, imunoglobulíny IgG) protilátky (Hurley et al., 2006).

3.5 Analytické metódy detekcie falšovania syrov

3.5.1 ELISA

Imunologicko-enzýmový test ELISA ma značné využitie v klinickej diagnostike.

Na začiatku objavu nemali ELISA testy využitie v potravinárskom priemysle. V roku

31

1990 sa ELISA metóda začala používať v environmentálnej oblasti. Najmä ako

detekcia cudzorodých látok v potravinách. V tejto dobe ELISA nebola ešte

prepracovaná pre detekciu alergénov. V nasledujúcom období sa odohrala séria úmrtí

v dôsledku potravinovej anafylaxie. V tomto období alergické reakcie na potraviny

neboli považované za významné riziko pre verejné zdravie. Začalo sa zvyšovať

povedomie obyvateľstva a sledovať alergény v potravinách. Pred zavedením ELISA

testov do bežnej praxe sa potraviny hodnotili na základe organoleptických vlastností

a na základe subjektívneho hodnotenia pozorovateľa. Taktiež sa používali aj

chromatografické metódy, ktoré neboli schopné detegovať alergény bielkovín v malých

množstvách. V súčasnosti sú ELISA testy prepracované a optimalizované na jednotlivé

alergény. Sú komerčné dostupné (Yeung, 2006).

3.5.1.1 Princíp ELISA

ELISA patrí do skupiny heterogénnych imunochemických metód. Súbežne

s rozvojom techniky EIA boli ostatné imunochemické metódy preskúmané a prekonali

obmedzenia používania rádioaktívnych markerov. ELISA metódu možno považovať

za najúspešnejší výsledok skúmania. Štandardný antigén je označený enzýmom

namiesto rádioizotopu a zmeny v enzymatickej činnosti sa považujú za kvantitatívnu

analýzu. Voľné a viazané frakcie musia byť oddelené počas analytického procesu,

pričom toto oddelenie je uľahčené použitím pevnej fázy. Protilátka je kovalentne

viazaná na stene reakčnej jamky. Oddelenie zložky možno dosiahnuť umývaním

jamiek kitu pufrom alebo destilovanou vodou. ELISA technika je založená na troch

hlavných metódach: 1. kompetetívna ELISA, 2. nepriama ELISA, 3. sandwich ELISA.

Na podobnom princípe pracuje aj metóda RIA. Počas priebehu testu sa vytvára súťaž

medzi antigénmi o obmedzený počet väzobných miest protilátky na stenách jamiek. Po

umytí vhodným enzýmovým substrátom „pufrom” sa všetok nenaviazaný materiál

odstráni z jamiek. Prebehne predpísaná doba inkubácie. Po inkubácii sa reakcia zastaví

a aktivita enzýmov je stanovená spektrofotometricky, zmeraním absorbancie. Enzým

zostáva aktívny aj po naviazaní. Antigén pripojený k enzýmu v štandarde sa používa len

na naviazanie protilátok a neblokuje aktivitu enzýmu. Čím je menej analytu vo vzorke,

tým menej analytu súťaží s pridaným enzýmom, ktorý sa naviaže na protilátky na

stenách jamiek. Aktivita enzýmu je vyššia, pretože viacej enzýmu je finálne viazaného

na protilátky. Nepriama ELISA a sandwich ELISA sú nesúťažné metódy. Všetok analyt

32

vo vzorke je viazaný počas testu. Nepriama ELISA sa používa pre kvantitatívnu

a kvalitatívnu analýzu imunoglobulínov alebo veľkých proteínových molekúl. Test je

považovaný za nepriamy. Analyt vo vzorke pôsobí ako protilátka a viaže sa na

imobilizovaný antigén na povrchu reakčnej jamky. Pre kvantifikáciu je enzýmom

značená protilátka pridávaná v nadbytku. Stáva sa citlivou na antigén. Enzým označí

antigén naviazaný na protilátkach na stene reakčnej jamky. Roztok s enzýmom sa

následne odplaví enzýmovým substrátom. Koncentrácia analytu sa zmeria fotometricky.

