Őssejtek (2)

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

ŐSSEJTEK (2)


Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 3. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Köldökzsinórvér-őssejtek (CBE)

• Kb. 130 millió gyermek születik évente – a regeneratív gyógyászat számára a köldökzsinórvér jelenti a legnagyobb potenciális őssejt-forrást

• Az elmúlt 36 évben több, mint 10000 beteget kezeltek köldökzsinórvér-őssejtekkel

• Több, mint 80 különböző betegség kezelésére alkalmaztak köldökzsinórvér eredetű őssejteket

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Köldökzsinórvér-őssejtek és magzati őssejtek

Köldökzsinórvér gyűjtése (Születés után)

A köldökzsinórvér sejteket speciális

zsákban vagy kapszulában fagyasztják

le

Folyékony nitrogén tartály (-150°)

A vér vizsgálataSejt szeparáció

Keverés ésülepítés

Sejtekkoncentrálása

Sejtekfagyasztása

35 perc 10 perc

Köldökzsinórvér hozzáadása

1 2 3

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Krioprezerváció (Mélyfagyasztás)

• A primer sejtek krioprezervációja hosszú távon lehetséges (akár 20 évig)

• Az alacsony hőmérsékletet (-150-196oC) folyékony nitrogén biztosítja

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Köldökzsinórvér feldolgozása

1. Vörösvértestek eltávolítása (Ficoll, Hetastarch, Lymphoprep, Prepacyte)

2. A kisebb tárolási méret érdekében a plazma eltávolítása

3. A kinyert sejtek tesztelése (fertőzés, térfogat, cellularitás, őssejt-szám, CD34+)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Köldökzsinórvér feldolgozása és krioprezerváció• A köldökzsinórvér elsősorban hematológiai

betegségek kezelésében hasznos• A köldökzsinórvért születéskor gyűjtik• Azonnal feldolgozzák vagy tisztítás nélkül

DMSO hozzáadásával folyékony nitrogénben lefagyasztják

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Köldökzsinórvér bank

• Ideális esetben valamennyi nagyvárosban rendelkezésre áll, egy nemzetközi adatbázis-hálózathoz csatlakozik, ahol valamennyi tárolt sejt HLA-tipizálásának adatai hozzáférhetőek.

• A köldökzsinórvér hosszú távú tárolása költséges

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A köldökzsinórvér-őssejtek pluripotenciája

Köldökzsinórvér

ŐssejtekCBE MSC

Tisztítás

Endodermális Mezodermális Ektodermális

Hepatobiliáris Vér Neurális

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Őssejtpopuláció a köldökzsinórvérben

Adherens Pre-MSC MSC

Nem adherens

CBE

Lin- CD133+ CD34+

Köldökzsinórvér

Csontvelő

Perifériás vér

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek I.Onkológiai betegségek

Akut limfoid leukémia

Akut mieloid leukémia

Autoimmun limfoproliferatív betegségek

Burkitt limfóma

Krónikus mieloid leukémia

Monoszómia okozta citopénia

Familiáris hisztiocitózis

Hodgkin-kór

Juvenilis mielomonocitás leukémia

Langerhans sejtes hisztiocitózis

Mielodiszpláziás szindrómák

Non-Hodgkin limfóma

Immundeficienciák

Ataxia telangiektázia

Porc-haj hipoplázia

Krónikus granulomatózus betegség

DiGeorge szindróma

Hipogammaglobulinémia

IKK gamma deficiencia

Autoimmun poliendokrin szindróma

II-es típusú mukolipidózis

Myelokathexis

Súlyos kombinált immunhiányos betegség

Wiscott-Aldrich szindróma

X-hez kötött agammaglobulinémia, immunhiány, limfoproliferatív szindróma

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek II.Hematológiai betegségekAutoimmun neutropénia

Ciklikus neutropénia

Diamond Blackfran anémia

Evan szindróma

Vörösvértest aplázia

Refrakter anémia

Súlyos aplasztikus anémia

Sarlósejtes anémia

Thalasszémia

Fanconi anémia

Glanzmann-kór

Kongenitális szideroblasztos anémia

Juvenilis dermatomiozitisz és xanthogranulomák, stb.

