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Estudio sobre cinetica enzimatica de carne de pollo con enzimas hidroliticasTRANSCRIPT
CINETICA DE HIDRÓLISIS ENZIMATICA EN CARNE DE POLLO USANDO ALCALASA
3
6
Arismendi 1, Urrutia 1 y Almonacid 1
9
1 Departamento de Ingeniería Química y Ambiental; Universidad Técnica Federico Santa María 12
Autores: C. Arismendi 15
Urrutia
Correo: [email protected]
Resumen
En la presente investigación se realizo el estudio de una cinética de hidrólisis enzimática de
pechugas de pollo, conociendo el contenido proteico exacto de estas para fijarlo como la concentración 21
de sustrato para la reacción, con la enzima comercial Alcalasa 2.4 L, a través del método de Ph-Stat.
Se realizaron diferentes experiencias, variando la concentración de sustrato y manteniendo fija
la concentración de enzima añadida y viceversa, para ser analizados cualitativamente y luego evaluar 24
un modelo cinético de inhibición y ajustarlo al set de variables estudiadas.
Los datos obtenidos mostraron una presencia a enzima constante, de una inhibición de sustrato a
una concentración mayor de 50 g/L, observando una disminución en la velocidad inicial de la reacción 27
a mayores concentraciones de la señalada.
Analizando los datos a concentración de sustrato constante, se determino que la reacción
obedece a la cinética de Michaelis Menten, ya que la velocidad inicial de la reacción se comparo con la 30
concentración inicial de enzima y se encontró una relación lineal entre ellas, como corresponde en las
bioreacciones modeladas a través de esta cinética.
Se estudio la influencia de otras inhibiciones, concluyendo que la velocidad de reacción 33
disminuye a medida que disminuye la concentración de enlaces peptídicos y también que la
inactivación enzimática no sucede en la reacción.
Se dedujo un modelo desarrollado en base al modelo de la cinética química de inhibición por 36
sustrato el cual se trato de ajustar a las variables medidas, lo cual no se consiguió con buenos
resultados, por lo que se concluyo que suposiciones realizadas en la deducción del modelo fueron
erróneas. 39
Introducción
La pechuga de pollo tiene un alto contenido proteico (22% en peso) y un bajo contenido de 42
grasas (3%) comparado con el tuto de pollo (18 % de proteínas y 5% grasa) y las alas (18% proteínas y
18% grasa) (TACO 2004). Además, la proteína de animal presenta un perfecto equilibrio de
aminoácidos esenciales que deben ser incluidos en la dieta ya que el organismo no es capaz de 45
sintetizarlos por sí mismo.
Según Barbut (2002), nuevos productos procesados de aves de corral (por ejemplo, las vienesas
de aves) han sido introducidos en el mercado en los últimos años, debido a los bajos precios de las 48
materias primas. Con el fin de ser competitivos, las industrias de aves de corral deberán desarrollar
nuevos productos para satisfacer las nuevas demandas de los consumidores y aumentar la rentabilidad.
Así, la hidrólisis de las proteínas de la carne de pollo podría ser una solución alternativa para obtener 51
productos con mayor valor agregado.
La hidrólisis de proteínas se puede lograr usando enzimas, ácidos o bases, pero la hidrólisis
enzimática es muy preferible a los métodos químicos para aplicaciones alimentarias. Las enzimas 54
proteolíticas se usan para disolver o descomponer la proteína muscular, lo que distingue dos fracciones,
la soluble y la insoluble. La fracción insoluble puede contener grasa y otros materiales no deseados y
puede ser utilizado en alimentos para animales. La fracción soluble contiene la proteína hidrolizada con 57
perfiles péptido bien definidos y un bajo contenido de grasa. Durante este proceso, los aminoácidos son
liberados, con esto mejora el sabor de la carne. Los hidrolizados de proteínas pueden ser utilizados
como potenciadores del sabor, ingredientes funcionales, aditivos o simplemente un potenciador de 60
alimentos con bajas de proteínas.