Následne sa vyhodnotí pomocou kalibračnej krivky zostavenej na základe štandardov,

ktoré sú spracované paralelne. Protilátky špecifické pre analyzovaný antigén sú na

povrchu reakčnej jamky. Jednou z hlavných výhod ELISA je jej univerzálnosť. Môže

byť použitá pre analýzu veľkých a malých molekúl, na rozdiel od homogénnej EIA,

ktorá je obmedzená na zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou. ELISA si

vyžaduje menšiu manipuláciu, ľahšiu skladovateľnosť. Patrí medzi ekonomicky

nenáročné metódy. ELISA je prispôsobená pre rutinné rýchle analýzy vzoriek

(Walczyk, 2005).

Protilátky na báze imunoglobulínov sú štruktúrou podobné glykoproteínom.

Pozostávajú z 82 % až 96 % bielkovín a 4 – 18 % sacharidov. Bielkovina je

produkovaná imunitným systémom za prítomnosti antigénu. Protilátky existujú ako

jedna alebo viacej kópií v Y-tvare, je zložená zo štyroch polypeptidových reťazcov.

Každá protilátka obsahuje dve identické kópie ťažkého reťazca (H) a dve identické

kópie ľahkého reťazca (L). Sú pomenované na základe ich molekulovej hmotnosti. Sú

navzájom poprepájané disulfidovými väzbami. Väzby sú zodpovedné za tvorbu slučiek,

vedú ku kompaktnosti štruktúry molekuly. Koniec ťažkého a ľahkého reťazca, ktorý sa

vyznačuje vysokou variabilitou aminokyselín v rôznych protilátkach, sú označované

ako variabilná doména ťažkého reťazca VH a variabilná doména ľahkého reťazca VL.

Konštantné časti ľahkého reťazca sú označované ako CL, zatiaľčo konštantná časť

ťažkého reťazca sa ďalej delí do troch odlišných subjednotiek CH1, CH2 a CH3. Funkčná

V doména sa podieľa na viazaní antigénu. H doména drží molekulu pohromade a je

zapojený do niekoľkých biologických aktivít ako je komplementarita väzieb a väzba na

bunkovú membránu. Protilátky sú rozdelené do piatich hlavných tried: IgM, IgG, IgA,

IgD a IgE. Najpoužívanejšie protilátky sú IgG (Yeung, 2006).

33

Obr. 2 Štruktúra protilátky (URL 2)

3.5.1.2 Sandwich ELISA

Sandwich ELISA test je citlivý test, ktorý dokáže detegovať a kvantifikovať

koncentráciu špecifických rozpustných proteínov. Sandwich ELISA test môže byť

presnejší, pretože obsahuje protilátky namierené proti dvom alebo viac epitopom

antigénu. Základná Sandwich ELISA metóda používa viac než vysoko koncentrované

protilátky, ktoré sú absorbované alebo potiahnuté na plast jamiek kitu. Imobilné

protilátky slúžia k zachyteniu špecifických antigénov, ako sú potravinové alergény,

ktoré sú prítomné vo vzorkách. Po umytí pufrom, nenaviazaný materiál je vyplavený,

zachytené antigény sú detegované pomocou enzýmovo-konjugovaných protilátok.

Následným pridaním chromogénneho substrátového roztoku sa zvyšuje úroveň

zafarbenia. Táto hodnota sa dá odčítať spektrofotometricky, nastavením správnej

vlnovej dĺžky. Intenzita zmeny farby sa zvyšuje koncentráciou antigénu v jamke kitu.

Výsledky testu je možné vyhodnotiť na základe zostavenej kalibračnej krivky pomocou

štandardov (Yeung, 2006).

34

Obr. 3 Schéma Sandwich ELISA (Yeung, 2006)

3.5.1.3 Kompetetívna ELISA

Metóda začína prichytením antigénu na povrch jamky. Táto nešpecifická

adsorpcia prebieha spontánne. Antigén je samovoľne naviazaný. Väzba je nekovalentná,

ale v podstate nezvratná. Adsorbovaný antigén sa zriedkakedy uvoľňuje v nasledovnom

umývacom kroku. Po vypláchnutí jamiek je pridaný koncentrovaný roztok bielkovín

(serový albumín), ktorý pokryje plastové steny jamky. Bráni neskoršej adsorpcii

protilátok na steny jamky. Doska sa premyje neutrálnym pufrom. Do jednotlivých

jamiek a štandardov známej koncentrácie antigenu sa pridá konjugát.

