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国立成育医療研究センター 研究所再生医療センター

阿久津英憲

「ヒト及び動物」の要素が交じり合うイメージについて

-動物性集合胚研究の成果からみる表現型の実際-

第98回特定胚等研究専門委員会

平成29年4月12日

動物性集合胚に関連する幹細胞の整理

Figure 5 ; Weinberger L, Ayyash M, Novershtern N, Hanna JH. Nat Rev Mol Cell Biol, 2016

多能性幹細胞の種間差 “Naïve”と”Primed”, マウスとヒト

特定胚及びヒトＥＳ細胞等研究専門委員会（第８７回）平成２６年８月４日資料８７－１－２

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動物性集合胚研究の現状

Table 2; Wu J, Izpisua Belmonte JC. Cell Stem Cell, 2015

Summary of the Current State of Research on Interspecies Chimeras

Species EvolutionaryDistancea

Method Surrogate Outcome Reference

Mus musculus,Myodes glareolus

30.4 Mya morula-morulaaggregation

Mus musculus majority of embryos were abnormal; two normallooking embryos at E9 and E10 with low chimerism; no live embryos beyond E11

Mystkowska, 1975

Mus musculus,Mus caroli

6.5 Mya blastocyst injection of ICMs Mus musculus live-born chimeras developed to adulthood

Rossant and Frels, 1980

Ovis aries, Caprahircus

9.9 Mya aggregation of four-cell or eight-cell embryos; blastocyst injection of ICMs

Ovis aries or Capra hircus

live-born chimeras developed to adulthood

Fehilly et al., 1984

Bos Taurus,Bos indicus

0.5 Mya aggregation of morulae,compact morulae or early blastocyst demi-embryos

Bos Taurus orBos indicus

live-born chimeras developed to adulthood

Williams et al., 1990

Mus musculus,Rattus

17.9 Mya morula-morula aggregation; morula-ICM aggregation; blastocysts injection of ICMs

Mus musculus chimeric blastocysts and embryonic chimeras; no viable live-born chimeras

Mulnard, 1973; Stern,1973; Zeilmaker, 1973;Gardner and Johnson,1973; Rossant, 1976

blastocyst injection ofrat PSCs

Mus musculus live-born chimeras developed to adulthood

Kobayashi et al., 2010; Isotani et al., 2011

blastocyst injection of mouse PSCs

Rattus live-born chimeras developed to adulthood

Kobayashi et al., 2010

Mus musculus,Apodemus sylvaticus

11.4 Mya blastocyst injection of apodemus ESCs

Mus musculus live-born chimerasdeveloped to adulthood

Xiang et al., 2008

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動物性集合胚研究の現状

Table 2; Wu J, Izpisua Belmonte JC. Cell Stem Cell, 2015

背景：キメラ形成能はiPS細胞に代表される多能性幹細胞の検証方法

Species EvolutionaryDistancea

Method Surrogate Outcome Reference

Mus musculus,Homo sapiens

90.1 Mya blastocyst injection of hESCs

Mus musculus developmentalretardation; poor and lowefficient contribution tonormal embryos

James et al., 2006

morula injection of naive hPSCs

Mus musculus interspecies chimeric embryos at E8.5–E10.5 (Gafni et al.); no chimeric contribution in recovered E10.5 embryos (Theunissen et al.)

Gafni et al., 2013; Theunissen et al.,2014

epiblast grafting of human rsESCs

Mus musculus chimeric contribution after grafting to posterior part of E7.5 mouse epiblast followed by 36 hr in vitro embryo culture

Wu et al., 2015

Mus musculus,Macaca mulatta

90.1 Mya eight-cell or blastocyst injection of rhesus naïve iPSCs

Mus musculus interspecies chimeric embryos at E10.5 and E16

Fang et al., 2014

in vivo: Blst-hESCs inj.→E5., in vitro: Blst-hESCs inj.→E6.

in vivo: Mor-hiPSCs inj.→E8.5-E10.5

in vivo: 8c/Mor/Blst-hESCs inj.→NO chimeras@E10.5

Summary of the Current State of Research on Interspecies Chimeras

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Theunissen et al., 2016, Cell Stem Cell 19, 1-14

