optimizavimas, analizĖ ir metabolominiŲ pokyČiŲ · raktiniai žodžiai: metabolomika, s....

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

ELIGIJUS KUPRIŪNAS

NAUJŲ IMIDAZOLIN-4-ONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, SĄLYGŲ

OPTIMIZAVIMAS, ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ

TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

prof. dr. Hiliaras Rodovičius

KAUNAS,

2016

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis _______

2016 - ___ - ___

NAUJŲ IMIDAZOLIN-4-ONO JUNGINIŲ SINTEZĖ, SĄLYGŲ

OPTIMIZAVIMAS, ANALIZĖ IR METABOLOMINIŲ POKYČIŲ

TYRIMAS VEIKIANT S.AUREUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

prof. dr. Hiliaras Rodovičius __________

2016 - ___ - ___

Recenzentas Darbą atliko

Vardas, pavardė _______ magistrantas Eligijus Kupriūnas ________

2016 - ___ - ___ 2016 - ___ - ___

KAUNAS,

2016

3

TURINYS

1. SANTRAUKA .............................................................................................................................. 6

2. SUMMARY .................................................................................................................................. 7

3. SANTRUMPOS ............................................................................................................................ 9

4. SĄVOKOS .................................................................................................................................. 10

5. ĮVADAS...................................................................................................................................... 11

6. LITERATŪROS APŽVALGA ................................................................................................... 13

6.1 Metabolomikos svarba sisteminėje mikrobiologijoje. ......................................................... 13

6.1.1 Metabolominiai metodai ................................................................................................. 14

6.1.2 Metabolinių kelių nustatymas. ........................................................................................ 15

6.2 Mikroorganizmų metabolomo sandara ................................................................................ 16

6.3 Metabolomikos taikymas S. aureus fiziologiniuose tyrimuose. .......................................... 18

6.3.1 Inovacijos mikrobiologinėje metabolomikoje ................................................................. 19

6.3.2 Staphylococcus aureus metabolomo tyrimai ................................................................... 19

6.4 S. aureus metabolomas ir metabolitinis atsakas į pasikeitusias aplinkos sąlygas. .............. 20

6.4.1 Genetinis atsakas ............................................................................................................. 21

6.4.2 Egzogeninių medžiagų atsakas ....................................................................................... 22

6.5 Potencialūs biologiniai S. aureus taikiniai. .......................................................................... 23

7. TYRIMO METODIKA IR METODAI ...................................................................................... 27

7.1 Junginių sintezė ................................................................................................................... 27

7.1.1 Naudotos medžiagos ir tirpikliai ..................................................................................... 27

7.1.2 Junginių sintezės metodikos ............................................................................................ 27

7.1.3 Reakcijos sąlygų optimizavimas ..................................................................................... 33

7.2 Junginių analizės metodai .................................................................................................... 33

7.2.1 FT–IR spektroskopija ...................................................................................................... 34

7.2.2 Plonasluoksnė chromatografija ....................................................................................... 34

4

7.2.3 UV spektrofotometrija .................................................................................................... 35

7.2.4 SC – tandeminės MS/MS spektrometrija ........................................................................ 35

7.2.5 1H BMR spektroskopija .................................................................................................. 36

7.2.6 Lydymosi temperatūros nustatymas ................................................................................ 36

7.3 Mikrobiologinio mėginio paruošimas.................................................................................. 37

7.3.1 Naudojamos medžiagos .................................................................................................. 37

7.3.2 Ląstelių kultivavimas, mėginių ėmimas ir intraceliuliarinių metabolitų ekstrakcija ...... 37

7.4 Metabolominio tyrimo vertinimas SC – tandeminės MS/MS metodu ................................ 38

7.4.1 Metabolominio pokyčio įvertinimas ............................................................................... 38

7.4.2 Šiluminio žemėlapio ir metabolinių kelių sudarymas ..................................................... 40

7.4.3 Statistinė analizė .............................................................................................................. 41

7.5 Molekulinis modeliavimas ir in silico atranka. .................................................................... 41

7.5.1 Baltymo struktūros parinkimas ir paruošimas darbui. .................................................... 41

7.5.2 Ligandų modeliavimas ir paruošimas darbui. ................................................................. 41

7.5.3 Prognozuojamo aktyvumo nustatymas. .......................................................................... 41

8. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ......................................................................................... 43

8.1 Cheminė junginių sintezė .................................................................................................... 43

8.2 Junginių analizė ................................................................................................................... 43

8.2.1 FT – IR spektroskopija .................................................................................................... 43

8.2.2 SC – MS analizė .............................................................................................................. 44

8.2.3 1H BMR spektroskopija .................................................................................................. 46

8.3 Metabolinio tyrimo analizė .................................................................................................. 47

8.4 In silico analizė ir rezultatai ................................................................................................. 51

9. IŠVADOS ................................................................................................................................... 56

10. REKOMENDACIJOS ............................................................................................................. 57

11. LITERATŪROS SĄRAŠAS ................................................................................................... 58

5

12. PRIEDAI ................................................................................................................................. 68

6

1. SANTRAUKA

Eligijaus Kupriūno magistro baigiamasis darbas „Naujų imidazolin-4-ono junginių sintezė, sąlygų

optimizavimas, analizė ir metabolominių pokyčių tyrimas veikiant S. aureus“. Mokslinio darbo vadovas prof.

dr. Hiliaras Rodovičius. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra

– Kaunas.

Tyrimo tikslas: nustatyti naujų 2,5 – pakeistų imidazolin-4-ono heterociklinių junginių reliatyvų

metabolinį poveikį S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923) padermei.

Tyrimo uždaviniai:

1. Sintezuoti naujus 2,5 – pakeistus imidazolin-4-ono heterociklinius junginius.

2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes.

3. Atlikti sintetintų junginių metabolominių pokyčių tyrimą veikiant S. aureus (ATCC 25923) padermę.

4. Atlikti gautų junginių molekulinį modeliavimą in silico.

Tyrimo metodai:. junginių sintezė atlikta vykdant modifikacijas imidazolin-4-ono žiedo 2-oje ir 5-

oje padėtyse. Sintetintų junginių struktūra įrodyta ultravioletinės (UV) infraraudonosios (IR) spinduliuotės ir

masių spektrometrijos metodais. Grynumas nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos su masių

spektrometrija (ESC-MS) metodu. Lydymosi temperatūra nustatyta Koflerio prietaisu. In silico tyrimai atlikti

panaudojant Schrodinger programinį paketą.

Tyrimo rezultatai: Susintetintų junginių grynumas yra 93-95 %. Ištirtas sintetintų junginių

metabolitinis poveikis į S. aureus (ATCC 25923). Nustatyta, jog 81 % junginių mažina stafiloksantino ir

dehidroskvaleno, tačiau 90,5 % didina izopentenil difosfato ir mevalonato difosfato kiekį lyginant su kontrole.

Atlikus in silico tyrimą nustatytas, potencialus slopinimo mechanizmas. Sintetinti junginiai jungiasi su baltymo

aktyviojo centro Asp, Arg, Lys aminorūgštimis.

Tyrimo išvados: Atlikta 21 junginio sintezė. Visuose junginiuose nustatytas ženklus dehidroskvaleno

ir stafiloksantino kiekio sumažinimas lyginat su kontrole (sumažėja 23,41 ir 21,54 karto atitinkamai).Taip pat

kaip ir tikėtasi rastas izopentenil difosfato ir mevalonato difosfato kiekio padidėjimas lyginant su kontrole.

Atlikus in silico tyrimą stipriausia sąveika tarp baltymo ir junginio buvo EK14 ir EK20.

Tyrimo rekomendacijos: atlikti detalesnius metabolitų pokyčių tyrimus, identifikuojant visų

metabolitų pokyčius ir nustatyti junginių tikslų veikimo mechanizmą.

7

2. SUMMARY

Master thesis of Eligijus Kupriūnas „Synthesis, reaction optimization, analysis and change of

metabolomics profile analysis against S. aureus of new imidazolin-4-one derivatives “. Tutor: Hiliaras

Rodovičius, professor, Ph.D. Lithuanian university of health sciences, faculty of Pharmacy, Department of

Drug chemistry.

Aim of study: to perform synthesis of 2nd and 5th substituted imidazolin-4-one compounds and

identify it metabolomic profile against S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923).

Study objectives:

1. To synthesize selected imidazolin-4-one derivatives.

2. To determine compounds structure and physic-chemical properties.

3. Identify synthesize compounds metabolomic profile against S. aureus.

4. Render compounds in silico screening.

Study methods: synthesis of compounds was done by modifying 2nd and 5th positions of imidazolin-

4-one ring. The identity of compounds was confirmed by means of UV, IR and MS spectral data. Purity analysis

was performed LC-MS Q-TOF method. Melting points were determined by using Kofler bench. In silico

studies was done using Schrodinger software.

Study results: purity of the synthesized compounds is 93-95%. The metabolic change of the

synthesized compounds to S. aureus was analyzed. It was found that 81 % of the compounds reduced the

amount of staphyloxantin and dehydrosqualene compared to the control, but 90.5 % of the compounds

increased the amount of isopentenyl diphosphate and diphosphomevalonate compared to the control. The in

silico study provides a potential mechanism of inhibition. Synthetic compounds interact with the active center

of the protein Asp, Arg, Lys amino acids

Conclusions: Successfully performed the synthesis of 17 compounds. It was found that all compounds

reduced of guanine dehydrosqualene and staphyloxantin was significant (decreased 23.4 ir 21.54 times

respectively) compared to the control. As expected was found significant increased the amount of isopentenyl

diphosphate and diphosphomevalonate compared to the control. After in silico test the strongest interaction

between the protein and the compound was in EK14 and EK20.

Recomendations: do more in depth metabolomic change research, identifying all metabolites changes

and identify compounds exact mechanism of action.

8

PADĖKA

Noriu padėkoti savo magistro darbo vadovui prof. dr. Hiliarui Rodovičiui už idėjas vykdant

magistro darbo eksperimentinę dalį, pagalbą rašant teorinę dalį bei visus organizacinius aspektus.

Dėkoju LSMU FF Vaistų chemijos katedros asistentams Liudui Šlepikui ir Jonui Saliui, kurie

dvejus magistratūros studijų metus padėjo man kryptingai, vykdant magistrinio darbo rengimą.

Dėkoju LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto darbuotojui prof. dr. Alvydui

Povilioniui bei laborantėms už nuoširdžią pagalbą ir mokslinę konsultaciją vykdant mikrobiologinį tyrimą.

Dėkoju LSMU FF Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. dr. Liudui

Ivanauskui ir doktorantui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant magistro tiriamąją dalį.

prof. dr. Hiliaras Rodovičius Liudas Šlepikas prof. dr. Alvydas Povilionis

prof. dr. Liudas Ivanauskas Mindaugas Marksa

9

3. SANTRUMPOS

S. aureus Auksinis stafilokokas (lot. Staphylococcus aureus)

DMSO Dimetilsulfoksidas

UV Ultravioletinė spinduliuotė

Rf Paviršiaus šiurkštumo faktorius

IR Infraraudonoji spinduliuotė

FT–IR Furjė transformacijos infraraudonųjų spinduliuotė

MS Masių spektrometrija

SC–MS Skysčių chromatografija – masių spektrometrija

MRSA Meticilinui rezistentiškas S. aureus

PCA Pagrindinė komponentų analizė (ang., principal component analysis)

CFU Kolonijas sudarančios vienetai

PTFE Politetrafluoretilenas

10

4. SĄVOKOS

Aduktas – jonizuotas jono ir kito atomo jonizuotas kompleksas

Analitė – mėginyje nustatomas komponentas.