Konjugát sa viaže na imobilný antigén. Nekonjugované protilátky sa vzájomne

vylučujú. To znamená, že čím vyššia koncentrácia nekonjugovaných protilátok, tým

menšie je množstvo imobilizovaného enzýmu. Potom čo protilátka z konjugátu sa

naviaže na antigén, je doska premytá. Následne sa pridá posledný konjugát, ktorý

vyvolá farebnú zmenu. Reakcia, pri ktorej sa na steny jamky v prvej fáze nenaviaže

žiaden antigén, bude mať najväčšiu absorbanciu a bude braná ako 100 %. V jamkách

s rastúcou koncentráciou antigénu budú klesať namerané hodnoty absorbancie. Jamka,

do ktorej sa pridal štandard s najvyššou koncentráciou antigénu, bude mať najnižšiu

absorbanciu. Výsledky sa následne vyhodnotia na kalibračnej krivke zostavenej zo

štandardov (Creighton, 1999).

35

Obr. 4 Schéma kompetetívnej ELISA (Yeung, 2006)

3.5.2 Izoelektrická fokusácia

Izoelektická fokusácia (IEF) je elektroforetická metóda, ktorá amfoterické

zlúčeniny separuje podľa izoelektrického bodu (pl) pomocou kontinuálneho pH

gradientu. Na rozdiel od zónovej elektroforézy, kde je konštantné pH separačného

média. Vzniká konštantná hustota náboja na povrchu molekuly. Migrácia molekúl má

konštantnú pohyblivosť (v prípade neprítomnosti molekulového sita). Povrchový náboj

amfoterických zlúčenín sa neustále mení a klesá podľa jeho titračnej krivky. Pohybuje

sa pozdĺž pH gradientu až dosiahne rovnovážnu polohu. Miesto, v ktorom pH

zodpovedá hodnote pl. Pohyblivosť sa rovná nule a molekula sa zastaví. Existujú 2 typy

pH gradientov. V prvom prípade je gradient vytvorený a udržuje sa prechodom

elektrického prúdu do roztoku amfoterickej zlúčeniny, ktorá je bližšie k pl hodnote.

Príčinou elektroforetického transportu amfolytov (CAs) je vzájomný pomer hodnoty pl

a pH gradientu, ktorý stúpa v smere od anódy ku katóde. Na začiatku procesu, médium

má stále pH, ktoré sa rovná priemernej hodnote pl transportovaných amfolytov CAs.

Väčšina kyslých amfolytov sa pohybuje k anóde, kde je koncentrácia pH v rovnováhe

s hodnotou pl, zatiaľčo zásadité amfolyty sú poháňané ku katóde. Niektoré amfolyty

vstupujú do oblastí s vyšším alebo nižším pH, kde nie sú už v izoelektrickej rovnováhe.

Akonáhle sa do týchto miest nahrnie veľké množstvo amfolytov, na základe napätia sa

36

amfolyty vracajú do rovnovážnej pozície. Tento kyvadlový pohyb, difúzia verzus

elektroforéza, je hlavnou príčinou zvyškového prúdu pozorovaného pri izoelektrickom

rovnovážnom stave. Molekula proteínu vzorky postupne dosahuje izoelektický bod.

Hodnota pH sa rovná pl hodnote (Righetti, 2004).

3.5.2.1 Voľná prietoková elektroforéza (FFE)

Oddeľuje nabité častice, ktoré sú nepretržite vnášané do transportného filmu

tečúceho medzi dvomi rovnobežnými platňami. Elektrické pole pôsobí kolmo na smer

toku. Vzorka sa v dôsledku elektroforetickej mobility alebo izoelektrického bodu

separuje a vytvára špecifický obraz. FFE metóda je vhodná na separáciu biopolymérov

(Zhan et al., 2009).

3.5.3 Chromatografické metódy

3.5.3.1 Hydrofóbna interakčná chromatografia (HIC)

Pomocou tejto metódy bol separovaný a stanovený denaturovaný αs1-kazeín,

αs2-kazeín, β-kazeín a κ-kazeín v kravskom ovčom kozom mlieku, mliečnej zmesi

a syroch. Použil sa Propyl stĺpec v prítomnosti močoviny 8,0 M v mobilnej fáze.

Metóda je založená na rýchlom a ľahkom rozpúšťaní vzoriek v 4,0 M guanidázovom

tiokyanáte bez akejkoľvek predbežnej manipulácie alebo separácie kazeínovej frakcie.