Anyagcsere betegségekAdrenoleukodisztrófia

Alfa mannozidózis

I-es típusú diabétesz

Gaucher-kór

Gunther -kór

Hermansky-Pudlak szindróma

Hurler szindróma

Hurler-Scheie szindróma

Krabbe-kór

Maroteau-lamy szindróma

Metakromatikus leukodisztrófia

II-es és III-as típusú mukolipidózis

A és B típusú Neimann Pick szindróma

Sandoff szindróma

Sanfilippo szindróma

Tay Sachs betegség

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC)Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC):• Könnyen izolálható• Állandó immunfenotípus jellemzi• A csontvelői őssejtekhez (BMSC) hasonló• Multipotens• Genetikailag módosítható

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A zsírszövetek típusai

Típus Funkció

1 Csontvelői zsírszövetAzon terek kitöltése, amelyek a hemopoézisben már nem vesznek részt

2 Barna zsírszövet (BAT) Az újszülöttek létfontosságú szerveinek védelme

3 Ektópiás zsírszövetAbnormális zsír felhalmozódás a májban, a szív- és vázizomzatban (pl.: metabolikus szindrómában)

4 Emlő zsírszövete Szoptatás – energia és tápanyagforrás

5 Mechanikai zsírszövet Mechanikai traumától való védelem

6 Fehér zsírszövet (WAT)Hőszigetelés, energia raktározás, rezervoár, endokrin szerv

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Zsírszöveti őssejtek izolálása

Emésztéskollagenázzal

37oC-on, 1 óra

Stróma-vaszkulárisfrakció (SVF)

Mosás PBS-ben

Zsírsejtek leszívása

300g, 5 perc

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Pozitív markerek

Marker Név Marker Név

CD9 Tetraspan CD55 Decay accelerating factor

CD10 Közös akut limfoid leukémia antigén CD59 Protektin

CD13 Aminopeptidáz CD71 Transzferrin

CD29 b1-integrin CD73 5’-ektonukleotidáz

CD34 Szialomucin CD90 Thy1

CD44 Hialuronsav receptor CD105 Endoglin

CD49d a4-integrin CD146 Muc-18

CD54 Intracelluláris adhéziós molekula CD166 Aktivált leukocita

sejtadhéziós molekula

HLA-ABC Hisztokompatibilitási lókusz antigén-ABC a-SMA a-simaizom aktin

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Negatív markerek

Marker Név Marker Név

CD11b ab-integrin CD50 Intracelluláris adhéziós molekula-3

CD14 LPS receptor CD56 Idegsejt adhéziós molekula

CD16 Fc receptor CD62 E-szelektin

CD18 b2-integrin CD104 B4-integrin

CD45 Közös leukocita antigén HLA-DR Hisztokompatibilitási lókusz antigén-DR

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A zsírszövet eredetű őssejtek citokinprofilja

CITOKIN FUNKCIÓ

• Adiponektin• Leptin• Plazminogén aktivált inhibitor-1

Adipokinek

• Hepatocita növekedési faktor• Pigment epitél eredetű faktor• Vaszkuláris endoteliális növekedési

faktor

Angiogén

• Flt-3 ligand• GCSF• Leukémia inhibitor faktor• IL-7• MCSF

Hemopoetikus

• IL-6, IL-8, IL-11• Leukémia inhibitor faktor• TNFa

Pro-inflammatorikus

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A zsírszövet eredetű őssejtek immunogenitása• Az immunogenitás hiánya annak köszönhető,

hogy a felszínükről hiányoznak a II-es típusú fő hisztokompatibilitási antigének (HLA-DR).

• Immunszuppresszív tulajdonságuk a prosztaglandin E2 termeléshez kapcsolódik.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A zsírszövet eredetű őssejtek differenciáciálódási potenciálja• Zsírsejt• Szívizomsejtek• Porcsejtek• Endodermális és ektodermális sejtvonalak• Endotél és simaizom sejtek• Hemopoetikus sejtek• Neuronális sejtvonal• Oszteoblasztok• Harántcsíkolt izomsejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Zsírsejtekké történő differenciáció

A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS

Fehér zsírszövet Forskolin (AMP agonista) Neutrális zsírok Funkcionális zsírpárnák

Methylisobutylxanthine (AMP agonista)

Adiponektin Plasztikai sebészet

Glükokortikoid receptor ligandok (dexamethasone)

CAAT/enhancer kötő protein-a zsírsav-kötő fehérje (aP2)

Kozmetikai és helyreállító sebészet

PPAR-g2 ligandok (thiazolidinedione)

Leptin

Inzulin Lipoprotein lipáz

bFGF PPAR-g2

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szívizomsejtekké történő differenciáció


Barna zsírszövet 5-azacytadine Szarkomer aktininIschaemiás károsodás után a sérült szívizomszövet helyreállítása

Fehér zsírszövet Szívizomsejt kivonat Konnexin-43

Dezmin

troponin-I

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Porcsejtekké történő differenciáció


Csontvelői zsírszövet Aszkorbinsav Aggrecan Térd, csípő porcszövet

Barna zsírszövet Dexamethasone Kondroitin-szulfát

Fehér zsírszövet TGF-b II-es típusú kollagén

3D struktúra IV-es típusú kollagén

BMP-6Porcsejt-specifikus proteoglikánok

FGF

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Oszteocitákká történő differenciáció


