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GeneArtTM人工遺伝子合成 ご注文マニュアル

2015年8月版

Option 1_ダイレクトクローニング・サブクローニング・プラスミド精製サービス

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目次

ダイレクトクローニングサービス・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P3 サブクローニングサービスの特徴・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P5 サブクローニングサービスの注意点・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P6 設定手順（フローチャート） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P7 設定の開始・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P8 サブクローニング情報の入力（ベクターリスト） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P9 サブクローニング情報の入力（リストにあるベクター） ・・・・・・・・・・・・・・・P10 サブクローニング情報の入力（リストにないベクター ） ・・・・・・・・・・・・・・P12 設定内容の確認・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P16 設定終了・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P17 クローニング用ベクターのご提供方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P18 プラスミド精製サービス・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P23

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ダイレクトクローニングサービスとは、、、

• 人工合成した遺伝子を発現ベクターへ直接クローニングします。pMXベクターにはクローニングしません。

• 製造日数を4営業日削減できます。

• 人工遺伝子合成・サブクローニングのサービス同様、本サービスでもインサートの配列確認を行います。

• ポータルサイトでご注文できます。

• 納品物は発現ベクター上の人工合成遺伝子になります。pMXベクター上のものはありません。

• 本サービス利用可能な遺伝子は4 Kb未満であり、合成難易度の高い配列を含まないものになります。（コドン最適化で合成難易度の高い配列を解消することができます）

• 本サービスをご利用できない場合は、通常のサブクローニングをご利用ください

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人工遺伝子合成「1.配列の入力」タブで、「エクスプレスクローニングサービス（ダイレクトクローニングサービスのことです）」にチェックを入れてください。続いてドロップダウンリストからご希望のベクターをご選択ください。 また適切な付加配列をご選択ください。 注意！合成予定配列の長さ・合成難易度等によっては本サービスを利用できない場合があります。その場合は、エラーメッセージに従って、配列の編集・修正・コドン最適化を行って下さい。それでもご利用いただけない場合は、チェックを外し、通常のサブクローニングとしてご注文下さい。

ダイレクトクローニングサービスご注文方法

ご選択可能なベクターの種類 No. ベクター 生物種 プロモーター タグ

安定株樹立用の選択マーカー

誘導因子 プラスミド選択用のマーカー N末端タグ C末端タグ

1 pcDNA3.3-TOPO 哺乳類 CMV なし Neomycin none Ampicillin none none

2 pcDNA3.4-TOPO 哺乳類 CMV なし Neomycin none Ampicillin none none

3 pET100/D-TOPO 大腸菌 T7 & lac operator N末6xHis & Xpress none IPTG Ampicillin 6xHis & Xpress none

4 pET151/D-TOPO 大腸菌 T7 & lac operator N末6xHis & V5 none IPTG Ampicillin 6xHis & V5 none

5 pRSET A 大腸菌 T7 N末6xHis & Xpress none IPTG Ampicillin 6xHis & Xpress none

6 pFastBac1 昆虫バキュロウイルス Polyhedrin なし none none Ampicillin & Gentamicin none none

7 pYes2.1V5-His TOPO 出芽酵母 GAL1 C末V5 & 6xHis URA3 galactose Ampicillin none V5 & 6xHis

