출아효모에서 paf1 h3의 네번째 라이신의 메틸화에 effects of paf1...

Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 4, pp. 487-494 pISSN 0440-2413DOI https://doi.org/10.7845/kjm.2016.6063 eISSN 2383-9902Copyright ⓒ 2016, The Microbiological Society of Korea

Note

출아효모에서 Paf1 복합체의 구성원들이 H3의 네번째 라이신의 메틸화에

미치는 영향

오준수 ･ 이정신*

강원대학교 의생명과학대학 분자생명과학과

Effects of Paf1 complex components on H3K4 methylation in budding

yeast

Jun-Soo Oh and Jung-Shin Lee*

Department of Molecular Bioscience, College of Biomedical Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic

of Korea

(Received November 17, 2016; Revised December 12, 2016; Accepted December 12, 2016)

ABSTRACT: In Saccharomyces cerevisiae, Paf1 complex consists of five proteins, and they are structurally and functionally well

conserved in yeast, fruit fly, plants, and human. With binding to RNA polymerase II from transcription start site to termination site, Paf1

complex functions as a platform for recruiting many types of transcription factors to RNA polymerase II. Paf1 complex contributes to H2B

ubiquitination and indirectly influences on H3K4 di- and tri-methylation by histone crosstalk. But the individual effects of five components

in Paf1 complex on these two histone modifications including H2B ubiquitination and H3K4 methylation largely remained to be identified.

In this study, we constructed the single-gene knockout mutants of each Paf1 complex component and observed H3K4 mono-, di-, and

trimethylation as well as H2B ubiquitination in these mutants. Interestingly, in each Δpaf1, Δrtf1, and Δctr9 strain, we observed the

dramatic defect in H3K4 monomethylation, which is independent of H2B ubiquitination, as well as H3K4 di- and trimethylation. However,

the protein level of Set1, which is methyltransferase for H3K4, was not changed in these mutants. This suggests that Paf1 complex may

directly influence on H3K4 methylation by directly regulating the activity of Set1 or the stability of Set1 complex in an H2B ubiquitination

independent manner.

Key words: H3K4 methylation, Paf1 complex, Set1

*For correspondence. E-mail: [email protected];

Tel.: +82-33-250-8540; Fax: +82-33-259-5641

Histone은 단위체인 H2A, H2B, H3, H4로 구성되어있고,

이 단위체들의 각 2쌍이 8량체(octamer)를 구성한다. 이 8량체

의 histone 단백질을 DNA가 감싼 구조인 nucleosome을 기본

단위로 하여 이루는 고단위의 구조는 chromatin이라 하며, 진

핵세포의 좁은 핵 내에 chromatin을 넣기 위해 높은 수준의 응

축이 요구된다(Kornberg and Lorch, 1999; Shilatifard, 2012).

하지만 chromatin은 전사 시에 전사인자들의 접근 및 결합을

용이하게 하기 위해 부분적으로 구조가 풀려야 한다(Peterson,

2002). 8량체 histone 각 소단위의 N-말단은 nucleosome 중심

으로부터 바깥으로 빠져 나와 있어서, 특정 잔기에 많은 histone

변형 효소들에 의한 여러 histone 변형이 가능하다. 이 histone

변형들이 일부 염색체 재구성 효소의 도입을 돕거나 DNA와

Histone간의 상호작용을 약화시킴으로써 전사에 유리한 chromatin

구조로 변화하도록 도울 수 있다. 궁극적으로 이러한 histone

변형은 특정 유전자들의 전사의 활성화나 억제를 조절할 수

있다(Bannister and Kouzarides, 2011). 지금까지 아세틸화

(acetylation), 유비퀴틴화(ubiquitination), 메틸화(methylation),

sumoylation, 인산화(phosphorylation) 등 많은 histone 잔기의

변형들이 알려져 있고 지금도 활발히 연구가 진행 중이다

(Bannister and Kouzarides, 2011).

많은 histone 변형들 중에, histone H3의 네 번째 라이신 잔

기(H3K4)에 세 개의 메틸기(methyl group)가 결합한 H3K4

488 ∙ Oh and Lee

미생물학회지 제52권 제4호

trimethylation (H3K4me3)은 잘 연구되어 왔고, 표적 유전자

의 전사 활성화와 관련이 있다는 보고들이 있다(Li et al., 2007).