Epigenetika – biochemijos mokslo šaka tirianti įvairių veiksnių įtaką kintančiai genų ekspresijai.

Fragmentacija (angl. fragmentation) – medžiagos ar molekulės dalijimąsi į mažus subvienetus.

Jonizacija – fizinis procesas, kurio metu atomas arba molekulė paverčiama jonu, keičiant santykį tarp protonų

ir elektronų skaičių.

m/z dydis – dydis, kuris atspindi santykį tarp masės ir krūvio jonizuotoje formoje.

Sonifikacija – procesas, kurio metu taikant ultragarso energija organinės medžiagos suskaidomos į radikalus.

Supernatantas – skaidrus skystis, kuris gaunamas po centrifugavimo.

Transkirptomika – biochemijos mokslo šaka, tirianti medžiagų apykaitos procesus visų transkripcinių

faktorių pernešimo lygmeniu.

11

5. ĮVADAS

Genomikos, proteomikos, transkriptomikos ir metabolomikos mokslo šakas lingvistiniu požiūriu sieja

galūnė „-omika“, kuri kildinama iš lotyniško žodelio „omne“, pažodiniu vertimu reiškiančio „viskas, visuma,

vientisas“. Šie naujadarai faktiškai vartojami tam, kad pabrėžtų jau egzistuojančių fundamentinių gamtos

mokslų tyrimo mastą. Tai yra, tiriamas ne vienas genas ar baltymas, jo funkcija, bet bandoma suprasti visų

genų ar baltymų ryšį, jų vientisą funkciją visai organizmo medžiagų apykaitai. Tyrėjai besispecializuojantys

pastarųjų mokslo šakų studijose susiduria su labai dideliais kiekiais informacijos, todėl yra taikomi

bioinformatiniai įrankiai ir programiniai paketai. Duomenų analizė ir interpretacija leidžia geriau suprasti

ląstelių universalumą ir funkcionalumą. Taip pat gautas žinias pritaikyti biotechnologijoje ar naujų vaistų

paieškos procesuose [1–3].

Sistematikos (sisteminės biologijos) vienas iš uždavinių yra geriau suprasti visus biologinius

mechanizmus, pasireiškiančius skirtinguose hierarchiniuose lygmenyse. Tai reiškia, jog organizmas gali būti

nagrinėjamas pavienės ląstelės lygmeniu: tiriama ne tik proteomo ar metabolomo kokybinė ir kiekybinė

sudėtis, bet ir jų dinamika bei lokalizacija subceliuliariniuose kompartamentuose. Dabar dienai yra vykdomi

įvairūs genominiai, proteominiai, metabolominiai tyrimai, o iš gautos informacijos yra sprendžiamos

fundamentinės problemos. Viena tokių yra ryšio nustatymas tarp ląstelės sudėties ir fenotipo bei jo adaptacijos

prie besikeičiančių aplinkos sąlygų. Gerai yra žinoma, jog metabolizmas reguliuojamas per genų ekspresiją bei

per post-transkripcines ir post-transliacines modifikacijas. Vykstantys tokie pokyčiai individualiose ląstelėse

yra išskirtiniai dėl genetinių ir fiziologinių skirtumų. Be to, taip yra apsprendžiamas fenotipas. Nuolatos

besikeičiantis mikroorganizmų genotipas ir fenotipas sukelia rimtus iššūkius prieš pavojingas hospitalines

infekcijas. Viena tokių rūšių yra S. aureus, kurios padermės yra tapusios atsparios meticilinui, vankomicinui ir

chinolonams [4].

Greiti S. aureus adaptaciniai procesai į stresines aplinkos sąlygas, pavyzdžiui, gydymą antibiotikais

ar pakitusias mitybines aplinkos sąlygas, skatina mokslininkų susidomėjimą šia rūšimi. Naujų prieš-bakterinių

biologinių taikinių paieška gali būti vykdoma žinant biocheminį ryšį tarp virulentiškumo faktorių ir

metabolomo sudėties bei lokalizacijos. Analitiniai metabolomikos tyrimai dažniausiai yra atliekami masių

spektrometrijos metodu kartu naudojant įvairias išskirstymo technikas: dujų ar skysčių chromatografiją,

elektroforezę [2].

Darbo tikslas – nustatyti naujų 2,5 – pakeistų imidazolin-4-ono heterociklinių junginių reliatyvų

metabolinį poveikį S. aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC 25923) padermei.

12

Darbo uždaviniai:

1. Sintezuoti naujus 2,5 – pakeistus imidazolin-4-ono heterociklinius junginius.

2. Nustatyti sintezuotų junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes.

3. Atlikti sintetintų junginių metabolominių pokyčių tyrimą veikiant S. aureus (ATCC 25923)

padermę.

4. Atlikti gautų junginių molekulinį modeliavimą in silico.

Raktiniai žodžiai: metabolomika, S. aureus, SC-MS/MS QTOF, stafiloksantinas

13

6. LITERATŪROS APŽVALGA

6.1 Metabolomikos svarba sisteminėje mikrobiologijoje.

Pagrindinis sisteminės biologijos tikslas yra sugebėti paaiškinti fiziologinius procesus, kurie priklauso

bei yra suderinti su ląstelės metabolitų apykaita. Tyrimai, nagrinėjantys bakterijų metabolizmą, yra perspektyvi

sritis, leidžianti plačiau ištirti ląstelės medžiagų apykaitą, jos ryšius tarp individualių organizmo rūšių.

Reliatyviai mikroorganizmai yra paprastos sandaros, tačiau jų autentiškas fiziologinis bruožas – subalansuotas

gebėjimas išgyventi, pakitusiomis aplinkos sąlygomis. Pastarąją savybę lemia jų metabolinis potencialas.

Atsižvelgiant į šias savybes, mikrobiologiniai modeliai yra lengvai kultivuojami bei genetiškai modifikuojami.

Be to, fermentų katalizuojami metaboliniai keliai, jų ryšiai yra pakankamai lengvai nustatomi, sudaromi ir

sistematiškai palyginami [5].

Nuoseklūs pasiekimai bakterijų metabolomo tyrimuose tapo sparčiausiai besivystančia sisteminės

biologijos šaka. Vis tik atsižvelgiant į visumą šioje srityje neišvengta ir problemų. Pagrindinė jų – riboti srauto

balanso analizės (ang. flux balance analysis – FBA) skaičiavimo metodai. Proveržis pasiektas tik nustačius,

jog E. coli (kita vertus, ne dauguma kitų mikroorganizmų) dažniausiai augimo fazėje geba maksimaliai

padidinti ir sunaudoti įvairius ląstelinius anglies šaltinius. Tai leido Jeremy S. Edwards padaryti išvadą, jog

metabolitų srautas yra optimaliai efektyvus [6]. Po šio tyrimo buvo iškelta daugiau klausimų: kokiais

mechanizmais metabolitų srautas yra valdomas? Kaip filogenetinės sistematikos požiūriu skiriasi šie

mechanizmai tarp genetiškai artimų padermių ar rūšių? Kaip yra koordinuojamas metabolitų srautas, jog

ląstelėje tinkamai būtų paskirstyti metaboliniai resursai [5]?

Pastarųjų problemų sprendimui buvo pradėti plėtoti ir vystyti metabolominiai tyrimo metodai, kuriais

yra išsamiai ir visapusiškai nustatomas (-i) metabolitas (-ai). Kartu su metabolominiais tyrimais yra atliekami

ir genominiai, kuriais komplementariai padedama nustatyti metabolitus ir reakcijas, kuriose jie dalyvauja. Šie

duomenys yra pritaikomi sudarinėjant metabolinių kelių žemėlapius. Kita vertus, metabolitų koncentracijos

nustatymas ląstelėje yra atliekamas pagal surinktus metabolominius, proteominius ir transkriptominius

duomenis [5].

Fluksomikos pritaikymo tikslas yra išmatuoti ląstelinį fermentų katalizuojamų reakcijų greitį.

Nustatytos metabolitų koncentracijos ir gauti srauto analizės duomenys, gali būti perdengti ir sulyginti su

14

metaboliniais keliais. Tai pritaikius galima sukurti naujus kiekybinius integracinius mikrobiologinius

modelius, kuriais galima palyginti tarprūšinius metabolinius skirtumus [5].

6.1.1 Metabolominiai metodai

Keseler vykdyti tyrimai su protrofiniais mikrobais (konkrečiau E. coli K12, E. coli O157:H7 ir E. coli

CFT073) atskleidė, kad didžioji dalis metabolomo yra sudaryta iš maždaug 700 mažos molekulinės masės

junginių, kurie dalyvauja centriniame ląstelėse metabolizme ir pagrindiniuose biocheminiuose apykaitos

keliuose [5,7]. Vis tik minėtas skaičius neatspindi individualios rūšies realaus metabolomo sandaros, kuris yra

gerokai didesnis. Be pagrindinių metabolitų yra nustatomi antriniai metabolitai ir įvairūs lipidai, būtini

normaliai ląstelės gyvybiniai veiklai. Pavyzdžiui, prokariotų, grybų ir eukariotų ląstelėse yra sintetinami ir

kaupiami panašūs steroliai, kurie reikalingi ląstelės membranos veiklai. Bakterijų ląstelių plazmolemoje yra

aptinkami pentacikliai triterpenoidai – hopanoidai, o atitinkamai grybų ir eukariotų plazminėje membranoje

nustatomi – keturcikliai steroidai – ergosteroliai ir cholesteroliai [5,8,9]. Kitas svarbus aspektas, lemiantis

nedidelį identifikuojamą metabolitų skaičių – tai analitinių instrumentų jautrumo stoka [5]. Dalis metabolitų

ląstelėje egzistuoja, kaip tarpinės medžiagos, būtinos pagrindinių ląstelės metabolitų biosintezei. Remiantis

moksliniais duomenimis, galima teigti, kad mažos molekulinės masės tarpinių junginių koncentracija yra labai

žema bei gali skirtis tarpusavyje nuo pagrindinių metabolitų iki 10 000 kartų [10].

Metabolominių metodų vystymąsi riboja tik naudojamų instrumentų jautrumas ir metabolinio mėginio

metodikų ribotumas, todėl vis dažniau yra pritaikoma kietafazė ekstrakcija (KFE). Šiai dienai metabolomikos

laboratorijose SC–MS metodais vyksta rutininiai pagrindinių metabolitų nustatymo darbai, įskaitant

aminorūgštis, nukleotidus ir kofaktorius [5,11–15]. Taip pat yra atliekami papildomo tyrimai su dujų

chromatografija–tandemine masių spektrometrija (DC–MS) ir branduolių magnetiniu rezonansu, kuriais yra

identifikuojamos mažai besijonizuojančios molekulės. Kita vertus, šių molekulių nustatymas SC–MS metodais

yra sudėtingas [16,17]. Be to, naudingos metabolominės informacijos gaunama ir kapiliarinės elektroforezės –

masių spektrometrijos (KE–MS) tyrimų metu. Pavyzdžiui, 2007 metais tyrėjas iš Japonijos Keio Universiteto

– Y. Ohashi nustatė KE–MS metodu, kokį metabolominį poveikį sukelia sumažintos histidino atsargos E. coli

ląstelėms. Buvo pastebėta, jog vos sutrikdoma histidino biosintezė, tarpiniai metabolitai pilnai susikaupia

greičiau nei per valandą [18].

