國立中興大學食品暨應用生物科技學系研究所...

國立中興大學食品暨應用生物科技學系研究所

碩士學位論文

從白蠶糞便分離出能利用膳食纖維的乳酸菌

Isolation of Lactic Acid Bacteria Using Dietary

Fiber from Feces of Silkworm

指導教授：林美吟博士 Ph.D. Mei-Yin Lin

研究生：林宏任 Hung-Jen Lin

中華民國一○一年七月

i

誌謝辭

回顧碩士這兩年，我的經歷還真的是會給人感到峰迴路轉。原本會選擇就讀

碩士，一方面是父母半推半就，另一方面也是有點想拖兵役的企圖心（笑），沒

甚麼確定的目標，進到實驗室也是一副隨時要走的想法，觀望了大約半年才下定

決心要把碩士弄好。最大的驚險就是在碩二上的一個實驗行程開天窗，導致碩二

下被迫重新設計實驗，當初真的認為會來不及趕畢業，還以為延畢延定了呢！不

過多虧老師、同學的不離不棄，我還是成功的應屆畢業了（汗）。

由於這個實驗室人數較少，能隨時請教的學長姊不多，所以在我整個實驗從

決定方向、擬定實驗方法到實驗器具操作，真的都是多虧毅恆在各方面的指導，

雖然中途曾經也有點小摩擦，但毅恆還是很盡責的指導我到最後，可以說沒有毅

恆我根本不可能在一個學期就把實驗做完，我對此真的萬般感謝。也謝謝老師的

關心，明明人遠在嘉義而且時間安排也很緊湊，仍然願意撥空指導我的實驗還有

論文，各種方面都笨矬的我能夠口試及格也多虧老師的力挺，真的非常感謝您的

教導。

最後謝謝父母讓我有機會體會碩士生活且不用煩惱學費的問題，這讓我碩士

期間的壓力減輕不少，且在待人接物以及臨機應變的能力上也因為實驗需要有相

當大的成長，現在覺得父母當初建議就讀碩士是有其價值存在的，這點真的要謝

謝父母這兩位人生的前輩，希望在未來的工作上能學以致用、一帆風順。

ii

摘要

常用來分解農業纖維素廢棄物的是真菌屬微生物，在特定環境下會產生真菌

毒素，如應用在食品上容易對人體造成危害。乳酸菌是 GRAS 的一種，如果能用

乳酸菌取代真菌類微生物，便能改善一些發酵程序上的衛生安全問題。因此本實

驗目的為篩出具有強力植物纖維素分解能力的乳酸菌菌株。

將白蠶糞便用 MRS broth、選擇性培養基、乳酸菌特性分析作篩選，總共篩

選出 32 珠具有纖維素、木糖分解能力又符合乳酸菌特性的菌株。這 32 株菌經由

纖維素酵素活性測定選出前 10 強做菌種鑑定，鑑定結果其中 8 株有高機率為

Enterococcus mundtii，剩餘 2 株則可能是 Enterococcus casseliflavus、Enterococcus

gallinarum。前者為乳酸菌，後者兩個皆為致病菌。

鑑定過的菌株與 Aspergillus clavatus 真菌比較纖維素酵素活性的結果，雖然

是真菌的酵素活性較高，但篩選菌株仍具有可在厭氧環境下繁殖、能利用木糖和

纖維素生長的優勢，在研究上都依然具有發展潛力。

iii

Abstract

Commonly used to break down agricultural wastes of cellulose are fungal

microorganisms of the genus, in a specific environment will produce mycotoxins,

such as applied to the food easy to cause harm to the human body. Lactic acid

bacteria are GRAS, if replaced by lactic acid bacteria fungi microbes will be able to

improve some health and safety issues on the fermentation process. Therefore, this

experiment aimed at screening with powerful plant cellulose-decomposing ability of

lactic acid bacteria strains.

Isolation of silkworm feces by MRS broth, selective medium, analysis of

characteristics of lactic acid bacteria, total filter out 32 strains. Strain can decompose

cellulose and xylose, and has the characteristics of lactic acid bacteria. Determination

of cellulase enzyme activity, then the election of the top 10 did identification. 8

strains of high-probability is Enterococcus mundtii. 2 strains possibilities are

Enterococcus casseliflavus, Enterococcus gallinarum.

Strains of fungi and Aspergillus clavatus comparison cellulase enzyme activity

results, although higher enzyme activity of fungi, but filtered strains still has

advantages, can breed in anaerobic environments, use cellulose and xylose to grow.

Research still has growth potential.

iv

目錄

誌謝辭………..……………………………………………………………………………………….…….…………i

中文摘要…………………………………………………………………………………………………….…………..ii

英文摘要………………………………………………………………………………………………………………..iii

表次……………………………………………………………………………………….…………………….…vi

圖次…………………………………………………………………………………………………………….…vii

第一章前言…………………………………………………………………………………………………………1

第二章文獻回顧…………………………………………………………………………………………………2

一、乳酸菌簡介……………………………………………………………………………………………..2

二、乳酸菌的多元化應用………………………………………………………………………………6

三、農業廢棄物簡介………………………………………………………………………………………8

四、植物細胞壁成分…………………………………………………………………………………….10

五、纖維素簡介…………………………………………………………………………………………….11

六、纖維素水解酵素…………………………………………………………………………………….14

第三章材料與方法…………………………………………………………………………………………….16

一、實驗材料…………………………………………………………………………….………………….16

（一）樣品採集………………………………………………………………………….…………16

（二）培養基與其配製…………………………………………………………………………16

（三）溶液配製……………………………………………………………………….……………17

（四）化學試藥……………………………………………………………….……………………18

（五）儀器設備…………………………………………………………………….………………18

二、實驗方法………………………………………………………………………………………….….…19

（一）乳酸菌的分離篩選（A 組）………………………………….…………….…….19

1.取得草食性昆蟲糞便………………………………………….………………….……19

v

2.菌株篩選與保存…………………………………………………………….…..…...…19

3.選擇性培養基篩選……………………………………………….…………….….....19

4.乳酸菌特性篩選…………………………………………………………………………20

（二）乳酸菌的分離篩選（B 組）……………………………………………….....…20

（三）纖維素酵素活性測定………………….………….…….……………………..…...21

1.葡萄糖標準曲線……………………..….………….…….…………………………….21

2.預實驗………………….……………………….……………………….……………........22

3.纖維素水解酵素活性測定…………………….……………………….………..…22

4.菌種鑑定…………………………………………………………………………………..…23

（四）與真菌屬比較酵素活性………………….…….……………………….………....24

1.菌數計算…………………….….……………………….………………………………….24

2.細菌纖維素酵素活性測定………………….……………………………………...25

3.真菌纖維素酵素活性測定………………….…………………………………..….26

4.比較與潛力評估………………….……………………………………………………...26

第四章結果與討論…………………….……………………………………………………………………...27

一、乳酸菌篩選結果……………………………………………………………………………..…..…27

（一）A 組………………….………………………………………………………………………….27

（二）B 組………………………………………………………………………………………..…...29

二、纖維素酵素活性測定結果…………………………………………………………..…………30

三、細菌屬與真菌屬比較纖維素酵素活性…………….………………………..….….…..32

第五章結論…………………………………………………………………………………….……..…….…….35

表首頁…………………………………………………………………………………….……..…….………………..36

圖首頁…………………………………………………………………………………….……..…….………………..56

第六章參考文獻……………………………………………………………………………….…..……….….74

vi

表次

表 1、第一次酸性測試（厭氧）……………………………………………………………………….…36

表 2、觸媒反應………………………………………………………………………….…………………………37

表 3、第二次酸性測試（微氧）………………………………………………………………….………38

表 4、革蘭氏染色…………………………………………………………………………………………………39

表 5、選擇性培養基生長結果……………………………………………………………………………..40

表 6、選擇性培養基生長結果(B)…………………………………………………………………..…….41

表 7、第一次酸性測試（厭氧）(B)…………………………………………………………….……….42

表 8、觸媒反應(B)…………………………………………………………………………………………..…...43

表 9、第二次酸性測試（微氧）(B) ……………………………………………………………….……44

表 10、革蘭氏染色(B) …………………………………………………………………………………….…...45

表 11、葡萄糖標準曲線之吸光值………………………………………………………………………..46

表 12、預實驗測定結果………………………………………………………………………………….…...47

表 13、預實驗酵素活性單位 U/ml……………………………………………………………………….48

表 14、酵素活性測定結果…………………………………………………………………………..……….49

表 15、酵素活性單位 U/ml…………………………………………………………………….…………….50

表 16、菌種鑑定結果…………………………………………………………………………………..……….51

表 17、生長點計數結果……………………………………………………………………………….……….52

表 18、孢子數計數結果……………………………………………………………………………….……….53

表 19、細菌纖維素酵素活性測定結果…………………………………………………………………54

表 20、真菌纖維素酵素活性測定結果…………………………………………………………………55

vii

圖次

圖 1、葡萄糖標準曲線圖……………………………..……………………………………………………..56

圖 2、預實驗 B1 菌株用 CMC 培養連續一周的酵素 U/ml 值（30min）………..…57

圖 3、預實驗 B1 菌株用 CMC 培養連續一周的酵素 U/ml 值（60min）…………..58

圖 4、篩選菌株用 CMC 培養至第五天的酵素 U/ml 值………………………………….…..59

圖 5、Aspergillus clavatus 用 CMC 培養連續一周的酵素 U/ml 值（10min）……60

圖 6、細菌與真菌 Aspergillus clavatus 的酵素 U/ml 值比較…………………………….…61

圖 7、菌株 A9 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果……………………………………………62

圖 8、菌株 A13 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果………………………………………….63

圖 9、菌株 B3 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果……………………………………………64

圖 10、菌株 B6 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果………………………………………….65

圖 11、菌株 B7 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果………………………………………….66

圖 12、菌株 B8 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果……………………………….…………67

圖 13、菌株 B12 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果……………………………………....68

圖 14、菌株 B13 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果…………………………………..…..69

圖 15、菌株 B29 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果……………………………………....70

圖 16、菌株 B31 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果………………………………..……..71