Podmienky boli optimalizované na základe komerčných bovínnych štandardov kazeínu

a ich zmesí. V optimalizovaných chromatografických podmienkach boli 4 kazeínové

frakcie separované za menej ako 45 minút. Lineárny vzťah medzi koncentráciou

kazeínu a plochou piku pri vlnovej dĺžke 280 nm bol získaný v koncentračnom

rozmedzí od 0,5 do 40 µM. Detekčný limit pre α-, β-, κ-kazeín bol medzi

0,37 a 0,7 µM. Presnosť metódy bola vyhodnotená ako koeficient variácie stanovený

v rozmedzí 3,0 až 6,0 %. Metóda je overená, referenčnou analýzou sušeného

odstredeného mlieka (BCR-063R). Metóda sa aplikovala aj na kvalitatívnu

a kvantitatívnu analýzu kazeínovej frakcie v nespracovanom surovom kravskom, ovčom

a kozom mlieku. HIC chromatogram bol navrhovaný a analyzovaný s cieľom

vyhodnotiť možné použitie metódy na detekciu falšovania mlieka a syrov (Bramanti et

al., 2002).

37

3.5.4 PCR metóda

3.5.4.1 Charakteristika PCR

PCR je polymerázová reťazová reakcia prebiehajúca v podmienkach „in vitro”.

PCR bola vynajdená Kary Mullis v 1986. PCR metóda má najväčšie zásluhy vo

výskume v oblasti molekulárnej biológie, v diagnostike a súdnom lekárstve. Postupne

sa vyvíjali a špecifikovali rady aplikácií: priame klonovanie z génovej DNA a cDNA,

genetické skúmanie súdnych vzoriek, analýza sekvenčných variacií (HLA-typov),

klinická diagnóza vírusových infekcií, prenatálna diagnostika dedičných chorôb,

mutagenéza a genómové mapovanie. Spôsoby využitia stále pribúdajú.

3.5.4.2 Princíp PCR

Jeden PCR cyklus pozostáva z troch krokov. V prvom kroku sa vzorka zahreje

na 93 ºC až 96 ºC, aby úplne denaturovala templátová DNA. V druhom kroku jedno

vlákno DNA vzorky je ochladené na vhodnú teplotu a primery sa hybridizujú

s príslušnými komplementárnymi sekvenciami cieľovej DNA. Táto hybridná molekula

slúži ako šablóna a miesto začatia pre DNA polymerázu, ktorá rozrušuje základnú

sekvenciu DNA molekuly od 3’konca. V prvom cykle rozšírenie DNA polymerázy

presahuje komplementárnu sekvenciu ostatných primerov. Syntetizovaná DNA slúži

ako väzobné miesto pre ďalší primer v nasledujúcich PCR cykloch. Každým cyklom sa

zdvojnásobí množstvo cieľovej DNA sekvencie, čo vedie k exponenciálnemu

hromadeniu amplikón. Tieto tri kroky sa opakujú, pokiaľ nie je dosiahnutá požadovaná

koncentrácia. Používaním termostabilnej DNA polymerázy sa otvorila cesta

k automatizácii. Všetky komponenty sú pridané do reakcie na začiatku. Celý proces

prebieha v uzavretom termocykléri. Prístroj zodpovedá za zmenu teploty v jednotlivých

cykloch.

Reakčné komponenty

DNA Polymeráza

Na začiatku sa používala DNA polymeráza získaná z Escherichie coli. Tento

enzým nebol termostabilný. Musel byť dopĺňaný po každom cykle. Optimálna teplota

enzýmu je 37 ºC. Pre kvalitný priebeh amplifikácie je teplota príliš nízka. Zavedením

termostabilnej DNA polymerázy sa zvýšila citlivosť, špecifickosť, výťažok reakcie

a zjednodušil sa postup. Najčastejšie používanou DNA polymerázou je Taq polymeráza,

ktorá bola izolovaná z Thermus aquaticus. Táto termofilná baktéria žije v horúcich

prameňoch Yellowstonského parku. Teplota vody dosahuje 96 ºC. Enzým obsahuje

38

približne 200 nukleotidov za optimálnych podmienok. Syntetická rýchlosť dramaticky

znižuje teplotu. Enzým je stále aktívny pri izbovej teplote. Aktivita enzýmu je značne

ovplyvnená koncentráciou iónov Mg2+. Aktivita enzýmu klesne na polovicu pri 95 ºC za

40 minút.