15

Taigi, akivaizdu, jog metabolominiai tyrimai ir individualaus metabolomo sudėties nustatymas yra

daugialypis procesas. Pagrindiniai eigos etapai yra: ląstelių kultivavimas, metabolizmo slopinimas,

metabolomo ekstrakcija, mėginio koncentravimas, metabolitų detekcija (dažniausiai naudojama SC–MS,

tačiau galimi ir kiti metodai) ir duomenų analizė. Apibendrinant, galima suprasti, jog metabolitų koncentracijos

pokyčiai ląstelėje vyksta per labai trumpą laiką. Pavyzdžiui, mikroorganizmuose medžiagų apykaita gali vykti

sekundžių laikotarpyje, todėl norint išvengti tyrimo artefaktų , būtina imtis visų specialų atsargumo priemonių

nuo ląstelių kultivavimo iki metabolizmo slopinimo etapo [5,19].

6.1.2 Metabolinių kelių nustatymas.

Pastarųjų dešimtmečių genetikų sekvenavimo darbai leido nustatyti įvairius mikrobinius genomus, jų

sandarą, tačiau iki pat šios dienos yra nesuprasta dauguma genų funkcijų. Kita problema, kad nemažai

katalizinių biotransformacinių reakcijų ląstelėse vyksta dėl filogenetiškai neidentifikuotu baltymų (ang.

unknown gene products). Šie teiginiai leidžia suprasti, kodėl yra sudėtinga kurti ypatingai tikslius prognozinius

in silico genominio masto modelius, kurie paaiškintų ląstelėse vykstančius medžiagų apykaitos procesus. Taigi,

pagrindinis ir ilgalaikis metabolomikos mokslo tikslas yra sugebėti nustatyti egzistuojantį ryšį tarp genų

funkcijų ir metabolomo bei jų filogenetinį pasiskirstymą [20–22].

Metaboliniai pokyčiai laboratorijose lengviausiai stebimi su genetiškai modifikuotomis rūšimis (ang.

knockout strains), kurių genų ekspresija yra eksperimentiškai apribota, nes proteominės ir metabolominės

analizės metodais galima identifikuoti substrato ir metabolito pokyčius [23]. Pavyzdžiui, tyrėjų grupė iš

Princtono Universiteto atliko palyginamuosius metabolominius tyrimus su S. cerevisiae, panaudodami

„Orbitrap“ MS. Šios studijos metu buvo išvesta mielių padermė, kuriose – išjungtas (ang. knockout) YKL215C

genas. Tirtuose MS spektruose buvo pastebėtas jono, kurio m/z reikšmė lygi 128.0351, koncentracijos

padidėjimas. Interpretuojant duomenis buvo prieita nuomonės, jog identifikuotas junginys yra oksoprolinas,

kas leido daryti išvadą, jog geno YKL215C delecija sukėlė oksoprolinazės deficitą [24].

Taip pat metabolitų stebėjimo tyrimai leidžia geriau suprasti jau žinomų metabolinių kelių funkcinį

aktyvumą. Pavyzdžiui, bioenergetiškai įdomiame organizme – acetobutilinė klostridija (lot. Clostridium

acetobutylicum, C. acetobutylicum) įrodytas citrato (TCA) buvimas pakeitė požiūrį apie šią padermę, nes

genome nėra rastas trikarboksirūgšties genas, kuris koduotų atitinkamą fermentą. Tai leidžia daryti išvadą, jog

C. acetobutylicum ląstelėse yra funkcionalus TCA ciklas [5]. 2010 metais D. N. Noguez pateikė į dvi šakas

16

išsiskiriančio TCA ciklo įrodymo duomenų, kurie buvo gauti radioizotopinės analizės metu [25]. Panašūs

tyrimai padeda geriau suprasti metabolinius kelius tiek genomikos , tiek fluksomikos požiūriu. Publikuotas K.

L. Olszewski mokslinės grupės tyrimas žurnale „Nature“ aptaria maliarijos sukėlėjo pjautuvinės plazmodijos

(lot. Plasmodium falciparum, P. falciparum) TCA ciklo išskirtinumą, nes jis nuo α–ketoglutarato išsiskiria

dvejomis kryptimis (V). Tyrėjai naudodami glutaminą, kuris turėjo 13C radioizotopiškai žymėtą anglį,

pastebėjo, kad iš α–ketoglutarato susidaro sukcinatas ir izocitratas, kurie atitinkamai kinta iki malato ir acetil–

kofermento A (acetil–CoA) [26]. Šie rezultatai leidžia daryti išvadą, jog TCA ciklas oksireduktacijos požiūriu

yra neutralus, nes tolimesnė anglies apykaita vyksta dvejomis kryptimis. Dabar tyrėjai ieško šiame cikle

dalyvaujančio fermento, kuris atskelia TCA cheminius ryšius. Šis hipotetinis baltymas galėtų būti svarbus

biologinis taikinys naujų prieš–maliarinių vaistų paieškoje [5].

Vis dėlto metaboliniuose tyrimuose sudėtingiausias uždavinys yra identifikuoti naujus substratus, jų

veikimo kelius, sąryšius su metabolitais ir validuoti tiek baltymo, tiek mažos molekulės teisingą struktūrą.

Idealiausiai būtų galima tai atlikti tikimybiniu metodu pagal jau žinomus MS/MS duomenis, tačiau tik maža

dalis tyrimų yra statistiškai patikimi [27]. Kita vertus, dažniausiai metabolominių duomenų analizės metu yra

patvirtinamos struktūrinės cheminių junginių tapatybės. Pavyzdžiui, Berklio Universitete vadovaujant K.S.

Kim tokiu principu buvo atliktas naujas katabolinis pirimidino kelio nustatymas E. coli padermėje [28,29].

6.2 Mikroorganizmų metabolomo sandara

Priklausomai nuo organizmo sistematinio diversiškumo, metabolomo kokybinė ir kiekybinė sudėtis

gali stipriai varijuoti. Metabolomikos vystymosi pradžioje, tyrėjai O. Fiehn (2002) ir R. Mungur (2005) atskirai

padėjo didelius pamatus šiai mokslo šakai, nes sugebėjo identifikuoti apytikriai 200 tūkstančių pirminių ir

antrinių metabolitų bei aptikti ląstelėje vykstančius jų pokyčius [30–32]. Kita vertus, lygiagrečiai atlikti J.

Forster (2003) tyrimai su vienu paprasčiausios sandaros eukariotu – alaus mieliagrybiu (lot. Saccharomyces

cerevisiae) atskleidė, jog pastarasis organizmas turi daugiau kaip 600 metabolitų [33]. Iki šios dienos

(2016.05.29) mielių metabolomo duomenų bazėje (prieiga per internetą: http://www.ymdb.ca) yra publikuoti

2027 metabolitai, o įvairių atskyrų tyrimų metu su S. cerevisiae yra identifikuojama tik kelios dešimtis naujų

metabolitų [34–40]. Mokslinė visuomenė dėl publikuotų prieštaringų ir kontraversiškų rezultatų išlaiko vis dar

atvirą klausimą apie mikroorganizmų metabolomo dydį, metabolitų varijavimą tiek chemine sudėtimi, tiek

savo koncentracija ląstelės viduje [30].

http://www.ymdb.ca/

17

Tolimesniu tyrimu metu buvo sukurta daugiau kaip 20 tikimybinių in silico genomo masto modelių,

kuriais prognozuojamas bakterijų metabolizmas. 2009 metais sistemiškai M. Durot išanalizavo publikuotus

pastarųjų studijų tyrimus ir nustatė, jog apytikriai 600 metabolitų yra priskiriama individualiai bakterijų rūšiai

[41]. Vis tik šių tyrimų metu svarbesnis nustatytas faktas yra tas, jog genominiai tyrimai ir gautų duomenų

interpretacija apie metabolominio modelio charakteristikas nesutapo su atliktais skaičiavimais. Pavyzdžiui,

tyrimuose su gram–teigiamomis bakterijomis, šieno lazdelėmis (lot. Bacillus subtilis, B. subtilis), prognozuotas

metabolitų skaičius buvo nuo 988 iki 1138, tačiau pavyko identifikuoti tik 537 mažos molekulinės masės

metaboliniai junginiai [42–44]. Taip pat 2005–2011 metų laikotarpyje buvo atlikti genomo masto S. aureus

metabolinių kelių tikimybiniai skaičiavimai. Duomenų analizės ir interpretacijos laikotarpiu buvo priskirta

daugiau kaip 700 galimų metabolinių reakcijų bei trijų atskirų in silico studijų metu įvertintas numanomas

metabolitų skaičius – 422, 571 ir 712 [45–47]. Be to, 2009 metais trylikos S. aureus padermių palyginamųjų

tyrimų metu D. S. Lee su komanda pasiūlė naują rekonstrukcijos skaičiavimo metodą bei išplėstą metabolomo

sandaros vaizdą, kurį sudaro apie 1250 metabolinių reakcijų bei 1400 metabolitų [48]. Remdamasis šiais

tyrimais, A. Feist atliko tyrimus su pneumoniją sukeliančia Klebsiele (lot. Klebsiella pneumoniae, K.

pneumoniae), nustatydamas 1658 metabolitų. Mokslininkas padarė išvadą, jog metabolomo sudėtimi S. aureus

ir K. pneumoniae galimai yra vieni sudėtingiausių mikroorganizmų [48,49]. Palyginimui, mikoplazmose – M.

pneumonia (lot. Mycoplasma pneumonia) ir M. genitalium (lot. Mycoplasma genitalium), turinčiose labai

mažus genomus, prognozuojamų metabolitų skaičius atitinkamai yra 150 ir 270 [50,51]. Apibendrinant

dauguma tyrimų, galima pastebėti, jog pagrindinė metabolomikos problema yra per maža analitinių duomenų

integracija į prognozuojamus genominius - metabolominius in silico modelius. Dažniausiai lemiantys faktoriai

yra instrumentinės analizės prietaisų jautrumo stoka, atskiriant mažos koncentracijos metabolitus nuo prietaiso

skleidžiamo triukšmo bei metabolominio mėginio paruošimo metu vykstantys cheminiai pokyčiai [52–58].

Teisingas metabolitų įvertinimas struktūriniu ir kiekybiniu bei variaciniu genominiu ir evoliuciniu

požiūriu yra sudėtingas uždavinys, nes tai priklauso nuo daug faktorių: pradedant darbo su bakterinėmis ląstelių

kultūromis aplinkos sąlygų iki laiko momento, kada yra ruošiamas metabolominis mėginys [30]. Dažniausiai

šie veiksniai aiškinami tuo, jog yra epigenetiškai pasireiškiančių medžiagų apykaitos kelių. Įprastomis

sąlygomis šie genai yra ne ekspresuojami, tačiau ląstelė veikia besikeičiančiomis sąlygomis, todėl

metabolominių studijų metu yra nustatomi metabolitų skaičiaus skirtumai tarp apskaičiuotų jų kiekio pagal in

silico modelį ir realiai patvirtinamų instrumentinės analizės metu [34]. Kita vertus, analitinių prietaisų jautrumo

trūkumas, reikiamų standartų naudojimas, detekcijos ribos, būtinos kiekybiniam įvertinimui, apsunkina visų

galimų ląstelės metabolitų pasiskirstymo nustatymą. Individualių metabolitų nustatymas yra atliekamas pagal

18

tikslinės metabolominės analizės (ang. targeted metabolomic analysis) metodikas. Šiai dienai tikslinės

metabolominės analizės duomenų yra dar mažai, kuriuose būtų nustatytos ne reliatyvios, bet absoliučios

metabolitų koncentracijos ląstelėje. Sisteminės metabolomikos požiūriu didžioji dalis tyrimų buvo atlikti 2007

– 2013 metų laikotarpiu. Pavyzdžiui, 2009 metais B.D. Bennett iš Princtono Universiteto nustatė, absoliučias

metabolitų koncentracijas E. coli ląstelėje [10]. Kitą panašų tyrimą po poros metų publikavo M. Liebeke

tirdamas S. aureus metabolitų pasiskirstymą [59]. Apibendrinant šiuos išsamius kiekybinius E. coli ir S. aureus

tyrimų duomenis, akivaizdu, jog tyrėjai mikroorganizmus eksponentinėje augimo fazėje kultivavo gausiai

padidintomis gliukozės kiekio sąlygomis. Abejais atvejais buvo nustatyta, jog pagrindinis metabolitas yra

glutamatas, kurio koncentracija atitinkamai E. coli ir S. aureus lygi 9.6 × 10-2 moll-1 ir 1.6 × 10-1 moll-1 [10,59].