Los hidrolizados de proteínas se aplican principalmente en el manejo nutricional de las personas
que no pueden digerir todo / proteína intacta. Hidrolizados rico en péptidos de bajo peso molecular, 63
sobre todo di y tri-péptidos con lo menos posible los aminoácidos libres, se ha demostrado que tiene
más usos dietéticos debido a sus altos valores nutricionales y terapéuticos (Bhaskar y otros, 2007). Las
proteínas hidrolizadas también muestran reducción de la reactividad inmunológica, y se puede utilizar 66
en las fórmulas para lactantes hipoalergénicos (Mahmoud, 1994). Por otra parte, los péptidos, que se
absorben fácilmente, pueden ser una fuente de nitrógeno en la nutrición para deportistas y péptidos de
alto valor biológico son atractivos como un suplemento de proteínas en general en una amplia variedad 69
de dietas (Sliyt y otros, 2005).
Proteólisis enzimática y la disolución de proteínas a partir de diversas fuentes han sido
ampliamente estudiados, como el del salmón rojo, el camarón de tratamiento de residuos, las víseras de 72
ovino, la carpa herbívora, y el caracol de barro (Sathivel y otros, 2005; Holanda y Netto 2006; Bhaskar
yotros, 2007, 2008; Wasswa y otros, 2007; Xia y otros, 2007). Sin embargo, hay poca información
disponible sobre la hidrólisis enzimática de la carne de pollo. 75
Las variables más importantes en la reacción enzimática son la concentración de la enzima y la
especificidad de la enzima, la temperatura de reacción y el pH y la naturaleza del sustrato proteico
(Adler-Nissen, 1985). Es importante saber cuál de estos factores son críticos, ya que la optimización de 78
los parámetros de proceso para la hidrólisis enzimática de la carne es esencial para desarrollar un
proceso económico y óptimo.
Como objetivo de la investigación se buscara encontrar un modelo que se ajuste a la cinética de 81
hidrólisis enzimática, y ver si es posible validarlo estadísticamente. También se analizaran
cualitativamente las experiencias más descriptivas y claras, con el fin de estimar el comportamiento de
sistema a diferentes concentraciones tanto de enzima como sustrato y ver posibles situaciones 84
presentadas en las reacciones de hidrólisis enzimática. Se evaluara el método experimental
cualitativamente para ver si es de fácil implementación y buena generación de datos validos.
Materiales y Métodos 87
Mecanismo de reacción planteado
El mecanismo de reacción planteado incluye inhibición por sustrato como se muestra en la
siguiente reacción. 90
93
donde E y S son las enzimas y sustratos libres; ES ES2 son complejos enzima sustrato; P es el producto 96
final; k1,k2,k3,k-1,k-3 son tasas de reacción.
Cabe destacar que es una reacción acompetitiva. La reacción correspondiente puede ser
determinada por la etapa de reacción irreversible: 99
1. ESk=dt
dP=V 20
Al asumir que la reacción se encuentra en estado estacionario, el balance de masa para los
complejos [ES] y [ES2] pueden ser escritas según: 102
2. 0233211 =ESk+SESkESk+kSEk=dt
ESd
3. 02332 =ESkSESk=
dt
ESd
Por lo que la concentración del complejo [ES2] se puede definir como usando la ecuación 3: 105
4.IK
SES=SES
k
k=ES
3
3
2
donde:
K1 = 3
3
k
k (constante de inhibición por sustrato) 108
La cantidad de enzima inicial se encuentra presente en tres estado: libre E, formando el
complejo ES y formando el complejo ES2.
Por lo que, al utilizar las ecuaciones 2,28 y 2,32, la concentración de enzima libre [E] queda: 111
5.2ESESe=E
6.2ESESe=E
La concentración del complejo ES se determina utilizando la ecuación 2., usando las ecuaciones 114
4. y 6., esta se reordena formando la siguiente ecuación:
7.
m
I
K+K
S+S
eS=ES
2
donde: 117
Km = 1
1
k
K+k 2 (constante de Michaelis)
Por lo que la variación de producto en el tiempo se define según:
8.
