pattern di sostituzione 1 la vita organica, ci dicono, si è evoluta gradualmente dal protozoo al...

Pattern di sostituzionePattern di sostituzione

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“La vita organica, ci dicono, si è evoluta gradualmente dal protozoo al filosofo, e questa evoluzione, ci assicurano, rappresenta senza dubbio un progresso. Disgraziatamente, chi ce lo assicura è il filosofo, non il protozoo.” (B. Russel, Misticismo e Logica, 1918)

SommarioSommario

L’evoluzione molecolareL’evoluzione molecolare

Pattern di sostituzione nei geniPattern di sostituzione nei geni

Stima del numero di sostituzioniStima del numero di sostituzioni

Variazioni nelle velocità evolutive tra geniVariazioni nelle velocità evolutive tra geni

Orologi molecolariOrologi molecolari

L’evoluzione negli organelliL’evoluzione negli organelli

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IntroduzioneIntroduzione

Confronti tra sequenze nucleotidiche di due o più organismi spesso rivelano che sono stati accumulati cambiamenti a livello del DNA, anche se le sequenze provengono da regioni funzionalmente equivalentiNon è raro, infatti, trovare sequenze che durante il percorso evolutivo sono diventate così diverse da rendere assai difficile ottenerne degli allineamenti attendibiliLe analisi, sia del numero sia del tipo di sostituzioni che si sono verificate durante il percorso evolutivo, sono di centrale importanza per lo studio dell’evolu-zione molecolare

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Perché l’evoluzione molecolare? Perché l’evoluzione molecolare? 1 1

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DNA molecules are not only the key to heredity, but DNA molecules are not only the key to heredity, but they are “document of evolutionary history” they are “document of evolutionary history” (Emile Zuckerkandl)L’evoluzione molecolare evoluzione molecolare integra la biologia evolutiva, la biologia molecolare e la genetica delle popolazioni

Descrive il processo evolutivo (cambiamenti nel tempo, essere vs. divenire) di DNA, RNA e proteineSi occupa di patternpattern (schemi, modelli) e studia l’evolu-zione…

…delle entità molecolari, geni, genomi, proteine, introni, arrangiamenti cromosomici…degli organismi e dei complessi biologici, cioè specie, sistemi che coevolvono, nicchie ecologiche, modelli migra-tori, usando i dati molecolari


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Per capire le basi della diversità biologicaPer capire le basi della diversità biologica


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Per comprendere la storia evolutiva della vita sulla Per comprendere la storia evolutiva della vita sulla terra, che è scritta nelle nostre molecoleterra, che è scritta nelle nostre molecole

Poiché il processo di selezione naturale selezione naturale è veramente efficace nel rimuovere i cambiamenti dannosi, l’evo-luzione molecolare serve anche a riconoscere e caratterizzare le porzioni di genoma che sono più importanti dal punto di vista funzionale…ovvero a rilevare come la frequenza di sostituzione dei nucleotidi sia diversa in zone distinte dello stesso gene, per geni differenti, e attraverso le specie, e possa essere usata come una misura dell’importanza funzionale (e quindi della necessità di “conservazio-ne”) della particolare sequenza

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Geni e proteine Geni e proteine 1 1Perché le proteine possono cambiare?

Perché sono presenti più proteine che svolgono la stessa funzione quindi, se ne cambia una, la funzione è comun-que preservataPerché il cambiamento non comporta modifiche né nella struttura (destabilizzazione) né nella funzione

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Geni e proteine Geni e proteine 2 2

Geni ortologhiGeni ortologhi: geni simili riscontrabili in organismi correlati tra loro

Il fenomeno della speciazione porta alla divergenza dei geni e quindi delle proteine che essi codificanoEsempioEsempio: le globine di uomo e di topo hanno iniziato a divergere circa 80 milioni di anni fa, quando avvenne la divisione che dette vita ai primati e ai roditori

Geni paraloghiGeni paraloghi: geni originati dalla duplicazione di un unico gene nello stesso organismo

EsempioEsempio: globina e globina umana hanno iniziato a divergere in seguito alla duplicazione di un gene globinico ancestrale

In entrambi i casi, c’è omologiaomologia

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Geni e proteine Geni e proteine 2 2

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duplicazione

speciazione

Come cambiano le proteine Come cambiano le proteine 1 1

Una proteina presente in un organismo può cambiare in seguito a mutazioni nella sua sequenza codificante

Le mutazioni possono essere puntiformi o più esteseSostituzione puntiforme Sostituzione puntiforme sostituzione di una singola base

InserzioneInserzione una o più basi vengono inserite

DelezioneDelezione una o più basi vengono tolte

InversioneInversione un tratto di DNA si inverte

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Il codice genetico è ridondante, perciò non sempre una sostituzione porta ad un cambiamento di amino-acido

Si ha una mutazione silente mutazione silente se la proteina rimane funzio-nalmente invariata

Negli altri casi, dal punto della mutazione in poi, gli aminoacidi cambiano, e la proteina può diventare “irriconoscibile” e perdere la propria funzionalità

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13

Sostituzioni puntiformiSostituzioni puntiformi

(1) Acido glutammico Acido glutammico(2) Cisteina Serina (aminoacidi polari con molecola chirale)(3) Glutammina Codone di stop

321


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DelezioniDelezioni


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InserzioniInserzioni


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InversioniInversioni

Come cambiano le proteine Come cambiano le proteine 7 7La similarità biologica è spesso dovuta ad omologia, ma può anche presentarsi per caso, oppure per fenomeni di conver-genza adattativa, sia a livello morfologico (analogia) sia a livello molecolare

Convergenza adattativaConvergenza adattativa: adozione, da parte di organismi di-versi, di «soluzioni tecniche» simili per adattarsi all’ambien-te, talvolta anche partendo da organi e apparati differenti

EsempioEsempio: l’ala di un uccello e l’ala di un pipistrello si sono evolute indipendentemente e di conseguenza non sono omologhe