Kita vertus, SC–MS analizės metu mažiausia jonų srauto gausa E. coli ląstelėje buvo aptikta, nustatant

nukleozidų ir kofaktorių koncentracijas. Pavyzdžiui, patvirtintas ląstelinis E. coli adenozino lygis – 1.3 × 10-7

moll-1 [10].

Apibendrinus minėtų tyrimų duomenis, galima pastebėti, jog ląstelėje metabolitų koncentracija labai

stipriai svyruoja. Lyginant pagrindinius ir sunkiau aptinkamus metabolitus, apytikris jų koncentracijų

skirtumas ląstelėje yra penki kartai. Taigi, šie duomenys, leidžia daryti išvadą, jog bakterijų metabolominiuose

tyrimuose yra reikalinga labai jautri ir didelės skiriamosios raiškos analitinė įranga [10,30,34–37,45,59].

6.3 Metabolomikos taikymas S. aureus fiziologiniuose tyrimuose.

S. aureus yra universalus žmogaus patogenas, sukeliantis daug sunkių infekcijų, kaip endokarditas ar

sepsis [30,60]. Bakterijos siekdamos išgyventi, turi įveikti priešiškas aplinkos sąlygas. Pagrindinis

mechanizmas padedantis išlikti šiems gyviams yra gleivinių, odos ar žaizdų kolonizacija. Staphylococci genties

mikroorganizmai naudoja įvairius virulentiškumo faktorius ir reguliacinius mechanizmus, kurie kovoja prieš

organizmo apsauginius barjerus ir imuninę sistemą. Šie veiksniai leidžia patogenui adaptuotis prie naujos

kolonizuotos aplinkos [61].

Pagrindinis aspektas, leidžiantis ląstelėmis prisitaikyti prie minėtų sąlygų, yra jos fiziologinė būklė.

Tai reiškia, kad renkant, analizuojant ir interpretuojant, metabolominę informaciją apie šiuos S. aureus

pokyčius gali padėti nustatyti jos kompleksišką ir sudėtingą patogenezę [30]. Vis dėlto iki šios dienos dar

trūksta išsamių kokybinių ir kiekybinių metabolominių tyrimų duomenų. Be to, S. aureus metabolomas nėra

taip gerai suprastas kaip jo proteomas ir transkriptomas [4,62].

19

6.3.1 Inovacijos mikrobiologinėje metabolomikoje

Nuo pat biochemijos vystymosi pradžios įvairūs instrumentai ir metodai yra reikalingi metabolitų

kokybiniai ir kiekybiniai analizei atlikti [63]. Vis dėlto tik neseniai įvykęs technologinis proveržis masių

spektrometrijoje ir branduolių magnetinio rezonanso spektroskopijoje leido sukurti naujas ir inovacinius

metodikas, kuriomis vienu metu galima aptikti nuo kelių šimtų ar net tūkstančių metabolitų [64]. Taigi,

technologinis vystymasis leido pradėti tirti ląstelę metabolominiu požiūriu [1,3,5,30,63,65–73].

Moksliniai visuomenei bendrai sutarus, jog biologiškai patikimiau į ląsteles yra žiūrėti kaip į

heterogenetinius tyrimo objektus, todėl būtini pavienių ląstelių metabolizmo tyrimai. Vis tik pagrindinė

problema pavienių ląstelių metabolomo nustatyme yra chemometrinių technologijų ribotumas. Science žurnale

publikuotame straipsnyje aptariamos dabar inžinierių kuriamos naujos kartos metabolinio vaizdavimo

technologijos, kurių dėka būtų galima mikroskopinėje erdvėje stebėti ir matuoti specifinio vieno metabolito

pokyčius ląstelėje [74]. Pora tokių tyrimų pavyzdžių duomenų jau yra publikuota.

Atvaizduojamoji masių spektrometrija (IMS) yra besivystanti technologija, kuri gali būti taikoma

mikrobinėje metabolomikoje, kai kartografavimo metodu yra sudaromas Euklidinėje ir Minkovskio erdvėse x

ir y koordinacinis žemėlapis. Jis parodo metabolitų pasiskirstymą mikrobinėje ląstelėje [75]. Vis dėlto, nors

IMS technologija yra brangi, jos pritaikymas yra labai platus, kai naudojamos įvairios modifikacijos.

Pavyzdžiui, panaudojus atvaizduojama antrinės jono masės spektrometrija (SIMS IMS), daugiamatiškai

galima išmatuoti bakterijų metabolizmą ir cheminius pokyčius subląstelinėse erdvėse ir vienaląsčiuose

organizmuose. Kita technologija pritaikoma mikrokolonijų elgesio ir sąveikos su aplinka tyrimuose yra IMS

su ant matricos vykstančia desorbcija/jonizacija, panaudojant sužadinamąjį lazerio spindulį ir lėkio trukmės

detekcijas (MALDI–TOF IMS). MALDI–TOF su desorbcinės nanoelektropurkštuvinės jonizacijos (nano–

DESI) IMS buvo pritaikyta aiškinantis ekstraceliuliarinių metabolitų apykaitos procesus bei sąveikas mikrobų

formuojamose kolonijose [76,77].

6.3.2 Staphylococcus aureus metabolomo tyrimai

20

Aptartos analitinės metodikos yra svarbios, nes taikomos metabolominių studijų tyrimuose. Įvairiai

modifikuojant ir optimizuojant analitinių instrumentų parametrus, galima atlikti įvairaus spektro ir pobūdžio

metabolominę analizę: parinktinės atrankos (ang. untargeted metabolomics) arba tikslinės paieškos (ang.

targeted metabolomics) metodu identifikuoti hidrofilinius arba lipofilinius metabolitus, jų pokyčius,

lokalizaciją ląstelės kompartamentuose. Pavyzdžiui, A.M. Beltramini atliko S. aureus 8325 padermių (naudota

tiek laukinio tipo (ang. wild type), tiek genetiškai modifikuota) palyginamuosius tyrimus dvejuose skirtingose

mitybinėse terpėse (kompleksinėje ir chemiškai žinomos sudėties) [78]. Tyrimo objektais buvo pasirinkti

serino/treonino kinazės ir fosfatazės (atitinkamai žymimos pknB/ΔpknB ir stp/Δstp). Gauti rezultatai parodė,

kad mutantų štamai, kuriems trūksta pknB ir stp arba stp tapo jautresni į ląstelės sienelės sintezę veikiančių

antibiotikų (cefalosporinų ir karbapenemo) poveikiui. Šie metabolominiai tyrimai leidžia daryti išvadą apie

grįžtamojo tipo fosforilinančių/defosforilinančių baltymų svarbą įvairiems ląstelės procesams [79].

Ląstelės diferenciacijos proceso reguliacija, signalo transdukcija ir metabolizmas priklauso nuo

konkrečių fosforilinančių baltymų giminingumo [80]. Įvairūs fosforilinantys serino/treonino ir tirozino

baltymai buvo nustatyti S. aureus štamuose. Be to, pastarieji fermentai yra priskiriami centrinės anglies

metabolizmo keliui [78]. Metabolominės ir transkriptominės fosforilinančių baltymų studijos su S. aureus 8325

ir jos modifikuota izogenine ΔpknB padermėmis leidžia geriau suprasti, kokią įtaką ląstelei daro pknB

fermentas. Normaliomis kultivavimo sąlygomis kompleksinėje terpėje pknB delecija keičia purinų ir

pirimidinų ekspresiją, ląstelės sienelės metabolizmą, autolizę ir glutamino sintezę [81]. 2009 metais atliktos

infekcinės studijos su modifikuotomis S. aureus padermėmis (tiek su ΔpknB, tiek su Δstp) parodė aiškų ryšį

tarp virulentiškumo veiksnių ir mutavusių kinazių aktyvumo (mutacijos tipas delecija). Tyrimas buvo atliktas

su pelėmis ir leido padaryti išvadą, kad ΔpknB ir Δstp atlieka labai svarbią funkciją S. aureus patogenezėje

[78,82].

Apibendrinant šiuos publikuotus tyrimus [78–82], galima teigti, jog yra reikalingi tolimesni genetiškai

mutavusių S. aureus štamų genominiai, proteominiai ir metabolominiai tyrimai, kad būtų geriau suprasta šio

organizmo fiziologija bei šios žinios pritaikytos naujų priešstafilokokinių vaistinių medžiagų paieškoje.

6.4 S. aureus metabolomas ir metabolitinis atsakas į pasikeitusias aplinkos sąlygas.

Naujai išvystyti analitinės chemijos instrumentai dabar tyrėjams leidžia nustatyti labai mažo

intensyvumo metabolitų jonų srautus, panaudojus labai jautrius masių spektrometrijos metodus. Metabolomo

21

sandara tyrinėjama įvairiausiomis perspektyvomis ir sąlygomis [30]. Vienas iš metabolomikos tikslų yra

bandyti suprasti patogeninių bakterijų medžiagų apykaitos procesų adaptaciją ir nustatyti ryšį tarp

patogeniškumo ir metabolizmo [83–85]. Be to, naujausių tyrimų duomenys su genetiškai modifikuotomis

„knockout“ S. aureus padermėmis rodo jų fiziologinius pokyčius. Taigi, metabolomikos pritaikymas gali leisti

nustatyti metabolomo giminingumą virulentiškumo faktoriams ir patogeniškumui [30,45,59,83–85].

Apibendrinant, šiuos tyrimus, didelis dėmesys privalo būti skirtas pavojingam žmogaus patogenui S. aureus,

kurio padermės sukelia pavojingas hospitalines infekcijas. Taip pat reikia gerai suprasti, kaip šios gram–

teigiamos bakterijos geba reaguoti į epigenetiškai pakitusias aplinkos sąlygas.

6.4.1 Genetinis atsakas

Per pastarąjį dešimtmetį buvo atlikta nemažai tyrimų, kurių metu stengtasi suprasti, kaip kinta S.

aureus metabolizmas po įvairių sukeltų genetinių mutacijų [86–90]. Pavyzdžiui, egzometabolomo nustatymui

ir metabolominio pokyčio tyrimams buvo išvestos naujos RN6390 padermės iš S. aureus NCTC8325 kultūros.