Primery

Primery sú 15 – 30 bp dlhé oligonukleotidy. Ohraničujú DNA sekvenciu

z oboch strán. Sekvencia primerov a ich kombinácia sú najviac rozhodujúce faktory

špecifickosti, efektívnosti a zaručenia celkového úspechu PCR. Fyzikálne vlastnosti

primerov musia spĺňať nasledovné požiadavky: mali by obsahovať G-C kombináciu

nukleotidov, optimálnu dĺžku, teplotu denaturácie, atď. Opakovaným úsekom

nukleotidov je potrebné sa vyvarovať. Primer by nemal mať formu sekundárnej

štruktúry, ktorá môže brániť priľnutiu na cieľovú DNA. 3’konce primerov by sa mali

vyhýbať komplementarite, aby sa zabránilo tvorbe diméru primerov. Primerová

štruktúra sa tvorí pomocou počítačového softvéru, ktoré berú do úvahy všetky tieto

faktory a vyberú najlepšie možné sekvencie. Môže sa stať, že DNA sekvencia

cieľového génu nie je známa, iba sekvencie proteínu sú k dispozícii. Vzhľadom na

kódovanie aminokyselín môže nastať situácia, keď správnu sekvenciu DNA nie je

možné určiť z bielkovinovej databázy. V tomto prípade nešpecifické PCR primery sú

použité. Sú to zmesi oligonukleotidov, ktoré reprezentujú všetky možné kódovania

sekvencií.

Taq polymeráza

Taq polymeráza vyžaduje prítomnosť dvojmocných katiónov Mg2+, Mn2+

v reakčnej zmesi. Optimálna koncentrácia Mg2+ je približne 1,5 mM. Táto hodnota musí

byť prepočítaná pre každý pár primerov. Presnosť enzýmu je tiež závislá na

koncentrácii Mg2+. Taq polymeráza vyžaduje pH 8,2 až 9,0 v 10-mM Tris pufer. Taktiež

je potrebný prebytok všetkých štyroch deoxynukleotidov. Optimálna koncentrácia

dNTP je závislá na dĺžke produktu, koncentrácií primerov a reakčnej presnosti. DNTP

roztok redukuje voľné Mg2+.

DNA pre PCR môže byť izolovaná z krvi, tkaniva, bunkových kultúr, forenznej vzorky.

Základnou požiadavkou je neporušenosť vzorky bez chemických látok, ktoré inhibujú

PCR. V klinických vzorkách sú najčastejšími inhibitórmi porfyríny a heparíny.

39

Kontaminanty

Vzhľadom k extrémnej citlivosti PCR je kontaminácia veľkým problémom.

Najčastejším problémom je prenos kontaminácie, keď produkt predchádzajúcej PCR

kontaminuje reakciu. Majú byť prijaté bezpečnostné opatrenia, aby sa minimalizovalo

riziko kontaminácie (napr. vyhradená sada pipiet). Pre sledovanie kontaminácie sa vždy

vykonávajú kontrolné experimenty, ktoré neobsahujú templátovú DNA.

Termocykler

Základne požiadavky na prístroj sú: vysoká presnosť teplôt a opakovateľnosť,

vysoká rýchla a presná opakovateľnosť cyklov. Prvé termocykléry používali tri vodné

kúpele, ktoré mali nastavenú teplotu pre jednotlivé cykly. To si vyžadovalo veľký

priestor pre zariadenie. Vzorky sa prekladali ručne alebo pomocou robotickej ruky.

Dnes používa termocyklér na riadenie teploty inkubačné hliníkové bloky. Rýchla

zmena teploty a opakovanosť v cykloch je najnáročnejší technický proces termocykléra.

Hliníkový blok je schopný pojať veľké množstvo vzoriek. Moderný termocyklér až 384

vzoriek. Zohrievanie a chladenie hliníkového bloku prebieha rýchlosťou 1 ºC až 2 ºC za

sekundu. Vzorky musia byť inkubované dlhšiu dobu počas PCR, aby bola zaistená

rovnomernosť. Konvenčné termocykléry nedokážu zmeniť teplotu dostatočne rýchlo,

aby využili kinetickú energiu PCR. Kapilárne PCR stroje využívajú sklenené kapiláry

ako stojany na vzorky. Povrch kapilár je podstatne väčší ako povrch plastových rúrok.