Fehér zsírszövet Aszkorbinsav Oszteokalcin Csont implantáció

Csontvelői zsírszövet Dexamethasone DMP-1 Csonttörés helyreállítása

1,25-dihidroxi-kolekalciferol

Oszteoadherin

B-glicerolfoszfát

BMP-2

BMP-7

Runx2

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Harántcsíkolt izomsejtekké történő differentáció


FBS alacsony koncentrációja

myoD

Ló szérum Miogenin

Miozin könnyűlánc kináz

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Idegsejtekké történő diferenciáció


IndomethacinGliális fibrilláris savas fehérje (GFAP)

Központi idegrendszer sérülései

Inzulin Nestin

Metlizobutilxantin Intermedier filamentum

Glutamát receptor alegységek

S-100

B-III tubulin

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Differenciáció endodermális és ektodermális sejtvonalakká


Csontvelői zsírszövetHepatocita növekedési faktor

Albumin Máj

Oncostatin M A-fetoprotein

DMSO és HGF, bFGF, nicotinamid együtt

Urea

ATRA Citokeratin-18Epitél szövet helyreállítás (Crohn-betegség)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Endotél és simaizom sejtekké történő differenciáció


Fehér zsírszövet CD31 Vaszkuláris trauma

kalponin Urogenitális trauma

a-simaizom aktin

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Hemopoetikus utánpótlás


ASC-k szekretálják:IL6,IL7, IL8, IL11, SCF, TNFa, MCSF, GMCSF

CD34+ a T, NK sejteken, B-sejt markerek

Nagydózisú kemoterápiát követő hemopoetikus őssejt-helyreállítás

ŐSSEJTEK (3)


Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 4. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

ESC-k és ASC-k felhasználása

Érlumen

Vaszkulogén zóna Keringési betegségek

Génterápiák

Genetikailag módosítottőssejtek

Intravénásinjekción

Mesoderma

Szívbetegségek

CSCsPitvar nicheSzívcsúcs niche

HSCEPC MSC

OszteoblasztokPorcsejtekZsírsejtek

Mioblasztok

Közös limfoidprekurzor

NK-sejtekT-limfociták

Dendritikus sejtekB-limfociták

Közös mieloidprekurzor

Makrofágok

VérlemezkékEritrociták

MonocitákGranulociták

HSCsEndoszteum felszín nicheHajszálér hálózat niche

MSCsPerivaszkuláris felszín niche

Csont

Hemopoetikus és Immun-rendszeri megbetegedések

Endoderma

BASCsBADJ niche

Tüdőbetegségek

PSCsHasnyálmirigy-vezetékfeltételezett niche

HasnyálmirigyInzulin-termelő b-sejtek

Endokrin Langerhansszigetek

Exockrinacinusok

Cukorbetegség

MájMájsejtek

HDCsEpevezeték(Hering csatorna)

Májbetegségek

Tüdő

Ektoderma

NSCsSzubventrikuláriszóna nicheHippokampusz niche(gyrus dentalis )

Neuron Asztrocita Oligodendrocita

Agyi és gerincvelői rendellenességek

Szembetegségek

RSCsCsillós epitél niche

CESCsLimbus nicheRetina

Cornea

KSCsAlapréteg niche

bESCseNCSCs„Bulge” régió niche

SKPsTüsző papilla

Bőrbetegségek

SzívSzívizomsejtek

Embrionális fejlődés

Belső sejttömegESC

Blasztociszta

Pluripotens ESC

Mezodermális őssejtEndodermális őssejt

Ektodermálisőssejt

Hemangioblaszt

HSC EPC

Érfalban található őssejtekEPCs and MSCs

Új endotélsejt

Véráram

MakrofágVérlemezke

Eritrocita Monocita

Eozinofil

NK-sejt

T-limfocita

Dendritikus sejt B-limfocitaBazofil

Neutrofil

Media

Agy

Szem

Bőr

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Génsebészet és génátvitel ASC-k felhasználásával• ASC sejtek transzdukciója lentivirális

vektorokkal• Egyéb rekombináns virális vektorok• Nukleofekció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Az őssejt-szaporodás és differenciáció irányítására alkalmazott módszerek

A többféle méretben és típusban kapható bioreaktorok növelik a tápanyagok illetve bomlástermékek cseréjének hatékonyságát, elősegítik a növekedési faktorok transzportját, lehetővé téve a sejtkultúrák hosszú távú fenntartását, és így nagyobb sejtszám vagy nagyobb szövetméret elérését.

