pcr pv - 92
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Según el kit de BIORADTRANSCRIPT
DEPARTAMENTO
DE QUÍMICA
Monitorización por PCR del intrón Alu del locus
PV92 del cromosoma 16 humano
AURORA CRIADO MONTERO, CARLOS DE PAZ VILLASENÍN, PILAR MACÍA RODRÍGUEZ, MARY SOL OTERO FERNÁNDEZ, MARIANO PAZOS AFONSO 1 de 29 | Página
Contenido
1.-TITULO: Monitorización por PCR del intrón Alu del locus PV92 del cromosoma 16 humano. ....................... 3
2.-OBJETO ............................................................................................................................................................ 3
3.-ALCANCE .......................................................................................................................................................... 3
4.-REFERENCIAS ................................................................................................................................................... 3
5.-DESCRIPCION ................................................................................................................................................... 4
5.1.- Fundamento ................................................................................................................................................ 4
Planificación de la práctica .................................................................................................................................. 5
5.2- Material necesario ....................................................................................................................................... 6
5.3- Procedimiento operativo ........................................................................................................................... 10
Sesión 1A: Previo a la Preparación del Molde de ADN .................................................................................. 10
Sesión 1A: PREPARACIÓN DEL MOLDE DE ADN ............................................................................................ 11
Introducción .................................................................................................................................................. 11
Procedimiento ............................................................................................................................................... 12
Sesión 1B: Previo a la Amplificación por PCR ................................................................................................ 14
Sesión 1B: AMPLIFICACIÓN POR PCR ............................................................................................................ 16
Introducción .................................................................................................................................................. 16
Procedimiento ............................................................................................................................................... 16
Sesión 2A: Previo a la Preparación del gel de agarosa .................................................................................. 18
Sesión 2A: PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA .......................................................................................... 18
Introducción .................................................................................................................................................. 18
Procedimiento ............................................................................................................................................... 18
Sesión 2B: Previo a la Electroforesis de los productos obtenidos en la PCR y Tinción de los geles .............. 19
Sesión 2B: ELECTROFORESIS DE LOS PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA PCR Y TINCIÓN DE LOS GELES .......... 20
Módulo: ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS
UD 2: Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos UD 4: Amplificación de Ácidos Nucleicos por PCR y
Separación por Electroforesis Laboratorio de Biotecnología Duración: 9 horas
(3 sesiones)
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Introducción .................................................................................................................................................. 20
Procedimiento ............................................................................................................................................... 21
6.- TRATAMIENTO DE DATOS ............................................................................................................................ 25
Registro de los Resultados ............................................................................................................................. 25
Análisis ........................................................................................................................................................... 26
7.- NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIOAMBIENTE ................................................................................................. 27
8.- ANEXOS ........................................................................................................................................................ 28
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PV92 del cromosoma 16 humano
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1.-TITULO: Monitorización por PCR del intrón Alu del locus PV92 del
cromosoma 16 humano.
2.-OBJETO
Extraer nuestro propio ADN de las células epiteliales bucales.
Realizar la amplificación de un segmento específico del ADN, el locus PV92 del cromosoma
16, mediante el método de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR), que es un método
para realizar millones de copias de segmentos específicos de ADN en poco tiempo, imitando
algunas de las estrategias utilizadas en la replicación de ADN que ocurre dentro de las células
vivas.
Realizar una electroforesis horizontal en geles de agarosa para separar por tamaños los
fragmentos de ADN que han sido amplificados.
Comprender la importancia que tiene este método por su aplicación en múltiples campos, uno
de ellos la genética de poblaciones, ya que en esta práctica se va a comprobar si somos o no
portadores, en ese segmento de ADN del cromosoma 16, del intrón Alu.
3.-ALCANCE
Alumnos y profesionales módulo “Ensayos Biotecnológicos” del Ciclo Formativo de grado
superior “Laboratorio de Análisis y Control de Calidad” de la familia Química.
4.-REFERENCIAS
Manual del kit: Chromosome 16: PV92 PCR Informatics Kit de BIORAD.
Catalog #166-2100EDU (explorer.bio-rad.com).
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5.-DESCRIPCION
5.1.- Fundamento
Se estima que los 23 pares de cromosomas del genoma humano (46 cromosomas en total)
contienen un total de 30.000-50.000 genes. Cada gen contiene el código para una proteína en
particular. Curiosamente, estos 30.000-50.000 genes representan sólo alrededor del 5% de ADN
cromosómico. El otro 95% es “ADN no codificante”.
Este “ADN no codificante” se encuentra no sólo entre los genes, sino también dentro de los
genes, dividiéndolos en segmentos. En eucariotas, estas secuencias de dentro de los genes, llamados
intrones, son transcritas a ARN, pero al final no forman una proteína. Las secuencias que codifican
proteínas se llaman exones. Tanto los intrones como los exones son inicialmente transcritos a ARN
(pre-mRNA), luego, el ARN correspondiente a los intrones se corta y el resto del ARN es
empalmado, formando los exones empalmados el ARN mensajero (ARNm).
A lo largo de la evolución, las secuencias de intrones han sido el blanco de las inserciones al
azar por elementos intercalados repetitivos cortos (SINEs, de “short repetitive interspersed
elements”). Los SINEs se han insertado al azar dentro de nuestros intrones durante millones de años.