動物性集合胚研究の現状１ヒト幹細胞の動物胚への寄与率は極めて低い

Figure 7; Theunissen TW, et al. Cell Stem Cell, 2016

ヒト細胞の種類 ナイーブ型ヒトES細胞

動物胚の種類 マウス

動物性集合胚の移植先 マウス

移植期間 9.5～12.5日

分化制御 なし

胚盤胞補完法 なし成功例：胎生9.5日の動物性集合胚。赤い点１つがヒト細胞１個

ナイーブ型ヒトES細胞をマウス胚盤胞に移植した動物性集合胚をマウス胎内に移植し、胎生9.5～12.5日でヒト細胞が含まれているかを解析。

2951個のマウス胚にヒトiPS細胞を注入した結果、ヒト細胞が残っていた胚の数は7個。

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動物性集合胚研究の現状２Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem CellsJun Wu, Aida Platero-Luengo, Masahiro Sakurai, Atsushi Sugawara, Maria Antonia Gil, Takayoshi Yamauchi, Keiichiro

Suzuki, Yanina Soledad Bogliotti, Cristina Cuello, Mariana Morales Valencia, Daiji Okumura, Jingping Luo, Marcela

Vilariño, Inmaculada Parrilla, Delia Alba Soto, Cristina A. Martinez, Tomoaki Hishida, Sonia Sánchez-Bautista, M. Llanos

Martinez-Martinez, Huili Wang, Alicia Nohalez, Emi Aizawa, Paloma Martinez-Redondo, Alejandro Ocampo, Pradeep

Reddy, Jordi Roca, Elizabeth A. Maga, Concepcion Rodriguez Esteban, W. Travis Berggren, Estrella Nuñez Delicado,

Jeronimo Lajara, Isabel Guillen, Pedro Guillen, Josep M. Campistol, Emilio A. Martinez, Pablo Juan Ross, Juan Carlos

Izpisua Belmonte

Cell Volume 168, Issue 3, Pages 473-486.e15 (January 2017)

▼Highlights

•Naive rat PSCs robustly contribute to live rat-mouse chimeras

•A versatile CRISPR-Cas9 mediated interspecies blastocyst complementation system

•Naive rodent PSCs show no chimeric contribution to post-implantation pig embryos

•Chimerism is observed with some human iPSCs in post-implantation pig embryos

論文の概要図

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Generation and interspecies ICM incorporation of different types of hiPSCs

Figure 4; Wu J, et al. Cell, 2017

ナイーブや中間型のヒトiPS細胞の概略図

ナイーブや中間型のヒトiPS細胞の形態

赤い点１つ1つがiPS細胞1個

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Generation and interspecies ICM incorporation of different types of hiPSCs

ブタまたはウシの胚盤胞に、ナイーブや中間型のヒトiPS細胞を注入し分析する実験の概略図

単為発生

体外受精

Figure 4C; Wu J, et al. Cell, 2017

BL：胚盤胞ICM：内部細胞塊、胚盤胞のうち胎仔になる部分

ヒト iPS細胞 を 注 入し た 胚 盤胞を2日間シ ャ ー レで 培 養 し1-5を解析

2日間シャーレで培養した結果

Figure S3; Wu J, et al. Cell, 2017

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ヒト-ブタキメラ胚の作製と移植評価

Figure 5; Wu J, et al. Cell, 2017

ヒト細胞の種類 ナイーブ型、中間型iPS細胞

動物胚の種類 ブタ

動物性集合胚の移植先 ブタ

移植期間 21-28日

分化制御 なし

胚盤胞補完法 なし

ナイーブや中間型のヒトiPS細胞のブタ胚盤胞注入と、移植後ブタ胚の分析実験手順の概略図

Figure S4; Wu J, et al. Cell, 2017

胚に細胞注入 母ブタから取り出した胎仔

正常な胎仔 成長が遅くなった胎仔

実験結果

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ヒト-ブタキメラ胚の作製と移植評価

Figure 5; Wu J, et al. Cell, 2017

妊娠21-28日の間に回収されたブタ胚の解析概要：

実験結果

2C, 2-cell embryo; ZG, zygote; MO, morula; BL, blastocyst; PT, parthenote

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Figure 6; Wu J, et al. Cell, 2017

ブタ胚に対するヒトiPS細胞（ GFP標識）のキメラ寄与実験結果

正常サイズの28日目のブタ胚に一部iPS細胞由来の細胞を認める

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Figure 6; Wu J, et al. Cell, 2017