A „scaffold”-ok fizikai (pl.: felszíni érdesség, porozitás, stb.) és biokémiai (pl.: beágyazott növekedési faktorok szabályozott felszabadulása) sajátságai elősegítik a sejtek tapadását, toborzását, differenciálódását, illetve megkönnyíti a sejtek szállítását.

A kívánt sejtekkel vagy szövetekkel (pl.: szövetregeneráció céljára) létrehozott ko-kultúrák a közvetlen fizikai kontaktus és/vagy közvetett biokémiai jelek útján elősegíthetik a differenciációt.

A tenyésztőmédiumhoz adott különböző biokémiai faktorok (szérumot beleértve) stimulálják a differenciációt. Ehhez szükséges azon faktorok ismerete, amelyek valószínűleg elősegítik a differenciációt, ugyanakkor ritka a 100%-os hatékonyság.

Egyes specifikus sejttípusok szelekciója adhéziós assay-el specifikus ECM fehérjék vagy receptor ligandok felhasználásával a sejt-szubsztrát interakciók affinitása és kinetikája alapján. Ide tartozik a kolónia formáló egység (CFU) assay is.

Sejt-szortoló technikák alkalmazásával (MACS vagy FACS) a kívánt sejtek kiválogathatóak (vagy a nem kívánt sejtek eltávolíthatóak) sejtfelszíni antigéneket kötő antitestek felhasználásával vagy fluoreszcens markerek, például GFP expresszió alapján.

FACS MACS

Sejtvonal-specifikus génekkel történő transzdukció segítheti a differenciáció irányítását. Riporterek (pl.: GFP) alkalmazása megkönnyíti a sejtek szelekcióját (pl.: FACS) illetve a génaktiváció helyének és idejének ellenőrzését.

Gén

Riporter(pl. GFP)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Újraprogramozás

Vírus szállítja az újraprogramozáshoz

szükséges faktorokat a szomatikus sejt magjába

Pluripotens iPSC sejtvonal

TenyésztéshESC-ként

Szomatikus sejt újraprogramozása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtek differenciálódása I.Prekurzor sejt

Szabályozó fehérje 2



Sejt A Sejt B Sejt C Sejt D Sejt E Sejt F Sejt G Sejt H





Sejtosztódás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtek differenciálódása II.

Blasztociszta

Zigóta

Gasztrula

Ivarsejtek

Spermium Petesejt

Mezoderma (Középső réteg)

SimaizomSzívizom Harántcsíkoltizomsejtek

Vörösvértestek Vesetubulussejtek

Endoderma (Belső réteg)

Tüdősejt(Alveroláris sejt)

Pajzsmirigysejt

Hasnyálmirigysejt

Ektoderma (Külső réteg)

Epidermiszbőrsejtjei

Agy neuronjai Pigmentsejt

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, szervspecifikus primer sejtek I.

Biopszia Tisztítás

Sejtkultúra

TE-ben használható

sejtek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett, szervspecifikus primer sejtek II.

Biopszia

Tisztítás

TE-ben használható

sejtek

Differenciálódott szöveti sejtek

Szövetspecifikusrezidens őssejtek Sejtkultúrák

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Az epidermisz differenciálódása

Filaggrin, loricin, trichohyalin, involucrin, SPRRs, S100 fehérjék

Stratum corneum

Szemcsés réteg

Alapréteg

Alapmbrán

Keratin-2e

Keratin-1, -10

Keratin-5, -14

Epid

erm

ális

diff

ere

nci

áci

ó

Stratum spinosum

Lipid envelopeElszarusodó envelope

Lipidek felszabadulása a lamelláris granulumokból

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Érett szövetspecifikus sejtek „tissue engineering”-ben• Biopszia vagy reszekció• Tisztítás• A proliferációs képesség visszaállítása

sejtkultúrában• Re-differenciáció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szabályozási kérdések I.Sejtek• GLP• GMP• Engedély embrionális őssejtekkel

történő munkához

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

• Engedély állatokkal végzett kísérletekhez• UK: Home Office Licence 1986• EC 1394/2007

Szabályozási kérdések II.Állatok

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szabályozási kérdések III.Humán embrionális őssejtekA humán embriók őssejt-forrásként való felhasználása körüli etikai viták (etikai kérdések)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Regeneratív medicina

• Szervek regenerációja saját regeneratív biokémiai és celluláris folyamataik révén

• Szervregeneráció in vitro létrehozott egész szervek vagy egy szerv specifikus szöveteinek hozzáadásával

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szervelégtelenség

• Betegség, baleset vagy öregedés miatt fellépő szervműködési elégtelenség esetén a teljes szerv pótlására vagy regenerációjára van szükség

• Ideális esetben a beteg számára a saját (autológ) szövetei szolgálnak „bioalapanyagként „e szervek létrehozásához

Őssejtek (2)

Documents