Uno de estos elementos repetitivos es la llamada “secuencia Alu” (Figura 2). Esta es una secuencia
de ADN de 300 pares de bases que se repite casi 500.000 veces en el genoma humano. El origen y la
función de esta secuencia repetida al azar no se conocen todavía. El nombre “Alu” viene del sitio de
reconocimiento de la enzima de restricción Alu I que se encuentra en esta secuencia.
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Este kit proporciona una simple monitorización basada en PCR para una sola secuencia Alu
dentro del locus PV92 del cromosoma 16. Este particular intrón Alu es dimórfico. Es decir, el
elemento está presente en algunos individuos pero no en otros (Figura 3). Algunas personas tienen la
inserción en el locus PV92 de uno de sus cromosoma 16, otros pueden tener la inserción en los dos
cromosomas homólogos (dos alelos), y algunos no tienen la inserción en este cromosoma. La
presencia o ausencia de esta inserción puede ser detectada usando la reacción en cadena de la
polimerasa seguida de electroforesis en gel de agarosa.
En esta actividad, los alumnos aislarán su propio ADN genómico a partir de sus células. Van a
utilizar dos “primers” o cebadores (de 300 pb) que flanquean toda la inserción Alu de forma que los
641 pares de bases del locus PV92 se amplifican a un fragmento de 941 pares de bases si el elemento
Alu está presente, o permanece un fragmento de 641 pares de bases si el elemento Alu está ausente.
La electroforesis en gel de agarosa de los productos de la PCR es suficiente para distinguir entre los
homocigotos (+/+) por la presencia de la repetición Alu (sólo hay un producto de 941 pb),
homocigotos (-/-) por la ausencia de la repetición Alu (sólo hay un producto de 641 pb), y los
heterocigotos (+/-) que tienen tanto los productos de 641pb y los de 941 pb.
Planificación de la práctica
Esta práctica consta de 4 unidades o lecciones que se pueden acomodar en 3 sesiones de
laboratorio:
Lección 1: Preparación del molde de DNA de células epiteliales bucales
Aislamiento de células epiteliales bucales
Preparación del ADN genómico de células epiteliales bucales
Lección 2: Amplificación mediante la PCR
Realización de la PCR
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Lección 3: Electroforesis en gel de los productos de la PCR y tinción de los geles de agarosa
Preparación del gel de agarosa
Actividad de cargar y correr los geles
Tinción de los geles
Lección 4: Análisis e interpretación de los resultados
Registrar los resultados y secar los geles
Analizar y discutir los resultados
Cada lección se divide en dos partes: un trabajo previo a la realización en sí de la
propia práctica destinado a la preparación de alícuotas y materiales necesarios, y la
realización de la práctica por parte de los alumnos.
5.2- Material necesario
Lección 1A: Preparación del Molde de ADN
5.2.1- Equipamiento:
SESIÓN 1
(3 horas)
•Extracción del ADN
•Amplificación por PCR
SESIÓN 2
(3,5 horas)
•Preparación del gel de agarosa
•Electroforesis
•Tinción del gel
SESIÓN 3
(2,5 horas)
•Análisis y Registro de resultados
•Secado del gel
Equipamiento Cantidad Verificar
Microcentrífuga 1 ☐
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5.2.2- Materiales:
5.2.3- Reactivos:
5.2.4- Disoluciones:
Lección 1B: Amplificación por PCR
5.2.1- Equipamiento:
Material en cada Puesto de Trabajo Cantidad Verificar
Microtubos de 1,5 mL con tapa 4 ☐
Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca 4 ☐
Portamicrotubos de espuma 2 ☐
Micropipeta P-20 (2-20 L) y P-200 1 ☐
Puntas de pipeta de 20-200 L 4 ☐
Botella de 500 ml 1 ☐
Material en cada Puesto de Trabajo
Cantidad
Verificar
Vasos de plástico 4 ☐
Rotulador permanente 1 ☐
Contenedor de residuos 1 ☐
Agitador vórtex 1 ☐
Baños de agua a 56ºC y 100ºC 4 ☐
Protocolo de trabajo 1 ☐
Reactivos Cantidad Verificar
Matriz InstaGene 1 vial ☐
Disoluciones Cantidad Verificar
Disolución NaCl al 0.9% en cada puesto de trabajo 10 ml ☐
Equipamiento Cantidad Verificar
Termociclador 1 ☐
Microcentrífuga 1 ☐
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5.2.2- Materiales:
5.2.3- Reactivos:
5.2.4- Disoluciones:
Lección 2A: Preparación del gel de agarosa
5.2.1- Equipamiento:
Material en cada Puesto de Trabajo Cantidad Verificar
Tubos de PCR 12 ☐
Microtubos de 1,5 mL sin tapa 4 ☐
Microtubo etiquetado como MIX (en hielo) 1 ☐
Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca 4 ☐
Micropipeta P-20 y P-1000 2 ☐
Puntas de pipeta 2-20 L, 100-100 L 8 ☐
Portamicrotubos de espuma 2 ☐
Material en cada Puesto de Trabajo Cantidad Verificar
