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GeneArtTM人工遺伝子合成 ご注文マニュアル

2015年8月版

Step 2_人工遺伝子合成サービス

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目次

人工遺伝子合成サービス設定の開始・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P3

１．配列の入力・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P4

２．配列の編集・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P9

３．配列の最適化・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P19

配列の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P25

設定終了・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P29

複数の人工遺伝子合成配列情報の入力方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P30

Large Order Assistantの利用・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・P31

設定済みサービスの複製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P32

個別入力・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・P33

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人工遺伝子合成サービス設定の開始

人工遺伝子合成サービスの内容を設定するには、追加したアイコンをクリックして開始します。

クリックして

サービス内容の設定を開始します。

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配列情報を入力します。サンプル名、配列の種類、配列（塩基配列・アミノ酸配列）、生物学的安全性レベルを入力します。

入力した配列を編集・最適化することなく、そのまま合成をご希望の方は配列の概要へ進み、内容を確認後、「保存」をクリックして下さい。

「*」で示されているのは必須入力項目です。

1. 配列の入力 必須項目の入力

赤枠内の情報を入力します。配列の種類はDNAかアミノ酸配列のどちらか一種類を入力し、選択します。

Biosafety Confirmation

の日本語訳が次ページにあります。

塩基配列かアミノ酸配列の一種類を入力 サンプル名

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Webオーダーポータル上のドロップダウンメニューで、顧客がバイオセーフティレベル1またはバイオセーフティレベル2のいずれを選択するかにかかわらず、顧客は対象DNAを、適用される国内法令および国際法令（ドイツ遺伝子工学法（「Gentechnikgesetz」）およびドイツ生物学的安全中央委員会（「ZKBS」）のステートメント（随時の修正を含む）を含むが、これらに限られない）に必ず従って使用することを、ここに確認する。

注：顧客の選択にかかわらず、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社は、バイオセーフティ評価を行う。顧客がバイオセーフティレベル1を選択したが、ライフテクノロジーズ・コーポレーションまたはその関連会社による評価では、依頼されたDNAがバイオセーフティレベル2を要するとされた場合、顧客は、バイオセーフティレベル2の要件に従って修正した見積書を送付し、審査を受ける。

Webオーダーポータル上のドロップダウンメニューで、顧客がバイオセーフティレベル2を選択した場合には、顧客がライフテクノロジーズ・コーポレーションまたはその関連会社に発注した各注文に基づき作成を依頼したDNA

（各注文に基づく顧客のためのライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社によるサービスの遂行中に受け取ったプラスミド、核酸配列、アミノ酸配列および／または中間体、ならびに顧客のためのライフテクノロジーズおよび／またはその関連会社によるサービスの遂行により得られた最終成果物を含むが、これらに限られない）（「対象DNA」）は、バイオセーフティレベル1の環境で取り扱うことができること、また、当該対象DNAの作成、取扱いおよび発送には、特別な安全対策を要しないことを、顧客はここに、さらに確認する。この場合、顧客は、対象DNAをライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に

提供した時点において顧客が実際に知っていたすべての関連する物質取扱い情報を、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社に提供する。

上記にかかわらず、ライフテクノロジーズ・コーポレーションおよび／またはその関連会社は、顧客に交付した注文確認書を、バイオセーフティ上の理由により、いつでも撤回することができ、これにより顧客に対して責任を負うことはないものとする。

Biosafety Confirmation / バイオセーフティ確認書

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1. 配列の入力 オプション１

標準のクローニングベクターの場合、薬剤耐性マーカー指定無しは無料になります。アンピシリン・カナマイシンを指定する場合、追加料金（￥7,000）が必要となります。

エクスプレスクローニングサービスでは、発現ベクターに直接クローニングできます。詳細は次ページをご参照ください。

TSE-Freeでは、TSE（伝染性海綿状脳症因子）を含まない培地とプレートを用いて全ての実験を行います。最終納品物にはTSE-Freeの証明書が付きます。

合成予定配列が薬剤耐性遺伝子、ori（複製起点）、毒性遺伝子を含む場合、該当する事項を選択してください。

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エクスプレスクローニングサービスにチェックを入れてください。続いてドロップダウンリストからご希望のベクターをご選択ください。 また適切な付加配列をご選択ください。