附圖 1…………………………………………………………………………………….……..…….………………..72

附圖 2…………………………………………………………………………………….……..…….………………..73

1

第一章前言

在一般常識中，講到益生菌大多數第一個都是聯想到乳酸菌，且食用乳酸菌

相關產品可以保持身體健康、增強免疫力已經是大多數人對它們既定印象。目前

乳酸菌已被認定為 GRAS（ Generally Recognized as Safe）的物質之一，表示人類

在食用此物質時相較於其他物質有著較高度的安全保證。

食品加工產生的產業廢棄物的處理，一直是食品產業中必須留意的課題，其

中又以農業廢棄物為最大宗。在台灣，每年的農業廢棄物可以達百萬噸，這些廢

棄物成分又以纖維素為主，雖然纖維素廢棄物大多數可在自然環境中被降解再循

環利用，但從人類的角度看來，無疑是大量自然資源的浪費。因此，將纖維素廢

棄物利用生物技術轉化成可供人類應用資源的技術，也逐漸在蓬勃發展中，這對

於減少環境汙染、食物短缺以及替代能源方面的問題，具有相當程度的影響。

最常用來分解纖維素廢棄物的是真菌屬微生物，它能在短時間分泌出多種且

強力的水解酵素，許多發酵產品的前置利用作業都是利用真菌的分解酵素來完成

的。但有些真菌在特定環境下會產生所謂的真菌毒素（如黃麴菌素），大多不好

觀測又難以去除，沒有特別處理的話會讓後續的產物對人體造成危害。既然如

此，如果能用乳酸菌取代某些在發酵時使用的真菌類微生物，減少產生毒性物質

的可能，或許能改善發酵食品在加工程序上的衛生安全性。

因此本實驗目的為篩出具有強力植物纖維素利用能力的乳酸菌菌株。由於草

食性動物腸道內有植物纖維利用能力菌株的可能性較高，所以選擇草食性昆蟲糞

便作來源，篩選分離後再選擇纖維素酵素活性前幾名的菌株，與真菌屬作比較，

評估其優勢及發展潛力。

2

第二章文獻回顧

一、乳酸菌簡介

（一）乳酸菌特徵

乳酸菌（lactic acid bacteria ;LAB）共通的代謝及生理特性為革蘭氏陽性 G

（+）、耐酸、不產孢子、非好氧性的桿菌或球菌、觸媒反應為陰性。這些細菌經

常被發現存在於降解植物或乳酸的產品之中，發酵碳水化合物主要的終產物為乳

酸。因為有這個特性，從古到今，乳酸菌經常被用來作為食品發酵的酸抑制劑，

以抑制腐敗菌的生長。甚至有幾株乳酸菌株會產生蛋白質細菌素，更額外提供了

一種抑制腐敗性、病原性微生物生長的方法。此外，乳酸和其他代謝產物還能提

供食品特殊的感官以及質地。在重要食品工業上使用的乳酸菌都已早一步被認證

為 GRAS。幾個主要的乳酸菌屬為 Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、

Lactococcus、 Streptococcus，其他旁系的乳酸菌屬還有 Aerococcus、

Carnobacterium、Enterococcus、Oenococcus、Sporolactobacillus、Tetragenococcus、

Vagococcus、Weisella，這些都屬於 Lactobacillales（張效銘，2008）。

（二）乳酸菌發酵途徑

乳酸菌對糖類的發酵可分為同型發酵（homofermentation）及異型發酵

（heterofermentation）兩種。在過量葡萄糖及有限氧氣的條件之下，同型發酵乳

酸菌會經過 Embden-Meyerhof-Parnas pathway 產生大量乳酸（同型發酵反應式:

C6H12O6 → 2CH3CHOHCOOH）。同型發酵的乳酸菌屬包括 Lactococcus、

Enterococcus、Streptococcus、Pediococcus、group I lactobacilli。異型發酵乳酸菌

則是經由 pentose phosphate pathway 產生乳酸、醋酸、乙醇、二氧化碳（異型發

酵反應式: C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2）。絕對異型發酵乳酸菌屬包

括 Leuconostoc、Oenococcus、Weissella、group III lactobacilli（張簡秀楓，2006）。

3

（三） Probiotics

Probiotics organisms 一般稱之為“益生菌微生物”，指的是能有益於宿主的活

體微生物。根據 FAO/WHO 的解釋， Probiotics 的定義為「在足夠的數量下能對

宿主的健康產生有益影響的活體微生物」。Prebiotics （益菌生）則是泛指經過腸

胃道消化後進入大腸可供特定細菌（益生菌）發酵分解的碳水化合物類物質。微

生物中最常被採用的益生菌是乳酸菌株，其中主要的兩屬為 Lactobacillus &

Bifidobacterium，已有許多相關的研究。現今的益生菌可從含活菌的發酵食品補

充，如優格、膳食補充劑（張效銘，2008）。

益生菌除了目前普遍為大眾所知的「可透過影響腸道菌相平衡，抑制致病原

和毒素產生來改善宿主的健康」外，現今有更多研究顯示它還具有下列功能性：

1.預防腹瀉。

一些初步研究已顯示益生菌能治療各種類型的腸胃炎（King CK, Glass R,

Bresee JS, Duggan C , 2003），也能減少發病的持續時間和排便頻率（Allen SJ,

Martinez EG, Gregorio GV, Dans LF, 2010）。

2.治療乳糖不耐症。

由於乳酸菌會積極的將乳糖轉換成乳酸，攝取特定活性菌株能有助於那些有

乳糖不耐症的人，使身體可耐受比原先更多量的乳糖（Sanders ME, 2000）。

3.抗腫瘤。

有研究調查證實，一些乳酸菌具有抗突變的效果，是因為它們能與烤肉中黑

色部分的異環胺類物質結合使之失活（Wollowski I, Rechkemmer G, Pool-Zobel BL,

2001）。

4

4.降低膽固醇。

動物實驗已證實部分乳酸菌能有效降低膽固醇層級，推測是經由破壞在腸道

內的膽汁，進而抑制對膽固醇的再吸收（Sanders ME , 2000）。

5.降低血壓。

儘管目前尚無實驗證實，但有些研究表示，飲用多種乳酸菌發酵的牛奶有可

能使血壓適度下降，推測與發酵過程中產生的類 ACE 抑制劑胜肽有關。

6.改善免疫功能。

一些乳酸菌會經由競爭性抑制來影響病原體生長，也有證據顯示它們會經由

提高產 IgA 漿細胞的數量、提高或改善吞噬作用、增加淋巴 T 細胞和 NK 細胞的

比例來改善免疫功能（ Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCormick JK, October 2003 &

Ouwehand AC, Salminen S, Isolauri E , 2002）。

7.調節發炎反應。

有部份乳酸菌株可調節發炎及過敏性反應，根據發現被認為是與能調節細胞

激素的功能有關（ Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCormick JK, 2003）。

8.改善腸道躁鬱症。

有研究顯示商業菌株 Bifidobacterium infantis 可以改善女性的腸道躁鬱症

（Irritable bowel syndrome ; IBS）（Whorwell PJ, Altringer L, Morel J et al, July 2006）。