Nel trattare le sequenze è sempre più corretto utilizzare il termine similaritàsimilarità, in quanto è sempre possibile stabilire quanto due sequenze siano simili, mentre non sempre si può decidere se la similarità sia dovuta ad omologia, a convergenza adattativa, oppure al caso

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Se due sequenze hanno un significativo grado di similarità per tutta la loro lunghezza è altamente probabile che ciò sia dovuto ad una “memoria” della loro relazione evolutiva

Due sequenze che non mostrano forti similarità posso-no però ugualmente essere omologhe ma molto diver-genti (comune progenitore molto remoto, dinamica evolutiva molto rapida)

AttenzioneAttenzione: Similarità Similarità Omologia Omologia

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È un dato qualitativo, che da atto dell’origine filogenetica comune di due sequenze

È un dato quantitativo, legato alla scelta di una metrica, e prescinde da eventuali ipotesi sulla causa della similarità stessa

Pattern di sostituzione nei geni Pattern di sostituzione nei geni 1 1

Le alterazioni della sequenza del DNA possono avere conseguenze drastiche per le cellule viventi

MutazioniMutazioni: scambi di nucleotidi o eventi indelGli errori possono essere deleteri, vantaggiosi o neutraliInoltre:

I cambiamenti vantaggiosi sono in minoranzaAlcuni cambiamenti in sequenze nucleotidiche hanno mag-giori conseguenze, che si diversificano ulteriormente in rela-zione ad organismi distinti

Tuttavia, per un organismo nel suo ambiente tipico, la maggior parte dei geni è molto vicina allo stato ottimale

Le cellule hanno sviluppato meccanismi complessi che assicurano l’accuratezza della replicazionereplicazione e della riparazioneriparazione del DNA

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La replicazionereplicazione (o duplicazioneduplicazione) del DNA è il meccanismo molecolare attraverso cui viene prodotta una copia del DNA cellulare

Ogni volta che una cellula si divide, infatti, l’intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso alla progenie

La riparazioneriparazione del DNA è essenziale alla sopravvivenza delle cellule, perché protegge il genoma da danni e mutazioni permanenti e nocive

È un processo costantemente in attoEsempioEsempio: nelle cellule umane, sia le normali attività metabo-liche che i fattori ambientali determinano almeno 500.000 singole lesioni molecolari per cellula al giorno

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Quando la cellula invecchia, la velocità di replicazione/ripa-razione del DNA decresce fino a non tenere più il passo con gli eventi di creazione dei danni

SenescenzaSenescenza (dormienza irreversibile): indica il processo per cui, durante la duplicazione cellulare, alcune cellule perdono progressivamente la capacità di dividersi ApoptosiApoptosi (morte cellulare programmata): è un sofisticato meccanismo in cui l’evoluzione cellulare ha fatto da setaccio per difendere l’organismo da cellule infettate da virus, da cellule del sistema immune autoreattive, da cellule in cui si verifica un danno al DNA, da cellule tumoraliCarcinogenesiCarcinogenesi: è il processo che trasforma cellule normali in cellule cancerose

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Frequenze di mutazione Frequenze di mutazione 1 1

Il numero di sostituzioni K che due sequenze omolo-ghe hanno subito dal loro ultimo antenato comune può essere valutato contandone le differenzeQuando K è espresso in termini di numero di sostitu-zioni per sito ed è accoppiato con un tempo di diver-genza T

Si può valutare la frequenza r di sostituzioneSupponendo che le sostituzioni si accumulino simulta-neamente e indipendentemente in entrambe le se-quenze, la frequenza di sostituzione è

r K(2T )

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Frequenze di mutazione Frequenze di mutazione 2 2Il calcolo della frequenza di sostituzione è efficace se le velocità evolutive, per diverse specie, sono simili

Stima dei tempi degli eventi evolutivi

Confronti delle frequenze di sostituzione all’interno di uno stesso gene, e fra un gene e l’altro, sono utili per determinare il ruolo di regioni genomiche differenti

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Vincoli funzionali Vincoli funzionali 1 1Cambiamenti di geni che diminuiscono la capacità di sopravvivenza di un organismo vengono “arginati” dal processo di selezione naturale

Poiché le proteine sono responsabili della funzionalità delle cellule, non sorprende che quei cambiamenti nel-la sequenza nucleotidica che fanno variare le proprietà catalitiche o strutturali delle proteine codificate siano oggetto di selezione naturale

Le porzioni di geni particolarmente importanti sono definite sotto vincoli funzionali vincoli funzionali e tendono a variare poco (a cambiare molto lentamente) nel corso dell’evoluzione

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Vincoli funzionali Vincoli funzionali 2 2Viceversa, molti cambiamenti della sequenza nucleoti-dica di un gene non hanno effetto sulla codifica delle relative sequenze aminoacidiche o sui livelli di espres-sione delle proteine

Sono meno soggetti a selezione naturale e si accumulano rapidamente durante il processo evolutivo

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Vincoli funzionali Vincoli funzionali 3 3

EsempioEsempio: cambiamenti accumulati nei geni per le globine di quattro mammiferi (uomo, topo, coniglio e mucca) che hanno avuto un antenato comune 100 milioni di anni fa

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Regione Lunghezza(in coppie di basi)

No. medio di cambiamenti

Deviazione standard

Frequenza di sostituzione

Non codificante

913 67.9 14.1 3.33

Codificante 441 69.2 16.7 1.58Sequenza 5’flanking

300 96.0 19.6 3.39

Sequenza 5’ non tradotta

50 9.0 3.0 1.86

Introne 1 131 41.8 8.1 3.48Sequenza 3’ non tradotta

132 33.0 11.5 3.00

Sequenza 3’flanking

300 76.3 14.3 3.60


Esempio (cont.)Esempio (cont.)Un tipico gene eucariotico è composto sia da nucleotidi che specificano la sequenza aminoacidica di una proteina (sequenze codificanti), sia da sequenze non codificanti

La frequenza dei cambiamenti è circa due volte più alta nelle sequenze non codificanti dei geni per le globine (3.33109 sostituzioni/sito/anno contro 1.58109 sosti-tuzioni/sito/anno)

Le sequenze non codificanti si dividono in:Introni

Regioni leaderleader (a monte dei geni strutturali)

Regioni trailertrailer, trascritte ma non tradotte

Sequenze che sono adiacenti alle terminazioni 5’ e 3’

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Vincoli funzionali Vincoli funzionali 5 5Esempio (cont.)Esempio (cont.)

