oligonukleotidok szintézise
DESCRIPTION
Oligonukleotidok szintézise. Dezoxinukleinsav szintézis. Elv:. ( ). 1. Kondenzáció (módszer) 5-OH + H (3) 2. Vízmentes közeg 3. Védőcsoportok. ( ). Módszerek. 1. KarbodiimidTood (Nobel díj 1968) (1955)Khorana (Nobel díj 1975) Kapcsoló szer: DCC/Piridin Védőcsoportok:. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/1.jpg)
Oligonukleotidok szintézise
![Page 2: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/2.jpg)
Dezoxinukleinsav szintézis
Elv:N
OOH
O
PO OH
OH
NO
OH
O
PO OH
OH
( )
( )
1. Kondenzáció (módszer)
5-OH + H (3)
2. Vízmentes közeg
3. Védőcsoportok
Módszerek
1. Karbodiimid Tood (Nobel díj 1968)
(1955) Khorana (Nobel díj 1975)
Kapcsoló szer: DCC/Piridin
Védőcsoportok:
N
N
N
N
NH
OO
OH
C
C
O
CH3
N
N
NH
OO
O
O
OH
OH
O
P
C
CH3
O
C
O
CH3
DCCTritil(Tr)
Acetil (Ac)
Acetil (Ac)6
4
![Page 3: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/3.jpg)
Védőcsoportokok eltávolítása
AO
OH
O CO
O
OH
O
P
OH
AO
Tr
O CO
O
OH
O
P
OH
OH TO
O
OH
O
P
OAc
AO
Tr
O CO
O
OH
O
P
OAc
Ac
Ac
1. Lúg
2. Sav
(80% AcOH)
Lúg
+
Láncnövekedés
Megjegyzések:1. Oldatban2. Ribonukleotid sor:
3.
CO védelem (Bz)
AO
MMTr
O
OH
OHO P
OBzCMeO védelem (MMTr)
mono
Bz2
![Page 4: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/4.jpg)
2. Foszfit módszer Beaucage, Caruthers; Matteucci, Caruthers
(szilárd hordozó)
2.1 Szilárd hordozó - szilika- üveggyöngy- műanyag- cellulóz papir
szilika Si OH Si O (CH2)3 NH2szilika
1. borostyánkősavanhidrid
2. védett nukleotid
szilika Si O (CH2)3 NH C (CH2)2 C
O O
O
AO
DMTrBz2
savérzékeny
bázis érzékeny
Si O (CH2)3 NH C (CH2)2 C
O O
O
AO
OH
szilika
BzH +
+ DMTr +
= 498 nm
C+
OCH3
OCH3
DMTr +
![Page 5: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/5.jpg)
2.2 Védőcsoportok
benzoil
CO
N-6-benzoil adenin[ABz]
N-4-benzoli citozin [CBz]
N-2-isobutil guanin [GIBu]
C
O
C
OCH3
OCH3
4,4’-dimetoxitritil
a) CH3-
b) -CN-CH2-CH2-
(-cianoetil)
NP
N,N diizopropil
2.3 Aktiválás
AO
O
O
DMTr
PNH3CO
N
N
N
N
NH2
OOH
O
OH OHP
N
N
NN
AO
O
O
DMTr
PH3CO
N
N
NN
H
Tetrazol
Bz Bz
Diizopropilfoszforamidát
![Page 6: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/6.jpg)
2.4 Kapcsolás
N
N
NN
AO
O
O
DMTr
PH3CO
Bz
GO
OH
O
Szilika
IBu
AO
O
O
DMTr
PH3CO O G
O
OSzilika
IBu
Bz
+ tetrazol
2.5 Oxidáció: „foszforossav foszforsav”
AO
O
O
DMTr
PH3CO O G
O
OSzilika
IBu
Bz AO
O
O
DMTr
P
OCH3
OG
O
O
O
Szilika
IBu
Bz
3
2
1
I2, H2O
kollidin
2.6 Hasítás
1. CH3 eltávolítása (tiofenol)
2. Oligonukleotid hasítása a hordozóról (NH3)
3. Nukleozid bázis védőcsoport (Bz, IBu) eltávolítása (NH4OH + hő)
2.7 Tisztítás HPLCElektroforézis
![Page 7: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/7.jpg)
![Page 8: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/8.jpg)
DNS/oligonukleotid chip (csip)
![Page 9: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/10.jpg)
Expression levels of 50 genes most highly correlated with the acute lymphoblastic leukemia
(ALL) and acute myeloid leukemia (AML).
Expressed in ALL
Expressed in AML
Expression levels greater than the mean: red, below the mean: blue.
TR Golub et al Science 286: 531 (1999)
![Page 11: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/11.jpg)
Koenzimek
![Page 12: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/12.jpg)
KOENZIMEK
Enzim = apoenzim (fehérje) + koenzim (nem-fehérje)
Szubsztrátspecifitás Reakciótípus
Nukleotid Fémion (példa) Egyéb
Fe (citokróm oxidáz)
NAD Cu (aszkorbinsav oxidáz) B1
FADZn (alkohol dehidrogenáz)
B6
ATPMn (hisztidin ammónia-liáz)
B12
koenzimA Co (glutamát mutáz) folsav
Ni (ureáz) pantoténsav
Mo (xantin oxidáz) biotin
V (nitrát reduktáz)
Se (glutation peroxidáz)
Típusai
![Page 13: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/13.jpg)
Nukleotid koenzimek
1. Adenozin mono-, di- és trifoszfát
felfedezés: Lohmann, Fiske (1929)
OO
OHOH
P
O
O-
O- N
N
N
N
NH2
OO
OHOH
P
O
O-
P
O
O
O-
OH
O-O
O
PN
N
N
N
NH2
OO
OHOH
P
O
O-
P
O
O
O-
OHN
N
N
N
NH2
P
O
OH
O-
O-+
+ H2O
adenozin-monofoszfát (AMP)
ATP ADP foszforsav
H° = -31 kJ/mol
-N-glikozid
D-ribóz
észterkötés ciklusos AMP
![Page 14: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/14.jpg)
2. NAD/NADH: oxidáció
N
O
NH2
N
N
NH
N
NH2
nikotinamid
adenin
nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+)
5’
5’
D-ribóz
Példa:
CH3-CH2-OH + ADH enzim
CH3-COH +
NAD+ NADH
ADH = alkohol dehidrogenáz
acetaldehid
Mechanizmus
N+
O
NH2
H
H
H H
R
N
O
NH2
H
H
H H
R
H
+2e- + H+
NAD+ NADH
![Page 15: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/15.jpg)
3. FAD/FADH2: oxidáció
/enzimkötődés/
Flavin-adenin-dinukleotid (FAD)
![Page 16: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/16.jpg)
4. Koenzim-A (CoA)felfedezés: Lipmann, 1946
adenozin-3’,5’-difoszfát
2,4-dihidroxi-3,3-dimetil-vajsav
-alanin ciszteamin
pantoténsav (vitamin)
5’
3’
észter kötés
észter kötés
savamid kötés
savamid kötés
- NH –(CH2)2 - SH - NH –(CH2)2 - S – CO – CH3
S-acetil koenzim-A (Ac-CoA)
![Page 17: Oligonukleotidok szintézise](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062217/56814a93550346895db7a0de/html5/thumbnails/17.jpg)
5. Koenzim-Q (ubikinon, CoQ)
Koenzim-Q,ubikinon
szemikinon
ubikinol
Koenzim Q4, n = 4Koenzim Q9, n = 9Koenzim Q10, n = 10