注意！合成予定配列の長さ・合成難易度等によっては本サービスを利用できない場合があります。その場合は、エラーメッセージに従って、配列の編集・修正・コドン最適化を行って下さい。それでもご利用いただけない場合は、チェックを外し、通常のサブクローニングとしてご注文ください。

1. 配列の入力 オプション2

ご選択可能なベクターの種類

No. ベクター 生物種 プロモーター タグ 安定株樹立用の選択

マーカー 誘導因子 プラスミド選択用のマーカー N末端タグ C末端タグ

1 pcDNA3.3-TOPO 哺乳類 CMV なし Neomycin none Ampicillin none none

2 pcDNA3.4-TOPO 哺乳類 CMV なし Neomycin none Ampicillin none none

3 pET100/D-TOPO 大腸菌 T7 & lac operator N末6xHis & Xpress none IPTG Ampicillin 6xHis & Xpress none

4 pET151/D-TOPO 大腸菌 T7 & lac operator N末6xHis & V5 none IPTG Ampicillin 6xHis & V5 none

5 pRSET A 大腸菌 T7 N末6xHis & Xpress none IPTG Ampicillin 6xHis & Xpress none

6 pFastBac1 昆虫バキュロウイルス Polyhedrin なし none none Ampicillin & Gentamicin none none

7 pYes2.1V5-His TOPO 出芽酵母 GAL1 C末V5 & 6xHis URA3 galactose Ampicillin none V5 & 6xHis

8 pcDNA3.1（+） 哺乳類 CMV なし Neomycin none Ampicillin none none

9 pDONR221 なし なし なし none none Kanamycin none none

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1. 配列の入力 オプション3

ご質問・ご要望をここに英語で入力します （有料、日本語不可）

ご質問･ご要望を入力する際は左枠にチェックを入れて下さい。入力画面が現れます。入力は英語でのみ可能です。なお入力するとGeneArt担当者の確認が必要となり、追加料金が発生します。必要な方のみ入力して下さい。

追加サービスでは、人工遺伝子合成と組み合わせるサービスを選択します。例えばサブクローニングを選択すると、人工合成した遺伝子を、別なベクターにサブクローニングできます。なお、すでにプロジェクト内のドラッグ＆ドロップで追加済みの場合は不要です。

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「ORF」では、コドン最適化の対象領域であるORFを選択します。自動処理により複数のORF候補が表示されます。ご希望のORFにチェックを入れて選択します。なお最適化を行わない場合はORFを選択する必要はありません。

2. 配列の編集 ORF候補の選択

チェックを入れた領域が水色で表示されます。

最適化を行うORF領域にチェックを入れて選択します。

選択したORFは Feature Mapに表示されます。

ここをクリックすると、他のORF候補が表示されます。

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2. 配列の編集 任意のORFの選択

右タブの「ORFの指定」をクリックすると、任意のORF領域を指定できます。

最適化を行わない場合はORFを選択する必要はありません。

クリックすると、任意のORF領域を指定できます。

最初と最後の位置を指定し、「適用」をクリックします。

指定した領域が水色で表示されます。

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2. 配列の編集 5’付加配列 制限酵素配列（1） 5’側のクローニング用制限酵素認識配列や付加配列を指定します。すでに

付加してある場合、候補が自動的に表示されます。もし、ご希望のものが表示されていない場合は、「新規配列の付加」をクリックします。 新しい画面が現れます

候補がここに表示されます。本画面ではまだ付加されていないので、表示されません。

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2. 配列の編集 5’付加配列 制限酵素配列（2） 新しい画面で ドロップダウンリストをクリックします。制限酵素やatt配列のリストが開きます。ご希望のものを選択し、「配列の付加」をクリックします。

BamHIを選択し、開始コドンのAにあたる1番目の塩基の前に付加します。

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2. 配列の編集 5’付加配列 制限酵素配列（3）

付加したBamHIは黄色の背景と赤線で表示されます。最適化配列から自動

的に除外されます。また保護の設定がされるので、最適化を行っても配列は変更されません。

自動的に保護されます

赤線と黄色の背景で表示されます

自動的に除外されます

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リストにない任意の配列を付加する場合には、付加する位置と配列を入力し、「配列の付加」をクリックして下さい。

