PERCOBAAN 3 ANALISA PIGMEN TUMBUHAN DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI KERTAS DAN SPEKTROSKOPI UV-VIS

A. TUJUAN PERCOBAAN 1. Memisahkan zat warna dari ekstrak tumbuhan menggunkan kromatografi kertas 2. Menentukan panjang gelombang maksimum yang diserap tiap zat warna yang diperoleh 3. Menyarankan jenis dan struktur molekul klorofil dari data spectrum UV-VIS yang diberikan instrumentasi spektroskopi UV-Vis

B. PRINSIP PERCOBAAN

C. DASAR TEORI Spektrofotometer UV-VIS Spektrofotometer UV-VIS merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan guna mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi. Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi. Atas dasar inilah spektrofotometri uv vis dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam1

sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan. Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut.

Hukum Lambert-Beer Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It. Dalam hal ini, hukum Lamber-Beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi: jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan. Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya yang hanburkan:

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati sampel. Hukum beer dapat ditulis sebagai: A= a . b . c atau A = . b . c dimana: A b c = absorbansi = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm) = konsentrasi larutan yang diukur.

2

= tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar) a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).

Spektrum absorpsi yang diperoleh dari hasil analisis dapat memberikan informasi panjang gelombang dengan absorban maksimum dari senyawa atau unsur. Panjang gelombang dan absorban yang dihasilkan selama proses analisis digunakan untuk membuat kurva standar. Konsentrasi suatu senyawa atau unsur dapat dihitung dari kurva standar yang diukur pada panjang gelombang dengan absorban maksimum. Dari kurva standar kalibrasi, diperoleh persamaan garis Y = ax + b Dimana Y merupakan serapan dan x adalah konsentrasi unsur atau senyawa. Dengan persamaan garis tersebut dapat ditentukan konsentrasi sampel. Pada spektrofotometer UV-VIS, warna yang diserap oleh suatu senyawa atau unsur adalah warna komplementer dari warna yang teramati.Hal tersebut dapat diketahui dari larutan berwarna yang memiliki serapan maksimum pada warna komplementernya. Namun apabila larutan berwarna dilewati radiasi atau cahaya putih, maka radiasi tersebut pada panjang gelombang tertentu akan diserap secara selektif sedangkan radiasi yang tidak diserap akan diteruskan.

Panjang Gelombang Maksimum Baik sinar polikromatis maupun monokromatis bila dilewatkan ke suatu larutan maka intensitasnya akan berkurang. Berkurangnya intensitas sinar terjadi akibat serapan larutan tersebut, sebagian dipantulkan dan dihamburkan. Untuk mendapatkan selektivitas dan sensitivitas yang baik umumnya dipakai sinar monokromatis, dan dipilih panjang gelombang ynag memberikan serapan maksimum (panjang gelombang maksimum). Terkadang sebuah larutan memiliki lebih dari satu panjang gelombang maksimum. Untuk itu perlu dilakukan pemilihan panjang gelombang yang sesuai baik berdasarkan sensitivitasnya maupun berdasarkan daerah serapan senyawa pengganggu yang ada dilarutan tersebut.

3

Kromatografi Kertas Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersamasama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Pada kromatografi kertas sebagai penyerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai. Pemisahan kromatografi dapat berlangsung menggunakan fase cair tunggal dengan proses yang sama dengan kromatografi adsorpsi dalam kolom. Oleh karena kandungan air pada kertas, atau inhibisi selektif dari komponen hidrofilik fase cair oleh serat kertasnya, dapat dianggap sebagai fase diam, maka mekanisme partisi beperan penting dalam pemisahan. Susunan serat kertas membentuk medium berpori yang bertindak sebagai tempat untuk mengalirkannya fase bergerak. Berbagai macam tempat kertas secara komersil tersedia adalah whatman 1, 2, 31 dan 3 MM. Kertas asam asetil, kertas kieselguhr, kertas silikon dan kertas penukar ion juga digunakan. Kertas asam asetil dapat digunakan untuk zat zat hidrofobik. Untuk memilih kertas yang menjadi

pertimbangan adalah tinggkat kesempurnaan pemisahan, difusitas pembentukan spot, efek tailing dan pembentuk komet serta laju pergerakan untuk teknik descending.