Genetinę modifikaciją lėmė vieno geno, koduojančio TCA ciklo fermentą, delecija. Egzometabolomo sudėtis

buvo nustatinėjama 1H BMR metodu. Buvo bandoma nustatyti TCA funkcinę reikšmę S. aureus RN6390

padermės augimui ir virulentiškumo potencialui [86–88,90]. Vėlesnių tyrimų metu buvo išaiškinta, jog delecija

sukėlė sukcinato dehidrogenazės (Δsdh) stygių S. aureus ląstelėse. Tai lėmė, jog buvo pastebėtas sukcininės

rūgšties padidėjimas bei daug smulkių taškelių (ang. pinpoints) mutavusių štamų augimo. TCA ciklo

sutrikdymas nulėmė, šių mikroorganizmų taškelių išryškėjimą, nes S. aureus ląstelės nebesugebėjo suformuoti

biologinės plėvelės ir gaminti energijos atsargas aerobiniu būdu [87]. Taip pat, kaip ir ankstesnių tyrimų metu

(pavyzdžiui, S. aureus RN6390 kultūrose su akonitazės geno delecija) buvo nustatyta, jog sumažėjo

aminorūgščių suvartojimas Δsdh mutantų padermėse, kaip atsakas į sutrikdytą TCA ciklo veiklą [30,87,90].

2011 metų tyrimo metu buvo įrodyta pentozės fosfato biocheminio kelio svarba S. aureus RN4220

ląstelėms ir įtaka virulentiškumui bei bioplevelės formavimuisi [30,91]. Y. Zhu iš Nebraskos Universiteto su

grupe mokslininkų išjungė ribozės atsako reguliatoriaus geną (transkripcijos faktorius, priskiriamas RpiR

klasei). Tai lėmė pentozofosfatinio kelio baltymų genų ekspresijos pokyčius. Galiausiai buvo nustatyta, jog

sukeltas genetinis stresas pakeitė centrinio fermento gliukozės–6–fosfato dehidrogenazės aktyvumą, o vėliau

ir bioplevelės formavimą bei hemolizinį aktyvumą [91].

22

6.4.2 Egzogeninių medžiagų atsakas

Tęsiant mintį apie S. aureus metabolomo ir besikeičiančios aplinkos ryšio supratimą, kitas svarbus

veiksnys yra egzogeninės medžiagos. Aplinkoje nuolatos yra įvairių medžiagų, pradedant elementariomis

gyvybinėmis molekulėmis – deguonimi, vandeniu, mineralų klasteriais bei baigiant sudėtingais organiniais bei

biologiniais junginiais. Seniai žinoma biologinė aksioma, jog visos gyvybės formos konkuruoja dėl aplinkoje

esančių gyvybiškai komfortiškų nišų. Vis dėlto mikroorganizmų lygmeniu ši konkurencija skatina prokariotus

greitai adaptuotis prie esamos aplinkos. Tai lemia bakterijų genomo – proteomo – metabolomo pokyčius. Ne

išimtis yra ir S. aureus rūšies bakterijos, kurios reaguodamos į cheminę aplinkos kaita greitai prisitaiko.

Mokslininkų grupės simuliuodamos pakitusias išgyvenimo sąlygas gali tirti tiesiogiai S. aureus bendruosius

biologinius mechanizmus ir suprasti, kaip ši gyvybės forma reaguoja į sukeltus stresorius [1–3,5,30,44,63,65–

73,92–96].

Vienas iš dažniausiai naudojamų stresinių faktorių mikroorganizmų metabolominiuose tyrimuose yra

maistinių medžiagų apribojimas. In vitro studijų metu svarbiausias kintamasis objektas yra kultivavimo terpė,

nes cheminė kompozicija gali turėti įtakos endometabolomo sudėčiai [45,59,78]. Pavyzdžiui, M. Liebeke

atliktas tyrimas atskleidė, kad S. aureus padermės 8325 metabolomo sudėtis priklauso nuo mitybinės terpės.

Pastebėta, kad lyginant dvi terpes tarpusavyje S. aureus metabolomo sudėtis skyrėsi. Naudotas lizogeninis

buljonas ir chemiškai apibūdinta augimo terpė, kurioje nebuvo nukleotidų. Pirmojoje terpėje kultivuotų štamų

metabolinės analizės rezultatas – didesnės guanozino trifosfato ir trehalozės–6–fosfato ląstelinės

koncentracijos [78].

Taip pat nustatyta, kad mikroorganizmai badavimo laikotarpiu iš eksponentinės augimo fazės pereina

į stacionarią augimo fazę. Metabolominės ir proteominės analizės metu buvo nustatyta, kad šis pokytis vyksta

dažniausiai dėl apribotų gliukozės atsargų [30,59]. Pagal gautus duomenis, akivaizdu, jog S. aureus subsp.

aureus COL (MRSA), kultivuotos chemiškai apibūdintoje augimo terpėje, metabolitų ir baltymų pokyčiai vyko

per apibrėžta laiko momentą. DC–MS, SC–MS ir 1H BMR „metabolinių pėdsakų“ (ang. metabolic

footprinting) analizės metodais buvo identifikuoti 94 S. aureus metabolitai. Metabolominiai rezultatai buvo

palyginti su proteominės analizės duomenimis. Pastarosios metu buvo atrinkta daugiau nei 500 baltymų 2D–

gelelektroforezės metodu. Įdomu tai, kad proteominiai ir metabolominiai rezultatai puikiai koreliavo, kurie

apsprendžia centrinius metabolinius kelius. Kita vertus, ne visus pasirinktus biocheminius kelius pavyko

statistiškai patvirtinti. Proteominės analizės metu nustatyti baltymų pokyčiai buvo nuo 2 iki 10 kartų, o

23

metabolominės – daugiau nei 100 kartų lyginant eksponentinę ir stacionarią augimo fazes. Šis publikuotas

tyrimas buvo pats pirmasis, kada visapusiškai kiekybiškai ištirtas S. aureus subsp. aureus COL (MRSA)

metabolomas, jo sudėtis [59].

6.5 Potencialūs biologiniai S. aureus taikiniai.

Svarbus S. aureus virulentiškumo faktorius yra auksinių karotinoidų grupės pigmentas

stafiloksantinas (STXa) [97]. Šis glikolipidas turi daug nesočiųjų dvigubų cheminių jungčių, todėl gali reaguoti

su neutrofilų ir makrofagų pagamintomis reaktyviomis deguonies formomis (ROS). STXa atlikdamas

antioksidanto funkciją apsaugo S. aureus nuo įgimto žmogaus imuniteto. Pastarasis virulentiškumo faktorius

tyrimų metu buvo parodytas, kaip ypatingai svarbus užkrečiamumo komponentas. Nustatyta, kad bakterijos,

1 pav. Stafiloksantino biosintezės kelias:

Schemoje pateiktas biosintezės kelias, per kurį S. aureus padermėse sintezuojamas

stafiloksantinas. Biosintezė panaši į eukariotų ir grybų sterolių sintezę, skiriasi tik preskvaleno

difosfato apykaita.

24

kurios stokoja šio karotinoido, nesugeba sukelti infekcijos bei yra lengvai susekamos ir numarinamos

neutrofilų. Šios studijos buvo atliktos su sisteminiais infekciniais modeliais ir pelių oda [98,99].

Nustatytas stafiloksantino sintezės kelias leidžia ieškoti naujų biologinių taikinių prieš stafilokokines

infekcijas. S. aureus šį faktorių sintezuoja pirmiausiai kondensuojant dvejas farnezilo difosfato (FPP)

molekules iki skvaleno prekursoriaus (cholesterolio biosintezės kelias) preskvaleno difosfato. Šį procesą

katalizuoja fermentas dehidroskvaleno sintazė (dar literatūroje vartojamas diapofitoeno sintazė arba CrtM).

Stafiloksantino sintezė yra panaši į žinduolių ląstelėse vykstančią cholesterolio biosintezę, todėl studijų metu

buvo iškelta hipotezė, jog žinomi skvaleno sintazės slopikliai (pastarieji kuriami ir vystomi cholesterolio kiekio

mažinimui) gali taip pat paveikti ir CrtM [99,100]. Kiti potencialūs taikiniai pateikti 1 lentelėje.

25

1 lentelė. Potencialūs biologiniai S. aureus taikiniai, per kuriuos biologiškai aktyvios medžiagos slopina metabolizmą

ID Stafilokoko baltymas Metabolinis kelias Taikinys Organizmas

P63892 ddl; D-alanil-alanino sintetazė

A

D-alanino metabolizmas D-alanil-D-alanino ligazė Staphylococcus

aureus

P99075 fbaA; fruktozės - bisfosfato

aldolazė

Glikolizė/gliukoneogenezė Triozefosfato izomerazė Homo sapiens

Q2G2M0 4 - oksolokrotonato

tautomerazė (numanomas)

Dioksino skilimas 4-oksolokrotonato tautomerazė Pseudomonas putida

Q2G069 murB, UDP-N -

acetilenolpirvoilgliukozamino

reduktazė

Nukleozidų metabolizmas UDP-alaktopiranozes mutazė, Escherichia coli K12

Q2FZP6 murE; UDP-N-

acetilmuramoilalanil-D-

gliutamato–L- lizino ligazė

Nukleozidų metabolizmas UDP-N-lacetilmuramilalanil-D-

glutamato–2,6-diaminopimelato

ligazė ;

Escherichia coli K12

Q7A3U0 narG, respiracinė nitratų

reduktazės α-grandinė

Dvi komponentė sistema Respiracinė nitratų reduktazės 1 alfa

grandinės


P66706

rpoA,

DNR-tiesioginis

RNR polimerazė α-grandinė

Purino metabolizmas DNR-tiesioginis RNR polimerazės

α-grandinė

DNR-tiesioginis RNR polimerazės

β-grandinė

DNR-tiesioginis RNR polimerazės

β-subvienetas


26

ID Stafilokoko baltymas Metabolinis kelias Taikinys Organizmas

P63638 murI; glutamato rakemazė D-Glutamino ir D-glutamato

metabolizmas

Kinureninazė Pseudomonas

fluorescens

P63982 polC, DNA polimerazės III,

α-grandinės polC-tipas

DNR replikacija Timidilato kinazė Mycobacterium

tuberculosis

P64108 fabZ; (3R)-hidroksimiristil-

ACP dehidratazė

Riebiųjų rūgščių biosintezė (3R)-hidroksimiristoil-[acil-

baltymo-nešėjo] dehidratazė

Helicobacter pylori

Q2G029 2,3-Bisfosfoglicerato-

independento fosfoglicerato

mutazė

Glicino, serino ir treonino

metabolizmas

2-Dehidro-3-deoksifosfoktonato

aldolazė

Aquifex aeolicus

Q2G0Q7 Dihidropteroato sintazė Folato biosintezė Dihidropteroato sintazė Bacillus anthracis

Q2G0Q5 2-Amino-4-hidroksi-6-

hidroksimetildihidropteridino

pirofosfokinazė

Folato biosintezė 2-Amino-4-hidroksi-6-

hidroksimetildihidropteridino

pirofosfokinazė

Haemophilus

influenzae

Q2G0Q6 Dihidroneopterino aldolazė Folato biosintezė Dihidroneopterino aldolazė Staphylococcus

aureus

P67719 ureA; ureazės γ-subvienetas Purino metabolizmas Timidilato sintazė Escherichia coli K12

P67407 ureB, ureazės β-subvienetas Arginino ir prolino metabolizmas Timidilato sintazė Escherichia coli K12

27

7. TYRIMO METODIKA IR METODAI

7.1 Junginių sintezė

7.1.1 Naudotos medžiagos ir tirpikliai

4-chlorbenzaldehidas (97 proc.), 4-fluorbenzaldehidas (98 proc.), 4-hidroksibenzaldehidas (98 proc.),

4-nitrobenzaldehidas (98 proc.), benzilaminas (99 proc.), aktyvuota anglis, kalio acetatas (≥99 proc.), bromacto

rūgšties metilo esteris (97 proc.), alilizotiocianatas (95 proc.) amonio acetatas (≥98 proc.), hidrazino hidratas

(78–82 proc.), jodmetanas (≥99 proc.), monochloracto rūgštis (≥99 proc.), 2-propanolis (99,5 proc.),

acetonitrilas (≥99,9 proc.), acetonas (≥99,8 proc.), benzenas, butanolis (99,8 proc.), dioksanas (99,8 proc.),

DMF, dimetilsulfoksidas (≥99,5 proc.) dimetilsulfoksidas-d6, anglies tetrachloridas (≥99,5 proc.), dietilo eteris

(≥99 proc.), heksanas (95 proc.), ledinė acto rūgštis (≥99,7 proc.), metanolis (≥99.9 proc.), n-butanolis (≥99,9

proc.), n-propanolis (99,7 proc.) įsigyti iš „Sigma-Aldrich GmbH“ (Buchs, Šveicarija), etanolis (96,3 proc.) iš

„Stumbras“ (Kaunas, Lietuva). Visi naudoti tirpikliai yra ESC analitinio švarumo.