Recipiente con hielo 1 ☐
Rotulador permanente 1 ☐
Contenedor de residuos 1 ☐
Protocolo de trabajo 1 ☐
Reactivos Cantidad Verificar
Mezcla de primers o cebadores del kit 1 ☐
Controles PV92 homocigóticos (+/+) y (–/–), y
heterocigóticos (+/–). 1 de cada ☐
Mezcla-maestra del kit 1 ☐
Equipamiento Cantidad Verificar
Horno microondas 1 ☐
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5.2.2- Materiales:
5.2.3- Reactivos:
5.2.4- Disoluciones:
Lección 2B: Electroforesis de los productos obtenidos en la PCR y Tinción de los geles
5.2.1- Equipamiento:
5.2.2- Materiales:
Material en cada puesto de trabajo Cantidad Verificar
Bandeja de gel y peine 1 ☐
Cinta adhesiva de laboratorio 1 ☐
Matraz erlenmeyer 1L 1 ☐
Probetas (grande y pequeña) 2 ☐
Protocolo de trabajo 1 ☐
Reactivos Cantidad Verificar
Agarosa 5 g ☐
Tampón de electroforesis TAE 50x 20 ml ☐
Tampón de electroforesis TAE 1x 1 L ☐
Equipamiento Cantidad Verificar
Fuente de electroforesis 1 ☐
Material en cada puesto de trabajo Cantidad Verificar
Gel de agarosa 1 ☐
Micropipetas P-20 3 ☐
Puntas de pipeta 2-20 L 12 ☐
Rotulador permanente 1 ☐
Portamicrotubos de espuma 2 ☐
Cubeta de electroforesis 1 ☐
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5.2.3- Reactivos:
5.2.4- Disoluciones:
5.3- Procedimiento operativo
Sesión 1A: Previo a la Preparación del Molde de ADN
Tareas Preparar las alícuotas de la matriz InstaGene
Preparar las alícuotas de la solución salina
Colocar los baños de agua a 56 oC y a 100
oC
Tiempo requerido 30 minutos
Material an cada puesto de trabajo Cantidad Verificar
Cubeta para la tinción del gel 1 bandeja/2 puestos
☐
Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca 1 ☐
Matraz de 500 ml 1 ☐
Contenedores grandes para decolorar los geles (protocolo de tinción rápida)
1-3/2 puestos
☐
Contenedor de residuos 1 ☐
Protocolo de trabajo 1 ☐
Reactivos Cantidad Verificar
Muestras de PCR 1 por alumno (4) ☐
Colorante de carga “PV92 XC DNA loading dye” 1 tubo ☐
Marcador de masas moleculares “EZ Load” (patrones de DNA)
1 tubo ☐
Solución 1x o 100x del tinte de DNA “Fast Blast”
120 mL/2 puestos
☐
Agua del grifo caliente para decolorar los geles (protocolo de tinción rápida)
1,5-2 L/2 puestos
☐
Agua destilada o desionizada 1 L ☐
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Preparación de las alícuotas de la matriz InstaGene
1. Mezclar la matriz InstaGene
agitando en un vórtex la botella varias veces para
resuspenderla. Asegúrese de que la matriz esté bien mezclada antes de preparar las alícuotas.
Para que las micropartículas de intercambio iónico de la matriz se encuentren en la solución,
durante el proceso de preparación de las alícuotas, agite cuidadosamente la botella varias
veces.
2. Pipetear 200 L de la matriz InstaGene
dentro de cada tubo de microcentrífuga con tapón de
rosca. Distribuir 1 tubo por cada estudiante, por lo que en cada puesto de trabajo debería
haber un portamicrotubos de espuma con 4 tubos de matriz.
Preparación de la solución salina y las alícuotas
1. Preparar una solución salina al 0,9%. En una botella de 500 mL añadir 4,5 g de sal de mesa
(no yodada) y completar con agua potable. Invertir la botella hasta disolver totalmente la sal.
2. Para cada estudiante, colocar 10 mL de solución salina en un vaso. Cada puesto de trabajo
debería tener 4 vasos de solución salina.
Colocar los baños de agua a 56 oC y a 100
oC
Sesión 1A: PREPARACIÓN DEL MOLDE DE ADN
Introducción
El ADN que se va a usar como molde en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) lo
extraeremos de nuestras propias células vivas: ADN genómico extraído de las células epiteliales
bucales.
Para ello, se enjuaga la boca con una solución salina, y se recogen las células epiteliales
desprendidas mediante centrifugación. Se transfieren a un microtubo que contiene la matriz
InstaGene
, que se compone de partículas microscópicas cargadas negativamente que quelan o
atrapan a los cationes metálicos de la solución, como el Mg2+
, que es un cofactor necesario de las
DNAsas lisosomales (enzimas que digieren o degradan el ADN). Así, cuando se lisan las células
mediante el calor y éstas liberan sus componentes celulares, la presencia de las micropartículas
quelantes de la matriz impide la degradación enzimática del ADN extraído. En la preincubación a 56 0C se suavizan las membranas plasmáticas, soltándose las células agrupadas, y se inactivan las
enzimas por el calor; y cuando se hierven las células a 100 0C se rompen las células liberando el
ADN de los núcleos.