Nilai Rf Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh pelarut; beberapa laiinya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat.

4

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut: Rf = jarak yang ditempuh oleh senyawa jarak yang ditempuh oleh pelarut Kromatogram dibuat dengan menotolkan larutan uji, larutan baku pembanding, dan suatu campuran uji dan baku pebaning dalam jumlah yang kurang lebih sama pada penyerap, dalam satu garis lurus sejajar dengan tepi lempeng atau kertas. Jika zat uji yang diidentifikasi dan baku pembanding itu sama, terdapat kesesuaian dalam warna dan harga Rf pada semua kromatogram, dan kromatogram dari campuran menghasilkan bercak tunggal, yaitu harga Rr adalah 1,0. Penetapan letak bercak yang dihasilkan kromatografi kertas atau lapis tipis letaknya dapat ditetapkan dengan: (1) pengamatan langsung jika senyawa tampak pada cahaya biasa, cahaya ultra violet gelombang pendek (254 nm) atau gelombang panjang (366 nm), (2) pengamatan dengan cahaya biasa atau ultra violet setelah disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak, (3) menggunakan pencacah Geiger-Muller atau teknik autoradiografi, jika terdapat zat radioaktif, (4) menempatan potongan penyerap dan zat pada media pembiakan yang telah ditanami untuk meihat hasil stimulasi atau hambatan pertumbuhan bakteri. Penyimpangan harga Rr, Rf, atau t, yang diukur untuk zat uji dari harga yang diperoleh untuk baku pembanding dan campuran tidak boleh melampaui taksiran keandaln yang ditentukan secara statistik dari penetapan kadar baku pembanding secara berulang. Perbedaan harga Rf, bila kromatogram dikembangkan searah serat kertas, dibandingkan dengan yang dikembangkan dengan arah tegak lurus terhadap serat ketas. Oleh karen itu, dalam suatu seri kromatogram, arah perambatan pelarut harus dipertahankan tetap terhadap arah serat kertas. Bayam Tanaman bayam berasal dari Amerika tropik dan mudah tumbuh dan tersebar di daerah tropis dan subtropics di seluruh dunia. Di Indonesia sendiri bayam dapat tumbuh sepajang tahun dan ditemukan pada ketinggian 5 2.000 m dpl,

tumbuh di daerah panas dan dingin, tetapi tumbuh lebih tumbuh subur di dataran rendah pada lahan terbuka yang udaranya agak panas.

5

Ada tiga varietas bayam yaitu bayam hijau biasa, bayam merah (Blitum rubrum), yang batang dan daunnya berwarna merah dan bayam putih (Blitum album), yang daun dan batangnya berwarna hijau keputih-putihan. Ada pula jenis bayam lainnya misalnya bayam duri, bayam kakap, bayam kotok atau tanah.

D. METODOLOGI PERCOBAAN ALAT 1. Gelas Kimia 250 ml 2. Tabung reaksi sedang 3. Rak tabung reaksi 4. Gelas ukur 5. Pipet tetes 6. Gunting 7. Penggaris 8. Logam 9. Staples 10. Pinset 11. Kuvet 12. Spektroskopi UV-Vis Cary 50

BAHAN 1. Daun Bayam 2. Etanol 3. Kertas Saring 4. Pensil 5. Aluminium Foil 6. Akuades

CARA KERJA

6

2 lembar daun bayam y Dikeringkan dengan lap/kertas tissue Daun bayam kering y Ditempatkan pada garis pensil sehingga tertutup hingga lebar kertas Daun bayam di atas garis pensil y Ditempatkan penggaris di atas daun bayam mengikuti garis pensil y Ditekankan dan digoreskan sepanjang garis pensil dengan logam y Diulangi hingga garis hijau terlihat jelas Warna hijau daun menempel dan terbentuk pada kertas saring y Dibiarkan kering Garis hijau mengering