Ogni regione tende ad accumulare cambiamenti a frequenze diverse, generalmente correlate a quanto i relativi nucleotidi sono funzionalmente vincolati

Inoltre, è logico aspettarsi che altri geni accumulino sostituzioni a frequenze differenti, così come che i geni per le globine sottostiano a livelli diversi di vincoli funzionali per specie distinte

Tuttavia… in generale:I cambiamenti si accumulano più rapidamente negli introni e nelle sequenze di tipo flanking…

…quindi nelle regioni che sono trascritte ma non tradotte… (con l’eccezione della sequenza alla terminazione 5’ del gene, che è funzionalmente importante per la successiva fase di traduzione)

…meno rapidamente all’interno di sequenze codificanti28


Esempio (cont.)Esempio (cont.)I dati provenienti dai geni per le globine forniscono una stima della scansione temporale di accumulo dei cambiamenti nucleotidici

Mentre per una sequenza nucleotidica, un cambiamento dello 0.35% ogni milione di anni (frequenza approssimativa per introni e sequenze flanking) può sembrare estremamente lento da una prospettiva umana, si rivela relativamente veloce dal punto di vista dell’evoluzione molecolare

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Vincoli funzionali Vincoli funzionali 7 7Dal punto di vista strutturale:

La maggior parte delle mutazioni avviene sulla superficie La maggior parte delle mutazioni avviene sulla superficie della proteina, mentre gli aminoacidi del della proteina, mentre gli aminoacidi del corecore sono sono maggiormente conservati, in modo da consentire lo stes-maggiormente conservati, in modo da consentire lo stes-so foldingso foldingNell’evoluzione, la similarità di sequenza è meno preser-Nell’evoluzione, la similarità di sequenza è meno preser-vata rispetto alla struttura terziariavata rispetto alla struttura terziaria

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Sostituzioni sinonime e non Sostituzioni sinonime e non 1 1

18 dei 20 aminoacidi sono codificati da più di un codonePer esempio, GGG, GGA, GGU, GGC codificano tutti per l’aminoacido glicinaOgni cambiamento nella terza posizione di un codone per la glicina porta ad un codone che i ribosomi interpretano equi-valentemente per la costruzione della struttura primaria della proteina

Cambiamenti a livello nucleotidico di sequenze codificanti che non variano la sequenza aminoacidica della proteina sono detti sostituzioni sinonimesostituzioni sinonimeViceversa, cambiamenti nella seconda posizione dei codoni della glicina possono causare cambiamenti nella sequenza aminoacidica risultante (per esempio, GCG codifica per l’alanina) e rappresentano sostituzioni non sinonimesostituzioni non sinonime

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Se è vero che la selezione naturale esegue una netta distinzione fra proteine funzionali e malfunzionanti, le sostituzioni sinonime dovrebbero osservarsi più fre-quentemente di quelle non sinonime (nelle sequenze codificanti)Inoltre, non tutte le posizioni all’interno della tripletta di nucleotidi di un codone danno luogo in modo equivalente a sostituzioni non sinonime

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I nucleotidi della tripletta appartengono a tre categorieSiti non degeneriSiti non degeneri: posizioni del codone in cui le mutazioni portano sempre a sostituzioni aminoacidiche (es.: UUU codifica per la fenilalanina, CUU per la leucina, AUU per l’isoleucina, GUU per la valina)Siti doppiamente degeneriSiti doppiamente degeneri: posizioni del codone i cui due diversi nucleotidi portano alla traduzione dello stesso aminoacido, mentre gli altri due codificano per un amino-acido differente (es.: GAU e GAC codificano per l’acido aspartico, GAA e GAG per l’acido glutammico)Siti quattro volte degeneriSiti quattro volte degeneri: posizioni del codone in cui il cambiamento di un nucleotide con ciascuna delle altre tre alternative non ha effetti sull’aminoacido che i ribosomi inseriscono nella proteina (es.: terza posizione del codo-ne della glicina)

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Sostituzioni sinomine e non Sostituzioni sinomine e non 4 4

La selezione naturale ”contrasta” primariamente le mutazio-ni che alterano la funzione della proteina

I cambiamenti nucleotidici si accumulano più rapidamente nei siti quattro volte degeneri e meno velocemente nei siti non degeneri

La situazione descritta si osserva normalmente in natura Le sostituzioni che si sono accumulate nelle sequenze codifi-canti dei geni per le globine dell’uomo e del coniglio si rilevano soprattutto in corrispondenza dei siti quattro volte degeneri (le frequenze di sostituzione sono molto simili a quella delle sequenze 3’flanking e delle altre regioni libere da vincoli selettivi)

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Regione No. di siti No. di cambiamenti Frequenza di sostituzione

Non degenere 302 17 0.562degenere 60 10 1.674degenere 85 20 2.35

Indel e pseudogeni Indel e pseudogeni 1 1Nel caso di geni di trascrizione attivi esiste, in natura, una forte propensione a contrastare eventi di inserzione e delezione, a causa della loro tendenza ad alterare la finestra di lettura usata dai ribosomiQuesta tendenza contraria alle mutazioni della finestra di scorrimento nelle regioni codificanti è così forte che gli enzimi coinvolti nella replicazione e riparazione del DNA sembrano essersi evoluti in modo da rendere gli indel in ogni regione del genoma circa dieci volte meno probabili rispetto a agli eventi di sostituzioneNel caso, invece, del fenomeno di duplicazione genica, può accadere che geni, che erano originariamente sottoposti a vincoli selettivi, siano diventati trascrizionalmente inattivi