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Procedimiento
1. Cada alumno debe tener un microtubo con tapón de rosca con 200 L de la matriz
InstaGene
, un microtubo de ensayo de 1,5 mL y un vaso con 10 mL de solución salina al
0,9%. Etiquetar cada uno de ellos con sus iniciales.
2. Introducir la solución salina en la boca y enjuagar vigorosamente durante 30 segundos.
Expulsar la disolución bucal en un vaso.
3. Con una micropipeta P-1000 transferir 1 mL de la disolución bucal en el microtubo de
ensayo.
4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos. Cuando la centrífuga se haya detenido
completamente, retirar el tubo. Se debería visualizar una especie de pelotita o bolita sólida de
células blancas en la parte inferior del tubo (“pellet”). Idealmente, esta bolita debería ser del
tamaño de una cabeza de cerilla. Si no ves el sedimento o no es de este tamaño, desechar el
sobrenadante salino, llenar el tubo con más enjuague bucal, y volver a centrifugar.
5. Después de sedimentar las células, se vierte el sobrenadante sobre un trocito de papel
secamanos, teniendo cuidado de no perder el pellet. Si queda en fondo del tubo una pequeña
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cantidad de disolución salina no pasa nada (aproximadamente del mismo tamaño que el
pellet, 50 L).
6. Resuspender el precipitado utilizando un agitador vortex, o dando pequeños golpecitos con el
dedo al microtubo, hasta que no queden grupos de células o grumos.
7. Con la micropipeta P-20 transferir todas las células resuspendidas al
microtubo de tapón de rosca que contiene el InstaGene
.
8. Cerrar el microtubo y agitar para mezclar el contenido. (No pipetear arriba y abajo
con la micropipeta para mezclar el contenido porque se puede taponar la punta con las
micropartículas del InstaGene).
9. Colocar los tubos del grupo en un portamicrotubos de espuma y dejar flotar el soporte en un
baño de agua a 56 0C durante 10 minutos. A la mitad (5 minutos), agitar los tubos varias
veces y luego volver a colocarlos en el baño de agua para los restantes 5 minutos.
10. Retirar los tubos del baño de agua y agitarlos varias veces. Colocar ahora el soporte con los
tubos en un baño de agua hirviendo (100 °C). Incubar durante 5 minutos.
11. Retirar los tubos del baño de agua de 100
0C y agitar varias veces para resuspender la
muestra. Centrifugar los tubos (4 tubos) a 6000 x g durante 5 minutos (o a 2000 x g durante
10 minutos) para sedimentar la matriz.
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12. Depositar los microtubos de rosca en el frigorífico hasta el período siguiente de laboratorio, o
bien proceder directamente con la siguiente parte de la sesión 1 (sesión 1B).
Sesión 1B: Previo a la Amplificación por PCR
Tareas Programar el Termociclador
Preparar la mezcla-maestra completa o MIX y las alícuotas
Preparar las reacciones control de la PCR
Tiempo requerido 60 minutos
Programar el Termociclador
Ciclo Paso Función Temperatura Tiempo
1 Paso 1
Repetir 1
vez
Pre-desnaturalización 94 ºC 2 minutos
2 Paso 1
Paso 2
Paso 3
Repetir 40
veces
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
94 ºC
60 ºC
72 ºC
1 minuto
1 minuto
2 minutos
3 Paso 1
Repetir 1
vez
Extensión final 72 ºC 10 minutos
Preparar la mezcla-maestra completa o MIX y las alícuotas
Para obtener mejores resultados, los siguientes pasos se deberían realizar 15-30 minutos antes de
realizar la reacción de PCR (en sesión 1A, cuando los alumnos están metiendo los portamicrotubos
de espuma en los baños de agua).
1. Pipetear 1100 L de la mezcla-maestra en un microtubo. Si se van a amplificar menos de 16
muestras de ADN, dividir la mezcla-maestra en 2 tubos con 550 L cada uno. Uno de estos
tubos se usará inmediatamente, mientras que el otro puede volver a congelarse para usar en
otro momento.
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2. Etiquetar como “MIX” un número determinado de microtubos, uno por cada puesto de
trabajo, y colocarlos en hielo.
3. Añadir 22 μL de la mezcla de “primers” o cebadores a los 1100 L de la mezcla-maestra (o
11 L de primers a 550 L de mezcla-maestra). Mezclar en un agitador vórtex 10 segundos.
Es muy importante que la mezcla-maestra se mezcle homogéneamente con los cebadores. La
solución debería ser de color amarillo.
Los cebadores se suministran como una solución concentrada amarilla en un tampón
Tris. Ya que los cebadores son más estables en disoluciones concentradas, añadir los
cebadores a la mezcla-maestra justo antes de empezar el trabajo de laboratorio –no más de
15-30 minutos antes de la amplificación con PCR-.
4. Preparar alícuotas de 95 L de la mezcla completa e introducir en los microtubos etiquetados
como “MIX”, un tubo para cada puesto de trabajo. Guardar el resto para las reacciones
control positivas. Colocar estos tubos en hielo en cada puesto de trabajo hasta que se usen.
Preparar las reacciones control de la PCR
Esta parte se preparará a la vez que los alumnos preparan sus muestras.