Prístroj využíva vzduch ako prenosné médium pri odvádzaní tepla. Sklenené kapiláry

majú niekoľko krát menšiu tepelnú kapacitu, preto je zmena teploty rýchlejšia. Tepelný

výkon môže dosiahnuť 5 ºC až 10 ºC/s-1. To má niekoľko výhod. Znižuje celkový čas

potrebný pre priebeh celej PCR reakcie. PCR s 35 cyklami trvá priemerne asi 15 minút

(Kiss, 2002).

3.5.4.3 Imuno-PCR (IPCR)

Imuno-PCR je veľmi sľubná metóda pre ultrasenzitívnu analýzu proteínov

a ďalších antigénov. IPCR kombinuje ELISA metódu a PCR. V dôsledku toho IPCR je

asi 1000 až 10000-krát citlivejšia ako ELISA. Taktiež odhaľuje veľmi dynamický

lineárny rozsah. Boli vypracované postupy pre kompetetívnu IPCR, multiplex-IPCR.

Súčasný nedostatok v oblasti optimalizácie IPCR je spojený s vysokou citlivosťou na

kontaminanty a falošne pozitívne signály. IPCR ako rutinná metóda si vyžaduje vysoko

štandardizované protokoly a dobre vyškolený personál (Adler et al., 2003).

40

Záver

Falšovanie mlieka predstavuje najvýznamnejší problém pri výrobe ovčieho

hrudkového syra. Nízka a sezónna produkcia ovčieho mlieka zapríčiňuje vysokú cenu

základnej suroviny pre výrobu produktov. Snaha výrobcov o redukciu nákladov na

výrobu vedie k pridávaniu kravského mlieka do kvalitnejšieho ovčieho. Hlavným

cieľom výrobcu je finančný zisk. Bryndza vyrábaná na Slovensku musí obsahovať

minimálne 50 % ovčieho hrudkového syra. Slovenský trh je zaplavený bryndzou

dovážanou z Poľska. V takejto bryndze je podiel OHS menší. Dovoľuje to legislatíva

danej krajiny.

Pridávanie mlieka vyvoláva radu komplikácií. Hlavným problémom je klamlivá

reklama. Zdravie spotrebiteľa môže byť takýmto počínaním ohrozené. Určitá skupina

ľudí je intolerantná na zložky kravského mlieka, ako je kazeín alebo laktóza.

Odhaľovanie falšovania syrov sa uplatňuje pomocou imunologických

a neimunologických metód. K najpoužívanejším metódam patria imunologické a to

PCR a ELISA. Štátna veterinárna a potravinová správa pravidelne odoberá vzorky

syrov. Referenčné laboratórium sa nachádza v Dolnom Kubíne. Zníženie množstva

falšovaných syrov by sa mohlo dosiahnuť dôkladnejšími kontrolami výrobcov.

41

Zoznam použitej literatúry

1 ADLER, M. – WACKER, R. NIEMEYER, CH. M. 2003. A real-time immuno-

PCR assay for routine ultrasensitive quantification of proteins. In Biochemical and

Biophysical Research Communications. 2003, s. 240-250.

2 BRAMANTI, E. – SORTINO, CH. – RASPI, G. 2002. New chromatographic

method for separation and determination of denatured αs1-, αs2-, β- and κ-caseins by

hydrophobic interaction chromatogramy. In Journal of Chromatography A, 2002, s.

157-166.

3 BUCHOWSKI, M. S. – SOWIZRAL, K. C. – LENGEMANN, F. W. – VAN

CAMPEN, D. –MILLER, D. D. 1989. A comparison of intrinsic and extrinsic tracer

methods for estimating calcium bioavailability to rats from dairy foods. In Journal

of Nutrition [online], 1989, s. 228-234 [cit. 2011-02-19]. Dostupné na: <

http://jn.nutrition.org/content/119/2/228.full.pdf>.

4 CREIGHTON, T. C. 1999. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

In Encyclopedia of Molecular Biology, Volumes 1-4. B. m. : John Wiley & Sons,

1999. ISBN 978-0-471-15302-3.

5 FOX, P. F. 2009. Milk: an overview. In Milk Proteins: From Expression to Food. B.

m. : Elsevier, 2009. s. 1-26. ISBN 978-0-12-374039-7.

6 FOX, P. F. – McSWEENEY, P.L.H. 1998. Dairy Chemistry and Biochemistry. B. m. : Springer - Verlag, 1998. 478 s. 978-0-412-72000-0.