효모에서, 이 변형은 효소복합체인 Set1 complex (COMplex

of Proteins ASsociated with Set1, COMPASS)에 의해서 시행

되며, 이는 H3K4에 잔기 특이적으로 메틸기를 전달해 줄 수

있는 효소인 Set1과 Set1의 기능을 조절하는 7개의 단백질들

로 구성되어있다(Shilatifard, 2006; Lee et al., 2007). 출아효모

에서의 Set1은 유일한 H3K4 메틸기 전달효소로서 mono-, di-,

tri-methylation을 모두 일으킬 수 있으며, Set1복합체는 효모

로부터 사람에 이르기까지 잘 보존되어 있다(Shilatifard, 2006,

2012; Smith et al., 2011).

그런데 이 Set1/COMPASS에 의한 H3K4의 di-와 tri-

methylation (H3K4me2, H3K4me3)은 다른 histone변형인

H2BK123 monoubiquitination (H2Bub)을 전제조건으로 한다

(Dover et al., 2002; Lee et al., 2007, 2010). 이러한 서로 다른 두 개

의 histone 변형들의 관계를 histone crosstalk이라 한다. 이때, H3K4

monomethylation (H3K4me1)은 감소 하지만 여전히 존재한다

(Schneider et al., 2005; Lee et al., 2007).

효모에서 잘 정의되어 있는 H2BK123 monoubiquitination

은 여러 종에 잘 보존되어있고, human에서 이 변형은 Histone

H2B의 120번째 Lys에 보존되어있다(Li et al., 2007). 효모에

서 Histone H2BK123 monoubiquitination은 E2 효소인 Rad6

와, E3 효소인 Bre1의 작용에 의해 시행되는 변형이며, 이러한

Ubiquitination machinery는 인간을 비롯한 여러 종에서 잘 보

존되어있다(Li et al., 2007; Shilatifard, 2012).

이 H2B monoubiquitination 의존적인 H3K4 trimethylation

에 관여하는 인자들 중 Paf1복합체는 효모에서는 Paf1, Leo1,

Cdc73, Ctr9, Rtf1의 5개의 소단위로 구성된 복합체이며, 초파

리(Drosophila melanogaster), 식물, 사람에 이르기까지 많은

진핵생물에서 구조적, 기능적으로 잘 보존되어 있다(Mueller

and Jaehning, 2002; Squazzo et al., 2002; Jaehning, 2010). 사

람에서 Paf1 복합체의 구성요소의 부재나 돌연변이의 결과는

유전자 발현의 변형을 가져오고, 발생 프로그램이 잘 조절되

지 못하거나, 세포 분열주기 조절의 손상을 일으켜, 암을 일으

키기도 한다(Jaehning, 2010). 사람의 Cdc73 (hCdc73)의 돌연

변이가 유방암, 신장암, 위암에 연관되어있다는 결과도 있으

며, 사람의 Ctr9 (hCtr9)의 결핍과 hPaf1의 과발현은 췌장암과

관련이 있다는 보고들이 있다(Newey et al., 2009; Jaehning,

2010).

Paf1 복합체는 중요한 전사신장인자로서, RNA 중합효소 II

에 붙은 채 Promoter로부터 유전자의 3’ 말단에 이르기까지 함

께 움직이며, 여러 전사인자들이 RNA 중합효소 II에 결합할

수 있도록 결합을 매개해준다(Jaehning, 2010; Tomson et al.,

2013). 초파리의 Paf1 복합체는 activator인 Gli, β-catenin과의

직접적인 상호작용이 관찰되었고, rDNA와 관련된 RNA pol I

과의 상호작용도 알려져 있으며, 정확한 전사 종결을 위해 필

요한 3′말단 processing 인자들의 도입을 도와준다고 알려져

있다(Penheiter et al., 2005; Mosimann et al., 2006; Nordick et

al., 2008; Mosimann et al., 2009; Zhang et al., 2009; Jaehning,

2010).