1. Etiquetar los tubos de control de la PCR como: “+/+”, “–/–“, y “+/–“. Si se va a utilizar el kit
completo de una sola vez, preparar 4 tubos de cada control, o sea, 12 en total. Si se divide el
kit en dos períodos, preparar 2 tubos de cada control, 6 tubos en total. Las soluciones de
control sin usar deberán almacenarse en el congelador hasta su uso.
▫ Pipetear 20 μL de la solución de control +/+ en cada tubo de PCR +/+.
▫ Pipetear 20 μL de la solución de control -/- en cada tubo de PCR -/-.
▫ Pipetear 20 μL de la solución de control +/- en cada tubo de PCR +/-.
2. Pipetear 20 μL de la mezcla completa en cada tubo de control de la PCR. Usar una punta de
pipeta nueva para cada tubo.
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3. Colocar los tubos en hielo hasta que se carguen en el termociclador. Amplificar las muestras
de control de la PCR junto con las muestras de los alumnos.
Sesión 1B: AMPLIFICACIÓN POR PCR
Introducción
La PCR, Reacción en Cadena de la Polimerasa, es capaz de “apuntar” sobre un fragmento
específico de ADN del genoma completo y hacer millones de copias o amplificarla. Nosotros vamos
a amplificar una región dentro del cromosoma 16.
Para replicar un fragmento de ADN, la mezcla de reacción requiere los siguientes componentes:
1. Molde de ADN.
2. Desoxinucleótidos individuales (A, T, G y C).
3. Taq ADN polimerasa.
4. Iones de magnesio.
5. Dos oligonucleótidos cebadores o “primers”.
6. Tampón Sal.
Animación sobre PCR en el siguiente enlace: http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
Procedimiento
1. Coger del frigorífico o del puesto de trabajo el microtubo con tapón de rosca que contiene el
molde de ADN. Centrifugarlo durante 2 minutos a 6000 x g (o 5 minutos a 2000 x g).
2. Etiquetar un tubo de PCR y un microtubo sin tapa con tus iniciales, y colocar el tubo de PCR
dentro del microtubo sin tapa tal como se muestra en la figura. Coloque todo en el
portamicrotubos de espuma.
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3. Transferir 20 μL del molde de ADN (en el sobrenadante) desde el tubo con tapón de rosca al
tubo de PCR. Tener cuidado de no transferir micropartículas de la matriz, que están en el
sedimento, al tubo de PCR, ya que se podría inhibir la reacción de la PCR.
4. Localizar el tubo etiquetado como “Mix”, amarillo, que está en hielo, y transferir 20 μL de la
mezcla dentro del tubo de PCR. Mezclar succionando con la micropipeta 2-3 veces. Evitar las
burbujas, especialmente en la parte inferior de los tubos. Se tapa el tubo de PCR
herméticamente y se mantiene en hielo hasta que se proceda al siguiente paso.
5. Saque el tubo de PCR del microtubo sin tapa y colóquelo en el
termociclador.
6. Cuando todas las muestras de PCR de los alumnos y las reacciones de
control de la PCR preparadas previamente por el profesor estén en el
termociclador, este se pondrá en marcha y comenzará la reacción de
PCR (40 ciclos de amplificación), lo que lleva unas 3,5 horas.
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Sesión 2A: Previo a la Preparación del gel de agarosa
Tareas Preparar el tampón de electroforesis TAE 1x
Tiempo requerido 10 minutos
Preparar el tampón electroforético TAE 1x
El tampón de electroforesis TAE (Tris, acetato, EDTA) se suministra como una solución
concentrada 50x, y nosotros usaremos una concentración 1x.
Las cantidades calculadas de tampón y de gel dependen de la cubeta de electroforesis y de la
bandeja de gel que se use. En esta práctica usamos una cámara Wide Mini-Sub Cell GT System de
BioRad, con una bandeja de 10 x 15 cm y un peine de 15 pocillos.
Para hacer 2 geles y llenar 2 cámaras de electroforesis un litro de tampón TAE 1x es
suficiente. Para hacer 1 L de tampón TAE 1x: (20 ml de TAE 50x + 0,98 L de agua destilada).
Sesión 2A: PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA
Introducción
Prepararemos una solución de agarosa al 1%, ya que esta concentración proporciona una
excelente resolución y minimiza el tiempo requerido para la separación electroforética de los
fragmentos de la PCR.
Como en esta segunda sesión de laboratorio se utiliza material para cada dos grupos de
trabajo (8 alumnos), los dos geles de agarosa que son necesarios también se prepararán de forma
conjunta.
A continuación cada puesto de trabajo preparará el gel de electroforesis.
Procedimiento
Preparación de la solución de agarosa al 1%
1. Agregar la agarosa en polvo en una botella de vidrio autoclavable. No se debe llenar esta
botella más allá de la mitad de su capacidad.
2. Añadir la cantidad adecuada de tampón de electroforesis TAE 1x y agitar para resuspender la
agarosa en el tampón.
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3. Disolver en un microondas: aflojar el tapón de la botella e introducir en el microondas. Poner
a potencia media-baja durante 3 minutos, deteniendo cada 30 segundos para agitar la botella
(cuidado al agitar, ya que el movimiento puede desencadenar la ebullición y disparar el gel
hirviendo). Hervir y agitar hasta que todas las pequeñas partículas transparentes de agarosa se
hayan disuelto y el gel esté totalmente líquido.