另一個獨立研究顯示植物型乳酸菌也能有效減少 IBS（Niedzielin K, Kordecki H,

Birkenfeld B , 2001）。

5

（四）乳糖不耐症

又稱「乳糖消化不良」或「乳糖吸收不良」，是指人體內不產生分解乳糖的

乳糖酶的狀態。主要癥狀為攝入大量乳糖後產生腹瀉、腹脹症狀。該症狀是基因

決定的，屬於遺傳性不會傳染。有「乳糖不耐症」的患者，大多數是體內缺乏乳

糖分解酶或是活性較弱，在缺乏乳糖酶的情況下，攝入的乳糖不能被消化吸收進

血液，而是滯留在腸道。腸道細菌發酵分解乳糖的過程中會產生大量氣體，造成

腹脹、放屁，過量的乳糖還會升高腸道內部的滲透壓，阻止對水分的吸收而導致

腹瀉。乳酸菌所分泌的乳糖分解酶可以利用腸道內所殘留的過量乳糖，能因此改

善「乳糖不耐症」的症狀（張簡秀楓，2006）。

6

二、乳酸菌的多元化應用

乳酸菌廣泛存在於自然環境當中，早在中世紀以前就已被用在製造酸酪、乾

酪、醬油、味增、釀酒等發酵產品上，可見應用歷史之悠久。由於生物技術快速

發展，對乳酸菌的研究已擴展到活菌體外的領域，包括乳酸菌的生物轉化能力，

例如把碳源或脂肪類化合物轉化為保健功效成分，或農產品原料經乳酸菌發酵後

強化產品的特性等。利用乳酸菌作為綠色環保微生物製劑在畜牧業已有許多成功

的例子，近年在魚類飼料中亦證明其功效性。由此可知，乳酸菌不只研究領域多

元化，在功能訴求、使用方式及產品種類也多元化，為了滿足發展需求，菌株的

多樣化，便是研發成功的重要基石，於是研究人員便從乳酸菌的菌株種類、菌株

來源、發酵調控、代謝產物及保健功效的作用機制等多方面切入，期盼能開發出

新穎性的乳酸菌產品。

世界各國許多民族都發展出某些特殊發酵傳統食品，最初的目的大多只是為

了保存食物。傳統食品發酵過程中，往往包括不同複合微生物的一系列作用，其

中乳酸菌群是較為重要的一群微生物。過去傳統發酵食品的製作，全靠環境落菌

或原料中原有微生物而自然發酵，若發現某一次成品的風味或效果特別優良時，

便把該成品剩餘的部份，投入新的原料中再次發酵，以保留優良成品的特性。可

是微生物在沒有良好的操作環境、製造程序、以及適當的保護下，容易發生變異

或因競爭而使優良菌株被自然淘汰。近年許多國家紛紛進行傳統發酵食品的乳酸

菌群分析研究，探討發酵過程中，不同階段優勢菌株的變化，分析各菌株的酵素

系統能力，期盼能得知各菌株在不同階段所扮演的角色及功能，目的是找到關鍵

菌株，建立現代化的生產管控流程。

7

乳酸菌在發酵過程中所產生的代謝物質，除了會影響食品的質地、風味與保

存性之外，有些代謝產物還具有機能性。這些物質包括完整的死菌體、細胞壁組

成分以及經由發酵過程產出的胜肽、胞外多醣、脂肪類物質等，因此現今乳酸菌

應用的著眼點不再限於活菌體，而是涵蓋以上物質。

乳酸菌中有數類菌屬具有產生胞外多醣的能力，胞外多醣可賦予發酵乳製品

特殊的質地、黏稠度與口感，由於乳酸菌屬於「GRAS」菌株，使得乳酸菌胞外

多醣可廣泛應用在食品工業，作為增稠劑、成膠劑及安定劑使用。此外，有些乳

酸菌胞外多醣更具有降低膽固醇、抗癌、抗潰瘍及調節免疫等功效，因此，乳酸

菌胞外多醣已成為研究開發的重要議題，包括其免疫功效及生產方式。

對於乳酸菌胞外多醣之免疫功效相關作用機制，尚不十分清楚，不過目前已

知胞外多醣可誘發小腸及大腸的腸道黏膜反應，可促進或抑制地調節以達到保護

性免疫、維持腸道平衡，並加強 IgA 生成量，且經由細胞激素釋放至血液循環

系統，而影響及全身系統免疫。乳酸菌胞外多醣雖可做為保健新素材，但仍有產

量少、不易分離、結構特性多樣等商業化障礙，例如，乳酸菌會因菌種、發酵條

件或營養因子調控而產生不同形式的胞外多醣，其功能性也有顯著差異。因此，

了解胞外多醣之功能與結構的相關性是很重要的。若能對其生合成途徑和各式調

控因子有更多了解，將有助於精確掌控胞外多醣之品質與特性，以期望更廣泛的

應用（陳慶源，2008）。

8

三、農業廢棄物簡介

農業廢棄物包含農產廢棄物與農業資材廢棄物，前者包含七大類，第一類為

穀類廢棄物；第二為特用作物廢棄物；第三為蔬果廢棄物；第四為食品工廠廢棄

物農產、水產及禽畜加工之廢棄物等；第五為菇類栽培介質廢棄物；第六為禽畜

及養殖廢棄物；第七為樹皮、庭園及行道樹等廢棄物。根據調查，台灣每年產生

的農產廢棄物總量約2300萬公噸。這些農產廢棄物多數均可回收再利用，製成堆

肥、廄肥，再回歸到農田，惟若隨意傾倒、丟棄、燃燒或不當處理均會造成環境

污染（台南區農業改良場，楊紹榮）。

（一）穀類廢棄物

穀類廢棄物包括稻草、稻殼及雜糧作物廢棄物如落花生藤蔓、落花生殼、玉

米穗軸、甘藷藤及大豆藤蔓等，穀類廢棄物之用途有直接利用，諸如撒布於耕地

防止壤沖刷並供給養分，或作為禽畜之粗飼料，亦可經由化學藥劑、酵素及生化

方法處理將穀類中所含木質素、纖維素及半纖維素分離做進一步利用或者是作為

熱能利用如直接燃燒等，以節省殘留廢棄物之搬運費用。

（二）特用作物廢棄物

特用作物廢棄物中以甘蔗為最大宗，甘蔗廢棄物係原料甘蔗採收及製糖過程

中產生，通常有蔗葉、蔗渣、濾泥及煙灰等廢棄物。其中蔗葉含有機物高達 80%，

故將蔗葉堆積、醱酵，做為堆肥再施於蔗田，或於甘蔗收穫後置放於蔗田，然後

以曳引機翻入土中，可增加蔗田肥力。

（三）蔬果廢棄物

由於蔬菜廢棄物含水量高達90％以上，掩埋不僅佔空間，且會造成掩埋場滲

9

漏水問題，引起二次污染。若採焚化處理也因水分過高，熱值不高，徙增處理費

用。目前果菜市場的蔬菜廢棄物以蕹菜、青梗白菜，結球白菜、芥藍、甘藍、蔥

較多，在產地分級包裝的廢棄物，有些直接翻犁入田區；部份做為家禽飼料或擇

地掩埋；和稻草、稻殼等進行堆肥化處理，進行有用資源之再利用。

（四）食品工廠廢棄物

食品工廠廢棄物分為農產加工廢棄物和水產加工廢棄物，農產加工廢棄物其

中包含鳳梨皮、蘆筍渣、竹筍殼、番茄渣、豆腐渣及酒糟等。大多數都回收作為

畜牧用的飼料。

（五）食用菇類廢棄物

目前一般菇農對菇類廢棄物--廢棄太空包木屑的處理方式為直接傾倒於低

地、河道、鄉間小徑或在空曠處燃燒；整包廢棄太空包木屑直接放置於果園表面

做為畦面敷蓋；經過醱酵腐熟過程製成堆肥。

（六）禽畜及養殖廢棄物

禽畜及養殖廢棄物一般指的就是排泄物。禽畜排泄物分為固態糞便及液體糞

尿兩部份，前者可添加稻草等作物殘留物醱酵製成堆廄肥。新鮮的禽畜糞便未經

醱酵，勿直接施用到田裡，以免土壤中氧氣被消耗殆盡，導致植物根部缺氧而枯

死。若經堆肥化處理後，可成為良好之有機肥料。

（七）樹皮、庭園及行道樹修剪之廢棄物

這些廢棄物除了小部份做為燃料利用外，亦可將樹皮、木屑混合其他農產廢

棄物堆積醱酵可產製樹皮堆肥。

10

四、植物細胞壁成分

細胞壁存在於植物、真菌、藻類及原核生物的細胞膜外層，動物細胞則不具

有細胞壁結構。細胞壁因其厚薄的程度而有不同的組織、功能性，其本身結構鬆

散，自然界許多物質都可以直接通過細胞壁進入細胞中。

植物細胞壁的主要成分為纖維素及果膠，用於支撐並維持植物細胞的形狀。

植物細胞壁可分為三層，初生壁（primary wall）和次生壁（secondary wall），中

間以胞間層（intercellular layer）作分隔，所有植物細胞都具有初生壁，位於胞間

層的兩側。次生壁存在於初生壁的內部，是細胞停止生長後分泌所形成的，可增

加細胞壁的厚度及強度，使之不易受到多糖降解酶的直接作用，但不是所有細胞

都具有次生壁。

次生壁又分為內、中、外三層，內、外層都很薄，只有中層較厚，占整個次

生壁厚度的70~90%，主要成分為半纖維素、纖維素、木質素，極少含有果膠，

久之會開始進行不同程度的木質化作用，木聚醣逐漸分布於整個次生壁當中，而

木葡聚醣則侷限分布於初生壁和胞間層中。次生壁越厚，壁內的細胞腔就會越

小，等細胞完全成熟細胞腔便會形成橢圓形狀。植物細胞壁的主要功能為保護細

胞減少外界的物理性傷害、維持細胞形狀，及避免水分過多而脹破細胞（Buchanan;

Gruissem, Jones, 2000）。

11

五、纖維素簡介

（一）纖維素

纖維素（cellulose）是自然界中含量最多的一種多醣。無論一年或多年生植

物，各種木材都含有大量的纖維素。植物體內約有 50％的碳以纖維素的形式存

在。木材中的纖維素則常與半纖維素和木質素共同存在。一般木材，纖維素佔

40～50％，10～30％的半纖維素和 20～30％的木質素。纖維素除了是重要的造

紙原料外，也廣泛用於塑料、炸藥、電工及科研器材等方面。食物中的纖維素（即

膳食纖維）對人體的健康也有著重要的作用（Crawford, R. L., 1981）。

（二）纖維素的結構性質

纖維素是D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵組成的大分子多醣，分子量約50000～

2500000，相當於300～15000個葡萄糖基。分子式寫作（C6H10O5）n。是維管束

植物、地植物以及一部分藻類細胞壁的主要成分。醋酸菌的莢膜，以及尾索類動

物的被囊中也發現有纖維素的存在，棉的種子毛是高純度（98%）的纖維素。在

化學上大部分結晶性纖維素通常稱為α-纖維素，含有除了纖維素以外的各種多醣

類的纖維素稱為β-纖維素、γ-纖維素。

細胞壁的纖維素形成微纖維，寬度為10－30毫微米，長度有的達數微米。應

用X線衍射和負染色法，根據電子顯微鏡觀察，鏈狀分子平行排列的結晶性部分

組成寬為3－4毫微米的基本微纖維。推測這些基本微纖維集合起來就構成了微纖

維。纖維素能溶於Schwitzer試劑或濃硫酸。不易用酸水解，但是稀酸或纖維素酶

可使纖維素生成D-葡萄糖、纖維二糖和寡糖。就纖維素的分解而言，估計在初生

細胞壁伸展生長時，微纖維的一部分由於纖維素酶的作用而被分解，成為可溶性。

12

纖維素不溶於水和乙醇、乙醚等有機溶劑，能溶於銅氨溶液（Cu（NH3）4

（OH）2）和銅乙二胺溶液（（NH2CH2CH2NH2）Cu（OH）2）等。某些酸、鹼和鹽

的水溶液可滲入纖維結晶區，促使纖維素溶解。纖維素加熱到約150℃時不會發

生顯著變化，超過這溫度會由於脫水而逐漸焦化。纖維素會與較濃的無機酸產生

水解作用生成葡萄糖等物質，與較濃的苛性鹼溶液作用會生成鹼纖維素，與強氧

化劑作用則生成氧化纖維素（Klemm, Dieter, Brigitte Heublein, Hans-Peter Fink,

Andreas Bohn, 2005）。

（三）纖維素的功能

全世界用於紡織造紙的纖維素，每年達800萬噸。用分離純化的纖維素做原

料，可以製造人造絲，賽璐玢以及硝酸纖維素、醋酸纖維素等酯類衍生物和甲基

纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素等醚類衍生物，用於塑料、炸藥、電工及科

研器材等方面。人類膳食中的纖維素主要含於蔬菜和粗加工的穀類中，雖然不能

被消化吸收，但有促進腸道蠕動，利於糞便排出等功能。草食動物則依賴其消化

道中的共生微生物將纖維素分解，從而得以吸收利用。（Kimura, S; Laosinchai, W;

Itoh, T; Cui, X; Linder, CR; Brown Jr, RM, 1999）

（四）膳食纖維

食物纖維素包括粗纖維、半粗纖維和木質素。食物纖維素是一種不被消化吸

收的物質，過去認為是「廢物」，現在認為它在保障人類健康，延長生命方面有

著重要作用，因此稱它為第七種營養素。以下為幾項膳食纖維的功能性:

1.有助於腸內大腸桿菌合成多種維生素。

2.纖維素比重小，體積大，在胃腸中佔據空間較大，使人有飽食感，有利於減肥。

3.纖維素體積大，進食後可刺激胃腸道，使消化液分泌增多和胃腸道蠕動增強，

13

可防治糖尿病的便秘。

4.高纖維飲食可通過胃排空延緩、腸轉運時間改變、可溶性纖維在腸內形成凝膠

等作用而使糖的吸收減慢。亦可通過減少腸激素如抑胃肽或胰升糖素分泌，減少

對胰島B細胞的刺激，減少胰島素釋放與增高周圍胰島素受體敏感性，使葡萄糖

代謝加強。

5.近年研究證明高纖維飲食使Ⅰ型糖尿病患者單核細胞上胰島素受體結合增

加，從而節省胰島素的需要量。由此可見，糖尿病患者進食高纖維素飲食，不僅

可改善高血糖，減少胰島素和口服降糖藥物的應用劑量，並且有利於減肥，還可

防治便秘、痔瘡等疾病。

纖維素的主要生理作用是吸附大量水分，增加糞便量，促進腸蠕動，加快糞

便排泄，使致癌物質在腸道內的停留時間縮短，減少對腸道的不良刺激，預防腸

癌發生（Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrate, fiber, Fat, Fatty Acids,