더욱이 Paf1복합체는 많은 히스톤 변형, 그 중에도 H2B

monoubiquitination 의존적인 H3K4 methylation에 영향을 주

는 것으로 알려져 있다(Jaehning, 2010; Tomson et al., 2013).

Paf1 복합체는 H2BK123 monoubiquitination의 E2와 E3효

소인 Rad6와 Bre1이 chromatin에 도입되는 것을 도와주고,

유전자의 암호화 부위 내에 퍼지도록 함으로써 H2BK123

monoubiquitination에 기여한다는 보고들이 있다(Xiao et al.,

2005; Kim and Roeder, 2009; Tomson et al., 2013). Paf1복합

체의 Rtf1 소단위는 H2BK123 monoubiquitination에 가장 중

요한 것으로 생각되며, 특히 62~152번째의 아미노산들이

이루는 HMD (Histone Modification Domain)가 H2BK123

monoubiquitination을 위해 중요하다고 여겨진다(Warner et al.,

2007; Tomson et al., 2011, 2013; Piro et al., 2012). Paf1 복합

체가 없으면 H2BK123 monoubiquitination의 결함이 일어나고,

histone crosstalk에 의해 간접적으로 H3K4 di-, tri-methylation

의 결함이 일어나게 되는 것이다(Wood et al., 2003; Ng et al.,

2003a, 2003b; Lee et al., 2007). Δrtf1, Δpaf1의 경우 H3K4

trimethylation의 감소를 일으키고, H3K4 methyl기 전달 효소

인 Set1의 chromatin 결합을 억제한다는 보고들이 있지만,

Paf1복합체의 구성요소들 각각이 이 histone crosstalk에 미치

는 영향에 대한 연구는 잘 진행되어 있지 않다. 우리는 Paf1 복

합체 구성요소 각각이 H2BK123 monoubiquitination 의존적

인 H3K4 methylation에 주는 영향을 연구하기 위해, Paf1 복합

체의 각 구성요소들을 결핍시킨 균주들을 확보하고자 했다.

일단 실험실에 확보하고 있는 Paf1 복합체 구성요소들의 결

핍 돌연변이 균주들에 대해 H2B monoubiquitination 및 H3K4

trimethylation에 대한 항체로 Western blot을 시행한 결과,

Table 1 및 Fig. 1A에서, Δleo1, Δcdc73, Δrtf1일 때에는, 각 균

주들의 histone 변형 결과가 일관되었으나, Δpaf1의 경우는 그

결과가 일관되지 않았다.

Δpaf1의 H2BK123 monoubiquitination 및 H3K4 trimethylation

의 상태를 확인하기 위해, 실험실내의 모든 Δpaf1 균주들의

genomic DNA를 뽑아서 PAF1 ORF의 upstream과 downstream

에 결합하는 primer를 이용한 PCR을 시행해서 결핍 여부를

Paf1 복합체 구성요소와 H3 네번째 라이신의 메틸화 ∙ 489

Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4

Table 1. Yeast strains used in this study

Strains Genotype Source

FM391 FM391 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 BY4741

Δset1 YLJ002 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 set1::KanMX Yeast KO library

Δrad6 YLJ003 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 rad6::KanMX Yeast KO library

Δbre1 YLJ004 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 bre1::KanMX Yeast KO library

Δpaf1#1 YLJ005 MAT alpah his3d1 leu2d0 ura3d0 lysd0 paf1::KanMX Yeast KO library

Δpaf1#2 YLJ006 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 paf1::KanMX Yeast KO library

Δpaf1#3 YLJ007MAT a his3-11,-15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 ade2-1 hta1-htb1Δ::LEU2 hta2-htb2Δ

HTA1-HTB1 (2μ URA3) <pZS145 HTA1-Flag-HTB1 CEN HIS3> paf1::KanMXThis lab

Δpaf1#4 YLJ008MAT a hta1-htb1Δ::LEU2 hta2-htb2Δ HTA1-HTB1 (2μ URA3) <pZS145

HTA1-Flag-htb1K123R CEN HIS3> paf1::KanMXThis lab

Δpaf1#5 YLJ009MAT a his3-11,-15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 ade2-1 hta1-htb1Δ::LEU2 hta2-htb2Δ