7.1.2 Junginių sintezės metodikos

Nauji imidazolin-4-ono junginiai gauti pakopinės sintezės metu. Pirmiausiai, 0,01 mol atitinkamos

aminorūgšties (glicino) ir 0,011 mol amonio tiocianato acto rūgšties ir jos anhidrido aplinkoje yra gaunamas

1–acetil–2–tioksoimidazolin–4–ono (1) žiedas ciklokondensacijos būdu. Reakcija vykdoma refliuksinantis 1

valandą nuo spalvos pasikeitimo su grįžtamuoju šaldytuvu. Reakcijos mišinys yra vėsinamas kambario

temperatūroje, koncentruojamas sumažinto atmosferos slėgio aplinkoje roto vakuuminiu būdu. Susidarę

kristalai yra nufiltruojami, praplaunami iš vandens, chloroformo, eterio. Džiovinami 60oC temperatūroje

džiovinimo spintoje. Gautas produktas yra perkristalinamas iš 1-propanolio.

Kitas etapas yra 1–acetil–2–tioksoimidazolin–4–ono (1) hidrolizė iki 2–tioksoimidazolin–4–ono (2).

0.01 mol (1) yra šildomas 10 % koncentracijos HCl tirpale santykiu 1:10. Reakcija vykdoma 1 valandą su

grįžtamuoju šaldytuvu iki refliuksinimosi. Tirpalas yra atvėsinamas kambario temperatūroje, į jį pridedama

aktyvintos anglies santykiu 1:3. Tada heterogeninis mišinys yra užkaitinamas iki virimo ir karštas filtruojamas.

28

Nufiltruoti kristalai praplaunami vandeniu, etanoliu, surenkami ir džiovinami 60oC. Gautas produktas

perkristalinamas iš etanolio.

Trečias sintezės etapas yra atliekamas iš (2) sintezuoto junginio gaunant pakeistus 5–ariliden–2–

tioksoimidazolin–4–ono (3) darinius. 0,01 mol (2) sumaišomas su 0,02 mol atitinkamu aromatiniu

benzaldehidu 40 ml acto rūgšties. Taip pat į mišinį yra pridedama 0,001 mol amonio acetato ir reakcija

vykdoma 90 minučių nuo refliuksinimosi pradžios. Reakcijos mišinys yra ataušinamas ir koncentruojamas

sumažinto atmosferos slėgio aplinkoje roto vakuuminiu būdu. Susidarę kristalai yra nufiltruojami, praplaunami

chloroformu ir eteriu bei džiovinami 60oC. Gautas (3) produktas Knovenagelio kondensacijos metodu

perkristalinamas iš izopropanolio.

Toliau (3) junginių grupė yra modifikuojama antroje padėtyje su įvairiais organiniais halogenidais iki

lengvai paliekančių grupių. 0.01 mol (3) su organiniu halogenidu 0.04 mol (CH3I) ir paruoštu 10 ml natrio

metilatu yra maišomas 30 minučių kambario temperatūroje iki kol susidaro puri geltona masė. Pastarieji yra

nufiltruojami ir praplaunami chloroformu bei eteriu bei džiovinami 60oC. Gautas (4) produktas yra

perkristalinamas iš etanolio arba acetonitrilo.

Paskutinė vykdoma reakcija yra nukleofilinė substitucija, kuomet yra pakeičiama lengvai paliekanti

grupė atitinkamu aminu arba aminorūgštimi. 0.01 mol (4) su 0.04 mol amino/aminorūgšties ištirpinami

etanolyje, pridedama 0.05 mol katalizatoriaus – kalio acetato. Reakcijos mišinys yra užkaitinamas iki

refliuksinimosi, tada atvėsinamas. Toliau reakcija vykdoma 4–6 valandas ultragarso aplinkoje. Po reakcijos į

2 pav. Bendra sintezės reakcijų schema, modifikuojant junginius penktoje

padėtyje:

Atliekama pakopinė cheminė sintezė – vykdomos ciklokondensacijos, hidrolizės ir

Knovenagelio kondensacijos reakcijos. R1 žymi pakeistus arilideninius pakaitus.

29

mišinį pilama distiliuoto vandens iki kol išsėda kristalai. Jie yra nufiltruojami ir praplaunami acetonu ir eteriu.

Kristalai džiovinami 60oC. Gautas (5) produktas yra perkristalinamas iš acetono.

N-etil-2-{[(5Z)-5-(4-etilbenziliden)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetamidas (EK-1):

Išeiga 84%, gelsvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 157-159 oC, λmax = 304 nm (UV), Rf = 0.52. Struktūrinė

tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1754 (C = O), 1599 (N – H), 1754 (CONH), 1578 (CH

aromatinis); 1H BMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (s, 1H, CH), 7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.2

Hz, 2H, ArH), 3.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.84 – 1.69 (m, 2H, CH2), 1.52 –

1.40 (m, 2H,CH2), 1.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H,CH3), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H,CH3); MS (ESI+): C16H19N3O2S, apsk.

[M+H]+ = 318.1270 Da, rasta [M+H]+ = 318.1267 Da.

{[(5Z)-5-(4-etilbenziliden)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetonitrilas (EK-2): Išeiga 78%,

gelsvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 154-156 oC, λmax = 301 nm (UV), Rf = 0.71. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1432 (CH aromatinis);

MS (ESI+): C14H13N3OS, apsk. [M+H]+ = 271.0774 Da, rasta [M+H]+ = 271.0764 Da.

(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-tioksoimidazolidin-4-onas (EK-3): Išeiga 57%, gelsvi kristalai (krist. iš

izopropanolio), Tlyd = 160-12 oC, λmax = 309 nm (UV), Rf = 0.39. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS:

υmax cm-1 (FT–IR) 1781 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis);; MS (ESI+):

C12H12N2OS, apsk. [M+H]+ = 233.0743 Da, rasta [M+H]+ = 233.0741 Da.

metil-{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)- 4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetatas (EK-4): Išeiga

67%, gelsvi kristalai (krist. iš acetonitrilo), Tlyd = 138-140 oC, λmax = 324 nm (UV), Rf = 0.56. Struktūrinė


aromatinis); 1H BMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.75 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.98 (s, 1H),

4.34 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.66 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.6 Hz, 3H); MS (ESI+): C15H16N2O3S, apsk.

[M+H]+ = 305.0954 Da, rasta [M+H]+ = 305.0951 Da.

(5Z)-5-[(4-etilfenil)metilidene]-2-(propilamino)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-5): Išeiga 89%,

pilki kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 157-159 oC, λmax = 303 nm (UV), Rf = 0.52. Struktūrinė tapatybė

30


MS (ESI+): C15H19N3O, apsk. [M+H]+ = 258.1601 Da, rasta [M+H]+ = 258.1609 Da.

2-{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanil}acetamidas (EK-6): Išeiga

92%, gelsvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 147-150 oC, λmax = 326 nm (UV), Rf = 0.47. Struktūrinė tapatybė


1H BMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (s, 1H, CH), 7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH),

3.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.84 – 1.69 (m, 2H, CH2), 1.52 – 1.40 (m, 2H,

CH2), 1.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H,CH3), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H,CH3); MS (ESI+): C14H15N3O2S, apsk. [M+H]

+ =

290.0958 Da, rasta [M+H]+ = 290.0966 Da.

{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]amino}acto rūgštis (EK-7): Išeiga 62%,

baltai gelsvi kristalai (krist. iš acetono), Tlyd = 234-241oC, λmax = 312 nm (UV), Rf = 0.58. Struktūrinė tapatybė


1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.82 (s, 1H, OH karboksilinis), 7.91 (s, J = 7.8 Hz, 2H, CH ariliniai, NH),

7.21 (d, J = 7.8 Hz, 2H, CH ariliniai), 6.32 (s, J = 5.0 Hz, 1H, CH alkilinis), 4.06 (s, 2H, CH2 alkilinis), 2.59

(q, J = 7.6 Hz, 4H, CH2 alkilinis), 1.18 (q, J = 7.4 Hz, 6H, CH3 alkilinis).MS (ESI+): C14H15N3O3, apsk. [M+H]

+

= 274.1186 Da, rasta [M+H]+ = 274.11 Da.

{[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanilo}acto rūgštis (EK-8): Išeiga

71%, geltoni kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 157-159 oC, λmax = 331 nm (UV), Rf = 0.53. Struktūrinė tapatybė


MS (ESI+): C14H14N2O3S, apsk. [M+H]+ = 291.0798 Da, rasta [M+H]+ = 291.0792 Da.

{[(5Z)-5-(4-fluorobenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]sulfanilo}acetonitrilas (EK-9): Išeiga

81%, geltoni kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 177-181 oC, λmax = 322 nm (UV), Rf = 0.42. Struktūrinė tapatybė


1H BMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83 (s, 1H, CH), 7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 2H, ArH),

3.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.84 – 1.69 (m, 2H, CH2), 1.52 – 1.40 (m, 2H,

CH2), 1.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H,CH3), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H,CH3); MS (ESI+): C12H8FN3OS, apsk. [M+H]

+ =

262.0445 Da, rasta [M+H]+ = 262.0454 Da.

31

(5Z)-5-(4-etillbenzilidene)-2-(etilsulfanil)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-10): Išeiga 57%, gelsvi

kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 175-177 oC, λmax = 334 nm (UV), Rf = 0.35. Struktūrinė tapatybė patvirtinta

FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1784 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1432 (CH aromatinis); MS (ESI+):

C14H16N2OS, apsk. [M+H]+ = 261.1056 Da, rasta [M+H]+ = 261.1062 Da.

(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-(prop-2-en-1-ilamino)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-11): Išeiga 15%,

balti kristalai (krist. iš acetonitrilo), Tlyd = 164-167 oC, λmax = 289 nm (UV), Rf = 0.77. Struktūrinė tapatybė



(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-[(2-hydroksietil)amino]-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-12): Išeiga

81%, pilki kristalai (krist. iš metanolio), Tlyd = 191-193 oC, λmax = 309 nm (UV), Rf = 0.51. Struktūrinė tapatybė


MS (ESI+): C14H17N3O2, apsk. [M+H]+ = 260.1394 Da, rasta [M+H]+ = 260.1387 Da.

(5Z)-2-(etilamino)-5-(4-etilbenzilidene)-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-13): Išeiga 85%, balsvai

pilki kristalai (krist. iš propanolio), Tlyd = 198-199 oC, λmax = 302 nm (UV), Rf = 0.52. Struktūrinė tapatybė



2-{[(5Z)-5-(4-chlorobenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]amino}-3-metilbutano rūgštis

(EK-14): Išeiga 75%, balti kristalai (krist. iš acetono), Tlyd = 249-259 oC, λmax = 311 nm (UV), Rf = 0.42.

Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH),

1605 (CH aromatinis); 1H BMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.03 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 7.8

Hz, 2H), 6.96 (s, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.69 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.6 Hz, 3H); MS (ESI+):

C15H16ClN3O3, apsk. [M+H]+ = 322.0953 Da, rasta [M+H]+ = 322.0952 Da.

(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-2-[(2H-tetrazol-5-il-metil)amino]-1,5-dihidro-4H-imidazol-4-onas (EK-15):

Išeiga 90%, pilki kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 177-179 oC, λmax = 359 nm (UV), Rf = 0.75. Struktūrinė

32


aromatinis); MS (ESI+): C14H15N7O, apsk. [M+H]+ = 298.1411 Da, rasta [M+H]+ = 298.142 Da.

1,3-diazaspiro[4.5]dekano-2,4-ditionas (EK-16): Išeiga 67%, rausvi kristalai (krist. iš etanolio), Tlyd = 127-

129 oC, λmax = 343 nm (UV), Rf = 0.47. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1767

(C=O), 1574 (N–H), 1739 (CONH), 1404 (CH aromatinis); MS (ESI+): C8H12N2S2, apsk. [M+H]+ = 201.0515

Da, rasta [M+H]+ = 201.0511 Da.

6,10-difenil-2-tiokso-1,3-diazaspiro[4.5]dekano-4,8-dionas (EK-17): Išeiga 87%, geltoni kristalai (krist. iš


υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1605 (CH aromatinis); MS (ESI+):

C20H18N2O2S, apsk. [M+H]+ = 351.1162 Da, rasta [M+H]+ = 351.1158 Da.

(5Z)-5-(4-fluorobenzilidene)-2-tioksoimidazolidin-4-onas (EK-18): Išeiga 80%, gelsvi kristalai (krist. iš


υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724 (CONH), 1432 (CH aromatinis); MS (ESI+):

C10H7FN2OS, apsk. [M+H]+ = 223.0336 Da, rasta [M+H]+ = 223.0341 Da.

(5Z)-5-(4-nitrobenzilidene)-2-tioksoimidazolidin-4-onas (EK-19): Išeiga 81%, gelsvi kristalai (krist. iš

acetono), Tlyd = 104-106 oC, λmax = 317 nm (UV), Rf = 0.8. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax

cm-1 (FT–IR) 1754 (C = O), 1599 (N – H), 1754 (CONH), 1578 (CH aromatinis); MS (ESI+): C10H7N3O3S,

apsk. [M+H]+ = 250.0281 Da, rasta [M+H]+ = 250.0288 Da.

2-{[(5Z)-5-(4-chlorobenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il]amino}-3-sulfanilpropano rūgštis

(EK-20): Išeiga 78%, baltai gelsvi kristalai (krist. iš acetono), Tlyd = 242-251 oC, λmax = 292 nm (UV), Rf =

0.61. Struktūrinė tapatybė patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1794 (C = O), 1624 (N – H), 1724

(CONH), 1605 (CH aromatinis); 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.82 (s, 1H, OH), 7.91 (s, J = 7.8 Hz, 2H,

CH, NH), 7.21 (d, J = 7.8 Hz, 2H, CH), 6.32 (s, J = 5.0 Hz, 1H, CH), 4.06 (s, 2H, CH2 alkilinis), 2.59 (q, J =

7.6 Hz, 4H, CH2), 1.18 (q, J = 7.4 Hz, 6H, CH3). MS (ESI+): C13H12ClN3O3S, apsk. [M+H]

+ = 326.0361 Da,

rasta [M+H]+ = 326.0368 Da.

33

S-[(5Z)-5-(4-etilbenzilidene)-4-okso-4,5-dihidro-1H-imidazol-2-il] etanoetioatas (EK-21): Išeiga 55%,

geltoni kristalai (krist. iš acetonitrilo), Tlyd = 151-154 oC, λmax = 344 nm (UV), Rf = 0.54. Struktūrinė tapatybė

patvirtinta FT-IR, MS: υmax cm-1 (FT–IR) 1767 (C=O), 1574 (N – H), 1739 (CONH), 1404 (CH aromatinis);

MS (ESI+): C14H14N2O2S, apsk. [M+H]+ = 275.0849 Da, rasta [M+H]+ = 275.0846 Da.

7.1.3 Reakcijos sąlygų optimizavimas

Po atliktos Knovenagelio kondensacijos reakcijos į penktąją imidazolin-4-ono žiedo, yra pradedama

modifikuoti antroji heterociklo padėtis. Nukleofilinės substitucijos reakcija vykdoma įvedant aminorūgštis per

lengvai atskylančia metiltio funkcine grupe. Atitinkamai naudoti įvairūs katalizatoriai ir tirpikliai reakcijos

sąlygų optimizavimui: TEA, DIEA, piridinas, amonio acetatas, natrio acetatas, kalio acetatas bei acetonas,

acetonitrilas, metanolis, vanduo, NaOH. Visi reakcijos mišiniai buvo šildomi iki refliuksinimosi 48 valandoms

arba reakcija vykdoma ultragarso aplinkoje 4 valandas.

7.2 Junginių analizės metodai

3 pav. Bendra sintezės reakcijų schema, modifikuojant junginius penktoje

padėtyje:

Antroje padėtyje yra modifikuojama tiokso grupė, sudarant lengvai paliekančią

metiltio grupę, kuri lengvai atskyla nukleofilinės substitucijos reakcijų metu su

įvairiais aminais ir aminorūgštimis.

34

Junginių reakcijos greičio monitoravimui ir pirminiam grynumo patikrinimui buvo pasitelkti

plonasluoksnės chromatografijos, FT–IR spektroskopijos metodai bei nustatyta lydymosi temperatūra.

Junginių struktūrinė ir priemaišų nustatymo analizei buvo taikytos FT–IR spektroskopijos, UV

spektrofotometrijos bei SC–MS/MS spektrometrijos metodai.

7.2.1 FT–IR spektroskopija

Sintetintų EK junginių IR spektrai užrašyti PerkinElmer UATR Two spektrometru. Atliekant FT–IR

spektro analizę, naudojamas dydis bangos skaičius n (cm–1), kuris proporcingas bangos dažniui. FT–IR

spektroskope interferavusi IR spinduliuotė nukreipiama tik į bandinį, todėl EK medžiagos milteliai užnešami

plonu sluoksniu ant prietaiso deimanto ir užrašomas jo FT–IR spektras 450–4000cm-1 bangos skaičiaus

intervale. Stebimos smailės gaunamos registruojant visos molekulės vibracinius pokyčius, todėl nustatomos

EK medžiagos funkcinės grupės bei pirštų antspaudų regionas palyginamas su pradinių sintezės reagentų

spektrais. Tai atliekama 450–1300 cm-1 bangos skaičiaus regione. Be to, po spektro užregistravimo yra

atliekamos gamintojų rekomenduojamos smailių ATR korekcijos.

7.2.2 Plonasluoksnė chromatografija

Atliekant EK junginių sintezę, pirminiam tapatumo nustatymui naudojamas paprastas, greitas ir labai

universalus plataus spektro medžiagų tyrimas – plonasluoksnė chromatografija. PLC naudojamas silicio gelio

plokštelė ant kurio starto linijos užlašinami su mikrokapiliarais keli μl tiriamojo EK junginio ir sintezės metu

naudojami reagentai. Kiekvieno tiriamojo lašo dėmė išdžiovinama ir tik tada dedamas sekantis lašas.

Chramatografinė kamera užpildoma judančiąja fazė, kuri priklauso nuo kiekvieno EK junginio savybių.

Eksperimentiškai parinkus tinkamą judančią fazę, tiriamojo junginio komponentai per sorbento sluoksnį juda

skirtingu greičiu. Pasibaigus tirpiklio keliui – plokštelė išimama iš kameros ir džiovinama. Tiriamosios zonos

identifikuojamos stebint apšvietus UV spinduliuote. Junginys nustatomas apskaičiuojant Rf vertes ir lyginant

jas su standartais.

Rf apskaičiuojama pagal šią formulę: Rf = 𝒂

𝒉

35

a – nueitas tiriamosios medžiagos kelias;

h – tirpiklių sistemos nueitas kelias.

7.2.3 UV spektrofotometrija

EK tiriamųjų junginių spektrai buvo užrašyti naudojantis Agilent Technologies Cary 8454 UV-VIS.

Atsveriamas 1mg EK junginys ir ištirpinamas 1 ml metanolio Gautas koncentruotas tirpalas, jis papildomai

praskiedžiamas: paimamas 10 µl tirpalo ir skiedžiamas 1ml metanolio, gaunamas 10 µg/ml EK tirpalas.

Metanolis pilamas į kiuvetę, dedamas į EK spektrofotometrą ir užrašomas jo sugerties spektras, kuris yra

atimamas. Tada tiriamas EK junginys - 10 µg/ml tirpalas matuojamas tuo pačiu principu – užrašomas EK

junginio UV sugerties spektras, matuojant UV absorbciją esant 200-600 nm bangos ilgiams.

7.2.4 SC – tandeminės MS/MS spektrometrija

Susintetinti EK junginiai buvo analizuojami naudojant Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-

TOF SC/MS prietaisą (parametrai nurodyti 1, 2 ir 3 lentelėse). Mėginiai buvo paruošiami pagal tą pačią

metodiką, kaip ir atliekant UV spektrofotometrijos analizę. Pagaminti EK mėginių tirpalai buvo filtruojami ir

įleidžiami į efektyvųjį skysčių chromatografą Agilent Technologies Infinity 1260 chromatografinei ir masių

spektrometrinei analizei. Palyginamasis masių spektras pagal elementinę izotopų distribuciją apskaičiuotas ir

sudarytas su Agilent MassHunter Workstation Data Analysis Core moduliu.

2 lentelė. Skysčių chromatografijos junginių išskirstymo parametrai metabolominio pokyčio

tyrimo įvertinimui.

Parametrai Agilent 1260 Infinity SC sistema

Chromatografinė

kolonėlė

Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 2.1 × 100 mm, 1.8-µm,

(p/n 959757-902)

Kolonėlės temperatūra 40oC junginių grynumo tyrimams

Injekavimo tūris 10 µL junginių grynumo tyrimui su Agilent 6530 Q–TOF

Injekavimo greitis 200 µL/min

36


Mobili faze (+

jonizacija)

Junginių grynumo tyrimai:

A: Vanduo, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%)

B: Metanolis, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%)

Tekmės greitis 0.40 mL/min junginių grynumo tyrimams

Gradienas (+

jonizacija)

Junginio grynumo tyrimai

0 min 1 min 11 min 13 min 15 min 20 min

A: 100 A: 100 A: 0 A: 0 A: 100 A: 100

B: 0 B: 0 B: 100 B: 100 B: 0 B: 0

Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio diapazonas 200–550 nm, po 2 nm, smailės plotis

37

Susintetintų EK cheminių junginių tapatumas nustatomas remiantis lydymosi temperatūros intervalu.

Cheminiai junginiai nustatomi Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatu. Prietaisas sudarytas iš

mikroskopo, kaitinimo elemento ir termometro. Nedidelis kiekis EK produkto uždedama ant objektyvinio

stiklelio, tačiau prieš tai jis nuvalomas su acetonu ir išdžiovinamas. Ant stiklelio su mėginiu yra dedamas kitas

nuvalytas ir išdžiovintas stiklelis, jie tarpusavyje suspaudžiami ir medžiaga sutrinama, kad neliktų akimi

matomų stambių junginio kristalų.