8 pcDNA3.1（+） 哺乳類 CMV なし Neomycin none Ampicillin none none

9 pDONR221 なし なし なし none none Kanamycin none none

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サブクローニングサービスの特徴

① 弊社標準ベクター上の人工遺伝子合成産物を、お客様ご希望のベクターにサブクロ

ーニングします。

② 制限酵素・Gateway対応ベクターへのサブクローニングが可能です。

③ Gateway 対応ベクターへのサブクローニングを行うため、合成予定配列へのattB配

列の付加、pDONR221・pDONR_zeoベクターへのサブクローニングをオンラインオーダ

ーサイトで設定できます。

④ サブクローニング後もインサートの全塩基配列を確認します。

⑤ 弊社製品のベクターは当方で用意します。お客様の方でご購入いただく必要はあり

ません。

⑥ 弊社製品以外のベクターはご提供ください。GeneArtで登録し保管します。一度登録

しますと、次回以降は保管したベクターを利用しますので、再度ご提供いただく必要

はありません。

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サブクローニングサービスの注意点

① 制限酵素サイトは5’側、3’側で異なるものを選択して下さい。

② クローニング方法は制限酵素＆ライゲーションかGateway組換え反応になります。他

の方法には対応しておりません。

③ 弊社製品のTOPOベクター、Multi-site Gatewayベクター、SeamLess用ベクターには対

応しておりません。

④ ベクターを登録後、サブクローニングの作業を開始します。ベクターのご提供時期に

よっては納期が変わることがありますので、予めご了承ください。

⑤ 一部のベクターでは事前にお客様ご登録等が必要となります。弊社製品ページで事

前登録の有無をご確認いただき、必要なお手続き後にご依頼ください。

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設定手順（フローチャート）

サブクローニングの設定手順はご利用予定のベクターによって異なります。以下のフローチャートをご参照ください。

サブクローニング用ベクターの種類

インビトロジェン製品 （TOPOベクター、キット構成品は除く）

（弊社で用意しますが、時間がかかる場合があります。）

インビトロジェン改変ベクター・弊社以外の製品（ご提供下さい）

リストから選択 リストのCustom vectorを選択

リストのCustom vectorを選択

リストにある リストにない

ベクター名を入力

ベクター名を入力

未登録 登録済み

I will provide

を選択 Already at

GeneArt

ＧＥＮＥＡＲＴ を選択

ベクター全配列等、その他必要な情報を入力し、「保存」をクリックする

ご質問・ご要望欄にもベクター名と製品番号を入力

ベクターのIDも入力 Already at ＧＥＮＥＡＲＴを選択

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設定の開始

サブクローニングサービスの内容を設定するには、追加したアイコンをクリックして、開始します。

クリックして サービス内容の設定を開始します。

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サブクローニングに必要な情報を入力します。まずベクターリストからご希望のベクターを選択して下さい。ご希望の物がない場合は「Custom vector」を選択して下さい。

サブクローニング情報の入力 ベクターリスト

ベクターリスト

ベクター名 利用目的

Custom vector リストにないベクター

pRSET A-C 大腸菌発現

pBAD/His A-C 大腸菌発現

pFastBacHT A-C バキュロ／昆虫細胞発現

pFastBac 1 バキュロ／昆虫細胞発現

pPICZa A-C* ピキア酵母発現

pYES2 出芽酵母発現

pcDNA3.1(+) /Hygro/Zeo 哺乳類培養細胞発現

pcDNA5FRT* Flp-In安定株作製

pDONR221/pDONR_zeo エントリークローン作製

*ライセンス/同意書登録必須

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リストにあるベクターを選択すると、自動的に必要事項が入力されます。ここではpcDNA3.1(+)を選択しています。

ご希望のサンプル名（プラスミド名）を入力して下さい。

サブクローニング情報の入力 リストにあるベクター(1)

サブクローニング後のサンプル名を入力して下さい。

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ご希望のクローニング方法を選択して下さい。通常、長いベクター断片に人工遺伝子合成断片をクローニングする方が自動的に選択されます。

入力が終わりましたら、「サブクローニングの概要」タブをクリックして下さい。

サブクローニング情報の入力 リストにあるベクター(2)

青：人工遺伝子合成由来の断片 グレー：ベクター由来の断片

ご質問・ご要望はこちらを クリックして入力して下さい。

クリック！

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「Custom vector」を選択し、赤枠の情報を入力して下さい。

弊社ベクターは弊社で用意します。その他のベクターはご提供下さい。

サブクローニング情報の入力 リストにないベクター(1)

※ベクターご提供の有無とベクター名について、2ページ後に詳細な説明があります。

※

※

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ご希望のクローニング方法を選択して下さい。通常、長いベクター断片に人工遺伝子合成断片をクローニングする方が自動的に選択されます。