HTA1-HTB1 (2μ URA3) <pZS145 HTA1-Flag-HTB1 CEN HIS3> paf1::KanMXThis lab

Δpaf1#6 YLJ010

MAT a his3-11,-15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 ade2-1 hta1-htb1Δ::LEU2 hta2-htb2Δ

HTA1-HTB1 (2μ URA3) <pZS145 HTA1-Flag-HTB1 CEN HIS3> HTB1-K123A

paf1::KanMX

This lab

Δpaf1#7 YLJ011 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 paf1::KanMX This lab



Δpaf1#10 YLJ014 MATa ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0 bre1::NatMX paf1::KanMX This lab

Δleo1#1 YLJ015 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 leo1::KanMX This lab

Δleo1#2 YLJ016 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 leo1::KanMX This lab

Δleo1#3 YLJ017 MATa ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0 leo1::KanMX Yeast KO library

Δcdc73#1 YLJ018 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 cdc73::KanMX This lab

Δcdc73#2 YLJ019 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 cdc73::KanMX This lab

Δcdc73#3 YLJ020 MATa ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0 cdc73::KanMX Yeast KO library

Δrtf1#1 YLJ021 MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 rtf1::KanMX This lab



Δrtf1#4 YLJ024 MATa ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0 rtf1::KanMX Yeast KO library

BY4741 BY4741 MATa ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0 Yeast KO library

Δpaf1::ura3#5 YLJ025 MATa ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0 paf1::ura3 This study

Δctr9::ura3#1 YLJ026 MATa ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0 ctr9::ura3 This study

Δpaf1-H2BK123R

(Δpaf1 in YZS277)YLJ027

MATa hta1-htb1Δ::LEU2 hta2-htb2Δ HTA1-HTB1 (2μ URA3) <pZS145

HTA1-Flag-htb1K123R CEN HIS3> paf1Δ::KanMXThis lab

H2BK123R

(YZS277)YLJ028

MATa hta1-htb1Δ::LEU2 hta2-htb2Δ HTA1-HTB1 (2μ URA3) <pZS145

HTA1-Flag-htb1K123R CEN HIS3>This lab

확인했고(Table 1 and Fig. 1B), 이때 각 균주의 H2BK123

monoubiquitination 및 H3K4 trimethylation의 수준을 western

blot을 통해 확인했다. Δpaf1 #3, #4, #5, #6의 경우 Δpaf1이기

는 하지만 background에서 의도한 것과 달랐기 때문에, 이 실

험에서 제외했다(Table 1 참고). 야생형의 amplicon 크기와 분

명히 다른 크기의 하나의 밴드만 나오는 Δpaf1#1, #2, #9의 경

우, H2BK123 monoubiquitination 및 H3K4 trimethylation

의 심각한 결함을 나타낸 반면, 야생형의 amplicon 크기를 포

함한 두 개의 밴드로 증폭이 된 균주들(Δpaf1 #7, #8, #10)의

경우, 야생형의 경우와 거의 차이가 없는 정도의 H2BK123

monoubiquitination 및 H3K4 trimethylation 수준을 나타내

는 것을 확인했다(Fig. 1B and C). 따라서, 우리는 야생형의

amplicon 크기를 포함한 경우를 PAF1 유전자가 제대로 disruption

이 되지 않은 경우로 결론짓고, Δpaf1 균주의 경우, H2BK123

monoubiquitination 및 H3K4 trimethylation을 일으킬 수 없는

것으로 생각하게 되었다.

490 ∙ Oh and Lee


(A)

(B)

(C)

Fig. 1. Paf1-depleted strains show unstable phenotype. (A) Deletion mutants

of individual Paf1 complex components show differential and significant

defects in H2B monoubiquitination and subsequent H3K4 trimethylation.

Deletion mutants of Paf1 complex components in our lab are plated on

YPD plates and incubated at 30°C. Cells are grown in YPD for 16 h at

30°C. The nuclear extracts were prepared by homogenizing the cells in

NIB (Nuclear Isolating Buffer, containing 0.25 M sucrose, 60 mM KCl, 14

mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.8% Triton X-100) containing 0.5

mm glass-beads in the 1.5 ml tubes and by boiling its cell lysates. Prepared

samples were used for subsequent western blot. In case of paf1, the strains

show unstable phenotype. (B) By PCR amplification with primer set

binding to both up- and down-stream of PAF1 allele, PAF1-depleted

strains, including #1, #2, #9, were compared with strains showing both

PAF1-disrupted PCR band and PCR band whose size was similar to WT

copy, including #7, #8, #10. (C) paf1 null mutant cells showed severe

defects in H2BUB1 and H3K4ME3. By comparing with PCR data in Fig.