m
I
max
K+K
S+S
VS=
dt
dP2
120
donde:
Vmax = k2 * eo (velocidad máxima)
La tasa de reacción r será determinada por la reacción irreversible: 123
9. r = S0 * dt
dx= k2 * [ES]
Si se asume estado estacionario y que la cantidad de enzima presente (e), se encuentra en forma
libre (E) y formando complejos (ES) y (ES2), la ecuación anterior queda: 126
10.r = S0 * dt
dx=
m
I
max
K+K
S+S
VS2
Si el proceso de inhibición por sustrato controla la reacción:
11.I
mK
SS+K
2
129
La ecuación se reduce a
12.SS
KeK=
dt
dx I
0
02
Sabiendo que la cantidad de sustrato es igual al sustrato inicial menos el producto generado y 132
separando variables para su integración podemos obtener una relación algebraica que nos relaciona la
cantidad de producto con el tiempo:
13.PSS
KeK=
dt
dP I
0
2
0
02 =S0 * dt
dx 135
14. tKeK=PS
PS I02
2
02
02
Por lo que se espera que, la tasa de reacción, a pH y temperatura constantes, dependa de la
concentración de enzima y sustrato iniciales en la mezcla a hidrolizar. 138
La variación del grado de hidrólisis en el tiempo, se representa como:
dt
DHd=
dt
dx
La cantidad de producto obtenido, se puede medir utilizando el grado de hidrólisis (DH), ya que 141
este representa el porcentaje de péptidos hidrolizados; por lo que la variación del producto durante el
transcurso de la reacción se puede representar como:
dt
DHdS=
dt
dP0 144
Las curvas de grado de hidrólisis versus el tiempo presentan un comportamiento exponencial.
Ellas indican que la tasa de reacción r disminuye al aumentar el tiempo de reacción y el grado de
hidrólisis. Esto puede ser modelado utilizando la siguiente expresión: 147
PSS
KeK=
dt
DHd I
2
0
3
0
02
P= DHS0
Separando variables e integrando se obtiene la siguiente expresión: 150
tKeK=DHS
DHS I02
23
03
02
Materia Prima
Pechuga de pollo fresca fue adquirida de la empresa Faenadora Súper Pollo (Lo miranda y San 153
Vicente, Chile) y congelada para su posterior uso. Las características de la carne fue obtenida del
catalogo de la empresa según requerimientos de las actuales normas nacionales y se detallan en la
tabla 1. 156
Tabla 1
Característica (%)
Proteína Total 21,25%
Humedad 76,07%
Grasa 1,38%
Cenizas 1,27%
*Corresponde a la media pechuga de pollo. Deshuesada y sin piel. Con hematomas leves.
Hidrólisis enzimática 159
El experimento se llevo a cabo en un reactor batch de 1000-mL con baño termorregulado y se
uso el método de pH stat, descrito por Adler-Nissen (1985). La materia prima fue descongelada y toda 162
la grasa y nervios visibles fueron extraídos, luego fue molida en un procesador de alimentos y
mezclada con 500-mL de agua destilada. La mezcla fue llevada a temperaturas y pH optimizados por
L.E. Kurozawa. K.J. Park, M.D. Hubinger (2008) en valores de 52,5 °C y 8,00 respectivamente. Se 165
variaron la proporción Enzima/Sustrato y Carne/Agua. Luego se añade la enzima diluida en 10-mL de
agua destilada y a 52,5 °C. Las pruebas consistieron en mantener constante el pH usando NaoH cada un
minuto los primeros 20 minutos y luego cada unos 5 minutos hasta generalmente completar la hora de 168
análisis. Luego se inactivo la enzima en un baño termorregulado a 90 °C por 15 minutos.
Determinación del grado de hidrólisis
EL grado de hidrólisis (DH) fue obtenido por el método pH-stat y definido como el porcentaje 171
del ratio entre los enlaces peptídicos aun disponibles (h) y los enlaces peptídicos iniciales (htotal)(Adler-
Nissen 1985). Se de acuerdo a la siguiente ecuación:
DH (%) = totalh
h* 100 =
total
b
hαMP
NB* 100 174
Donde B es el consumo de NaOH (mL) para mantener el pH constante durante la reacción; Nb
es la normalidad de la base; MP es la masa de proteína (g); htotal es el numero de enlaces peptídicos en
la proteína del sustrato (7,6 mEq/g); y α es el grado de disociación del grupo α-NH2 que se expresa 177
como:
α = pKpH+101
1
Los valores de pK varían significativamente con la temperatura y pueden ser estimados como a 180
continuación (Kristinsoon y Rasco, 2000):
pK = 7,8 +T
T
298
298* 2400
donde T es la temperatura (K). 183
Ensayo de inactivación de enzima
Para probar la existencia o inexistencia de inactivación enzimática, se agrego enzima fresca pasados 1
hora de reacción y se sigue analizando con el mismo método (añadiendo base). 186
Ensayo de agotamiento de sustrato
Con el fin de estudiar la posibilidad de que exista agotamiento en la concentración de enlaces
peptídicos hidrolizables que afecta la cinética de la reacción, se añadió sustrato fresco pasados 50 189
minutos de reacción y se sigue agregando base como indica el método pH-stat.