例として、開始コドンのAの前に、GCCACCを付加します。

2. 配列の編集 5’付加配列 任意の配列の付加

１．付加配列（GCCACC)と付加部位（開始コドンのA）を入力し、「配列の付加」ボタンをクリックします。

２．開始コドンの前にGCCACCが挿入されます

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2. 配列の編集 3’付加配列

3’側の付加配列を選択し、挿入します。方法は5’付加配列と同じです。例として、Eco RIを1147番目の塩基の前に挿入します。

赤線と黄色の背景で表示されます

自動的に保護されます 自動的に除外されます

EcoRIを選択し、ストップ

コドンの直後になる1147番目の前に付加します。

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左のタブは塩基の挿入です。ご希望の配列を挿入します。なお赤線で示されている付加配列は修正できません。修正する場合は設定した画面に戻って行って下さい。

挿入後にUndoのやり直しはできません。削除タブで挿入配列を削除してください。さらに修正時にBackSpaceキーを押さないで下さい。画面が消えてしまいます。

2. 配列の編集 配列の挿入

挿入位置と挿入用の塩基配列を入力し、「挿入」をクリックします。

ここに挿入配列を入力します

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2. 配列の編集 配列の削除

中央のタブは塩基の削除です。ご希望の範囲を指定し、削除します。なお赤線で示されている付加配列は修正できません。修正する場合は設定した画面に戻って行って下さい。

削除後にUndoのやり直しはできません。挿入タブで削除した配列を挿入してください。さらに修正時にBackSpaceキーを押さないで下さい。画面が消えてしまいます。

削除する範囲を入力し、「削除」をクリックします。

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2. 配列の編集 コドンとアミノ酸の置換

右のタブはコドンとアミノ酸置換用の画面です。希望のアミノ酸部位を指定し、ドロップダウンリストから選択します。なお赤線で示されている付加配列は修正できません。修正する場合は設定した画面に戻って行って下さい。

修正後にUndoのやり直しはできません。さらに修正時にBackSpaceキーを押さないで下さい。画面が消えてしまいます。

リストから候補を選択し、「置換」をクリックします。

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3. 配列の最適化 制限酵素認識配列の保護

最適化で保護する配列を選択します。保護する塩基配列は最適化後も変更ありません。検出されたものが自動的に表示されます。

候補配列が表示されない場合は「+表示範囲を広げる」をクリックして下さい。

リストに表示されない配列を保護する場合は、「任意の配列の保護」をクリックして下さい。

チェックを入れて選択します。

保護する配列は、Feature Mapに表示されます。

保護した制限酵素認識配列は、赤線で表示されます。

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3. 配列の最適化 任意の配列の保護

最適化で任意の配列を保護する場合は、その範囲を入力し、「保護」をクリックします。保護した範囲の塩基配列は最適化後も変更ありません。

保護した範囲の配列は、Feature Mapに表示され

ます。

保護した範囲の配列は、赤線で表示されます。 最初と最後の位置を入

力し、「保護」をクリックします。

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3. 配列の最適化 除外する制限酵素配列

最適化後の配列中に含めたくない配列を、リストの中から選択します。

リストは部分表示されています。全表示するには一番下にある「+表示範囲を広げる」をクリックして下さい。

リストにない任意の配列を除外する場合は、右タブの「任意の配列」をクリックして下さい。

チェックを入れて選択します。

除外する配列は、Feature Mapに表示されます。

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3. 配列の最適化 除外する任意の配列

最適化後に含みたくない任意の配列を指定します。配列の名前と配列を入力し、「除外する」をクリックします。除外した配列は最適化後の配列には含まれません。

除外する配列は、Feature Mapに表示されます。

配列の名前と配列を入力し、「除外する」をクリックします。

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最適化タブを開き、コドン最適化用生物種のドロップダウンリストから、ご希望の生物種を選択します。ご希望のものがない場合は、一番下にある「Other

」を選択します。専用入力枠が現れるので、そこに学名を入力します。最適化を希望しない場合は「Non optimized」を選択します。生物種を選択し、「最適化」をクリックすると、自動的に開始します。

3. 配列の最適化 生物種の選択と最適化の実行

ご希望の生物種を選択します

最適化タブを開き、コドン最適化用生物種のリストを

開きます。

青くなった「最適化」ボタンをクリックして最適化を開始します

。

生物種によってはコザック配列を付加できます。

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リストにある生物種の一般名と付加できるコザック配列は下記の一覧表を参照して下さい。