Cholesterol, Protein, and Amino Acids (Macronutrients), 2005）。

14

六、纖維素水解酵素

纖維素酶（cellulase）主要是由真菌、細菌、原生動物為了促進纖維素水解

所產生的一群酵素。然而，也有些纖維素酶是以共生的方式來產生的，如白蟻與

其腸道微生物的共生模式。目前已知有幾種不同類型的纖維素酶，其結構和作用

機制也都不同。一般纖維素酶的反應是將纖維素、地衣多醣、穀類裡 β-D-葡聚醣

中的 1，4-β-D-糖苷鍵水解來作用的（Watanabe H., Hiroaki Noda, Tokuda G., Lo N. ,

1998）。

（一）纖維素酶的種類

依反應催化類型的不同，纖維素酶主要可分為五類：

1. Endocellulase （EC 3.2.1.4）：內切型纖維素酶

隨機切斷非結晶端的鍵結並產生新的末端。

2. Exocellulase （EC 3.2.1.91）：外切型纖維素酶

從露出的末端以二~四個單位切斷鍵結，終產物為纖維四糖、纖維雙糖、雙糖類。

Exocellulase 主要又分為作用於還原端的 CBHⅠ以及非還原端的 CBHⅡ兩種類型。

3. Cellobiase （EC 3.2.1.21） or β-glucosidase ：纖維二糖水解酶

會將 Exocellulase 的終產物專換成單醣類。

4. Oxidative cellulases ：氧化型纖維素酶

藉由自由基反應將纖維素降解，如纖維二糖脫氫酶（受體）。

5. Cellulose phosphorylases ：纖維素磷酸化酶

分解磷酸取代水成分達到纖維降解目的。

常見的纖維素酶通常是以複合式酵素型態存在，將纖維素分解成 β-葡萄糖。

這種類型的纖維素酶主要是草食性反芻動物的腸道共生菌所產生。除了反芻動物

外，大多數的動物包括人類都沒有產生纖維素酶的能力。

15

（二）纖維素酶水解機制

纖維素酶的水解途徑分三種（見附圖一）：

1.破壞存在於纖維素結構內結晶區的非共價鍵結（endocellulase）。

2.從小分子糖類鍵結末端進行水解（exocellulase）。

3.將雙糖或三糖水解成葡萄糖（beta-glucosidase）。

其中 β-glucosidase 作用的詳細過程見附圖二（Bayer E.A, Chanzy H., Lamed R.,

Shoham Y. , 1998）。

（三）纖維素酶的應用

纖維素酶已應用於咖啡等商業加工食品中，主要是將乾燥豆類中的纖維素成

份水解。此外，纖維素酶亦被廣泛應用紡織業及洗滌業，同時也被應用於紙漿和

造紙工業，甚至還有應用於製藥方面。目前纖維素酶主要是用來發酵產生生質

能，不過這不代表未來纖維素酶就沒有其他的用途。

16

第三章材料與方法

一、實驗材料

（一）樣品採集

草食性昆蟲是向[獅潭泉明生態教育蠶業農場]購買的白蠶，共 15 隻。取

四齡蠶三小時內的新鮮糞便。Aspergillus clavatus 是由陳錦樹實驗室提供。

（二）培養基與其配製

1. MRS、CMC、Xylose、pectin broth & agar

【培養基】配方

MRS broth CMC broth Xylose broth Pectin broth g/L

dextrose CMC Xylose Pectin 20

meat peptone 10

beef extract 10

yeast extract 5

sodium acetate 5

disodium citrate 2

ammonium citrate 2

tween 80 1

magnesium sulfate 0.1

manganese sulfate 0.05

【固態選擇性培養基】需多下列配方

agar 15

17

3. PDA agar

Potato Dextrose Agar （PDA）斜面培養

Potato 20 g

Dextrose 2 g

Agar 1.5-2 g

Distilled water 100 ml

（三）溶液配製

1. DNS agent

【DNS 試劑】配方

3,5-dinitrosalicylic acid （二硝基水楊酸） 1.0 g

K-Na-tartarate 30.0 g

2N NaOH 1.6 g

d.d. water 100 ml

2. CMC PBS 緩衝溶液

0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液加入 1% 的 CMC。

3. Tween 80 d.d. water

去離子水加入 0.1% 的 Tween 80。

18

（四）化學試藥

（1） Lactobacilli MRS broth 購自 Difco （Detroit, MI, USA）。

（2） Agar、dextrose、CMC、Xylose、Pectin、Peptone 購自 Difco （Detroit, MI,

USA）

（3） Beef extract、yeast extract 購自於 BD（Sparks, MD, USA）藥品。

（4） Sodium acetate、disodium citrate、ammonium citrate、tween 80、magnesium

sulfate、manganese sulfate 購自於 USB（Cleveland, OH, USA）藥品。

（5）H2O2 購自於中國藥局（台中，台灣）。

（五）儀器設備

1.無菌操作台（Laminar flow）：造鑫公司（台北，台灣）。

2 恆溫培養箱（Incubator）：LE-529，裕德公司（台北，台灣）。

3.震盪恆溫水槽（Shaker bath）：M903，和德公司（台北，台灣）。

4.酸鹼測定儀（pH meter）：SP-2200，Suntex 公司（台中，台灣）。

5.厭氧培養缸（Anaerobic system）：Becton Dickinson & Company （Sparks, MD,

USA）

6.分光比色計（Spectrophotometer）：LR45227，Spectronic instruments（NY, USA）

7.高壓殺菌釜（Autoclave）：YTM 公司（台中，台灣）。

8.高速冷凍離心機（Ultra centrifuge）：CR20B2，Hitachi 公司（Tokyo, Japan）

9.微量高速離心機（Eppendorf centrifuge）：1-15K，Sigma 公司（Harz, Germany）

10.超低溫冰櫃（Ultra-Low temperature freezer）：MDF-U32V，Sanyo 公司（Tokyo,

Japan）

11.菌落計數器（Colony counter）：CC-560，Suntex 公司（台中，台灣）。

19

二、實驗方法

（一）乳酸菌的分離篩選（A 組）

1.取得草食性昆蟲糞便

剛購買時的白蠶為二齡蠶，糞便體積過小不好收集，所以多培養兩周使其脫

皮並生長至四齡蠶後才取其糞便。蠶成長至四齡蠶後取新鮮糞便（3 hr 內），於

同天用 MRS broth 在 37℃厭氧環境（厭氧包）培養 24 hr。

2.菌株篩選與保存

（1）將糞便 MRS broth 分別吸取 50、25、10 μl 塗抹至 MRS agar 上作劃線培

養，後於 37℃ 厭氧環境培養 72 hr，觀察菌落生成情況。

（2）取 MRS agar 中獨立不重疊的菌落，用接菌環挑起，個別接種在新的 MRS

broth，於 37℃厭氧環境培養 24 h 後，取 50 μl 菌液再接到新試管內作活菌。

（3）將活菌後的 MRS broth 分裝到 eppendorf，用微量高速離心機（2500 rpm）

離心 5 min，取上清液用酸鹼測定儀作 pH 酸性測試（厭氧）。

（4）將離心後殘留的菌體個別做菌種保存，於-80℃冰箱冷凍。

3.選擇性培養基篩選

（1）將初步篩選保存的菌株培養在 MRS broth 於 37℃微氧環境培養 24 h。

（2）培養後的菌液取 10 μl 接種到 CMC、木糖、果膠培養基上，將對應號碼

的菌株接到指定位置上後在 37℃厭氧環境（厭氧包）作分區培養。

（3）連續培養一周，每天觀察是否有菌落生成。

（4）保留能生長於選擇性培養基的菌株。

20

4.乳酸菌特性篩選

將 3.步驟中的剩餘菌液分裝到 eppendorf 離心（2500 rpm，5 min）後，作乳

酸菌特性分析。

（1）H2O2 觸媒測試（catalase test）

將 H2O2 滴入經過離心並去除上清液的 eppendorf 中，觀察殘留菌體是否

會跟 H2O2 發生反應而產生氣泡，產氣泡者為陽性，不產氣泡者為陰性。

（2）第二次酸性測試（微氧）

上清液部分用試管盛裝，使用酸鹼測定儀作第二次的 pH 酸性測試（微氧）。

（3）革蘭氏（Grams）染色、鏡檢

用接菌環取 eppendorf 中殘留菌體塗抹於載玻片上，滴上數滴結晶紫

（crystal violet）染色 30 秒後用水洗去染劑。再滴數滴碘液（iodine solution）

固定結晶紫 30 秒後，用 95%酒精將碘液沖洗乾淨，直到流下的酒精不呈藍色

為止。最後再用矽紅（safranin）染色 30 秒，用水洗去染劑。載玻片風乾後，

用光學顯微鏡觀察染色情況。G（+）呈現藍紫色，G（-）呈現紅色。

（4）保留具有乳酸菌特性的菌株

將符合觸媒（-）、產酸、G（+）的菌株保留，去除不符合的菌株。

（二）乳酸菌的分離篩選（B 組）

B 組跳過用 MRS agar 篩菌的步驟，直接用選擇性培養基從糞便篩菌再作乳

酸菌特性分析。

1.取得草食性昆蟲糞便

取四齡蠶的新鮮糞便（3 hr 內），於同天用 MRS broth 在 37℃厭氧環境（厭

氧包）培養 24 hr。

21

2.選擇性培養基菌株篩選與保存

（1）將糞便 MRS broth 分別取 25、50、75 μl 塗抹在 CMC、木糖、果膠培養基

上作劃線培養，於 37℃厭氧環境（厭氧包）培養一周，每天觀察菌落生成。

（2）取 CMC agar 中獨立不重疊的菌落，用接菌環挑起，個別接種在新的 MRS

broth，於 37℃厭氧環境培養 24 h 後，取 50 μl 菌液再接到新試管內作活菌。

（3）將活菌後的 MRS broth 分裝到 eppendorf，用微量高速離心機（2500 rpm）

離心 5 min，取上清液用酸鹼測定儀作 pH 酸性測試（厭氧）。

（4）將離心後殘留的菌體個別做菌種保存，於-80℃冰箱冷凍。

3.乳酸菌特性篩選

（1）將初步篩選保存的菌株培養在 MRS broth 於 37℃微氧環境培養 24 h。

（2）培養後的菌液取 10 μl 接種到選擇性培養基上，作第二次的生長確認。

（由於 B 組菌株都是從 CMC agar 取出的，所以 CMC 不用再作）

（3）將剩餘 MRS broth 菌液分裝到 eppendorf 離心（2500 rpm，5 min）後，

作乳酸菌特性分析：H2O2 觸媒測試、第二次酸性測試（微氧）、革蘭氏（Grams）

染色鏡檢。（分析方法同 A 組）