1) Pemisahan Pigmen Kertas saring y Digulung berbentuk silinder dengan cara distaples y Diposisikan garis/pita hijau diluar Kertas saring berbentuk silindery y y y Dimasukkan ke dalam beaker glass berisi 20 ml etanol Diusahakan pelarut tidak menyentuh garis hijau Ditutup beaker glass dengan plastic wrap Dibiarkan pelarut mengelusi sampel di kertas saring selama 5 menit

Pelarut bergerak naik dan pita-pita warna memisah y Dibuka tutup plastik beaker glass 7 Pelarut hampir mencapai garis batas atas

y Dikeluarkan kertas saring dari beaker glass Kertas saring basah y Dibiarkan mengering di ruangan gelap Kertas saring kering

2) Ekstraksi PigmenKertas saring kering y Diluruskan dengan melepas staplesnya Kertas saring lurus y Diukur jarak setiap pita warna dari garis batas bawah y Dihitung harga Rf setiap pita warna y Dicatat warna pita Warna pita dan Harga Rf setiap warna y Digunting setiap warna pita y Dipisahkan hati-hati Potongan masing-masing pita y Dimasukkan ke tabung reaksi yang berbeda Tabung reaksi berisi potongan pita y Diberi label dengan menuliskan harga Rf pita y Ditambah 5 ml etanol Tabung reaksi berisi potongan pita dan etanol y Ditutup dengan plastic wrap y Dibiarkan semua zat warna larut dalam etanol Zat warna larut dalam etanol

3) Pengukuran Panjang Gelombang

Kuvet blanko y Dibersihkan dari debu & pengotor lainya 8 Kuvet blanko bersih y Dimasukan larutan blanko (aquades ) hingga 2/3 tinggi kuvet

Kurva panjang gelombang gelombang sampel berikutnya, panjang gelombang dan absorbansi berikutnya y dicetak Hasil scanning

4) Analisa Panjang Gelombang Maksimum Zat WarnaPanjang gelombang maksimum tiap zat warna y Ditandai y Dicatat nilainya Panjang gelombang maksimum tiap zat warna y Dibandingkan dengan data literatur y Ditentukan klorofil a, klorofil b, karotenoid berdasarkan panjang gelombang maksimum Klorofil a, klorofil b, karotenoid

Ekstraksi Pigmen Pengukuran Panjang Gelombang Analisa Panjang Gelombang Maksimum Zat Warna E. DATA PENGAMATAN

F. PERHITUNGAN

9

Penentuan harga Rf Rf = jarak yang ditempuh oleh senyawa jarak yang ditempuh oleh pelarut

Noda 1 (kuning) Jarak noda: 3 cm Jarak eluen : 4 cm Rf =

Noda 2 (hijau) Jarak noda : 2,1 cm Jarak eluen : 4 cm Rf = 2,1/4 = 0,525

Noda 3 (orange) Jarak noda : 0,8 cm Jarak eluen : 4 cm Rf = 0,8/4 = 0,2

= 0,75

G. PEMBAHASAN

H. KESIMPULAN

I. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2011.UV-Visible.Online,tersedia : http:/ /teknologikimiaindustri. blogspot.com. Anomin. 2010. UV-Vis Spektrofotometry Ultraviolet & Visible Absorption

Spectrophotometry. Online, tersedia :http//takdir.blogspot.com. Khopkar, S.M. 2008.Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI-PRESS.

Svehla, G. 1985.Analisis Anorganik Kualitatif Jilid 1. Jakarta : P T Kalman Media Pustaka.

Tim Penyusun, 2009. Penuntun Praktikum Analitik Instrumen. Samarinda : POLNES.

Underwood, R.A. Day. 2002. Analisa Kimia Kuantitatif, Edisi ke Lima. Jakarta :Erlangga.

10