7 FOX, P. F. – KELLY, A. L. 2004. The caseins. In Proteins in Food Processing. B.

m. : Woodhead Publishing, 2004. s. 27-71. ISBN 978-1-85573-723-5.

8 GUÉGUEN, L. – POINTILLART, A. 2000. The bioavailability of dietary calcium.

In Journal of the American College of Nutrition, roč. 19, 2000, č. 2, s. 119-136.

9 HAENLEIN, G.F.W. – WENDORFF, W.L., 2006. Sheep milk – production and

utilization of sheep milk. In Handbook of Milk of Non-Bovine Mammals. Iowa :

Blackwell Publishing Professional, 2006. S. 137-194. ISBN 0-8131-2051-0.

10 HAMR. K – CUHRA, P. 2004. Falšovaní potravin a jeho prokazování, zajímavé

prípady. In Výživa a potraviny, roč. 59, 2004, č. 4, s. 92-93. ISSN 1211-846X.

11 HOLT, C. – JENNESS, R. 1984. Interrelationships of constituents and partition of

salts in milk samples from eight species. In Comparative Biochemistry and

Physiology Part A: Physiolog, roč. 77, 1984, č. 2, s. 275-282.

42

12 HUPPERTZ, T. – KELLY, A. L. 2009. Properties and Constituents of Cow’s Milk.

In Milk Processing and Quality Management. B. m. : John Wiley & Sons, 2009. s.

23-47. ISBN 978-1-4051-4530-5.

13 HURTLEY, P. I. – COLEMAN, R.C. – IRELAND, H. I. – WILLIAMS, J. H.H.

2006. Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of

adulteration of milk and soft cheese. In International Dairy Journal, roč. 16, 2006,

s. 805-812.

14 KAILASAPATHY, K. 2008. Chemical Composition, Physical and Functional

Properties of Milk and Milk Ingredients. In Dairy Processing and Quality

Assurance. B. m. : John Wiley & Sons, 2008. s. 75-103. ISBN 978-0-8138-2756-8.

15 KIRA, C. S. – MAIO, F. D. 2004. Comparison of partial digestion procedures for

determination of Ca, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, and Zn in milk by inductively

coupled plasma optical emission spectrometry. In Journal of AOAC International,

roč. 87, 2004, č. 1, s. 151-156.

16 KISS, C. 2002 PCR (Polymerase Chain Reaction). In Wiley Encyclopedia of

Molecular Medicine, Volumes 1-5. B. m. : John Wiley & Sons, 2002. ISBN 978-0-

471-37494-7.

17 KONTOVÁ, Marcela. 2003. Zmeny bielkovín a tuku u kravského a ovčieho syra

Roquefortoveho typu. In Výživa a potraviny pre tretie tisícročie „Funkčné

potraviny” 2003 : 4. ročník vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou. Nitra :

Slovenská Poľnohospodárska Univerzita v Nitre, 2003, s. 207-211. ISBN 80-8069-

249-174-6.

18 MACGIBBON, A.K.H. – TAYLOR, M.W. 2006. Composition and Structure of

Bovine Milk Lipids. In Advanced Dairy Chemistry, volume 2. B. m. : Springer –

Verlag, 2006. s. 1-42. ISBN 978-0-387-26364-9

19 Nariadenie (ES) č. 178/2002 Európskeho parlamentu a Rady z 28. Januára 2002.

20 PARK, Y. W. – HAENLEIN, G. F. W., 2006. Goat milk, its products and nutrition.

In Handbook of Food Products Manufacturing. New York : John Wiley & Sons,

2007. s. 447-486.

21 PARK, Y.W. – JUÁREZ, M. – RAMOS, M. – HAENLEIN, G.F.W. 2007.

Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. In Small Ruminant

Research, roč. 68, 2007, s. 88-113.

43

22 POPELKA, P. – HORSKÁ, D. – GOLIAN, J. – MARCINČAK, S. 2002. Detekcia

falšovania ovčieho mlieka a syrov pomocou enzýmovej imunoanalýzy (ELISA). In

Slovenský veterinársky časopis, roč. 3, 2002 s. 36-37. ISSN 1335-0099.

23 RAMOS, M. – JUAREZ, M. 2003. Sheep milk. In Encyclopedia of Dairy Sciences,

vol. 4. Amsterdam : Academic Press, 2003 s. 2539-2545. ISBN 0-12-227239-0.