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Indel e pseudogeni Indel e pseudogeni 2 2I geni con nuove funzioni, comunemente, derivano da geni con funzioni esistenti e utiliLa duplicazione di un intero gene permette a una copia di essere provvista della funzione dell’originale e all’altra di svincolarsi dal vincolo selettivo e accumulare mutazioni (nella regione codificante o nel promotore) Talvolta, la copia in evoluzione del gene è soggetta a cambiamenti che le permettono di acquisire una nuova funzione fondamentale per la salute dell’organismoPiù spesso, tuttavia, una copia diventa uno pseudogenepseudogene, cioè non funzionale e trascrizionalmente inattivoI genomi dei mammiferi sono ricchi di pseudogeni, e le loro sequenze tendono ad accumulare sostituzioni ad una frequenza molto alta, con una media di 4 sostituzioni per sito ogni 100 milioni di anni

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Sostituzioni e mutazioniSostituzioni e mutazioni

La selezione naturale ha un effetto insidioso sui dati disponibili per le analisiCon rarissime eccezioni, infatti, nelle popolazioni di orga-nismi presenti in natura, gli unici allelialleli (varianti di sequenza di un gene) disponibili sono quelli che non hanno avuto un effetto dannoso sulla salute dell’organismo

I cambiamenti nella sequenza nucleotidica di un gene sono tutti possibili, ma non tutti sono invece “osservabili”Differenza fra i concetti di mutazionemutazione e sostituzionesostituzione

Le mutazionimutazioni sono cambiamenti nella sequenza nucleotidica che avvengono per errore durante i processi di replicazione/riparazione del DNALe sostituzioni sostituzioni sono mutazioni che hanno “passato il filtro” della selezione naturale

Il numero di sostituzioni è “facile” da stimare, difficile invece ottenere una stima attendibile della frequenza di mutazione

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Deriva genetica e fissazione Deriva genetica e fissazione 1 1

La maggior parte delle popolazioni di organismi presenti in natura posseggono un numero consistente di variazioni geneticheGli esseri umani, per esempio, differiscono tra loro in media per una coppia di basi ogni 200Versioni diverse di un gene all’interno di un organismo di una data specie sono chiamate allelialleliLe differenze fra gli alleli possono…

…essere relativamente innocue (un’unica differenza in un nu-cleotide in una sequenza 3’flanking)…avere conseguenze drammatiche (per esempio, la presenza di un codone di stop prematuro che causa la produzione di una proteina troncata e non funzionante)

Il cambiamento nelle frequenze relative dei diversi alleli rappresenta l’essenza dell’evoluzione

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Ad eccezione di quelli introdotti tramite migrazione o trasferimento tra specie (trasporto orizzontale del DNAtrasporto orizzontale del DNA, cioè sovrapposizione non dovuta ad ereditarietà), i nuovi alleli provengono da sostituzioni che si presentano in un allele esistente all’interno di un singolo membro di una popo-lazione

Le nuove versioni dei geni si presentano inizialmente con frequenza molto bassa

q1(2N )con N numero di organismi diploidi attivamente riproduttivi all’interno della popolazioneUn allele neutrale appena sorto per sostituzione in una popolazione di N individui ha una probabilità 1/(2N ) di essere fissato e (2N1)/(2N ) di essere eliminato

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Dal momento che le frequenze di sostituzione sono general-mente basse e che i cambiamenti cruciali per la salute di un individuo raggiungono rapidamente una frequenza pari a 0 o 1, come si spiegano i livelli relativamente alti di variazione riscontrati all’interno delle popolazioni di organismi?

La maggior parte delle variazioni osservate tra gli individui ha effetti trascurabili (favorevoli o dannosi), tende ad essere cioè selettivamente neutraleDi fatto, la deriva genetica deriva genetica può portare alla fissazione di alleli neutrali comparsi per mutazione

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La probabilità P che ogni variante neutrale di un gene venga alla fine perduta da una popolazione dipende dal caso ed è pari a 1q, dove q è la frequenza relativa dell’allele nella popolazionePer lo stesso principio, la probabilità che un particolare allele neutrale sia fissato (si presenti nella popolazione con frequenza 1) è uguale a q, la frequenza corrente del gene nella popolazione

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Le analisi comparative fra sequenze permettono ai biologi molecolari di evitare il lungo e faticoso processo di mutagemutage-nesi a saturazionenesi a saturazione, attraverso il quale si producevano tutte le possibili variazioni della sequenza nucleotidica di un gene per determinare quelle in grado di alterarne la funzioneInfatti, la Natura di per sé esegue un esperimento di mutagenesi a saturazione perpetuo e la maggior parte delle variazioni osservabili corrispondono a cambiamenti che non alterano la funzione dei geni in modo significativo

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Stima del numero di sostituzioni Stima del numero di sostituzioni 1 1

Il numero di sostituzioni K in un allineamento tra due se-quenze è la variabile più importante per le analisi di evoluzione molecolareSe esiste un allineamento “ottimale” che suggerisce che tra due sequenze si sono verificate relativamente poche sostituzioni, il conteggio diretto delle sostituzioni osservabili p è una buona stima di KIn generale, il computo diretto è però una sottostima, a causa delle sostituzioni multiple che possono verificarsi relativamente allo stesso nucleotide nel percorso evolutivo dall’ultimo antenato comune

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Stima del numero di sostituzioni Stima del numero di sostituzioni 2 2

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Sottostima del numero di sostituzioni Sottostima del numero di sostituzioni a causa delle sostituzioni a causa delle sostituzioni multiple, le distanze osservate possono sottostimare il reale multiple, le distanze osservate possono sottostimare il reale ammontare del cambiamento evolutivoammontare del cambiamento evolutivo