7.3 Mikrobiologinio mėginio paruošimas

7.3.1 Naudojamos medžiagos

Visi tirpalai turi būti paruošti naudojant ultrašvarų vandenį (UŠV) ir analitiškai grynus reagentus. Visi

reagentai buvo pagaminti ir laikomi kambario temperatūroje (išskyrus, tuos atvejus, kai laikymui buvo būtinos

kitos aplinkos sąlygos). S. aureus (ATCC 25923) kultūra auginama Mueller Hinton terpėje. Buvo naudojamas

ypač švarus metanolis (99,99 %), kurio darbinė temperatūra –20°C, todėl privalo būti laikomas šaldytuve.

Dimetilsulfidas (DMSO) (Nr. 20688) – 99,5 %.

7.3.2 Ląstelių kultivavimas, mėginių ėmimas ir intraceliuliarinių metabolitų ekstrakcija

Mikrobiologiniai mėginiai buvo paruošiami remiantis Ting L., Yu Y. bei Liu Y., mokslininkų paruoštais

eksperimentiniais protokolais [101–103]:

1. Inokuliuojama (įvedama) 12 x 109 kolonijas sudarančių vienetų CFU ml-1 S. aureus (ATCC

25923) mikroorganizmų kultūrą į paruoštą Mueller-Hinton terpę ir tai atlikus inkubuojama

37oC 24 valandas.

2. EK junginiai buvo ištirpinami DMSO, gaunant 10 mM koncentraciją. Koncentruotas tirpalas

vėl skiedžiamas iki 10 µM koncentracijos. Kontrolei pasirinkti trimetoprimo, norsulfazolio ir

fiziologiniai tirpalai.

3. Naudojantis DEN-1 Mc-Farland densitometru, kol nustatoma nuo 1,0 optinio tankio reikšmė

esant 600 nm spinduliuotei (ODλ=600) gauta kultūra praskiedžiama fiziologiniu tirpalu iki 1,0

38

x 109 kolonijas sudarančių vienetų (CFU) ml-1. Gauta 1,0 ml bakterinės suspensija buvo

sumaišyta su 1μl EK tiriamųjų junginių tirpalais (galutine 10 μmol koncentracija) ir

analogiškai pakartota ir su kontroliniais tirpalais. Mišiniai buvo aerobiškai kultivuojami 37 °C

20-24 val.

4. Pasibaigus inkubacijai, bakterijos yra lizuojamos. EK junginiai bei kontrolės buvo

praskiedžiami 1 ml -20 °C CH3OH. Po to, mikroorganizmų kultūra buvo lizuojama veikiant

ultragarsu 30 min ir 1 val.. Baltymų gautinis nusodinimas pasiekiamas mėginius šaldant 1 val.,

esant – 20°C.

5. Mėginiai 30 min centrifiguojami 600 aps. greičiu, o lizatas filtruojamas per 0.22 µm PTFE

membraninį filtrą.

6. Mėginiai iki analizės laikomi esant -20°C temperatūrai.

7.4 Metabolominio tyrimo vertinimas SC – tandeminės MS/MS metodu

7.4.1 Metabolominio pokyčio įvertinimas

3 lentelė. Skysčių chromatografijos junginių išskirstymo parametrai metabolominio pokyčio

tyrimo įvertinimui.


Chromatografinė

kolonėlė

Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition (RRHD) Eclipse Plus C18 2.1 × 100 mm, 1.8-µm,

(p/n 959757-902)

Kolonėlės temperatūra 50oC metabolitų profiliavimo tyrimams

Injekavimo tūris 1 µL metabolinio profiliavimo tyrimui su Agilent 6530 Q–TOF

Injekavimo greitis 200 µL/min

Mobili faze (+

jonizacija)

Metabolinio profiliavimo tyrimai:

A: Vanduo, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%) B: Metanolis, turintis 0.1 % amonio acetato (99.999%)

Tekmės greitis 0,35 mL/min metabolinio profiliavimo tyrimams

Gradienas (+

jonizacija)

Metabolinio profiliavimo tyrimams

0 min 1 min 20 min 31 min 32 min 40 min

A: 90 A: 90 A: 10 A: 10 A: 90 A: 90

B: 10 B: 10 B: 90 B: 90 B: 10 B: 10

Detektorius Agilent 1260 Infinity DMD, bangos ilgio diapazonas 200–550 nm, po 2 nm, smailės plotis

39

SC – MS analizė buvo atlikta naudojant Agilent 1260 Infinity SC kartu su Agilent 6530 Q–TOF sistema. 1, 2

ir 3 lentelėse pateiktos optimizuotos junginių gryninimo ir metabolinio profiliavimo tyrimų sąlygos.

4 lentelė. Optimizuoti masių spektrometrijos parametrai

Programinė įranga duomenų analizei:

• Agilent MassHunter Qualitative Analysis (Qual) B.07.00;

• Agilent MassHunter Profinder B.06.00, sp. 1;

A: 254/4 nm B: 474/4 nm C: 550/4 nm D: 215/4 nm

E: 360/4 nm F: 200/4 nm G: 310/4 nm H: 410/4 nm

Analizės trukmė (stop

time)

40 minučių metabolinio profiliavimo tyrimams

Post-analizės trukmė 15 minučių

Parametrai Agilent 6530 Q–TOF MS sistema

Jonizacija Teigiama (+)

Jonizacijos šaltinis Agilent Dual Jet Stream elektropurkštuvinis jonizatorius (ESI)

Kapiliarinė įtampa 4250 V (+)

Purkštuvo įtampa 250 V

Džiovinimo dujų temperatūra 350oC

Džiovinimo dujų tėkmė 13 l/min

Purkštuvo slėgis 40 psig

Apgaubiančių dujų temperatūra 280oC

Apgaubiančių dujų tėkmė 12 l/min

MS ribos 100 – 1700 m/z

Kolizijos energija 2.5 V

MS registravimo dažnis 2 spektrai/s

MS/MS ribos MS: 100 – 1700 m/z

MS/MS: 100 – 1700 m/z

MS/MS registravimo dažnis MS: spektrai/s

MS/MS: 3 spektrai/s, Auto MS/MS

Izoliavimo plotis Siauras (~1.3 m/z)

Kolizijos energija 0 – 20 V

Etaloninė masė (+): 121.050873 ir 922.009798

Instrumento režimas Didelės raiškos režimas (4 GHz)

40

• Agilent Mass Profiler (MP) B.07.01;

• Agilent MassHunter Molecular Structure Correlator (MSC) B.07.00;

SC–MS metabolinio tyrimo eiga:

7.4.2 Šiluminio žemėlapio ir metabolinių kelių sudarymas

Šiluminis žemėlapis buvo sudarytas atviro programinio R kodo XCMS moduliu. Atrinkti didžiausią

metabolinį poveikį sukėlę sintetiniai junginiai ir atlikta neigiamos kontrolinės grupės ir tiriamojo bandinio

daugiagrupinė analizė. Metabolitai dendrogramoje suskirstyti į klusterius pagal m/z reikšmę, sulaikymo laiką

ir Pirsono koreliacijos koeficientą. Spalvų reikšmės rodo metabolinį pokytį skirtingose bandinio ir kontrolės

grupėse.

1 2 3 4 5

MS duomenų surinkimas metabolinio

profiliavimo tyrimui (TOF)

Junginio savybių nustatymas (Profinder)

Diferencinė analizė (MP)

MS/MS duomenų surinkimas identifikavimui (Q–TOF)

Identifikacija (Qual ir MSC)

4 pav. Metabolinio tyrimo eigos schema:

Didelės raiškos Q – TOF SC – MS metabolominio profiliavimo tyrimui buvo pasirinktos S. aureus

rūšies bakterijos, esančios ankstyvoje stacionarioje fazėje.

41

7.4.3 Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta pagal dvimatę (2D) pagrindinių komponenčių teorija. Metabolitų atrankos ir

pokyčio patikimumas yra p

42

Spėjamam aktyvumui nustatyti naudojamas GlideDocking modulis. Trimatėje struktūroje nustatoma

baltymo aktyvioji sritis ir vykdomas jos nuskaitymas. Po to erdvėje modeliuojami sudarytų ligandų modeliai.

Jie išdėstomi skirtingomis pozomis, kaskart įvertinant galimas sąveikas tarp ligando ir baltymo. Modeliuotų

ligandų energijos kiekis užrašomas „GScore“ rezultato lange.

43

8. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

8.1 Cheminė junginių sintezė

Sintezuotas 21 junginys su pakaitais 2 ir 5 padėtyse. Optimizuotos reakcijos sąlygos į antrąją padėtį

pateiktos 5 lentelėje.

5 lentelė. Reakcijos į antrąją imidazolin-4-ono padėtį reakcijos sąlygų optimizavimas.

Tirpiklis

Katalizatorius

Etanolis Acetonitrilas

Šildymas Ultragarsas Šildymas Ultragarsas

Kalio acetatas 51,14 proc. 82,45 proc. 43,62 proc. 65,17 proc.

Natrio acetatas 22,15 proc. 57,16 proc. 17,19 proc. 39,19 proc.

Natrio acetato trihidratas - - - -

DIEA 10,15 proc. 7,86 proc. 15,13 proc. 4,57 proc.

Piridinas - - - -

Kontrolė (- katalizatorius) - - - -

8.2 Junginių analizė

8.2.1 FT – IR spektroskopija

Sintetinti EK junginiai reakcijos eigos monitoravimui ir junginių struktūrinis tapatumas įrodomas

FT-IR spektroskopijos metodu. Junginių struktūra patvirtinama keliais būdais: užregistruotos spektrų smailės

identifikuojamos pagal funkcines grupes bei atliekant palyginamąją analizę su pradiniais sintezės reagentais

„pirštų antspaudų“ regione. Toliau spektro tapatumas yra tikrinamas su Sigma Aldrich junginių bibliotekoje.

EK14 junginyje (5 pav.) yra stebima charakteringa antrinė aminogrupė, kuri susidaro iš aminorūgšties valino,

kai pastarasis atlieka nukleofilinės substitucijos ataką į antrąją imidazolin-4-ono žiedo padėtį. Abiejuose

spektruose amino funkcinės grupių smailės tame pačiame regione (3278 cm-1, 94,185 proc. T, 1590,7 cm-1,

79,348 proc. T). Stebima karbonilo (1753,2 cm-1, 65,733 proc. T) ir amidinė grupės (1688 cm-1, 61,185 proc.

T). Matomi aromatinio žiedo virpesiai ties (1574,3 cm-1, 67,171 proc. T, 1415,6 cm-1, 87,45 proc. T), o

44

karboksilo grupė prie (1385,6 cm-1, 76,253 proc. T). Raudona spalva pažymėtas suintegruotas plotas rodo

valino rūgštinės liekanos hidroksilo funkcinę grupę. Kita vertus, atskylant merkapto radikalui nebėra matoma

tiokarbonilinės grupės spektriniai virpesiai. Kiti sintetiniai junginiai yra išanalizuoti analogišku būdu.

8.2.2 SC – MS analizė

Susintetintų EK junginių elementinė sudėtis patvirtinama SC – MS QTOF analizės metodu.

Kiekvienas sintetinis junginys, pagal izotopinį cheminių elementų pasiskirstymą, turi charakte

optimizavimas, analizĖ ir metabolominiŲ pokyČiŲ · raktiniai žodžiai: metabolomika, s....

Documents