1B, we concluded that H2BK123 monoubiquitination and H3K4 trimethylation

were not detected in PAF1 depletion.

결과에 대한 보다 분명한 검증을 위해, 야생형 균주인 BY4741

에서 PAF1을, 현재까지 갖고 있는 Δpaf1 균주가 갖고 있는 것

(geneticin resistant marker, KanMx)과 다른 마커인, URA3

marker로 disruption했다. Fig. 2A와 같이 one-step gene disruption

assay를 시행했고, 군집들을 선택한 후, 이들 중 PAF1 유전자

가 붕괴된 균주들을 Fig. 2A에 명시한 primer를 이용한 PCR로

찾아 선별해낸 후, 다시 이들의 단일 군집을 선별해내서, 이를

PCR로 확인했다(Fig. 2B). 선별해 낸 단일 군집 균주들에 대한

western blot을 시행한 결과(Fig. 2C), PAF1의 결핍은 H2BK123

monoubiquitination 및 H3K4 trimethylation에 심각한 결함을

유발한다는 것을 확인했다. 하지만 동일 균주 유래의 단일 군

집 선별을 했고, PAF1의 대립인자는 분명 결실이 되었음에도

(Fig. 2B), 균주들이 보이는 H2B monoubiquitination 수준이

불안정했다(Fig. 2C). 이후의 실험에서는 보고된 내용과 일치

하는 #5를 사용했고(Xiao et al., 2005; Tomson et al., 2013), 상

당히 많은 양의 H2BK123 monoubiquitination이 감지되는 나

머지 균주들은 결실 된 PAF1의 기능이 다른 유전자 부위의 돌

연변이에 의해 보완되었을 가능성도 제안해 볼 수 있지만 확

인하지 않았다. 하지만, 놀라웠던 점은, 기존에 보고된 내용에

서는 H2BK123 monoubiquitination의 심각한 손실과 histone

crosstalk에 의한 간접적인 영향이 H3K4 di-와 tri-methylation

의 결핍에 영향을 주는 것으로 여겨졌는데(Lee et al., 2010),

Fig. 2C에서 상당한 수준의 H2BK123 monoubiquitination이

나타났음에도 H3K4 trimethylation은 확실하게 감소되거나

사라진 적으로 보아, Paf1이 Set1 복합체의 안정성이나 기능에

직접적인 영향을 줄 가능성을 암시한다.

실험실내에 Paf1 복합체의 구성요소인 Ctr9의 결핍 돌연

변이 균주가 없기 때문에, PAF1의 유전자를 붕괴시킬 때와

동일한 방법으로, 이번에는 CTR9 유전자를 URA3 marker로

disruption했다(Fig. 3A). 형질전환 후 선택해 낸 군집들을 Fig.

3A에 명시한 primer를 이용한 PCR로 찾아 선별해냈다(Fig. 3B).

이들에 대한 western blot으로 H2BK123 monoubiquitination

및 H3K4 trimethylation의 수준을 확인해 보았다. 그 결과,

Ctr9이 결핍된 경우에도, Paf1이 결핍된 경우와 마찬가지로,

H2BK123 monoubiquitination 및 H3K4 trimethylation의 심

각한 결함이 나타났다(Fig. 3C).