（4）將符合觸媒（-）、產酸、G（+）的菌株保留，去除不符合的菌株。

（三）纖維素酵素活性測定

由於纖維素分解的終產物為葡萄糖，以偵測葡萄糖含量來推估纖維素水解酵

素的活性（U）。

1.葡萄糖標準曲線

配製 1 ml 已知濃度（0，25，50，100，200，400，800 μg/ml）的葡萄糖 dextrose

溶液，各別加入 1 ml DNS 試劑，於 100℃作用 10 min，靜置至室溫後用分光比色

22

計測定在 550 nm 的吸光值，做出葡萄標準曲線。

效正歸零是用 1 ml 蒸餾水與 1 ml DNS 試劑反應，跟上列同樣條件環境下

反應，所得的溶液用來歸零。

2.預實驗

預實驗目的為測定酵素活性最佳時間點及最佳酵素比。

（1）用 B1 做試驗樣品，測定菌株生長 7 天間的酵素活性。

（2）先將菌株在 MRS broth 於 37℃微好氧環境下培養 24 hr，活菌三次。

（3）取 MRS broth 菌液 50 μl 接種到 CMC broth 中，共作 7 管，並同時間全

部於 37℃微好氧環境下開始培養，連續一週每天取 1 管做酵素活性測定。

（4）取出 CMC broth 菌管分裝到 eppendorf 做 8000 rpm 離心 10 min，取上清

液部份作酵素液。

（5）試驗組以 1:4、2:3、3:2、4:1 的比例混合酵素液 & CMC PBS；控制組用

相同的比例混合 CMC broth & CMC PBS。將試驗組、控制組全部放入 37℃恆溫

水槽，分別反應 30 min & 1 hr。

（6）時間到樣品全部取出，加入等量 DNS 試劑，於 100℃作用 10 min 後，靜

置冷卻至室溫，用分光比色計測定在 550 nm 的吸光值並記錄之。

*（4）~（6）步驟連續一週重複執行

3.纖維素水解酵素活性測定

（1）將 A、B 組所篩選出的全部菌株作酵素活性測定。

（2）先將菌株在 MRS broth 於 37℃微好氧環境下培養 24 hr，活菌三次。

（3）取 MRS broth 菌液 50 μl 接種到 CMC broth 中，並同時間全部於 37℃微

好氧環境下開始培養，於預實驗結果中的「最佳時間點」作酵素活性測試。

23

（4）取出 CMC broth 菌管分裝到 eppendorf 做 8000 rpm 離心 10min，取上清


（5）試驗組以預實驗結果中的「最佳酵素比」比例混合酵素液 & CMC PBS，

控制組以同樣的比例混合 CMC broth & CMC PBS。將試驗組、控制組全部放入

37℃恆溫水槽，分別反應 10 min & 20 min。



*酵素活性單位U/ml，表示每min釋出 1 μmole還原醣的酵素量（μmole/min x ml）

<葡萄糖 dextrose 分子量=180> <重量/分子量=莫耳數>

酵素活性 U 值計算公式：

U/ml=[ A550 sample/（A550/mg standard）]*（5.55μmole/mg）*（1/T_min）*（1/L_ml）

A550 sample = DNS 測定的樣品吸光值

A550/mg standard = 樣品吸光值對應的標準品 mg 數

5.55 μmole/mg = 1mg 葡萄糖的 μmole 數

T_min = 反應時間

L_ml = 酵素液體積

4.菌種鑑定

（1）從纖維素水解酵素活性測定的結果，選擇活性前 10 強的菌株作菌種鑑定。

（2）菌株鑑定是先將菌株用 CMC broth 於 37℃微好氧環境下培養 24 hr，再將

菌管交由[基隆米克斯公司]做專業鑑定。

24

（四）與真菌屬比較酵素活性

1.菌數計算

分別計算 1 ml 菌液中含有多少菌數&真菌孢子數。

（1）細菌生長點計數

選擇酵素活性前 10 強菌株中的 B3 作細菌計數的樣品。

【1】將菌株在 MRS broth 於 37℃微好氧環境下培養 24 hr，活菌三次。

【2】之後取 MRS broth 菌液 50 μl，用 4.95 ml & 4.5 ml 的去離子水做序列稀釋

到 10-6、10-7、10-8 三個濃度後，分別取 1 ml 的稀釋菌液，用 MRS agar 做 pour

plate（倒盤）培養，每個濃度做三盤。

【3】將培養基於 37℃微好氧環境下培養 48 hr 後，計算每個濃度的菌落數。

【4】推算每 1 ml 菌液所含的菌數。

（2）真菌血球計數玻片計數

選擇 Aspergillus clavatus 作真菌計數的樣品。

【1】將真菌孢子用接菌環塗抹至 PDA agar 上，於 30℃有氧環境作斜面培養

72 hr 以上。（取孢子時，凍管須完全解凍才可接菌）

【2】確定真菌孢子萌發後，用介面活性溶液（去離子水 + 0.1% tween 80）從

培養基沖提出孢子液。

【3】將孢子液滴在血球計數玻片，於顯微鏡下用計數器計算孢子數。

【4】推算每 1ml 孢子液所含的孢子數。

25

◎血球計數玻片操作法

1.血球計數盤放置於桌面水平處，蓋上特製蓋玻片。

2.取樣品液由計數區上下方滴入。

3.計數器計數中央的大方格（內有 25 中格，400 小格）。

4.重複計算另一個計數區的細胞數。

5.取另一個水樣，同一水樣至少要重複計算三次取平均值。

6.所得平均數值乘上 104 即為 1 ml 所含的樣品液細胞數。

2.細菌纖維素酵素活性測定

由於菌種鑑定確定 B13、B31 為人類致病菌，為了避免感染風險，決定將這

兩株從實驗中排除。

（1）將菌株（A9、A13、B3、B6、B7、B8、B12、B29）在 MRS broth 於 37

℃微好氧環境下培養 24 hr，活菌三次。

（2）取 MRS broth 菌液 50 μl 接種到 CMC broth 中，並同時間全部於 37℃微

好氧環境下開始培養，於預實驗結果中的「最佳時間點」作酵素活性測試。

（3）取出 CMC broth 菌管分裝到 eppendorf 做 8000 rpm 離心 10 min，取上清




37℃恆溫水槽，反應 10 min。

（5）時間到樣品全部取出，加入等量 DNS 試劑，於 100℃作用 10min 後，靜


26

3.真菌纖維素酵素活性測定

選擇 Aspergillus clavatus 作酵素活性測定。

（1）將真菌孢子用接菌環塗抹至 PDA agar 上，於 30℃有氧環境作斜面培養

72 hr 以上。（取孢子時，凍管須完全解凍才可接菌）

（2）確定真菌孢子萌發後，用介面活性溶液（去離子水 + 0.1% tween 80）從

培養基沖提出孢子液。

（3）將定量孢子液接種到裝有 50ml CMC broth 的大型容器中，於 30℃有氧環

境下培養，同時需用震盪器維持均勻搖晃，使氧氣較容易滲入培養液內。連續

一週每天取 1 ml 培養液做酵素活性測定。

（4）取 1 ml CMC broth 分裝到 eppendorf 做 8000 rpm 離心 10 min，取上清液

部份作酵素液。



37℃恆溫水槽，反應 10 min。



*（4）~（6）步驟連續一週重複執行

4.比較與潛力評估

（1）將真菌的最佳酵素活性數據與細菌最佳酵素活性數據作比較。

（2）評估細菌菌株的優勢及相關潛力。

27

第四章結果與討論

一、乳酸菌篩選結果

（一）A 組

1.厭氧

由於篩菌初期就是用厭氧環境培養，因此可以肯定能生長出的菌落不會是

絕對好氧型的菌種，此滿足了乳酸菌的特性之一「厭氧或兼性厭氧」。

2.產酸

從 agar plate 挑取 20 個獨立不重疊的菌落並編號，用 MRS broth 培養並活

菌後，將菌液離心，用其上清液測其 pH。為符合乳酸菌的「產酸」特性，pH<5

的視為有產酸，剔除 pH 明顯過高（酸性不足）的菌株。（表 1）可以看出，5、

20 號與其他菌株相比 pH 明顯過高，故將不符合乳酸菌特性的這兩株菌株去

除，並將剩餘的菌株先作菌種保存來確保菌株。

將保存的菌株於微氧環境下培養離心後，利用其沉澱物及上清液再作第二

次酸性測試、觸媒反應測試、革蘭氏染色，確認其乳酸菌特性。

3.觸媒反應

將 H2O2 滴入離心產生的沉澱物中，會產生氣泡的為陽性（+），不產生氣

泡的為陰性（-）。一般正常乳酸菌都會呈現觸媒陰性（-），所以會產生氣泡的

就絕對不是乳酸菌。（表 2）中可得知，僅 15 號呈現陽性（+）反應，故將此

菌珠剔除。

28

4.產酸（微氧）

由於這次是在微氧環境下培養，pH 的結果（表 3）與第一次酸性測試（厭

氧）（表 4）比較僅能表示菌株對氧氣的耐受性程度。與第一次相比，第二次

pH 較低僅能表示有氧環境下菌株生長性較好；反之 pH 較高，也僅能表示有氧

生長性較差。

5.革蘭氏染色

經過革蘭氏染色後，呈現藍紫色的為 G（+），呈現紅色的為 G（-）。正常

乳酸菌全部都屬於 G（+），故染色呈現紅色的菌株絕對不是乳酸菌。（表 4）

顯示染色的結果全部為 G（+），因此無菌株剔除。

6.選擇性培養基篩選

篩選菌株用選擇性培養基於厭氧環境培養一周，（表 5）為生長結果。可

以看出，雖然大部分菌株無法利用果膠生長，不過都能在纖維素及木糖培養基

生長，表示菌株能利用纖維素及木糖，因此都與予保留。

其中 A4 很特別的成為唯一可以利用果膠生長的菌株，為求正確性，在 B

組實驗結束後再用同樣成分的果膠培養基培養 A4 一次，卻發現這次在果膠上

無法生長，表示上次生長出來的極有可能是菌保管中的雜菌。

#（A 組）到此符合乳酸菌特性又具有纖維素利用能力的菌株剩餘 17 珠。

29

（二）B 組

1.厭氧&選擇性培養基篩選

B 組跳過用 MRS agar 篩菌的步驟，糞便菌液於厭氧環境直接用選擇性培

養基培養一周的結果顯示在（表 6）。

（表 6）的結果可以得知，糞便中的菌株沒有任何一株具有果膠利用能

力。由於是在厭氧環境下培養，因此也可以肯定能生長出的菌落不會是絕對好

氧型的菌種，符合乳酸菌的「厭氧或兼性厭氧」特性。

2.產酸

從 CMC agar plate 挑取 36 個獨立不重疊的菌落並編號，後續流程同 A 組。

結果顯示在（表 7）。

3.觸媒反應

流程同 A 組，結果顯示在（表 8）。

4.產酸（微氧）


5.革蘭氏染色


根據上面 2.~ 5.的乳酸菌特性分析結果將 B 組菌株做篩選。菌種保存後為

避免雜菌干擾結果的可能性，這 15 株菌後又做了一次木糖、果膠培養基生長

測試，結果依然與（表 6）無異，在木糖上可生長、果膠上無法生長。

30

#（B 組）到此符合乳酸菌特性又具有纖維素利用能力的菌株剩餘 15 珠。但要完

全確認 A & B 組篩選的菌株是否為乳酸菌，必須待後續的菌種鑑定結果出爐。

根據菌株在選擇性培養基的生長強度，推測草食性昆蟲糞便中的菌株，對

於植物纖維素的利用率比其他植物主要成分（木糖、果膠）來的高，合理推論

其纖維素水解酵素的活性比其他種類的水解酵素來的強，因此後續的酵素活性

實驗決定以測定菌株的纖維素酵素活性來作比較。

二、纖維素酵素活性測定結果

（一）葡萄糖標準曲線

葡萄糖各濃度的吸光值顯示在（表 11），並繪製標準曲線圖（圖 1）。

（二）酵素活性測定結果

根據上述乳酸菌篩選的結果，推測本實驗篩選出的菌株其纖維素酵素活性