Modello di Jukes-Cantor Modello di Jukes-Cantor 1 1

Per considerare questa possibilità, T. Jukes e C. Cantor (1969) as-sunsero che ogni nucleotide aves-se la stessa probabilità di essere sostituito da un qualsiasi altroUtilizzando questa ipotesi, crearo-no un modello matematico in cui, se la frequenza di mutazione di

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C

C

T

C

Tempo 1 C

CTempo 0

Tempo 2

un nucleotide in ognuno degli altri tre è , la frequenza complessiva di sostituzione di un dato nucleotide è 3

Dove le sostituzioni sono comuni, non vi sono garanzie che un particolare sito non sia stato sottoposto a cambiamenti multipli


al tempo 1 è PC(1)13

• Poiché, se la C originale mutasse in un altro nucleotide in quel primo lasso di tempo, potrebbe verificarsi una rever-sione (retromutazione) a C, al tempo 2, la probabilità PC(2) sarebbe (13)PC(1) (1 PC(1))

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Si può dimostrare che, a un dato tempo t, nel futuro, vale

PC(t) 14 (34)e4t

In questo modello, se un sito all’interno di un gene è occupato da una C al tempo 0, allora la probabilità PC(1), che in quel sito rimanga lo stesso nucleotide


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Infatti, utilizzando una formalizzazione del metodo mediante la matrice di probabilità di sostituzione puntuale si ha:

con rij che rappresenta il tasso di sostituzione del nucleo-

tide j con il nucleotide i• Sia P la matrice evolutiva, dove gli elementi pij sono le

probabilità di avere, in un certo sito, il nucleotide i al tempo t, dato j al tempo t0


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La matrice evolutiva P è la soluzione dell’equazione differenziale

dP(t)/dt P(t)Rovvero

dpij(t)/dt pik(t)rkj

da cui P(t) exp{Rt}

• Pertanto, gli elementi della matrice P sono complessi-vamente definiti da

14 (14)e4t se i j pij(t) 14 (34)e4t se i j

4

k1

{


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I dati di sequenze nucleotidiche divennero disponibili, per la prima volta, dieci anni dopo la formulazione del modello di Jukes e Cantor e fu subito evidente che l’assunzione di uniformità globale, nei pattern di sostituzione, costituiva una semplificazione grossolanaTuttavia, il loro modello continua a fornire un utile strumento per valutare il numero K di sostituzioni per sito, quando sono possibili sostituzioni multiple


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Il modello JC può essere formalizzato anche attraverso la relazione

K 34 ln[1(43)p]

dove p è la frazione di nucleotidi che un semplice conteggio rivela essere differenti fra le due sequenze

L’equazione è coerente con l’idea che, quando due sequenze hanno pochi siti di noncorrispondenza, p sia piccolo, così come è bassa la probabilità che siano avvenute sostituzioni multiple in un dato sitoViceversa, quando si osserva un numero significativo di noncorrispondenze, il numero reale di sostituzioni per sito sarà molto maggiore del computo direttoI termini 34 e 43 danno atto della presenza di quattro nucleotidi che possono essere sostituiti in tre modi diversi, tutti equiprobabili (sequenze non affini dovrebbero corrispondere al 25% solo per effetto del caso)


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EsempioEsempioSe due sequenze sono identiche per il 95%, sono diverse per il 5%, ovvero p0.05, perciò:

K 34 ln(1(43)0.05) 0.0517Da notare che la dissimilarità osservata di 0.05 aumenta soltanto leggermente, essendo la distanza stimata pari a 0.0517 ciò ha un senso perché in due sequenze molto simili ci si aspettano pochi cambiamenti multipli nello stesso sito, dato il breve tempo di divergenzaTuttavia, se due sequenze sono identiche soltanto per il 50%, sono diverse per il 50%, ovvero p0.50, perciò

K 34 ln(1(43)0.5) 0.824

Stima del numero di sostituzioni (cont.)Stima del numero di sostituzioni (cont.)

Per aumentare il realismo dei modelli metrici si posso-no considerare ulteriori parametri

È meglio usare un modello che sia conforme ai dati piuttosto che imporre, alla cieca, un modello sui datiI parametri più comuni che vengono aggiunti sono:

Una correzione per la proporzione di siti invariantiUna correzione per i tassi di variazione per i siti variabiliUna correzione che permetta tassi di sostituzione differente Una correzione che permetta tassi di sostituzione differente per ogni tipo di cambiamento nucleotidicoper ogni tipo di cambiamento nucleotidico

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Modello di Kimura Modello di Kimura 1 1

Si assume che le transizioni avven-gano con una frequenza costante e le transversioni con una frequen-za costante In natura, 3Se un sito all’interno di un gene è occupato da una C al tempo 0, la probabilità che in quel sito rimanga lo stesso nucleotide al tempo 1 risulterebbe essere

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PCC(1) 12

Nel 1980, M. Kimura sviluppò un modello a due parametri per tenere in considerazione le differenze di frequenza di transizioni e transversioni


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Retromutazioni potrebbero verificarsi tra il tempo 1 ed il tempo 2, e la probabilità che il sito contenga ancora una C al tempo 2, PCC(2), è la somma delle probabilità associate alle quattro diverse situazioni

e cioè:PCC(2) (12)PCC(1) PGC(1) PAC(1) PTC(1)

C

C

TTempo 1

C

A

CTempo 0

Tempo 2 C

C

C

C

G

C


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Come nel modello JC, continuando ad espandere la formula di ricorrenza per il calcolo della probabilità di invarianza nel tempo di un dato nucleotide, si ottiene

PCC(t) 14 (14)e4t (12)e2()t

Utilizzando la matrice di probabilità, il modello di Kimura sarà descritto da:


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La simmetria dello schema di sostituzione fa sì che tutti i nucleotidi abbiano la stessa probabilità di rimanere in situ tra il tempo 0 e qualsiasi istante t nel futuro (PGG(t) PAA(t)

PTT(t) PCC(t))

Si deriva la stima per K

K 12 ln[1(1 2P Q)] 14 ln[1(1 2Q)]

con P frazione di nucleotidi che un semplice conteggio rivela essere transizioni e Q frazione di transversioni

