pcr 及分子标记

PCR 及分子标记

资料来源：丁香园

生命经纬 www.biox.cn

PCR(Polymerase Chain Reaction)

Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.

Peoples Choice Reaction


The PCR cycle

• 95 step to℃ denature the duplex DNA,

• An annealing step of around 55 to allow ℃the primers to bind,

• 72 ℃ polymerization step.

• Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and enzyme


历史60s-70s：基因的体外分离技术。Khorana （ 1971）：美国 MIT教授、 1968年诺贝尔医学奖得主 “经过 DNA变性，与合适引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想遗忘 : 当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；当时 (1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能


Kary Mullis(1985)

发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到 : “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下， � 即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌 �DNA聚合酶 Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性 DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热 DNA聚合酶的应用使得自动化。


专利官司1987年美国专利局专利授权1989年， DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。 DuPont理由是， 1971年 PCR� 的雏形已由 Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学 Kornberg（研究 DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从 Khorana等的文章中推知如何操作 PCR。

美国专利局驳回 DuPont异议，地方法院判属CetusCetus获胜后马上反诉，指出 DuPont已侵犯另一项与 �PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与 PCR有关试剂和仪器


PCR 发展速度

惊人，没有一种技术能与之相比

引用论文最多、应用范围十分广泛

1993 � 年度诺贝尔化学奖： Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家 Michael Smith共获


原理类似于 DNA的体内复制。首先待扩增DNA �模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。 �这种热变性 - 复性 - 延伸的过程就是一个PCR循环， PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。


procedures

• template(DNA or RNA),

• primers,• Taq enzyme,• 10×PCR buffer,• Mg++,

• 5mmol/L dNTPs

• pre-denaturation--denature completely

• Denaturation• annealing• Elongation• cycles:25-30


Primer designMost imp.(1)length: 20 ～ 30bp(2)G+C contents:ATCG random distributed(3)primers : no complementary sequence(4)3‘end of the primer: no modification(5)5‘end of the primer:product length ， can be modified(6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base


Primer designed with the help of computer

DNA databaseconservative region comparisionprimers or blast


PCR reaction components and their functions

template ： ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNAsamples ： from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques.DNA ： very stable


primesIf the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5’-ends of the primers.Can amplify fragments over 10kb in lengthStore:纯化引物在 25％乙腈溶液中4℃ ；冻干引物于 -20℃ 可保存 1-2年，液体状态于 -20℃ 可保存 6 个月。不用时应 -20℃保存。


buffer10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃) 。Mg2+ ： for Taq polymerase activityconc.:Low:low activity high: non-specific amplification

dNTPs ：贮备 dNTP液： 1 mol/L NaOH 调 pH至中性。贮备浓度为 5-10mmol/L，终浓度为 20-200umol/L，分装 -20℃保存。4 种 dNTP浓度应相同。


Taq DNA polymerase ：

from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus.other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.

mineral oil


Selection for DNA polymeraseKlenow 酶早期采用该酶不耐热，缺点有①温度要求低 (37 )℃ ，受热即失活；②产物特异性不高；③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；④扩增的最长序列约 400bp（ Taq酶则能扩增10kb）


thermostable DNA polymerases

①Taq DNA polymerase

②Tth DNA polymerase—from

T.thermophilus

③VENT DNA polymerase—from

T.litoralis

④Sac polymerase

⑤pfu polymerase


Taq DNA 聚合酶•分离 :1969年，美国黄石国家公园温泉

•分子量 :94KDa•活性：在几种水生栖热菌中活性最高， 200 000U/mg


Taq DNA 聚合酶离子需要：对 Mg2+、单价离子性质和浓度较

敏感。最适浓度为50mmol/L。忠实性 : 没有校正单核苷酸错配功能 --致命弱点。一般出错率为 2×10-4核苷酸 / 每轮循环，利用 PCR克隆、测序时尤应注意。


Taq DNA 聚合酶抑制剂 : 尿素、乙醇、 DMSO 、 DMF、甲酰胺、 SDS � 及许多其他化学药剂。

内源 DNA: 不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌 DNA 或 PCR产物的污染而含有不明来源的 DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存 : 在 -20℃至少 6 个月。


PCR optimization变性温度和时间92-95℃ ，富含 G 和 C 的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间引物中 G 、 C 含量高、 �长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常 37-55℃ 、 1-2分钟。延伸温度和时间温度： 72℃ ，接近 Taq酶的最适 75℃时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。循环次数循环过多，非特异性产物大量增加