192
195
198
201
Resultado y discusión
Grado de hidrólisis 204
Los primeros experimentos fueron realizados con una concentración de enzima de 2,97 [g/L],
variando la concentración de sustrato. La figura 1. muestra las curvas correspondientes para 3
concentraciones de sustrato distintas. 207
Figura 1.
Nótese que al aumentar el contenido de sustrato el grado de hidrólisis la velocidad inicial de
reacción disminuyen; esto implica que el sustrato ejerce una acción negativa sobre el grado de 210
hidrólisis al llegar a cierta concentración, lo que da indicios de inhibición por sustrato.
Para comprobar esto se realiza un gráfico con las velocidades iniciales de la reacción (figura 2.)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
Grado de Hidrolisis
Concentracion de sustrato variable e=2,21[g/l]
[S] [g/l] 45,9287848605578
[S] [g/l] 49,9185137884976
[S] [g/l] 50,5358268006481
[S] [g/l] 53,8842139902219
tiempo [s]
%D
H
Figura 2. 213
De la figura 2 se deduce que la velocidad de reacción disminuye a concentraciones de sustrato
altas como consecuencia de la inhibición por sustrato. La máxima velocidad inicial, se observa a una
concentración de sustrato en un rango entre 46 y 50,5 g/L. 216
Para estudiar el efecto de la concentración de enzima sobre la cinética de la reacción, se
realizaron ensayos con concentración de sustrato constante (49,92 g/L) variando la concentración de
enzima como se muestra en la figura 3. 219
Figura 3.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
Grado de Hidrólisis
Concentración de enzima variable So=49,92 [g/L]
[E] [g/l] 2,0226024775909
[E] [g/l] 2,2175565654749
[E] [g/l] 2,24497978822644
tiempo [s]
%D
H
45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
Velocidad Inicial vs Concentración inicial de Sustrato e
S0 [g/l]
V[%
/s]
222
Para demostrar que existe una dependencia (como se observa en la figura 4.) entre la velocidad
inicial de reacción y la concentración inicial de enzima, se comprueba que la reacción se comporta
según lo descrito por Michaelis y Menten. 225
Figura 4.
En general, al graficar el grado de hidrólisis versus el tiempo, se observa que existe una velocidad de 228
reacción, esto se puede atribuir a uno de los siguientes fenómenos:
a. Una disminución en la concentración de enlaces peptídicos hidrolizables. 231
b. Inhibición enzimática
c. Inactivación enzimática
234
2 2,05 2,1 2,15 2,2 2,25 2,3
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
f(x) = 0,18x - 0,31R² = 0,98
Velocidad inicial vs Concentracion inicial de enzima Eo
Eo [g/L]
V[%
/s]
Con el fin de estudiar la primera posibilidad, se realizo un experimento en el cual, durante la
reacción, se añadió sustrato (130g). Si existiese una disminución en la concentración de péptidos
hidrolizables, se observaría un aumento en el grado de hidrólisis después de la adicionó del sustrato 237
fresco (figura 5).
240
Figura 5.
Existe un cambio notable en la reacción, por lo que la primera hipótesis es correcta.
243
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
Grado de hidrolisis
Adición de sustrato
tiempo [s]
%D
H
La inactivación enzimática, hipótesis c, se estudio agregando enzima fresca 1 hora después de
comenzada la reacción en un tiempo determinado como se muestra en la figura 6.
Figura 6. 246
El gráfico sugiere que no existe inactivación enzimática para la reacción.
Determinación de Parámetros para Ajustar los Resultados Obtenidos
A partir de cada experiencia realizada se ajusto una curva para predecir su comportamiento y 249
luego poder comparar con el modelo planteado. Si se despejase el valor del grado de Hidrólisis para el
modelo planteado, en función de las demás variables, se podría obtener un modelo que correlacionara
las variables medidas en función del grado de hidrólisis. 252
En la tabla 2 se presentan el Parámetros de Ajuste para cada experiencia, estos debiesen estar en
función de las demás variables, vale decir, Eo, So y k2 y KI (A = 2·k2·KI), entregando el valor de R2. 255
Esto se realizo asignando un valor A talque genere la menor cantidad de error Cuadrático para los
tiempos medidos.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
Grado de hidrolisis
Adición de enzima
Columna E
tiempo [s]
%D
H
Tabla 2. 258
Experiencia Eo So A ΣR2/n
2,02260248 49,7595428 16,1 1,4
2,21755657 45,9287849 6 0,96843245
2,21755657 49,9185138 11,2 1,19163112
2,21755657 50,5358268 6,3 0,51218133
2,21755657 53,884214 4,4 0,61308594
2,24497979 49,9185138 6,1 0,53821358
Los bajos valores de la suma de los errores cuadrados llevan a analizar que los ajustes
generados dan una buena aproximación de las cinéticas estudiadas. El las figuras 8 y 9 se muestran los 261
valores teóricos para los casos anteriormente estudiados (a sustrato constante y enzima constante
luego).