Se non viene fatta distinzione fra transizioni e trans-versioni, ponendo p P Q, si ottiene nuovamente la stima prodotta dal metodo di JukesCantor

Modelli a molti parametri Modelli a molti parametri 1 1

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La grande quantità di dati di sequenza generati a partire dagli anni ‘80, ha rivelato che anche l’assun-zione di Kimura, che assegna probabilità distinte per transizioni e transversioni, è ancora significativamente distante da quanto avviene in naturaPoiché ogni nucleotide può di fatto essere sostituito da uno qualunque degli altri tre, sono possibili 12 diffe-renti tipi di sostituzione, AC AG AT CA CG CT GA GC GT TA TC TGa ciascuno dei quali può essere assegnata una diversa probabilità, andando a costituire un modello a 12 parametri


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Un esempio di matrice di punteggio (per le frequenze relative di sostituzione nucleotidica nella sequenza di AluY del genoma umano) è data da:

Un tredicesimo ulteriore parametro potrebbe essere impie-gato per compensare le differenze tra quanto descritto dalla matrice di punteggio e la tendenza (osservabile) alla sosti-tuzione associata del contesto genomico regionale GC

A T C G

A 4.0 4.6 9.8

T 3.3 10.4 2.7

C 7.2 17.0 6.2

G 23.6 4.6 6.0

Valued Acer Customer

I membri della famiglia di DNA ripetitivo Alu sono approssimativamente lunghi 260 coppie di basi. Sono derivati da un'unica o da un piccolo numero di sequenze ancestrali che sono state duplicate quasi un milione di volte durante l'evoluzione dei primati.


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Tuttavia… gli studi di simulazione indicano che i mo-delli più semplici (ad uno o due parametri) forniscono spesso risultati più attendibili rispetto ai modelli a più parametri, perché…

…non necessitano di grosse quantità di dati per stimare le frequenze relative di sostituzione (senza l’introduzione di errori di campionamento)…sono, di fatto, virtualmente indistinguibili quando le sequenze in esame sono strettamente correlate

Sostituzioni tra sequenze proteiche Sostituzioni tra sequenze proteiche 1 1

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La proporzione p degli aminoacidi diversi tra due sequenze proteiche può essere “osservata” come per le sequenze nucleotidiche (e valutata come il rapporto fra i siti di non corrispondenza e la lunghezza delle sequenze)Tuttavia, stabilire con esattezza il numero di sostitu-zioni verificatesi nel percorso evolutivo di due o più proteine è generalmente più complesso dell’opera-zione equivalente sulle sequenze di DNA (una sosti-tuzione aminoacidica corrisponde ad un numero varia-bile di sostituzioni nella sequenza nucleotidica codi-ficante)Così come per le sequenze nucleotidiche, le sostitu-zioni osservate rappresentano una sottostima del nu-mero di sostituzioni occorse nel percorso evolutivo

Sostituzioni tra sequenze proteiche Sostituzioni tra sequenze proteiche 2 2

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Inoltre:Alcune sostituzioni si verificano più frequentemente di altreIl percorso che porta alla sostituzione di un aminoacido con un altro non ha sempre la stessa lunghezza

EsempioEsempio: il codone CCC per la prolina può essere convertito nel codone CUC per la leucina con una sola sostituzione, ma non è possibile convertirlo in un codone AUC per l’isoleu-cina, se non utilizzando due sostituzioni

Le sostituzioni aminoacidiche non hanno tutte un effetto equivalente sulla funzione proteica e gli effetti differi-scono per contesti distintiPesare ogni sostituzione aminoacidica in modo diverso, in base a stime su dati empirici, utilizzando una matrice tipo PAM

Variazioni nella velocità evolutiva Variazioni nella velocità evolutiva 1 1

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Variazioni nelle velocità evolutive sono visibilmente riconoscibili nel confronto fra differenti regioni all’inter-no dello stesso gene, così come si osservano differen-ze rilevanti nella velocità di evoluzione fra geni diversiSe non si considerano le possibili fluttuazioni dovute ad errori di campionamento su piccole popolazioni, la differenza di velocità evolutiva è attribuibile a due fattori principali:

Differenze nella frequenza di sostituzioneEffetto, in termini quantitativi, della selezione naturale sul locus

Esempi specifici di due classi di geni, che codificano per istoniistoni e apolipoproteineapolipoproteine, illustrano gli effetti dei di-versi vincoli funzionali che impattano sulla velocità evolutiva


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Esempio 1Esempio 1Gli istoni sono proteine essenziali cariche positivamente che si legano al DNA e sono presenti in tutti gli eucariotiLa quasi totalità degli aminoacidi di un istone interagisce direttamente con specifici residui chimici associati con il DNA carico negativamente

Ogni cambiamento nella sequenza aminoacidica dell’istone può influire sulla sua capacità di interazione con il DNAGli istoni si evolvono molto lentamenteÈ possibile sostituire l’istone H2A di lievito con il suo omo-logo umano senza effetti collaterali, anche se la speciazio-ne ha prodotto milioni di anni di evoluzione indipendente


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Esempio 2Esempio 2Le apolipoproteine accumulano sostituzioni non sinonime ad altissima frequenzaSono responsabili dell’interazione non specifica con una gran varietà di lipidi e del loro trasporto nel sangue dei vertebratiI loro siti di legame con il lipide sono composti princi-palmente da aminoacidi idrofobici

Ogni aminoacido idrofobico (leucina, isoleucina e valina) funziona ugualmente bene


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Anche se le sostituzioni nucleotidiche in molti geni sono generalmente deleterie, in alcuni casi la selezione naturale favorisce, di fatto, la variabilitàEsempioEsempio