入力が終わりましたら、サブクローニングの概要をクリックして下さい。

サブクローニング情報の入力 リストにないベクター(2)

青：人工遺伝子合成由来の断片 グレー：ベクター由来の断片

こちらをクリックしてベクター名とカタログ番号を入力して下さい。 2ページ後に詳細な説明があります。

クリック！

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すでにベクターを登録済みの場合は、ベクター名と発行されたIDを入力して下さい。Plasmid Shipment Formに記載があります。（ベクター名_A111の場合、A111がIDです。)

リストにないベクターの場合、ベクターご提供の有無を選択します。

• 弊社製品の改変ベクターや弊社以外の製品を、お客様からご提供いただく場合

→I will provide

• 弊社ベクターをご利用の場合、またはGeneArt®にご登録済みベクターを再利用する場合

→Already at GENEART

サブクローニング情報の入力 リストにないベクター(3)

例：pXXX_A111

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リストにない弊社製品ベクターをご希望の場合、ご質問･ご要望欄にベクター名と製品番号をご記入下さい。下記例文をご利用下さい。

例： Please use an Invitrogen vector, the name XXX and the catalog number YYY.

リストにないベクターをご希望の場合、GeneArt担当者による確認が必要となり、追加料金（1塩基あたり3円）が発生します。

サブクローニング情報の入力 リストにないベクター(4)

▼を右向きにすると入力欄が現れます。

ベクター名と製品 番号をご記入下さい

ライフクテノロジーズのホームページから検索すると、より詳細なベクター情報が得られます。

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「サブクローニングの概要」で、設定した内容を確認できます。

確認後、よろしければ「保存」をクリックして下さい。

修正する場合は「サブクローニング情報の入力」タブをクリックし、修正して下さい。

設定内容の確認

クリック！

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サブクローニングサービス 設定終了

サブクローニングサービスの設定が終了しました。アイコン内の緑色のチェックマークは、必要な情報が全て入力されたことを表しています。

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クローニング用ベクターのご提供方法(1)

ベクターをご提供頂く場合、羽田事業所サービスラボにご送付下さい。

プラスミド量は10ug以上、（濃度0.1ug/uL以上）ご提供下さい。

郵送する際は下記の様に記載・署名済みのPlasmidShipmentFormの原本を同封して下さい。Formは弊社から提供します。(次ページに続く）

通常ベクター全塩基配列をご提供済みなので、チェックを入れて下さい。

ご提供頂くベクターのバイオセーフティレベル（3ページ後に掲

載）を人工遺伝子合成と同様に選択して下さい。

ベクター名_IDです。

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クローニング用ベクターのご提供方法(2)

郵送する際は下記の様に記載・署名済みのPlasmidShipmentFormの原本を同封して下さい。 Formは弊社から提供します。(前ページからの続き)

ベクターに関して特記事項があれば、英語で記載して下さい。

全ての入力情報は正しく、全ての事項に同意・承認いただけましたら、署名して下さい。

3.Liability Limitation（免責事項、3ページ後に掲載）に同意いただきましたら、署名して下さい。

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クローニング用ベクターのご提供方法(3)

配送先住所はこちらになります。

〒143-0004 東京都大田区昭和島2-4-3

ライフテクノロジーズジャパン株式会社 羽田事業所 3F サービスラボ Tel : 03-5753-3006

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Webオーダーポータル上のドロップダウンメニューで、顧客がバイオセーフティレベル1またはバイオセーフティレベル2のいずれを選択するかにかかわらず、顧客は対象DNAを、適用される国内法令および国際法令（ドイツ遺伝子工学法（「Gentechnikgesetz」）およびドイツ生物学的安全中央委員会（「ZKBS」）のステートメント（随時の修正を含む）を含むが、これらに限られない）に必ず従って使用することを、ここに確認する。