Paf1 복합체 구성요소들의 결핍 돌연변이 균주들을 모두 확

보했고(Fig. 4A), 이들 각각이 H2BK123 monoubiquitination

및 H3K4 mono-, di-, tri-methylation 모두에 미치는 영향을 확

인해 보기 위해 western blot을 시행했다. 그 결과(Fig. 4B), Paf1

복합체의 구성요소들 각각이 H2BK123 monoubiquitination

및 H3K4 mono-, di-, tri-methylation에 미치는 영향은 각각 조

금씩 달랐지만 큰 영향을 주었고, 특히, Paf1 혹은 Ctr9 혹은

Rtf1이 없는 경우에서 두드러졌다. Leo1 혹은 Cdc73가 없는

경우에는, 더욱 세밀한 실험을 해야 하지만, 세포 전반적인



(A)

(B)

(C)

Fig. 2. PAF1 depletion leads to the severe defects in H2BUB1 and

H3K4ME3. (A) A schematic diagram represents the wild-type PAF1

allele and the paf1 deletion allele in S. cerevisiae. The entire PAF1

(YBR279W) ORF region was replaced by the marker gene, URA3+

, using

one-step gene disruption method. The PAF1 ORF is shown by an open

box. The arrow under the ORF indicates the direction of transcription. The

arrowheads mark the positions of PCR primers for confirmation of wild

type and deletion allele. The size of PCR products is denoted under or

above the arrows. (B) By PCR amplification using primers mentioned in

Fig. 2A, PAF1 WT and deletion allele were confirmed. Confirmed PAF1-

deleted strain underwent single colony isolation and isolated strains (#1~#6)

were used for this experiment. All confirmed strains were utilized in

western blot (Fig. 2C). (C) paf1 null mutant cells showed severe defects in

H2BUB1 and H3K4ME3, especially in H3K4ME3 by western blot. After

cells were grown in YPD for 16 h at 30°C, Cells were separately harvested

for preparing nuclear extracts and for isolating genomic DNA. Prepared

nuclear extracts were used for subsequent western blot. Although all

strains were originated from same strain by single colony isolation and

their PAF1-allele were definitely disrupted with ura3 marker, all strains

were showing slightly differential phenotypes in H2BUB1. We thought

this surprising event may be result from the additional mutations of other

genes and compensation of lost Paf1 function.

(A)

(B)

(C)

Fig. 3. Depletion of CTR9 leads to severe defects in H2BUB1 and

H3K4ME3. (A) A schematic diagram represents the wild-type CTR9 allele

and the ctr9 deletion allele in S. cerevisiae. The entire CTR9 (YOL145C)

ORF region was replaced by the marker gene, URA3+

, using one-step gene

disruption method. The CTR9 ORF is shown by an open box. The arrow

under the ORF indicates the direction of transcription. The arrowheads

mark the positions of PCR primers for confirmation of wild type and

deletion allele. The size of PCR products is denoted under or above the

arrows. (B) By PCR amplification using primers mentioned in Fig. 3A,

CTR9 WT and deletion allele were confirmed. Confirmed CTR9-deleted

strain underwent single colony isolation and isolated strains (#1~#3) were

used for this experiment. All strains were utilized in western blot (Fig. 3C).

(C) ctr9 null mutant cells showed severe defects in H2BUB1 and H3K4ME3.

After cells were grown in YPD for 16 h at 30°C, Cells were harvested for

preparing nuclear extracts. Prepared nuclear extracts were used for subsequent

western blot. Deletion of ctr9 leads to severe defects in H2BUB1 and

H3K4 trimethylation.

histone 변형들의 수준에 대한 주목할만한 변화는 없었다. Δrtf1

균주와 Δpaf1 균주의 경우 H2B monoubiquitination에서의 심

각한 결손이 있고, histone crosstalk에 의해 간접적으로 H3K4

di- 및 tri-methylation의 결함이 있다는 것은 이미 보고가 된 바 있

492 ∙ Oh and Lee


(A) (B)

(C)

(D)

Fig. 4. Paf1 complex components directly influence on the H3K4 methylation. (A) After cells were grown in YPD broth for 16 h at 30°C, cells were harvested

for isolating genomic DNA. By PCR of purified DNA using allele-specific primer set, deletion of each components were confirmed. (B) Each of Paf1

complex components diversely and significantly has an effect on H2BUB1 and subsequent H3K4 di- and tri-methylation. After all Paf1 complex

component-deleted mutants were constructed, cells were grown in YPD broth at 30°C for 16 h and were harvested for preparation of nuclear extracts.