I geni associati con l’antigene (macromolecola capace di rea-gire con i prodotti del sistema immunitario) dei leucociti uma-ni, HLA, sono altamente inclini alla diversificazione evolutivaNella popolazione umana, circa il 90% degli individui riceve differenti insiemi di geni HLA dai propri genitori e si può stimare che, per un campione di 200 individui, si abbiano dai 15 ai 30 alleli differentiLivelli elevati di diversità, nel caso specifico, sono favoriti dalla selezione naturale, perché il numero di individui vulnerabili ad una data infezione da parte di ogni singolo virus è assai minore rispetto al caso di un unico sistema immunitario


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Mentre le popolazioni ospiti sono sottoposte a pressione evolutiva per mantenere diversi i propri sistemi immunitari, i virus sono sottoposti a pressione analoga per evolversi rapidamenteUna replicazione che tende all’errore, accoppiata con una selezione naturale diversificatrice, fa sì che la frequenza di sostituzioni nucleotidiche nei geni NS dell’influenza sia ugua-le a 1.9103 sostituzioni per sito per anno, un milione di volte più grande della frequenza di sostituzioni sinonime nei geni rappresentativi dei mammiferi

Orologi molecolari Orologi molecolari 1 1

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L’idea di datare gli eventi evolutivi attraverso le differenze calibrate fra le proteine fu espressa per la prima volta nel 1965 da E. Zuckerkandl e L. Pauling, che rilevarono come le velocità di evoluzione molecolare per loci con vincoli funzionali simili siano pressoché costanti su lunghi periodi di tempoDa osservazioni fatte su differenti globine, Zuckerkandl e Pauling postularono che la differenza genetica tra due specie diverse, espressa dalla sequenza aminoacidica, è funzione del tempo di divergenza dall’antenato comuneLa verifica di tale affermazione fu ottenuta confrontando le sequenze proteiche e, quindi, i tassi di sostituzione amino-acidica, di diverse specie, con i tempi di divergenza stimati sulla base di ritrovamenti fossili


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di battiti tra due proteine omologhe appare linearmente correlato con la quantità di tempo trascorso dal momento in cui la speciazione le ha fatte divergere nel loro percorso evolutivo

Le frequenze di sostituzione in proteine omologhe erano così costanti su molte decine di milioni di anni, da suggerire un paragone diretto fra l’accumulo di cambiamenti aminoacidici ed il continuo ticchettio di un orologio orologio molecolaremolecolareL’orologio molecolare può “battere” a diverse velocità per proteine distinte, ma il numero


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Secondo l’ipotesi dell’orologio molecolare, quindi, i geni e i prodotti genici evolvono con tassi che sono approssimati-vamente costanti nel tempo e lungo le differenti linee evolutivePerciò, se la divergenza genetica si accumula in modo regolare con il passare del tempo, allora è possibile dedurre i tempi di divergenza anche in assenza di evidenze fossiliIn pratica, una frequenza costante di variazione faciliterebbe non solo la determinazione delle relazioni filogenetiche fra specie, ma anche dei tempi di divergenza, così come il decadimento radioattivo si utilizza per stimare i tempi geologici


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La validità dell’ipotesi di un orologio molecolare universale è stata subito molto discussa

E. Mayr, nel 1965, affermò: “Evolution is too complex and too Evolution is too complex and too variable a process, connected to too many factors, for the time variable a process, connected to too many factors, for the time dependence of the evolutionary process at the molecular level dependence of the evolutionary process at the molecular level to be a simple functionto be a simple function”……mentre gli evoluzionisti classici argomentavano che l’anda-mento irregolare dell’evoluzione morfologica era incompatibile con una velocità costante di cambiamento molecolare

Inizialmente ci si riferì ad un orologio molecolare proteico, dal momento che negli anni ‘60, i dati sul DNA erano ancora troppo scarsi, ed intenso fu il dibattito fino agli anni ‘80, che portò fino a mettere in discussione l’essenza stessa dell’idea di Zuckerkandl e Pauling, ovvero la costanza delle velocità evolutive


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Fin dal 1971 è stato chiaro che proteine diverse evolvono con tassi ampiamente variabiliDi conseguenza venne esclusa, da subito, la possibilità di osservare un orologio proteico universaleTest statistici condotti da Ohta e Kimura (1971), da Fitch (1976), da Gillespie e Langley (1979) hanno restituito risul-tati contrastanti, suggerendo che l’ipotesi dell’orologio molecolare proteico deve essere rifiutata per la maggior parte delle proteine sia nei confronti fra vertebrati che fra invertebrati


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EsempioEsempioPer determinare la frequenza relativa di sostituzione nelle discendenze delle specie 1 e 2, occorre definire una specie 3, meno correlata ma simile, come gruppo esternogruppo esternoUomo e gorilla outgroupoutgroup: babbuino

3

A

1 2

La maggior parte delle date di divergenza utilizzate negli studi di evoluzione molecolare provengono dall’interpre-tazione di testimonianze fossili, incomplete e inaccuratePer evitare ogni questione sulle date di speciazione, Sarich e Wilson (1973) proposero un metodo per stimare la fre-quenza complessiva di sostituzione in diverse discendenze, indipendentemente dalla conoscenza dei tempi di diver-genza


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Esempio (cont.)Esempio (cont.)Si assume che il numero di sostituzioni tra due specie qualsiasi sia uguale alla somma del numero di sostituzioni presenti lungo i rami dell’albero filogenetico che le connette

d13 dA1 dA3

d23 dA2 dA3

d12 dA1 dA2

dove d13, d23, d12 si “osservano” e misurano rispettivamente le differenze tra le specie 1 e 3, 2 e 3, 1 e 2

• Si può ricavare la divergenza occorsa fra le specie 1 e 2, dal momento in cui hanno condiviso l’ultimo antenato

dA1 (d12 d13 d23)2dA2 (d12 d23 d13)2

• Per definizione, il momento in cui le due specie hanno cominciato a divergere è lo stesso