264
267
Figura 8 270
Figura 9
273
Observando las figuras presentadas, se ve que el comportamiento no es igual al presentado
experimentalmente, esto significa que ajuste desarrollado no es completamente valido y el modelo no
se puede validar estadísticamente con el ajuste planteado, por lo que se debe evaluar otra forma de 276
ajuste para poder validar el modelo y encontrar el parámetro que relacione correctamente al modelo
planteado.
279
Conclusiones
El análisis cualitativo del comportamiento del grado de Hidrólisis en función de la
concentración de sustrato, revela una inhibición por sustrato, ya que al estimar las velocidades iniciales 282
a una concentración de enzima constante, en un momento al aumentar la concentración de sustrato, el
valor de la velocidad máxima empieza a descender, mostrando un comportamiento equivalente a una
inhibición por sustrato. 285
Por otro lado el comportamiento a sustrato constante, muestra que la reacción obedece la
cinética de Michaelis Menten, ya que se muestra una dependencia lineal de la concentración de enzima
en función de la velocidad máxima de reacción, situación que sucede en este tipo de cinéticas. 288
Se concluyo que la disminución de la velocidad de reacción, entre otros supuestos que no se
pudieron demostrar, es dependiente, de la concentración de enlaces peptidicos hidrolizables, debido a
que al agregar más sustrato (vale decir más enlaces peptidicos dispuestos a hidrolizarse) cuando la 291
reacción ya tiende a ser constante hacia un grado de hidrólisis, el sistema muestra una disminución
brusca del pH mostrando una aumento en la velocidad de Hidrólisis a la llevada antes de la adición de
mas sustrato. Esto indica el aumento de concentración de enlaces posibles de hidrolizar. 294
También esta disminución de la velocidad se concluyo que no depende de una inactivación
enzimática, ya que al agregar más enzima cuando la ciné tica lleva un tiempo donde la velocidad del
grado de hidrólisis se torna constante, el comportamiento sigue igual por lo que todavía la enzima está 297
trabajando con la misma actividad, solo que la disminución del sustrato disponible a hidrolizar genera
que no pueda tener una mayor velocidad.
El ajuste realizado en base al modelo desarrollado, no entrega buenos resultados comparables 300
con los estudios experimentales, pudiendo implicar un mal desarrollo estadístico del modelo, asignando
parámetros de ajuste inadecuadamente, o que las hipótesis planteadas, para la determinación del
modelo no son completamente correctas y es más conveniente desarrollar el modelo con una 303
descripción completa y sin despreciar términos en los balances y expresiones desarrolladas.
La configuración del equipo utilizado permitió controlar la reacción de hidrólisis enzimática de
proteínas, de forma relativamente sencilla y precisa; sin embargo, si no se realiza una mezcla 306
homogénea agua-pollo, los resultados obtenidos cambian considerablemente y afectan la
reproducibilidad de los mismos. Un sistema automático de titulación, permitiría obtener datos más
precisos del grado de hidrólisis. 309
El mecanismo de la hidrólisis enzimática de proteínas de pechuga de pollo, es un conjunto de
reacciones en paralelo que involucran inhibición acompetitiva por sustrato. La inhibición por sustrato
se presentó a concentraciones superiores a 50 g/L, donde a máxima velocidad alcanzada en este punto 312
fue de 0,089 % DH/s.
La homogenización de la mezcla, durante el proceso de reacción, es un parámetro importante
que debe ser estudiado para optimizar los costos de operación, ya que la viscosidad de la mezcla 315
cambia con el tiempo.
Los hidrolizados obtenidos deben ser analizados para determinar la d istribución de pesos
moleculares, y así, poder estimar los parámetros operacionales, que maximicen la producción de 318
péptidos con las características deseadas.
321
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