4. Dejar enfriar esta disolución hasta los 60 ºC (que se pueda tocar el frasco sin quemarse), antes
de verterla en la bandeja del gel de electroforesis. Se puede acelerar el proceso enfriándolo
debajo del grifo.
Para preparar dos geles de agarosa (2 puestos de trabajo = 8 alumnos) con 0,5 cm de grosor
se utilizaron 131 mL de agarosa al 1% = (1,31 g de agarosa + 131 mL TAE 1x).
Preparación del gel de electroforesis
5. Sellar los extremos de la bandeja de gel de forma segura con tiras de cinta adhesiva de
laboratorio. Presionar la cinta firmemente a los bordes de la bandeja para formar un precinto
hermético. Colocar el peine en la ranura correspondiente de la bandeja de gel. El peine se
debe colocar a unos ~ 2 cm del extremo de la bandeja del gel (no en el centro del gel).
6. Colocar la bandeja de gel en una mesa de trabajo nivelada.
7. Verter la disolución de agarosa a 60 oC en la bandeja. Apartar o eliminar las burbujas o
suciedad con una punta de pipeta o papel de aluminio.
8. Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos – será opaco
cuando esté listo para su uso. Se puede acelerar el proceso metiéndolo en la nevera.
Sesión 2B: Previo a la Electroforesis de los productos obtenidos en la PCR y Tinción de los geles
Tareas Preparar las alícuotas del colorante de carga “PV92 XC loading dye”
Preparar el tinte de ADN “Fast Blast”
Tiempo
requerido 30 minutos
Preparar las alícuotas del colorante de carga “PV92 XC loading dye”
Etiquete un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca como “LD” (Loading Dye) por cada
puesto de trabajo, y añada 50 L del colorante de carga dentro de cada tubo. Distribuya los tubos en
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cada puesto de trabajo.
Preparación del tinte de ADN “Fast Blast”
El tinte se suministra en una concentración de 500x y debe ser diluido antes de usarlo. Se
puede usar diluido a 100x en el protocolo de tinción rápida, que permite visualizar el ADN en 12-
15minutos, o diluido a 1x en la tinción durante toda la noche.
a) Para preparar la solución 100x, para la tinción rápida, diluya 100 mL de la solución 500x
con 400 mL de agua destilada o desionizada en una botella o matraz de tamaño apropiado
y mezcle. Tape el matraz y almacene a temperatura ambiente hasta que esté listo para usar
b) Para preparar la solución 1x, para la tinción durante la noche, diluir 1 mL del Fast Blast
500x con 400 mL de agua destilada o desionizada en un matraz de tamaño apropiado y
mezclar. Tape el matraz y almacene temperatura ambiente hasta su uso.
Sesión 2B: ELECTROFORESIS DE LOS PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA PCR Y TINCIÓN DE LOS GELES
Introducción
La electroforesis separa fragmentos de ADN según sus tamaños relativos. Los fragmentos de
ADN son cargados en un gel de agarosa, que se coloca en una cubeta llena de una solución
conductora tampón. Una corriente continua atraviesa la cámara de un electrodo al otro. Los
fragmentos de ADN están cargados negativamente, y cuando se colocan en un campo eléctrico
migran hacia el polo positivo. La matriz del gel de agarosa actúa como un tamiz molecular a través
del cual los fragmentos pequeños de ADN pueden moverse más fácilmente que los más grandes.
Pasado un tiempo, los fragmentos pequeños migrarán más lejos que los grandes. Los fragmentos del
mismo tamaño permanecen juntos y migran produciendo "una banda" sola de ADN en el gel.
Cuando los productos de la PCR son sometidos a electroforesis en gel de agarosa, son
posibles 3 resultados distintos:
Si ambos cromosomas contienen la inserción Alu, cada producto amplificado de PCR
será de 941 pb y en el gel migrarán a la misma velocidad, por lo que aparecerá una
sola banda que corresponde a una banda de 941 pb.
Si ningún cromosoma contiene la inserción, cada producto amplificado de PCR será
de 641 pb y migrarán como una banda de 641 pb.
Si hay una inserción Alu sobre un cromosoma, pero no en el otro, habrá un producto
PCR de 641 pb y otro de 941 pb. El gel revelará dos bandas para esta muestra.
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En el gel de la muestra de abajo, las bandas PCR-AMPLIFICADAS de 941 pb y 641 pb se separan
en base a sus tamaños.
Procedimiento
Preparar las Muestras de Control Amplificadas y el patrón de bandas de ADN
En cada gel de electroforesis se deben cargar, además de las muestras de los alumnos, las
muestras control amplificadas y el patrón de bandas de ADN (MMR). Este trabajo lo puede hacer el
profesor o un grupo de alumnos.
La preparación del patrón y los controles se realiza de la siguiente manera:
1. Añadir 10 L del colorante de carga “PV92 XC Loading Dye” a cada muestra control
amplificada (+/+, +/–, –/–), se mezcla con cuidado y se sitúan los 3 tubos en una gradilla
de espuma.