Hp. Orologio molecolare: i valori dA1 e dA2 coincidono


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La quantità di dati disponibili per testare l’ipotesi dell’oro-logio molecolare sta crescendo in modo esponenzialeLe frequenze di sostituzione nei ratti e nei topi sono risultate molto similiViceversa, l’evoluzione molecolare dell’uomo e della scimmia antropomorfa (es. gorilla) ha una velocità pari alla metà di quella delle scimmie del vecchio mondo (es. babbuini) dal momento della loro speciazioneInfatti, i test di frequenza relativa eseguiti su geni omologhi nel topo e nell’uomo indicano che i roditori hanno accumu-lato un numero di sostituzioni doppio rispetto ai primati, dall’ultimo antenato comune (speciazione dei mammiferi) da 80 a 100 milioni di anni fa

Orologio molecolare non costante: l’uso della divergenza molecolare per datare i tempi di esistenza di due specie ha senso solo se le specie “condividono l’orologio”


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Cause di variazione di frequenza nelle discendenzeDiversità dei tempi di generazione (durata del periodo riproduttivo)Efficienza media di riparazione, tasso metabolicoNecessità di adattamento a nuove nicchie ecologiche

Difficili da quantificare:Conosciamo le differenze attualiSappiamo che nel momento della divergenza gli organi-smi avevano attributi simili……ma abbiamo poche informazioni sulle differenze relati-ve durante tutto il corso dell’evoluzione

L’evoluzione negli organelli L’evoluzione negli organelli 1 1

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All’interno della cellula eucariota sono presenti vari organelliorganelli od organuliorganuli, che svolgono differenti funzioni necessarie alla sua sopravvivenzaGli organelli, assieme al citosolcitosol, formano il citoplasmacitoplasma

Gli organelli di una cellula vegetale (a) e di una cellula animale (b)Gli organelli di una cellula vegetale (a) e di una cellula animale (b)

(b)(b)(a)(a)

L’evoluzione negli organelli L’evoluzione negli organelli 2 2La lunghezza media del DNA mitocondriale (i mitocondrimitocondri sono organuli, che servono per la produzione di energia, presenti nel citoplasma di tutte le cellule animali a meta-bolismo aerobico) dei mammiferi, abbreviato con mtDNA, è di circa 16000 coppie di basiViceversa, il DNA dei cloroplasticloroplasti (organuli presenti nelle cellule delle piante e nelle alghe eucariotiche, all’interno dei quali si svolge il processo di fotosintesi) varia in lunghezza tra le 120000 e le 220000 coppie di basi

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cloroplasto

mitocondrio


I singoli cromosomi di entrambi gli organelli contengono geni codificanti proteine ed RNA che sono essenziali per la loro funzioneLa dimensione relativamente piccola dei cromosomi presenti sia nei mitocondri che nei cloroplasti ed il pattern inusuale di ereditarietà (nei mammiferi, i mitocondri sono un contributo unicamente materno) li rende interessanti oggetti di studio per l’evoluzione molecolare

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L’alta concentrazione di mutageni presenti all’interno dei mitocondri (soprattutto radicali liberi radicali liberi dell’ossigeno) sotto-pone l’mtDNA ad una frequenza di mutazione pari a dieci volte quella del DNA nucleare, con sostituzioni sia sinonime che non

Si usa mtDNA per studiare le relazioni evoluzionistiche fra popolazioni di organismi strettamente correlateÈ invece poco utile per specie che hanno subito una divergenza da più di 10 milioni di anni perché ci si aspetta che siano avvenute sostituzioni multiple (non osservabili) in ogni sito

Viceversa, il DNA dei cloroplasti accumula sostituzioni molto lentamenteIl numero di sostituzioni sia sinonime che non è circa un quinto delle sostituzioni osservate per i geni nucleari delle stesse specie

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Concludendo… Concludendo… 1 1

Il DNA, come ogni altra molecola, accumula nel tempo danni chimiciQuando tali danni, o un errore di replicazione del DNA, determinano un cambiamento del contenuto informa-tivo di una molecola di DNA, si dice che si è verificata una mutazioneIn altre parole, le mutazioni sono cambiamenti del materiale genetico (DNA e più raramente RNA) di un organismo

Possono originarsi spontaneamente o essere indotte da particolari agenti fisici o chimici detti, appunto, mutageniSe non sono riconosciute e riparate correttamente dai sistemi di riparazione del DNA si fissano permanente-mente nel genoma e vengono ereditate dalle generazioni successive 80

Le mutazioni potranno avere un effetto, sia positivo che (più frequentemente) negativo, oppure essere neutraliLe mutazioni forniscono in pratica il “materiale grezzo” su cui agisce l’evoluzione

Creano in una popolazione la necessaria condizione di variabilità genica, su cui operano i processi di ricombi-nazione genetica formando le diverse combinazioni alle-liche di ciascun individuo; queste combinazioni infine possono essere sottoposte a diversi processi evolutivi che alterano la frequenze dei vari alleli

La selezione naturale, quindi, causa molte perdite nel pool dei geni e i cambiamenti che vanno soggetti a “fissazione” sono detti sostituzioni


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Le frequenze di sostituzione possono essere usate come una misura dell’importanza funzionale di un gene o di una porzione del genoma

Le sequenze sono tanto più “stabili” quanto più una sostituzione potrebbe causare perdita di funzionalità della proteina codificata e conseguenze deleterie per la vita dell’organismo

Per stimare il numero totale di sostituzioni che hanno portato all’attuale divergenza di due sequenze omolo-ghe (di nucleotidi o aminoacidi) sono stati sviluppati diversi modelli parametrici che considerano la possibi-lità di sostituzioni multiple in un dato sito

Modelli con pochi parametri (uno o due, che descrivono le probabilità di transizione/transversione) sono più ro-busti e computazionalmente più semplici


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Tuttavia, poiché alcuni geni accumulano sostituzioni più velocemente di altri, i test di frequenza relativa mostrano che gli organismi possono avere caratte-ristiche evolutive diverse, anche quando si considerino geni con vincoli funzionali simili


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pattern di sostituzione 1 la vita organica, ci dicono, si è evoluta gradualmente dal protozoo al...

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