碱性磷酸酶标记的链霉亲和素－生物素法（碱性磷酸酶标记的链霉亲和素－生物素法（ SSAPAP 法）法）

实验材料实验材料• 1 、小鼠胰腺的石蜡切片；• 2 、胰岛素抗体（鼠抗人单克隆抗体）；• 3 、 SAP 检测试剂盒；• 4 、正常羊血清；• 5 、 0.01M PBS（ pH7.2～ 7.6） ；• 6 、 BCIP/NBT 显色试剂；• 7 、孵育湿盒。

实验原理

ABCABC法法 SAPSAP 法法

实验方法或步骤实验方法或步骤• 11 、石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗，、石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗， PBSPBS 浸泡浸泡 2min2min ；； (( 如需采用如需采用

抗原修复，可在此步后进行抗原修复，可在此步后进行 )) 。。• 22 、、 1010 ％正常羊血清封闭，室温孵育％正常羊血清封闭，室温孵育 10min10min ；；• 33 、倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工、倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工

作液，作液， 37℃37℃ 孵育孵育 45min45min 。 。 PBSPBS 冲洗，冲洗， 3×3min3×3min ；；• 44 、滴加生物素标记羊抗鼠、滴加生物素标记羊抗鼠 IgGIgG 工作液，工作液， 37℃37℃ 孵育孵育 20min20min ；；• 55 、 、 PBSPBS 冲洗，冲洗， 3×3min3×3min ；；• 66 、滴加碱性磷酸酶标记链霉亲和素工作液，、滴加碱性磷酸酶标记链霉亲和素工作液， 37℃37℃ 或室温孵育或室温孵育

20min20min 。 。 PBSPBS 冲洗，冲洗， 3×3min3×3min ；；• 77 、显色剂显色（、显色剂显色（ BCIP/NBTBCIP/NBT ）；）；• 88 、自来水充分冲洗，封片。、自来水充分冲洗，封片。

结果 胰岛内可见蓝色或紫蓝色着色的阳

性细胞，阳性产物见于细胞质

多聚鳌合物酶法

HRP--- 多聚化合物 --- 抗体

一、 Epos 法

Enhanced polymer one-step staining

组织抗原

一抗

HRP

多聚化合物骨架

EPOS 方法

原理：采用一种具有惰性的多聚

化合物作为骨架，将特异

性抗体和 HRP ，同时标记

在多聚合物分子上，形成

HRP--- 多聚化合物 --- 特异

性抗体。

步骤：一步法

特点：快速，简便，特异性强，

敏感性高

但商品化种类不全，

价格昂贵

二、 EnVision 法（或 PowerVison ）

Enhanced Labelled Polymer System

原理： HRP --- 多聚化合物 --- 第二 抗体

组织抗原

一抗

二抗酶多聚化合物骨架

第一步 第二步

PowerVision 方法

特点：

敏感性高：（每个多聚鳌合物中含 70 个 HRP

分子和 10 个第二抗体）

特异性强： 复合物内无内源性 Avidin 和

Biotin 的干扰。

基本操作步骤 1. 抗原修复

2. 内源性过氧化

物抑制

3. 正常血清封闭

4. 第一抗体

5. 多聚骨架复合物

6. 显色

实验步骤实验步骤• 11 、石蜡切片脱蜡至水，、石蜡切片脱蜡至水， PBSPBS 洗洗 3×3min3×3min ；；• 22 、、 3%H3%H22OO22 室温孵育室温孵育 10min10min ，以消除内源性过氧化 ，以消除内源性过氧化 物酶的活性；蒸馏水洗，物酶的活性；蒸馏水洗， PBSPBS 浸泡浸泡 5min5min ；；• 33 、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液， 、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液， 37℃37℃ 孵育孵育 1hr1hr ；；• 44 、 、 PBSPBS 冲洗，冲洗， 3×3min3×3min ；；• 55 、 滴加、 滴加 HRPHRP 标记羊抗小鼠标记羊抗小鼠 IgIg 多聚体，多聚体， 37℃37℃ 或室温孵或室温孵 育育 2020 ～～ 30min30min ；；• 66 、 、 PBSPBS 冲洗，冲洗， 3×3min3×3min ； ； • 77 、显色剂显色（、显色剂显色（ AECAEC 或或 DABDAB ）；）；• 88 、自来水充分冲洗，封片。、自来水充分冲洗，封片。

结果：胰岛内可见棕色着色的阳性细胞，阳性产物见胰岛内可见棕色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质。于细胞质。

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