La función de este colorante es la de aumentar la densidad de la muestra y asegurar que se
hunda en los pocillos del gel (por el glicerol que contiene), y la de visualizar el desarrollo
electroforético, ya que contiene xileno cianol, que es un colorante que migra hacia el
ánodo con la misma velocidad que un fragmento de 4000 pb de ADN.
2. Etiquetamos un tubo de PCR como “MMR” y le añadimos 11 L del marcador de masas
moleculares “EZ Load”.
Los tamaños de las bandas patrón de ADN que contiene son de 1000 pb, 700 pb, 500 pb,
200 pb y 100 pb.
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Electroforesis en gel de las muestras amplificadas por PCR
1. Añadir 10 L del colorante de carga (PV92 XC Loading Dye) a cada tubo de PCR y
mezclar cuidadosamente. Situar los tubos en la gradilla de electroforesis.
2. Retirar con cuidado la cinta adhesiva de la bandeja del gel. Colocar la bandeja con el gel
solidificado apoyada sobre la base central de la cubeta de electroforesis de forma que los
pocillos estén cerca del cátodo (negro). Las muestras de ADN, durante la electroforesis,
migrarán hacia el extremo donde se encuentra el ánodo (rojo).
3. Agregar el tampón de electroforesis TAE 1x necesario hasta cubrir bien el gel ( 650 mL;
que el gel se encuentre de 2 a 6 mm por debajo del tampón), y retirar con cuidado, tirando
hacia arriba lentamente, el peine del gel solidificado.
4. Situar la cubeta de electroforesis sobre un fondo oscuro, para que
se vean mejor los pocillos, y usando una punta limpia para cada
muestra, cargar las muestras en los pocillos del gel de la siguiente
manera:
5. Poner la tapa del aparato. La tapa se ajusta a la base en una sola orientación: rojo con rojo
y negro con negro. Conectar los electrodos a la fuente de alimentación, el cable rojo con
el terminal rojo y el negro con el negro.
6. Realizar la electroforesis de las muestras a 100 V durante 30 minutos.
Si usamos la fuente de alimentación PowerPac Basic de BioRad:
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Se nota que comienza el proceso porque aparecen burbujas en las cámaras de la cubeta.
7. Cuando acabe la electroforesis, apagar la fuente de alimentación y retirar la tapa de la
cubeta. Con cuidado, sacar la bandeja y el gel del aparato. Hay que tener cuidado porque
el gel es muy resbaladizo. Da un golpecito en el gel con el pulgar y con cuidado deslízalo
dentro de la bandeja plástica de tinción proporcionada en el kit.
Tinción del gel
Ya que el ADN es incoloro, no es visible inmediatamente en el gel. El examen visual de gel
después de la electroforesis indica sólo las posiciones de los tintes que se cargan pero no las
posiciones de los fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN son visualizados por tinción del gel
con un colorante azul llamado tinción de ADN Fast Blast.
PROTOCOLO 1: Tinción rápida de los geles de agarosa con la solución Fast Blast 100x
1. Marcar la bandeja de tinción con las iniciales y la fecha. En cada bandeja de tinción sólo cabe
un gel de 15 x 10 cm.
2. Tinción del gel (2-3 minutos): Verter 125 ml de la solución de tinción FB 100x en la
bandeja de tinción sobre el gel. Si fuera necesario, añadir más solución 100x hasta sumergir
completamente el gel. Teñir los geles durante 2-3 minutos, pero no más de 3 minutos.
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3. Aclarado del gel: transferir el gel a un contenedor grande que contenga 500-700 ml de agua
del grifo limpia y caliente (40-55°C). Como el gel es frágil, hay que tener especial cuidado
manejándolo (usar una espátula grande u otra superficie de apoyo para transferir el gel de un
contenedor al otro). Con cuidado sacudir el gel en el agua durante ~10 segundos para aclarar.
4. Lavado del gel: Transferir el gel a un contenedor grande con 500-700 ml de agua del grifo
limpia y caliente. Con cuidado sacudir el gel sobre una plataforma oscilante durante 5
minutos. Si no tienes, mueve los geles con cuidado en el agua una vez cada minuto.
5. Lavado del gel: Realizar un segundo lavado como en el paso anterior.
6. Las bandas comienzan a aparecer pero se marcarán más en 5-15 minutos. Si es necesario se
pueden realizar lavados adicionales con agua caliente, pero nunca dejar el gel a remojo toda
la noche. Cuando se de por terminado el proceso de tinción, depositar el gel en la bandeja de
electroforesis para trasladarlo de forma más segura.
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PROTOCOLO 2: Tinción durante toda la noche de los geles con la solución Fast Blast 1x
1. Marcar la bandeja de tinción con las iniciales y la fecha. En cada bandeja de tinción sólo
cabe un gel de 15 x 10 cm.
2. Tinción del gel (toda la noche): Verter la solución de tinción 1x dentro de la bandeja de
tinción sobre el gel. Si es necesario, añadir más solución 1x para sumergir completamente
el gel. Situar la cubeta de tinción en una plataforma oscilante para agitar durante toda la
noche. Si no se dispone de la plataforma, agitar los geles con cuidado e
intermitentemente, ya que los fragmentos pequeños de ADN tienden a difundir si no se
agitan. Se deberían empezar a ver las bandas de ADN después de 2 horas, pero se
recomiendan al menos 8 horas de tinción para una completa visibilidad de las bandas
teñidas.