3. 配列の最適化 コドン最適化用生物種一覧表

学名 一般名 +コザック配列 Non optimized 最適化なし なし Arabidopsis thaliana シロイヌナズナ なし

Bacillus subtilis 枯草菌 なし Bos taurus 牛 GCCACC Brassica napus セイヨウアブラナ なし Caenorhabditis elegans 線虫（C.elegans) なし Caulobacter crescentus CB15 C. crescentus CB15株 なし

Chlamydomonas reinharditii クラミドモナス（Engineering Kits, A14258） なし Cricetulus griseus チャイニーズハムスター、CHO細胞 GCCACC Drosophila melanogaster キイロショウジョウバエ GCCACC Escherichia coli 大腸菌 なし Glycine max 大豆 なし

Homo sapiens ヒト GCCACC Hordeum vulgare 大麦 なし

Lycopersicon esculentum トマト なし Mus musculs マウス GCCACC Nicotiana benthamiana ベンサミアナタバコ なし

Nicotiana tabacum タバコ なし Olyctolagus cuniculus ウサギ GCCACC

Oryza sativa イネ なし Pichia pastoris ピキア酵母 AAAA Saccharomyces cerevisiae 出芽酵母 AAAA Schizosaccharomyces pombe 分裂酵母 AAAA Spodoptera frugiperda ヨトウガ、Sf9細胞、Sf21細胞 GCCACC Synechococcus elongatus シアノバクテリア（Engineering Kits, A14259） なし Vaccinia virus ワクシニアウイルス なし

Zea mays トウモロコシ なし Other その他 なし

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配列の概要 合成予定配列の確認

配列の概要で、合成予定配列の内容と解析結果を確認できます。最適化した場合は最適化配列が表示されます。また解析結果と塩基配列をダウンロードできます。解析結果はCodon Quality Distribution、Codon Quality Plot、GC Contentが示されます。問題がなければ「保存」をクリックして下さい。

解析結果、合成予定塩基配列をダウンロードできます。

クリック！

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配列の概要 最適化後の解析結果(1)

青：最適化前 黄：最適化後

「Codon Quality Distribution」 では、コドンクオリティーに基づくコドンの割合が

示されています。コドンクオリティーの値は、各アミノ酸で最も使用頻度の高いコドンを100に設定し、他のコドンをそれに応じて相対的に設定したものです。青が最適化前で黄色が最適化後です。

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配列の概要 最適化後の解析結果(2)

青：最適化前 黄：最適化後

「Codon Quality Plot」では、塩基配列の各ポジションにおけるコドンクオリティ

ーを示してます。コドンクオリティーの値は、各アミノ酸で最も使用頻度の高いコドンを100に設定し、他のコドンをそれに応じて相対的に設定したものです。青が最適化前で黄色が最適化後です。

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配列の概要 最適化後の解析結果(3)

青：最適化前 黄：最適化後

「GC Content」では、各ポジションの前後20bpから成る40bpのGC含量を示してます。青が最適化前で黄色が最適化後です。

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人工遺伝子合成サービス 設定終了

人工遺伝子合成サービスの設定が終了しました。アイコン内の緑色のチェックマークは、必要な情報が全て入力されたことを表しています。

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複数の人工遺伝子合成配列情報の入力方法

複数の人工遺伝子合成の配列情報を入力するには、次の方法があります。

1. Large Order Assistantの利用

2. 設定済みサービスの複製

3. 個別入力

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１．Large Order Assistantの利用

Large Order Assistantを利用すると、最大50本の配列を一度に入力できます。

Large Order Assistant

アイコンをドラッグ＆ドロップします。

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２．設定済みサービスの複製

1. 人工遺伝子合成サービスを設定します。

2. 編集メニューからコピーを選択します。

3. 「新規ターゲットの追加」を開き、「ここにドロップ、、」の編集メニューから貼り付けを選択します。

4. 同じサービス内容が複製されます。

5. ２ 配列の編集を利用して、修正・変更します。

A.赤枠の上にマウスを重ねます

B.編集メニューが現れます

C.「コピー」を選択します

D.「ここにドロッ

プ、、」の編集メニューから「貼り付け」を選択します。

E.同じ設定内容の

アイコンが複製されました。ご希望に応じて修正・変更します。

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３．個別入力

Gene Synthesisのアイコンを本数分ドラッグ＆ドロップします。

ターゲットごとに配列情報等を入力します。

ご希望の本数分（ここでは2本なので2回）ドラッグ＆ドロップします。

ターゲットごとに入力します