H2BUB1 and H3K4 mono-, di-, and tri-methylation levels were checked by western blot. Each gene-deletion of PAF1, CTR9 or RTF1 shows severe defects

in H3K4 mono-, di-, and tri-methylation as well as H2B monoubiquitination. (C) Dramatic defects of protein level of sole H3K4 methyltransferase Set1 were

not detected in any case. Drastic defects in all of the H3K4 methylation in ctr9 null mutant may be not result from the loss of Set1 level. (D) Loss of Paf1 leads

to H2BK123 monoubiquitination-independent reduction in H3K4 monomethylation. H2BK123 monoubiquitination-defective strain, result from H2B

monoubiquitination-residue specific substitution (H2BK123R), has reduced, but significant level of H3K4 monomethylation. But, subsequent deletion of

Paf1 induces more dramatic reduction in H3K4 monomethylation.

다(Krogan et al., 2003; Ng et al., 2003a, 2003b). 하지만, Δctr9

균주의 경우에는 현재까지 잘 알려진 바가 없었는데, 본 연구

를 통해서 H2B monoubiquitination 및 H3K4 methylation 모

두에서의 심각한 결함을 보인다는 것을 확인했다. 그리고 놀

랍게도, Fig. 4B에서 보이는 것과 같이, Δpaf1 균주, Δrtf1 균주,

그리고 Δctr9 균주에서는 H2B monoubiquitination에 영향을

받지 않는 H3K4 monomethylation에서도 심각한 결함을 보인

다. 이러한 결과가 Paf1 복합체의 세 구성요소인 Paf1 혹은 Rtf1

혹은 Ctr9이 H3K4 methylation을 일으키는 효소인 Set1에 직접

영향을 미쳐서 일어난 것인가를 확인하기 위해, Set1에 대한

western blot을 시행했지만 Set1의 단백질 양에는 큰 변화가 없

었다(Fig. 4C). Figure 4B의 결과에서 Δpaf1 균주가 보인 H3K4

monomethylation에서의 감소가 H2BK123 monoubiquitination

의존적으로 나타나는 Histone crosstalk의 결함에 의한 것인지

를 확인하기 위해, H2BK123 monoubiquitination을 일으키는

잔기의 치환 돌연변이 균주(H2BK123R, YZS277)와 H2BK123R

돌연변이에 Paf1까지 결핍시킨 균주의 H3K4 monomethylation

정도를 비교했다. 그 결과, Paf1의 결핍은 H2BK123 monoubi-

quitination의 결함에 의한 H3K4 monomethylation의 감소에

더불어 H3K4 monomethylation의 더욱 심각한 결함을 유도함

을 알 수 있었다(Fig. 4D).

Paf1복합체는 H2B monoubiquitination을 일으키는 ubiqui-

tination machinery인 Rad6와 Bre1이 chromatin에 도입되고

유전자의 암호화 부위 내에 널리 퍼지도록 하는 데 기여한다

(Tomson et al., 2013). 나아가 이러한 H2B monoubiquitination

에 대한 기여가 histone crosstalk에 의해 간접적으로 H3K4 di-

및 tri-methylation에 영향을 미친다. 하지만, Paf1 복합체의 각

구성요소들이 미치는 영향에 대한 연구가 잘 진행이 되어있지

않기 때문에, 이 논문에서는 Paf1 복합체의 각각이 결핍 된 균

주를 확보했다. 일단, Paf1의 결핍 돌연변이 균주를 만들었고,



보고된 바와 같이 H2BK123 monoubiquitination 및 H3K4

trimethylation의 심각한 결손을 관찰했으나, H2BK123 monou-

biquitination이 일관되지 않았다(Fig. 2B and C). 하나의 유래

균주에서 단일 군집 선별을 거친 균주들이고, Paf1의 대립인자

의 분명한 결실을 확인했기에(Fig. 2B), 놀라운 결과였다. 또한,

paf1::ura3#1,3의 경우 상당한 양의 H2BK123 monoubiquitination

이 존재하나, H3K4 trimethylation은 전혀 나타나지 않았다

(Fig. 2C). 모든 Paf1 복합체의 단일 결손 돌연변이 균주들의

H2B monoubiquitination 및 H3K4 mono-, di-, tri-methylation을

western blot을 통해 확인한 결과, 기존에 연구 되었던 Paf1 혹은

Rtf1뿐만 아니라 Ctr9이 없는 경우에 H2B monoubiquitination

및 H3K4 methylation들의 심각한 결손을 관찰했다(Fig. 4B).