PCR 污染及其对策强大扩增能力 + 检测的敏感性极微量的污染便可导致假阳性

污染源的追踪①点样器和加样器 ;② 离心机 ;③微解剖刀 ;④浓缩用具、真空瓶 ;⑤电泳装置 ;⑥紫外灯箱 ;⑦乙醇或水浴锅 ;⑧冰箱门把手、实验台面等


污染的预防

(1)隔离不同操作区 (2)分装试剂 (3)改进实验操作 (4)专用加样器(5)结果的重演

PCR 技术的应用


遗传性疾病

地中海贫血的基因诊断

血友病

苯丙酮尿症


传染性疾病

肝炎性病肿瘤


法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家 Jeffreys采用DNA

指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 �有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA指纹分析， PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中 PCR技术被普遍采用。


植物遗传育种

构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化


畜牧

畜禽病诊断 : 猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测

性别鉴定：牛、绵羊 Y 染色体上特异 DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达：转基因鱼


植物保护

杀虫病原微生物的基因型鉴定植物病原微生物分类形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录 PCR （ RT-PCR）可准确快速区分


其他

①考古学②植物分类学③群体生态学

Molecular marker


Introduction形态标记、细胞学标记、生化标记

数十种技术问世。万变不离其宗：分子杂交、 PCR扩增第一类：电泳、分子杂交为核心代表： RFLP 、 DNA指纹第二类：电泳、 PCR为核心代表： RAPD 、 SSR 、 AFLP第三类： DNA序列为核心代表： ITS测序分析


优点

•数量丰富、信息量大；•与生长发育无关，取材不受限制；•较多共显性，信息量完整•在真核生物中，基因组 DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的 DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约


Applications

• 种质资源研究• 品质纯度鉴定（包括 DNA指纹鉴定）• 构建遗传连锁图• 基因定位（ QTL）• 标记辅助选择• 比较基因组研究• 基因克隆（图位克隆）• 生物起源、进化、医学及法医学


RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)by Botstein(1980)

基本原理：物种的基因组 DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记 DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。优点 : 共显性，非常稳定缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱；用作探针的 DNA克隆制备、保存不方便；放射性同位素自从人的 RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的 RFLP图谱。


RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA)1990:Williams(Du Pont) ： RAPD;Welsh(Cal.Biology Inst.) ： AP-PCR(Arbitrary Primer-PCR) =Random Primer-PCR=Oligo Primer-PCR=SODA(Small Oligo DNA Analysis ）

Rapid and simpleRandom primer:9-10bp


与常规 PCR 的不同A. 引物长度短常规 PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。 �RAPD只需一个引物，长度 9-10个核苷酸，而且是随机引物。B. 退火温度低RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为 35-37℃ 。


通用性--实验步骤少，省工、省力、进度快--不需先知道基因组的任何分子信息--所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体 �DNA研究中也可使用；--引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有广泛性和通用性。


植物分子生物学中的应用用于种属特异性鉴定外源导入基因的追踪遗传作图RAPD标记从理论上讲是无限的，而且在端粒及重复顺序上可以找出 RAPD标记位点，因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。鉴定染色体上特异的 DNA片段，进行基因定位和分离 RAPD易发现多态性，敏感性高。可找出与靶基因连锁的 RAPD标记，进行基因定位。


AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism)

瑞士 Zabeau 等 1992年发明结合了 RFLP 和 PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和 PCR � 技术高效性。基本原理：对基因组 DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。它将 RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。


三个步骤

(1)DNA � 酶切及人工接头连接，对提取 DNA质量要求较高，需避免其它DNA �污染和抑制物质的存在；(2) 扩增反应；(3) 通常在 4 ％ -6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离


特点--理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。--每次谱带在 50-100条之间，多态性检测非常有用--呈典型的孟德尔方式遗传--可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。--可用于分析基因组 DNA、克隆的 DNA大片段，—对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。


缺点专利技术，试剂盒价格贵

需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备

基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对 DNA纯度和内切酶的质量要求较高。


SSR （ Simple sequence Repeat ）=(microsatellite)=(Short Tandem Repeat,STR)

Satellite DNA ：真核生物基因组酶切、离心后，在主带附近会出现（ AT）含量很高的简单高度重复序列。

Microsatellite DNA ：一类由几个核苷酸（一般 1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的 DNA序列。

继 RFLP之后的第二代分子标记多态性好、重复好、共显性标记


特点微卫星 DNA广泛存在：人和动物（ TG） n ，植物（ AT） n微卫星 DNA长度的多态性微卫星 DNA两端多是高度保守的单拷贝序列

原理根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序列多态性。


applications构建遗传连锁图种质资源鉴定标记辅助育种基因诊断与治疗：一些人类基因病的产生与三核苷酸重复序列动态有关。


其他• 简单序列重复区间（ Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)

• 序列标记位点（ Sequence-Tagged Sites,STS)

• 小卫星 DNA（ Minisatellite DNA)

• 单链构型多态性（ Single-strand Comformation Polymorphism,SSCP)

• 变性梯度凝胶电泳（ Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)

pcr 及分子标记

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