較強，因此用 B1 菌株做連續 7 天 CMC 培養預實驗。結果顯示在（表 12）。

數據換算成 U 值（表 13）並繪製成圖（圖 2 & 3）。

從（圖 2 & 3）可以得知，酵素液：CMC PBS 在不同比例下活性沒有絕對

的高低，但整體上確定可以在第 5 天測到最高吸光值，表示該時間點 B1 的酵

素活性最高。因此後續的酵素活性實驗，其他菌株的培養時間點皆參考 B1 的

數據作為可得到最佳酵素活性的基準。

由於預實驗目的僅找出最佳酵素活性時間點，故後續實驗將縮短酵素作用

的反應時間，以加速流程。

31

利用預實驗得到的最佳時間點，將 A & B 組共 32 株菌做酵素活性測定。

結果顯示在（表 14）。將數據換算成 U 值（表 15）並繪製成圖（圖 4）。

從（圖 4）就可以看出，B 組的纖維素水解酵素活性普遍比 A 組來的強。

這可能與 A & B 組的篩菌步驟不同有關。A 組是先用 MRS agar 培養，才用選擇

性培養基篩選；B 組則是直接就用選擇性培養基培養篩選。根據這些差異，推

測菌株如果越早接種於較難生長的環境（CMC）中做培養，可以刺激菌株強化

其對該環境的適應性並增加相關酵素的產生。

從（圖 4）得知纖維素酵素活性前 10 強的菌株為 A9、A13、B3、B6、B7、

B8、B12、B13、B29、B31，將以上菌株作菌種鑑定後再作後續實驗。

（三）菌株鑑定結果

將[基隆米克斯公司]所鑑定出的序列來做比對，（表16）為鑑定結果。根

據鑑定結果，B13、B31有高機率屬於 Enterococcus casseliflavus、Enterococcus

gallinarum。但根據一些醫學資料顯示，Enterococcus casseliflavus 會導致腦膜

炎（JI Yuan-yuan, 2011）；Enterococcus gallinarum 則會引起本土性心內膜炎、

主動脈心房瘺（ Fahmi Yousef Khan, Sitina S. Elshafi, 2011）。為避免感染風險，

將 B13、B31 這兩株從實驗中排除。剩餘8株則高機率是屬於Enterococcus

mundtii的一種。

厚壁菌門（phylum Firmicutes）中有部分的腸球菌（Enterococcus）屬是屬

於乳酸菌的一員，為革蘭氏陽性菌。它們經常被發現的物理特性是呈現雙鏈（雙

球菌）或短鏈狀，很少有單獨存在的。其中 E. faecalis （90-95%） & E. faecium

（5-10%）屬於正常人體腸道菌， E. casseliflavus， E. gallinarum， E. raffinosus

32

則屬於比較稀有且不常見的感染菌。 Enterococci 屬於兼性厭氧菌，雖然不會

產生孢子，但是對外在環境卻有著相當大範圍的耐受性。如：極限溫度（10

℃-45℃）、pH（4.5-10）、高鹽環境。

有研究發現，Enterococcus mundtii QU 25能將纖維二糖轉換成高純度的同

型L-（+）-乳酸（Mohamed Ali Abdel-Rahman et.al, 2011）。更有研究證實 QU 25

也能將木糖經同型乳酸發酵產生L-(+)-乳酸（Keisuke Shibata & Kenji Sonomoto.,

2011）。上述對 Enterococcus mundtii的研究結果，皆與本實驗的選擇性培養基

生長結果相符，這使本實驗篩選的菌株是Enterococcus mundtii其中一株的可能

性提高不少。此外，也有研究指出從黃豆中分離的Enterococcus mundtii ST4SA

會產生出一種具有抗菌作用的胜肽，可抑制腸胃道內其他腸球菌的生長（Dicks

LM, Granger M, van Reenen CA, 2010）說明本實驗菌株也可能具有抑菌作用。

三、細菌屬與真菌屬比較纖維素酵素活性

根據鑑定結果，將 A9、A13、B3、B6、B7、B8、B12、B29 以上 8 株與 Aspergillus

clavatus 作纖維素酵素活性比較。

（一）菌數含量

1.細菌

用 B3 作生長點菌數計算的結果顯示在（表 17）。用此數據計算 1 ml 菌液

所含菌數。

（1391+1330+1100）/3=1274 ……以 10-6 濃度計算平均

因此推算每 1 ml 所含的菌數: 1274*106=1.274*109

結論：細菌每 1 ml 的菌液約會含有 109 的菌數。

33

真菌孢子數根據上面細菌 1 ml 所含的菌數結果，接種時必須將 1 ml 所含

孢子數調整至與細菌接種時的菌數量等量。

2.真菌

Asp. clavatus 生長的孢子用 0.1% tween 80 無菌水沖提出的孢子液，用血球

計數玻片在顯微鏡底下計算孢子數的結果（表 18）。用此數據計算 1 ml 孢子液

所含孢子數。

5888*（104）=5.9*107 …四捨五入

結論：真菌每 1 ml 孢子液約含有 6*107 的孢子數。

推算接種 CMC broth 需要多少 ml 的孢子液？

細菌接種 CMC 時固定是取 50 μl 菌液，每 1 ml 菌液含有 109 的菌數

109*0.05=5*107…每次接種的細菌菌數

（5*107） / （6*107） = 0.833…#

結論：約 0.833 ml 孢子液的孢子數與 50 μl 菌液的菌數差不多等量。

（二）酵素活性測定

1.細菌

A9、A13、B3、B6、B7、B8、B12、B29 於最佳時間點，測定纖維素酵素

活性。結果顯示在（表 19）。

34

2.真菌

（表 20）為 Asp. clavatus 連續 7 天的纖維素酵素活性測定結果。（圖 5）

可以看出於第 7 天的纖維素酵素活性最高，或許 7 天以後酵素活性還會再增

強，但作真菌實驗的目的僅是用來與細菌做比較，實驗不是以真菌為主，所以

到此打住。從（圖 6）可以看出，Asp. clavatus 不論是培養至與細菌同時間的

第五天或最高活性的第七天，其纖維素酵素活性皆高於任何一株的篩選菌株。

（三）細菌與真菌的比較與評估

本實驗所篩出的菌株酵素活性雖然皆比不上真菌，但仍具有一些真菌所沒

有的優勢。從培養繁殖面來看，細菌可以在厭氧環境下生長，不像絕對好氧性

的真菌一定要在有氧環境下才能生長，培養條件較簡單且繁殖速度較快，如果

增加同體積內的細菌量，也可能達到接近真菌的酵素活性程度。

且 Enterococcus mundtii 菌株的培養不像一般乳酸菌一定要用葡萄糖等單

醣作為碳源，可以改用含有大量纖維素、木糖成分的一些植物來源廢棄物做發

酵培養，不但可以減少培養時的碳源用量，更可以使廢棄物有燃燒、掩埋以外

的應用方法，有助於纖維素資源的回收再利用。

另外，從纖維素酵素層面來看，真菌類所生產出的酵素大多還是只能用在

工業發酵、堆肥等非對人目的使用上，可能是礙於真菌毒性的問題，因此也鮮

少有真菌類酵素應用於人體上的相關研究，但如果是 GRAS 乳酸菌菌株所產生

的酵素，在人體使用上的安全性也就較不需顧慮，菌體本身也可當微生物蛋白

質來源。

35

第五章結論

從草食性昆蟲-白蠶的糞便中所篩選出的菌株，A & B 組共 56 株。其中符合

乳酸菌特性又具有纖維素分解利用能力的菌株只有 32 珠。值得一提的是這 32

株也都同時具有木糖分解利用能力。

32 株菌經由纖維素酵素活性比較所選出的前 10 強的菌株，根據菌種鑑定的

結果其中 8 株有高機率為 Enterococcus mundtii，剩餘 2 株則可能是 Enterococcus

casseliflavus、Enterococcus gallinarum。前者為纖維素、木糖利用型乳酸菌之一，

後者兩個菌種皆為較稀有的致病型腸球菌。

將篩選的菌株與 Aspergillus clavatus 真菌做纖維素酵素活性比較，結果雖然

是真菌的酵素活性更高一籌，但篩選菌株仍具有可在厭氧環境下繁殖、可利用葡

萄糖等單醣以外難以利用的醣類生長的優勢，不論是在益生面、發酵面上都具有

發展潛力。

36

表 1

第一次酸性測試（厭氧）

菌株編號 pH 菌株編號 pH

1 4.89 11 4.82

2 4.81 12 4.82

3 4.84 13 4.86

4 4.82 14 4.92

5 5.38a 15 4.81

6 4.81 16 4.82

7 4.81 17 4.82

8 4.82 18 4.86

9 4.82 19 4.85

10 4.81 20 6.53a

a 該菌株 pH>5 視為不產酸，將 5、20 號剃除。

37

表 2

觸媒反應

菌株編號結果菌株編號結果

1 － 11 －

2 － 12 －

3 － 13 －

4 － 14 －

5 15 ＋a

6 － 16 －

7 － 17 －

8 － 18 －

9 － 19 －

10 － 20

會產氣泡的標示為”＋”,不產氣泡的為“－”。

a 該菌株產生氣泡為觸媒陽性(+)反應，故將 15 號剃除。

38

表 3

第二次酸性測試（微氧）

菌株編號 pH 菌株編號 pH

1 4.65 11 5.24

2 4.88 12 4.83

3 4.73 13 4.76

4 5.08 14 4.74

5 - 15 -

6 4.89 16 5.17

7 4.80 17 5.18

8 4.94 18 4.75

9 5.13 19 5.26

10 5.51 20 -

第二次酸性測試僅供參考。

39

表 4

革蘭氏染色

菌株編號結果菌株編號結果

1 ＋ 11 ＋

2 ＋ 12 ＋

3 ＋ 13 ＋

4 ＋ 14 ＋

5 15 ＋

6 ＋ 16 ＋

7 ＋ 17 ＋

8 ＋ 18 ＋

9 ＋ 19 ＋

10 ＋ 20

染色結果，藍紫色為 G(+)、紅色為 G(-)。

40

表 5

選擇性培養基生長結果

菌株編號 CMC Xylose Pectin 菌株編號 CMC Xylose Pectin

1 ++a +b -c 11 ++ + -

2 ++ + - 12 ++ + -

3 ++ + - 13 ++ + -

4 ++ + - 14 ++ + -

5 15

6 ++ + - 16 ++ + -

7 ++ + - 17 ++ + -

8 ++ + - 18 ++ + -

9 ++ + - 19 ++ + -

10 ++ + - 20

a 表示有菌落生長且數量較多

b 表示有菌落生長

c 表示沒菌落生長或菌落不明顯

41

表 6

選擇性培養基生長結果(B)

菌液體積(ml) CMC Xylose Pectin

25 ++a +b -c

50 ++ + -

75 ++ + -

a 表示有菌落生長且數量較多

b 表示有菌落生長

c 表示沒菌落生長或菌落不明顯

42

表 7

第一次酸性測試（厭氧）(B)

菌株編號 pH 菌株編號 pH 菌株編號 pH

1 4.90 16 4.93 31 4.97

2 4.82 17 4.91 32 4.96

3 4.87 18 4.90 33 4.91

4 4.92 19 4.92 34 4.88

5 4.83 20 4.90 35 4.94

6 4.77 21 4.91 36 4.92