ブタ胚に対するヒトiPS細胞（ GFP標識）のキメラ寄与実験結果

B：28日目のブタ胚におけるiPS細胞のキメラ寄与SMA（中胚葉）TUJ1（外胚葉）、CK8（内胚葉）、HuNu（ヒト細胞）を赤く染色。GFP（緑）陽性ヒトiPS細胞が赤く染まると3段目で黄色く見え、同じ細胞であることがわかる。

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動物性集合胚研究の現状３

ヒト細胞の種類 ヒトEPS細胞

動物胚の種類 マウス

動物性集合胚の移植先 マウス

移植期間 10.5日

分化制御 なし

胚盤胞補完法 なし

ヒトEPS細胞：Extended Pluripotent Stem cells from blastocysts=ES細胞

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Figure 5, 6; Yang Y, et al. Cell, 2017

Fig.5：ヒトEPSを8細胞胚へ移植し、48-60時間後回収

Fig.6：ヒトEPSをマウス初期胚（E2.5/E3.5）へ注入しマウス子宮内へ移植．E10.5に回収

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動物性集合胚研究の現状15

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第97回特定胚等研究専門委員会

資料97－2

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ブタ ヒト

画像は「ブタ人間」でGoogle検索したもの

クローン技術規制法で胎内移植を禁止特定胚指針で作成を禁止

ヒトと動物との境界（外見）

「一般国民が「『ヒト及び動物』の要素が渾然一体となって交じり合うイメージの個体」との懸念を抱く可能性があるものとは具体的にどのようなものか。また、それが生じる蓋然性について整理すべき。」

総合科学技術会議 第９回 生命倫理専門調査会（平成13年11月6日）資料２－２ 特定胚の取扱いに関する指針（案）（見え消し版）（PDF）

動物性集合胚 ヒト性集合胚 ヒト動物交雑胚

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動物性集合胚からヒトと動物の境界があいまいな個体が生まれることはないのか？

➡動物性集合胚からヒト－動物のそれぞれを合わせ持つ表現型の個体は生みだせない。

実際、胚盤胞補完法による膵臓作成ではラット-マウスで最大キメラ率20%。基本的にホスト胚及び母体の体格になる。さらに、キメラ率は種の近さに依存するため、ヒト-ブタではそれ以下となる。

『ヒト及び動物』の要素が交じり合うイメージの個体が生じる蓋然性について

Wu J, et al. Review in Nature, 2016

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Figure 3| Potential application of interspecies chimaeras with human stem cells. Organ generation via interspecies blastocyst complementation or interspecies targeted organ complementation could help to solve the severe shortage of organ donors worldwide. Human–animal chimaeras will also help researchers to understand the aetiology, onset and progression of human diseases better. Additionally, they could be useful for testing the efficacy and safety of a candidate drug in vivo.

ヒトに関するクローン技術等の規制に関する法律（動物性集合胚定義部分）第二条二十 動物性集合胚 次のいずれかに掲げる胚（当該胚が一回以上分割されることにより順次生ずるそれぞれの胚を含む ）をいう。イ 二以上の動物性融合胚が集合して一体となった胚（当該胚と体細胞又は胚性細胞とが集合して一体となった胚を含む ） 。ロ 一以上の動物性融合胚と一以上の動物胚又は体細胞若しくは胚性細胞とが集合 して一体なった胚ハ 一以上の動物胚とヒトの体細胞又はヒト受精胚、ヒト胚分割胚、ヒト胚核移植 胚、人クローン胚、ヒト集合胚、ヒト動物交雑胚、ヒト性融合胚、ヒト性集合胚 若しくは動物性融合胚の胚性細胞とが集合して一体となった胚（当該胚と動物の 体細胞又は動物胚の胚性細胞とが集合して一体となった胚を含む ）ニ イからハまでに掲げる胚の胚性細胞であって核を有するものがヒト除核卵又は動物除核卵と融合することにより生ずる胚

• ハの水色ハイライト部分が一般的なヒト－動物キメラ胚。

• ニ（オレンジハイライト）は、動物性集合胚の細胞の核を動物除核

卵に移植する場合が含まれ、当該胚はヒト性融合胚に相当する。

→ ハとニの動物性集合胚の取扱いは分けて考えるべき。

クローン法の動物性集合胚の定義についての課題

特定胚及びヒトＥＳ細胞等研究専門委員会（第８７回）平成２６年８月４日資料８７－１－２

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