24 RAYNAL–LJUTOVAC, K. – LAGRIFFOUL, G. – PACCARD, P. – GUILLET, I.

– CHILLIARD, Y. 2008. Composition of goat and sheep milk products: An update.

In Small Ruminant Research, roč. 79, 2008, č.1, s. 57-72.

25 RIGHETTI, P. G. 2004. Determination of the isoelectric point of proteins by

capillary isoelectric focusing. In Journal of Chromatography A, 2004, s. 491-499.

26 SANTOS, J. – FERNANDES, P. – BARDSLEY, R. 2003. Portuguese „PDO“

cheese and species origin of Milk. In Electronic Journal of Environmental,

Agricultural and Food Chemistry, roč. 2, 2003, s. 476-479. ISSN 1579-4377.

27 SAWYER, J. – WOOD, C. – SHANAHAN, D. – GOUT, S. 2003. Real-time PCR

for quantitative meat species testing. In Food Control, roč. 14, 2003, s. 549-583.

28 SHEN, L. – ROBBERECHT, H. – VAN DAEL, P. – DEELSTRA, H. 1995.

Estimation of the bioavailability of Zinc and Calcium fromhuman, cow’s, goat and

sheep milk by an in vitro method. In Biological Trace Element, roč . 49, 1995, s.

107-118.

29 SCHLIMME, E. – MARTIN, D. – MEISEL, H., 2000. Nucleosides and nucleotides:

natural bioactive substances in milk and colostrums. In British Journal of Nutrition,

roč. 84, 2000, č. 1, s. 59–68.

30 HALKEN, S. 2003. Early sensitisation and development of allergic airway

diseaserisk factors and predictors. In Paediatr. Respir. Rev. vol. 4 , 2003, no. 4, p.

128-134.

31 Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva

zdravotníctva Slovenskej republiky z 28. Apríla 2004 č. 1187/2004-100.

32 Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva

zdravotníctva Slovenskej republiky zo 14. Augusta 2006 č. 2143/2006-100.

33 WALCZYK, T. 2005. Iron Speciation in Biomedicine. In Handbook of Elemental

Speciation II - Species in the Environment, Food, Medicine and Occupational

Health. B. m. : John Wiley & Sons, 2005. s. 218-238. ISBN 978-0-470-85598-0.

44

34 YEUNG, J. 2006. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for detecting

allergens in foods. In Detecting Allergens in Food. B. m. : Woodhead Publishing,

2006. s. 109-124. ISBN 978-1-85573-728-0.

35 ZHAN, Y. – LEMMA, T. – MUSTEATA, M. F. – PAWLISZYN, J. 2009.

Development of a simple ampholyte-free isoelectric focusing slab electrophoresis

for protein fractionation. In Journal of Chromatography A, 2009, s. 2928-2933.

36 ZELEŇÁKOVÁ, Lucia – GOLIAN, Jozef – ZAJÁC, Peter 2010. Nové trendy

v detekcií falšovania mlieka a syrov . In Mléko a sýry 2010. Praha : Vysoká škola

chemicko-technologická v Praze, 2010, s. 161-167. ISBN 978-80-7080-760-6.

37 ZELEŇÁKOVÁ, L. – GOLIAN, J. 2008. Application of ELISA tests for detection

of milk and cheese adulteration. Monograph. In Slovak agricultural university in

Nitra. Nitra : Vydavateľstvo SPU, 2008. 98 p. ISBN 978-80-552-0075-0.

38 ZELEŇÁKOVÁ, L. – ŽIDEK, R. – ČANIGOVÁ, M. – PAULOV, J. –

GALLISOVÁ, T. 2010b. Evalution of Elisa method to detection of cow

β-laktoglobulin in sheep milk and sheep cheese. In Potravinárstvo [online], roč. 4,

2010, č. 4, s. 80-84 [cit. 2011-02-10]. Dostupné na :

<http://www.potravinarstvo.com/journal1/index.php/potravinarstvo/article/view/

78/81>. ISSN 1337-0960.

Internetové zdroje:

URL 1: http://laktoza.navajo.cz/ [cit. 2011-05-10]. Dostupné na:

<http://laktoza.navajo.cz/>.

URL 2: http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Chorismate5.html [cit. 2011-05-

08]. Dostupné na: <http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Chorismate5.html>.

45

46