7 4.79 22 4.83 37 4.90

8 4.83 23 4.91

9 4.80 24 4.87

10 4.89 25 4.91

11 4.93 26 4.95

12 4.99 27 4.95

13 4.96 28 4.88

14 4.87 29 4.91

15 4.91 30 a -

全部菌株 pH<5，故皆保留。

a 該菌株無紀錄。

43

表 8

觸媒反應(B)

菌株編號結果菌株編號結果菌株編號結果

1 － 16 － 31 －

2 － 17 － 32 －

3 － 18 － 33 －

4 － 19 － 34 －

5 － 20 － 35 －

6 － 21 － 36 －

7 － 22 － 37 －

8 － 23 －

9 － 24 －

10 － 25 －

11 － 26 －

12 － 27 －

13 － 28 －

14 － 29 －

15 － 30

會產氣泡的標示為”＋”,不產氣泡的為“－”。

44

表 9

第二次酸性測試（微氧）(B)

菌株編號 pH 菌株編號 pH 菌株編號 pH

1 4.62 16 4.75 31 4.65

2 4.63 17 4.67 32 4.68

3 4.59 18 4.79 33 4.71

4 4.63 19 4.72 34 4.79

5 4.61 20 4.72 35 4.67

6 4.61 21 4.71 36 4.72

7 4.65 22 4.74 37 4.69

8 4.62 23 4.65

9 4.62 24 4.75

10 4.72 25 4.73

11 4.78 26 4.71

12 4.69 27 4.67

13 4.69 28 4.75

14 4.86 29 4.64

15 4.82 30 -

第二次酸性測試僅供參考。

45

表 10

革蘭氏染色(B)

菌株編號結果菌株編號結果菌株編號結果

1 ＋ 16 ＋ 31 ＋

2 ＋ 17 － 32 －

3 ＋ 18 － 33 －

4 － 19 － 34 －

5 ＋ 20 － 35 －

6 ＋ 21 － 36 ＋

7 ＋ 22 － 37 ＋

8 ＋ 23 －

9 ＋ 24 －

10 － 25 －

11 － 26 －

12 ＋ 27 －

13 ＋ 28 －

14 － 29 ＋

15 － 30

染色結果，藍紫色為 G(+)、紅色為 G(-)。

將結果為 G(-)的菌株全數剃除。

46

表 11

葡萄糖標準曲線之吸光值

葡萄糖溶液濃度 (μg/ml) OD550 (Å)

0 0.000 ±0.000

25 0.001 ±0.000

50 0.018 ±0.009

100 0.128 ±0.014

200 0.366 ±0.005

400 0.842 ±0.045

800 1.766 ±0.095

將數據繪製成標準曲線圖（見圖 1）。

47

表 12

預實驗吸光值測定

Day

1 2 3 4 5 6 7

Reaction Time OD550（Å）

30 min

1:4a 0 0.007 -0.011 0.010 0.090 0.053 0.039

2:3 0.021 0.067 0.081 0.040 0.232 0.147 0.165

3:2 0.123 0.098 0.114 0.080 0.253 0.260 0.270

4:1 0.183 0.175 0.211 0.130 0.270 0.380 0.304

60 min

1:4 0.021 0.009 -0.011 0.016 0.045 0.031 0.045

2:3 0.055 0.059 0.048 0.044 0.154 0.131 0.165

3:2 0.122 0.117 0.090 0.078 0.238 0.251 0.243

4:1 0.129 0.198 0.184 0.124 0.417 0.359 0.245

a 數字比= 酵素液 : CMC PBS 。

48

表 13

預實驗酵素活性單位

Day

1 2 3 4 5 6 7

Reaction Time U/ml

30 min

1:4a 0.053 0.059 0.044 0.061 0.125 0.096 0.084

2:3 0.035 0.053 0.059 0.043 0.120 0.086 0.093

3:2 0.051 0.044 0.048 0.039 0.086 0.087 0.090

4:1 0.050 0.048 0.056 0.039 0.068 0.090 0.074

60 min

1:4 0.035 0.030 0.022 0.033 0.045 0.039 0.045

2:3 0.024 0.025 0.023 0.022 0.044 0.040 0.046

3:2 0.025 0.025 0.021 0.019 0.041 0.042 0.041

4:1 0.020 0.027 0.025 0.019 0.049 0.043 0.031

a 數字比= 酵素液 : CMC PBS 。

將數據繪製成趨勢圖（見圖 2 &圖 3）。

49

表 14

酵素活性吸光值測定

OD550（Å）

Reaction Time Reaction Time

菌株 10 min 20 min 菌株 10 min 20 min

ca 0 0 B1 0.135 0.124

A1 0.118 0.093 B2 0.083 0.054

A2 0.080 0.080 B3 0.174 0.145

A3 0.106 0.096 B5 0.143 0.146

A4 0.050 0.039 B6 0.155 0.180

A6 0.143 0.135 B7 0.143 0.153

A7 0.071 0.056 B8 0.144 0.164

A8 0.118 0.094 B9 0.129 0.134

A9 0.183 0.136 B12 0.199 0.218

A10 0.133 0.103 B13 0.179 0.194

A11 0.142 0.133 B16 0.058 0.046

A12 0.056 0.056 B29 0.231 0.231

A13 0.257 0.164 B31 0.224 0.231

A14 0.055 0.056 B36 0.142 0.097

A16 0.132 0.120 B37 0.108 0.120

A17 0.031 0.029

A18 0.074 0.078

A19 0.058 0.080

a 為控制組。

50

表 15

酵素活性單位

U/ml

Reaction Time Reaction Time

菌株 10 min 20 min 菌株 10 min 20 min

ca - - B1 0.121 0.057

A1 0.111 0.048 B2 0.090 0.036

A2 0.088 0.044 B3 0.145 0.064

A3 0.104 0.049 B5 0.126 0.064

A4 0.070 0.032 B6 0.133 0.074

A6 0.126 0.061 B7 0.126 0.066

A7 0.083 0.037 B8 0.127 0.069

A8 0.111 0.048 B9 0.118 0.060

A9 0.150 0.061 B12 0.160 0.086

A10 0.120 0.051 B13 0.148 0.078

A11 0.125 0.060 B16 0.075 0.034

A12 0.074 0.037 B29 0.179 0.090

A13 0.195 0.069 B31 0.175 0.090

A14 0.073 0.037 B36 0.125 0.049

A16 0.119 0.056 B37 0.105 0.056

A17 0.058 0.029

A18 0.084 0.043

A19 0.075 0.044

a 為控制組。

將數據繪製成柱狀圖（見圖 4）。

51

表 16

菌種鑑定結果

菌株 Scientific classification（16S ribosomal RNA，partial sequence）

A9 Enterococcus mundtii ATCC 43186 99%

A13 Enterococcus mundtii ATCC 43186 97%

B3 Enterococcus mundtii ATCC 43186 98%





B13 Enterococcus casseliflavus 84%

B29 Enterococcus mundtii ATCC 43186

Enterococcus hirae R

99%

99%

B31 Enterococcus casseliflavus

Enterococcus gallinarum

96%

96%

52

表 17

生長點計數

菌液稀釋濃度

10-6 10-7 10-8

CFU（菌落數）

1380 132 12

1320 128 10

1472 138 12

avg 1391 133 11

用平均數推算 1 ml 菌液所含菌數。

53

表 18

孢子數計數

沖提液孢子數

1 2 3

上 5750 4875 6950

下 5725 5500 6525

avg 5738 5188 6738

Total avg 5888

用平均數推算 1 ml 孢子液所含孢子數。

54

表 19

細菌纖維素酵素活性測定

OD550(Å)

菌株 avg U/ml

A9 0.027 0.056 ±0.006aa

A13 0.065 0.079 ±0.007b

B3 0.051 0.071 ±0.014b

B6 0.032 0.059 ±0.007a

B7 0.061 0.077 ±0.010b

B8 0.061 0.076 ±0.011b

B12 0.077 0.086 ±0.005c

B29 0.076 0.086 ±0.003c

a 關於標準差後面標示 a b c 字母的意義。

標相同字母表示兩數據無顯著差異(p>0.05)；

標不同字母表示兩數據有顯著差異(p<0.05)。

55

表 20

真菌纖維素酵素活性測定

Aspergillus clavatus

OD550(Å)

Day 1 2 3 avg U/ml

1 0.039 0.002 0.002 0.014 0.039 ±0.010

2 0.142 0.148 0.140 0.143 0.101 ±0.002

3 0.211 0.217 0.211 0.213 0.135 ±0.002

4 0.268 0.296 0.311 0.292 0.173 ±0.011

5 0.312 0.295 0.294 0.300 0.177 ±0.005

6 0.455 0.431 0.406 0.431 0.240 ±0.012

7 0.430 0.428 0.446 0.435 0.242 ±0.005

將數據繪製成趨勢圖（見圖 5）。

本表第 5、第 7 天的數據與表 19 的數據一同繪製成柱狀圖（見圖 6）。

56

con.