3. Depositar el gel en la bandeja de electroforesis para trasladarlo de forma más segura.
Los geles teñidos se guardan en la nevera para realizar el registro y análisis de resultados al
día siguiente.
6.- TRATAMIENTO DE DATOS
Registro de los Resultados
a. Examen visual de los geles teñidos: Analizar las bandas visibles de ADN que aparecen en
el gel y determina si eres homocigoto o heterocigoto para la inserción Alu.
b. Sitúa el gel en el transiluminador con luz visible (blanca)
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y realiza una fotografía con el Documentador de Geles Doc-Print VX2, que permite
imprimir y grabar imágenes en un puerto USB sin necesidad de estar conectado a un
ordenador. Se puede editar la imagen y deducir más información (identificación
automática de bandas, cálculos de pesos moleculares, área e intensidad de las bandas,
etc.) utilizando el software Photo-Capt.
c. Seca el gel de agarosa para tener un registro permanente del experimento en el Secador
de Geles.
Análisis
Recuerda que la interpretación de este gel te permite determinar tu composición genética
sólo en el locus que se está estudiando. Para la clase, determinar el número de individuos de cada
genotipo: homocigotos + / +, homocigoto - / -, y heterocigotos + / -.
Tabla 1. Frecuencias genotípicas observadas para la clase
Categoría Número Frecuencia
(Frecuencia del genotipo/Total)
Homocigoto (+/+)
Heterocigoto (+/-)
Homocigoto (-/-)
Total = 1,00
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número de alelos (+)p = frecuencia del alelo (+) =
número total de alelos (+ y -)
2(nº alumnos + /+)+1(nº alumnos + /-) =
número total de alelos (+ y -)
1 = frecuencia alumnos (+ / +)+ .frecuencia alumnos (+ / -)2
número de alelos (-)q = frecuencia del alelo (-) =
número total de alelos (+ y -)
2(nº alumnos - /-)+1(nº al =
umnos + /-)
número total de alelos (+ y -)
1 = frecuencia alumnos (- / -)+ .frecuencia alumnos (+ / -)2
Tabla 2. Frecuencias alélicas calculadas para la clase
Categoría Número Frecuencia
Alelos (+) p =
Alelos (-)
q =
Total alelos= 1,00
La inserción Alu, amplificada en este ejercicio, se ha usado a lo largo del tiempo para estudiar
los patrones de migración de las poblaciones humanas. Los datos de estos estudios han sido
publicados, y las muestras de clase se pueden comparar con los datos recogidos de poblaciones más
grandes.
Puedes entonces comparar las frecuencias alélicas y genotípicas de tu población de clase
con los informes publicados de poblaciones de tamaños mayores.
En la siguiente dirección se pueden encontrar artículos y enlaces a páginas web relacionados
con el intrón Alu PV92: http://www.babec.org/node/44
7.- NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIOAMBIENTE - No proceden.
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8.- ANEXOS
Explicaciones sobre Líneas Vacías o Muestras sin amplificar
Hay muchas explicaciones para el hecho de que algunas muestras no hayan sido amplificadas en la
PCR:
Recolección inadecuada de las células epiteliales bucales.
Excesivo número de células.
Matriz del InstaGene no transferida.
Restos de InstaGene en la reacción de PCR.
Observaciones a considerar
Se puede realizar una electroforesis del ADN extraído de las células epiteliales bucales
para comprobar si el ADN está muy degradado. Lo ideal sería obtener una única banda que
apenas se moviera, lo que indicaría que el ADN está intacto. Si aparecen muchas bandas muy
juntas significa que el ADN está muy degradado, lo que se traduciría en que se podrían haber
perdido los sitios que son el blanco de los cebadores y en una mala PCR.
Para ello necesitaremos 10-20 L de la disolución de ADN (sobrenadante en el tubo
con tapón de rosca). Por tanto, guardaremos el microtubo con tapón de rosca en el frigorífico
hasta la próxima sesión en la que se realizará la electroforesis.
La disolución TAE 1x sólo es válida 1 día. Se puede almacenar en nevera, y cuando se vaya
a utilizar, si tiene precipitación en el fondo se debe calentar antes de utilizar.
La disolución de agarosa se puede preparar 1-2 días antes para montar el gel el día de la
práctica
El gel de electroforesis se puede preparar 1-2 días antes por el profesor y guardarse en el
frigorífico hasta que se use.
El tampón electroforético se puede guardar para otra electroforesis (sirve para 2
electroforesis)
Si se usa otra bandeja de tinción diferente a la del kit, añadir suficiente volumen de la
solución de tinción como para sumergir completamente los geles.
La solución de tinción Fast Blast 100x puede reutilizarse hasta 7 veces.
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La tinción durante toda la noche es más cómoda y se obtienen mejores resultados.
Como las bandas se decoloran ligeramente al secar el gel, lo mejor es analizar los geles
teñidos antes de que se sequen.
Evite la exposición de los geles secados a la luz directa para prevenir la decoloración de las
bandas. Sin embargo, las bandas de ADN reaparecerán si los geles secados se almacenan en
la oscuridad durante 2-3 semanas después de la decoloración.