注：顧客の選択にかかわらず、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社は、バイオセーフティ評価を行う。顧客がバイオセーフティレベル1を選択したが、ライフテクノロジーズ・コーポレーションまたはその関連会社による評価では、依頼されたDNAがバイオセーフティレベル2を要するとされた場合、顧客は、バイオセーフティレベル2の要件に従って修正した見積書を送付し、審査を受ける。

Webオーダーポータル上のドロップダウンメニューで、顧客がバイオセーフティレベル2を選択した場合には、顧客がライフテクノロジーズ・コーポレーションまたはその関連会社に発注した各注文に基づき作成を依頼したDNA（各注文に基づく顧客のためのライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社によるサービスの遂行中に受け取ったプラスミド、核酸配列、アミノ酸配列および／または中間体、ならびに顧客のためのライフテクノロジーズおよび／またはその関連会社によるサービスの遂行により得られた最終成果物を含むが、これらに限られない）（「対象DNA」）は、バイオセーフティレベル1の環境で取り扱うことができること、また、当該対象DNAの作成、取扱いおよび発送には、特別な安全対策を要しないことを、顧客はここに、さらに確認する。この場合、顧客は、対象DNAをライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に提供した時点において顧客が実際に知っていたすべての関連する物質取扱い情報を、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に提供する。

上記にかかわらず、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社は、顧客に交付した注文確認書を、バイオセーフティ上の理由により、いつでも撤回することができ、これにより顧客に対して責任を負うことはないものとする。

Biosafety Confirmation / バイオセーフティ確認書

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Liability Limitation/免責事項

本件サービス（遺伝子合成、サブクローニング、プラスミド作製、遺伝子変異／配列置換、遺伝子ライブラリーの作製およびタンパク質生成を含むが、これらに限られない（総称して「サービス」という））は、顧客のためのみに遂行される。顧客は、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に発注した各購入注文に基づきライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に交付した物質（プラスミド、核酸配列、細胞株、細菌、ウイルスを含むが、これらに限られない）（総称して「対象物質」という）を、顧客が使用し、かつ、第三者に使用させる権利を有すること、また、かかる権利には、特に、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社をして、顧客のために対象物質について本件サービスを遂行させることが含まれることを、ここに確認する。顧客は、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよびその関連会社が、この点について責任を否認すること（ただし、下記の最後の段落を前提とする）に、ここに同意する。

また、顧客は、顧客のために本件サービスを遂行させる目的でライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に対象物質を使用させる権利に関する顧客の過失または故意の不正行為に起因して、第三者から提起された請求、訴訟、手続きまたは調査から生じた一切の費用、損失、請求、損害、経費（合理的な弁護士費用を含む）および債務について、ライフテクノロジーズ・コーポレーションならびにその関連会社、役員および従業員および代理人を、補償し、防御し、免責するとともに、これらに損失を与えないことに、ここに同意する。

上記のライフテクノロジーおよびその関連会社の責任の制限は、(i)製造物責任法に基づく責任、(ii)ライフテクノロジー・コーポレーションおよび／またはその関連会社、これらの役員、従業員または代理人の過失または故意に起因する死亡、人身被害または人の健康被害、(iii)ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社、これらの役員、従業員または代理人の重大な過失または故意による作為または不作為、または(iv)顧客との各契約の履行にとって不可欠であって、顧客が正当に依拠している契約上の義務が、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社、これらの役員、従業員または代理人の過失に起因して違反された場合には、適用されないものとする。

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プラスミド精製サービス 設定の開始

プラスミド精製サービスの内容を設定するには、追加したアイコンをクリックして、開始します。

クリックして

サービス内容の設定を開始します。

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プラスミド精製 培養スケールとバッファーの選択

ご希望の培養スケールとバッファーを選択します。

精製はトランスフェクショングレードです。

>250mLは低エンドトキシン（

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プラスミド精製サービス 設定終了

プラスミド精製サービスの設定が終了しました。アイコン内の緑色のチェックマークは、必要な情報が全て入力されたことを表しています。