Histone crosstalk에 의해 H2B monoubiquitination에 미치는 심

각한 결함이 H3K4 di-및 tri-methylation에 관한 결함의 원인으

로 설명이 가능하지만(Tomson et al., 2013), H2B ubiquitination

에 크게 영향을 받지 않는 H3K4 monomethylation에서의 심

각한 결함은 주목할 만 하다(Schneider et al., 2005) (Fig. 4B

and D). 또한, 이는 H3K4 methylation들을 일으키는 효소인

Set1의 단백질 양이 감소해서 생긴 현상이 아니었고(Fig. 4C),

Set1의 기능 혹은 COMPASS의 복합체 안정성에 직접 영향을

미칠 수 있다는 가능성을 제시한다.

마지막으로, H2BK123 monoubiquitination의 결함과 Paf1의

결함을 동시에 유도한 경우, H2BK123 monoubiquitination의

결함만 유도한 경우보다 더욱 심각한 H3K4 monomethylation

의 결함이 나타났다(Fig. 4D). 이는 Paf1이 없을 때, H2BK123

monoubiquitination의 심각한 결손 및 histone crosstalk에 의

해서 H3K4 methylation의 심각한 결손이 나타난다는 기존의

관점뿐 아니라, Paf1이 histone crosstalk과는 별개로 직접 Set1

의 활성을 조절하거나 COMPASS의 안정성을 조절할 수 있음

을 암시한다. 또한 현재까지 보고된 바는 없지만, Paf1 복합체

가 RNA가 합성되는데 필요한 다른 여러 단백질들이 크로마

틴과 결합하는데 플랫포옴으로 작용한다고 보고된 것(Jaehning,

2010; Tomson et al., 2013)으로 미루어보아, Set1 복합체나 그

밖에 H3K4 methylation에 필요한 다른 단백질들이 크로마틴

과 결합하는 것을 조절할 가능성도 배제할 수는 없다.

적 요

출아 효모에서의 Paf1 복합체는 총 5개의 단백질로 구성되

어있고, 구성성분들은 출아효모, 초파리, 식물들, 그리고 인간

에 이르기까지 구조적으로, 기능적으로 잘 보존되어 있다. RNA

중합효소 II와 결합한 상태로 전사 개시부위부터 종결부위까

지 함께 이동하며, 여러 전사인자들의 유입을 위한 매개체로

작용하여, 유전자 발현 조절의 핵심적인 역할을 수행한다. Paf1

복합체는 H2BK123 monoubiquitination에 기여하고, histone

crosstalk에 의해 간접적으로 H3K4의 di-, tri-methylation에 기

여하는 것이 알려져 있다. 하지지만, Paf1 복합체 구성요소들

의 개별적인 기능에 대해서는 연구가 되어있지 않다. 이 연구

에서는, Paf1 복합체 구성요소들의 단일 결핍 돌연변이 균주

를 만든 후, 이들의 H2BK123 monoubiquitination 및 H3K4

mono-, di-, tri-methylation에 미치는 영향을 관찰했다. 놀랍게

도, Δpaf1, Δrtf1, Δctr9 돌연변이 균주에서는 H2Bub에 영향을

받는 H3K4me2와 H3K4me3뿐 아니라, H2B monoubiquitination

에 영향을 받지 않는 H3K4 monomethylation의 심각한 감소

를 관찰했다. 그러나, methyl기 전달 효소인 Set1의 발현 정도

는 이 돌연변이 균주들에서 변하지 않았다. 이러한 결과로부

터, Paf1 복합체가 Set1의 활성이나 Set1 복합체의 안정성을

직접 조절함으로써 H3K4 methylation을 조절할 수 있음을 제

시한다.

감사의 말

이 논문은 2014년도 강원대학교 학술연구조성비(C1010957-

01-01)와 2015년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한국

연구재단의 지원(NRF2015R1A4A1041105, NRF2015R1D-

1A1A02061743)을 받아 수행되었다.

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