0 200 400 600 800 1000

OD

550

avg.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Con. vs OD550 [avg.] Plot 1 Regr

y = 0.0023x - 0.0659

R2 = 0.9972

圖 1、葡萄糖標準曲線圖

57

Day

0 1 2 3 4 5 6 7 8

U/m

l

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Day vs 1:4 Day vs 2:3 Day vs 3:2 Day vs 4:1

圖 2、預實驗 B1 菌株用 CMC 培養連續一周的酵素 U/ml 值（30min）

58

Day

0 1 2 3 4 5 6 7 8

U/m

l

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

0.045

0.050

0.055

Day vs 1:4 Day vs 2:3 Day vs 3:2 Day vs 4:1

圖 3、預實驗 B1 菌株用 CMC 培養連續一周的酵素 U/ml 值（60min）

59

圖4、

篩選

菌株

用CM

C培

養至

第五

天的

酵素

U/m

l值

60

Day

0 1 2 3 4 5 6 7 8

U/m

l

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

圖 5、Aspergillus clavatus 用 CMC 培養連續一周的酵素 U/ml 值（10min）

61

圖6、

前8強

細菌

菌株

與真

菌As

perg

illus

clav

atus

的酵素

U/m

l值比

較（

5d*:

第五

天；

7d*:第

七天

)

62

GGGCGGCGGATGCTACTTATGTAAGTCGCATGCTTCTTTTCCCTCCGGAGCTTGCTCCCCGGG

AAAAGAGGACTGGCGAACGGTTGATTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAA

CACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAAAGGC

GCTTTACGGTGCCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTATCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTC

ACCAAGGCCACCATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACAC

GGCCCAAACTCATACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACC

GAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAAC

AAGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT

GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA

GCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGG

AAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCG

TAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGC

TCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT

GCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG

GGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA

GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGTCTTGACATCCTTTGACCACTCT

AGAGATAGAGCTTCCTCTTCGGGGCAAAGTGACAGTGGTGCATGGTTGTCGT

圖 7、菌株 A9 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果

63

GTACGGCAGTGTGCTCTGACGTAGGTCGCATGCTTCTTTTCCCTGCGGAGCTTGCTCCACCGG

GAAAAGAGGACTGGGGAACGGTTGATTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTCAGAAGGGGATA

ACACTTGTAAACTGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAAAGGC


ACCAAGGCCACCATGCATATCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACG

GCCCAAACTCATACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCG

AGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACA

AGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT

GCCAGCAGTCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA


AAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCG

TAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGC

TCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT

GCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG

GGAGTACGACCGCAAGGTTGAACTCAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAGCGGTGGAGCAT

GTGGTTTATTCGAGCACGCGAGACCTTACCAGTCTTGACATCCTTTGAGCACTCTAGAGATAG

AGCTTCCCTTC

圖 8、菌株 A13 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果

64

GGGGGGGCGCTGAAATCCACCTGCTAGTCGAGCGCTTATTTTCAACTGCAGCTTGCTCCACC

GGGAAAAGAAGACTGGCTAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGA

TAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAAA

GGCGCTTTACGGTGCCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACG

GCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAG

ACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCT

GACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAA

GAACAAGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAAC

TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAA

AGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTC

ATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCATAAGAGGATAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAA

TGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTG

AGGCTCAAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGAT

GAGTGCTATGTGTTGGAGGGTTTCCCCCCCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTTAGCACTCCTC

CTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTCACA

圖 9、菌株 B3 之 16S ribosomal RNA 序列定序結果

65

GGGGGGGCGGTATGACTATCTCCTTCGGTCGGGCGCTTCTTTTCCCACCGGAGCTTGCTCCAC

CGGGAAAAGAGGAGTGGATAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGG

GATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAA

AGGCGCTTTACGGTGCCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAC

GGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGA

GACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTC

TGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGA

AGAACAAGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAA

CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAA


ATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAAAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAA

ATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCT

GAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG

ATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCCCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC

GCCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAGGAATTGACGGGCCCGCACAAGCGGT

GGAGCATGTGGTTTATTCGAAGCAACGCGAAAACCTACCAGTCTGACATCTGTTGACCACTCT

AGAATAGACCTCCCCTTCGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGG


66

GGGCGGCCGTATTACTACTCCGTCGGTCGACGCTTCTTTTCCCACCGGAGCTTGCTCCACCGG

GAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATA

ACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAAAGG

CGCTTTACGGTGCCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC

TCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGAC

ACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGA

CCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGA

ACAAGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGC

GAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATT

GGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATG

CGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAG

GCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA

GTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT

GGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAGGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG

GAGCATGTGGTTTAATTCGAGCACGCGAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTC

TAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGTTGTGC


67

GTGCGGCCGTTGTGCCTCCTCCTGTCGGTCGACGCTTCTTTTCCCACCGGAGCTTGCTCCACC

GGGAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGG

ATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAAA

GGCGCTTTACGGTGCCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACG

GCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAG

ACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCT

GACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAA

GAACAAGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAAC

TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAA


ATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAA

ATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCT

GAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG

ATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC

GCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAGCGG

TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAGCACGCGAGACCTTACCAGGTCTTGACATCCGTTTGACCTA

CTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGCTAAGTGACAGGTGGTTGCATG


68

GGGGGGGGTTATACTCCTCCGCGAGTCGGCGCTGGTTTTCACACAGGAGCTTGCTCCACCGG

GAAATAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAA

CACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAAAGGC


ACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACAC

GGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACC

GAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAAC

AAGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT

GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA


AAACTGGGAGACTTGAGTGCATAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCTT

AGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCT

CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG

CTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTACGCACTCCGCCTGGG

GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGTGGAGCA

TGTGGTTAATTCGAATCATCGCGAGACCTTACAGGTCTTGACTTCTTTGACCTCTCTAAAATTAG

AACTCCCCTTCGGGGCAAGGGACAGTTGTC


69

GGGGGCTGATGTATACTTTGTAAGTCGACGCTTCTTTTTTCACCGGAGCTTGCTCCACCGAAA

AAAAAAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAAC

ACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACACTATTTTCCGCATGGATTAATTTTGAAAGGCGC

TTTTGCGTCCCTGATGGATGGACCCCCGGTGCATTTTATCTATGGTGAGGTAACGGCTCACCAA

GGCGCCAATGCATATACCACCTGAGAGGGGGAGATCCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC

CCACTCCTATAGGAGGGGCAGCTAGGGAATCTCCTCCAATGGACAAAAGTCTGAGACAGCAA

CGCCCCGTGAGTGAAAAGAGTTTTCTCATATAAAACTCTCTGTTAGAGAAAAGAAGGATGAGA

GAAAACTGTCATCCCTTGACGGTATCTAACCCAGAAGCCCGGCTAACTACGTGCCCCAGCCGC

GCGTAATACGTAAGTGGGAGCGTTGTCCGGATTTATTTGCGTTAGCGAGCGCGCAGCGCGGT

CTTTATCTGAATGTAAGCCCCGGCTCTCCCGGAAGTCCATGAACTTGAACTTGAGTGCCAAGA

AAAGTGGAATCCTGTGTAGCGTTAATGCGTAGATATATAGAAGAACCATGCCAAGGGTCTCTC

GGCTGTGACTGAGCTAGGTGAAGCTGGGGAGAACAGATAGACCTGGTAGCCAGCCTAAGAT

GATGCTAGTTTGAAGCTCGGCACATGCGGAGTACCATAGGCTCGCTGGATCACCGAGTAATCA

GATGAACGGTCGCAGCGTGACTTGATATCGAACCGGAGCTACGCTGACTGACCTGATAGTCTT

GCATATGTCATATCACTGCGATGACATGCAAGACATGTAGCAATCGCTCAGTCGT


70

CGCGGCGGTATGCTACATAAGTAAGTCGAACGCTTCTTTTCCCACCGGAGCTTGCTCCACCGG

GAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATA

ACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTCGTTTTGAAAGG

CGCTTTACGGTGCCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC

TCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGAC

ACGGCCCAAACTCATACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGA


ACAAGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGC

GAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATT



GCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA

GTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT

GGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG

GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCAC

TCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGCAAAGTGACAGTGGGTGCATGG


71

GGGGCGGGTAGTGCCTCCTATTGTAAGTCGAACGCTTTTTCTTTCACCGGAGCTTGCTCCACC

GGAAGAAAAAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGG

ATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACACTATTTTCCGCATGGAAGAAAGTTGAAA

GGCGCTTTTGCGTCACTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC

TCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC

ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGA


ACAAGGATGAGAGTAAAATGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA

CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAG

CGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATT



GCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA

GTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCATCGCATTAAGCACTCCGCCTG

GGGAGTACGACCGCGAGTTGAACTCAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAGCGTGGAGCATGT

GGTTAATTCGAGCACGCGAAGACTACAGTCTGACATCCTTGACACTCTAAGAATAGAGCTCCC

CTCAGGCAATGACAGTGTGCATGTGTCTCAGCCTCTGTCCT


72

（附圖來自英文維基百科）

附圖 1

纖維素水解酶的三種觸發類型:

1.破壞存在於纖維素結構內結晶區的非共價鍵結（endocellulase）。

2.從小分子糖類鍵結末端進行水解（exocellulase）。

3.將雙糖或三糖水解成葡萄糖（beta-glucosidase）。

73

（附圖來自英文維基百科）

附圖 2

β-glucosidase 作用的詳細過程。

74

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國立中興大學食品暨應用生物科技學系研究所...

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