phÂn lẬp vÀ tuyỂn chỌn cÁc chỦng vi sinh …vcn.vnn.vn/uploads/files/bao cao khoa hoc...

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT LÊN MEN LACTIC ĐỂ

TẠO CHẤT CẤY VI SINH VẬT (INOCULANTS) DÙNG TRONG CHẾ BIẾN, BẢO

QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP

CHO GIA SÚC NHAI LẠI

1Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương,

1Trần Quốc Việt2 và

1Ninh Thị Len

Viện Vi sinh vật và CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội; 1Bộ môn Dinh dưỡng, TACN và Đồng cỏ - Viện Chăn Nuôi

Tóm tắt

Từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên, 134 chủng vi khuẩn lactic được phân lập trong đó có 131 chủng vi

khuẩn đồng hình và 3 chủng dị hình. Các chủng này được tuyển chọn bằng cách thử hoạt tính catalaza, nhuộm

Gram, khả năng sinh axit lactic, kháng vi khuẩn kiểm định, enzyme ngoại bào… Tám chủng có hoạt tính sinh học

cao nhất là 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17, L01 và L19 được lựa chọn để định danh. Kết hợp cả phương pháp sinh

lý, sinh hóa (lên men các nguồn đường, khả năng di động, dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng…) và sinh

học phân tử (giải trình tự rADN 16S) có thể xếp chủng L19 và 2-9 thuộc loài L. pentosus; các chủng 2-10, 3-5, 4-14,

8-10, 9-17 thuộc loài L. plantarum và chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis. Các chủng được lựa chọn đều là

những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm probiotic.

1. Đặt vấn đề

Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng vi sinh vật (VSV) để chế biến và bảo quản thực

phẩm, nhưng phải đến nửa cuối thế kỷ 19, việc chế biến thức ăn xanh theo phương pháp ủ chua

dựa mới bắt đầu được phát triển ở các nước châu Âu (Mc Donald, 1991). Đến nay, kỹ thuật ủ

chua thức ăn xanh và phụ phẩm nông nghiệp đã trở nên rất phổ biến ở hầu hết các nước trên thế

giới. Mặc dù là một kỹ thuật cổ điển dựa trên cơ sở lên men của các VSV, nhưng điều khiển quá

trình lên men để nâng cao hiệu quả chế biến, bảo quản, giảm tối đa sự thất thoát, thối, hỏng, nâng

cao hiệu quả sử dụng thức ăn và năng suất vật nuôi làm một việc rất khó. Để khắc phục điều đó,

rất nhiều chất bổ trợ truyền thống như các loại nguyên liệu giầu nguồn đường dễ lên men (rỉ mật,

bột sắn, cám gạo…vv) thường được sử dụng để thúc đẩy quá trình lên men của các VSV

(Sadahiro Ohmono, 2002). Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng các chất bổ trợ cũng rất khác nhau, phụ

thuộc vào bản chất của vật liệu ủ, thời gian, nhiệt độ hỗn hợp ủ..vv (Mc Donald, 1991). Trong

những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, sử dụng chất cấy vi sinh vật

(Bacterial Inoculants) như chất bổ trợ sinh học đã tạo ra một bước ngoặt mới trong công nghệ

chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới

(Sadahiro Ohmono, 2002; Machin, 2005).

Theo Weinberg và ctv (2007), sử dụng các VSV lactic như chất VSV đã nâng cao rõ rệt

hiệu quả chế biến và bảo quản thân cây ngô, làm tăng khả năng ăn vào và tăng năng suất sữa ở

bò. Các chất cấy VSV không chỉ thúc đẩy nhanh quá trình lên men của các vi khuẩn lactic trong

hỗn hợp ủ thông qua hiệu quả sản sinh axit lactic, làm giảm pH, tạo ra các bacterioxin ức chế các

vi khuẩn gây thối, mà chúng còn có tác dụng như những vi sinh vật probiotic, làm thay đổi đáng

kể hệ vi sinh vật dạ cỏ của loài nhai lại theo hướng có lợi cho vật chủ (Wallace và ctv, 1993;

Nocek và ctv, 2006).

Nội dung của nghiên cứu này thuộc đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong chế

biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sử dụng thức ăn thô xanh, phế phụ

phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại” được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, xác

định các đặc điểm phân loại, đặc tính sinh lý, sinh hoá của một số chủng vi khuẩn lên men lactic

phục vụ cho việc sản xuất chất cấy vi sinh vật (Innocunants).

2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu nghiên cứu

- Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp

được ủ chua, bã dứa.

- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống Vi

sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà

- Các hóa chất nuôi cấy vi sinh vật, định tính, định lượng và phân loại sử dụng của các

hãng Merck, Sigma, Wako…

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, phân loại và định danh các vi khuẩn lactic như nguồn

sản xuất các chất cấy VSV.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic

- Mẫu được pha loãng 10-3

và 10-5

, lấy 0,05 ml gạt trên môi trường MRS, nuôi cấy ở nhiệt

độ 30oC. Sau 48 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc trên các đĩa dưới kính lúp, chọn các khuẩn lạc

có vòng trong bao quanh. Các chủng này sau đó được thuần khiết và cấy truyền ra các ống thạch

nghiêng để sử dụng ngay cho các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời các chủng này còn được bảo

quản lạnh sâu ở - 800

C nhằm giữ được giống trong thời gian dài.

- Các chủng vi khuẩn phân lập đầu tiên được thử khả năng sinh catalaza (bằng cách nhỏ 1

giọt 3% H2O2 lên khuẩn lạc vi khuẩn. Nếu là dương tính thì sủi bọt. Vi khuẩn lactic phải có

catalaza (-)). Các chủng có catalaza âm tính được nhuộm Gram và chỉ các chủng là Vi khuẩn

Gram dương mới được xác định khả năng lên men đồng hình (Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm môi

trường MRS dịch thể có chứa ống Durham, để 1-3 ngày. Nếu không sinh khí CO2 trong ống

Durham thì đó là lên men đồng hình) và khả năng kháng vi khuẩn kiểm định.

Các phương pháp định tính và định lượng

- Định lượng axit bằng phương pháp chuẩn độ Therner (Emanuel et al., 2005)

- Xác định nồng độ axit lactic (%) bằng sắc ký lỏng cao áp.

- Xác định khả năng kháng khuẩn và sinh enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch

tán trên đĩa thạch.

- Xác định khả năng sinh trưởng bằng mật độ quang (OD) (đo dịch nuôi cấy tế bào trên

máy quang phổ ở bước sóng 600nm).

2.3.2. Phương pháp phân loại

2.3.2.1. Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá (Kozaki et al., 1992)

- Xác định khả năng lên men sinh axit từ các loại đường: Cấy vi khuẩn vào môi trường

dịch thể MRS (có chứa bromocresol purple làm chất chỉ thị pH) chứa các loại đường khác nhau

(1%) thay cho glucoza. Sau 2-3 ngày, nếu vi khuẩn phát triển, sinh axit từ các nguồn đường thì

dịch nuôi cấy chuyển sang màu vàng.

- Xác định khả năng di động: Môi trường MRS dịch thể bổ sung 0.15% thạch. Cấy đứng,

để 2-3 ngày ở 300C, nếu vi khuẩn mọc loang ra, đục cả môi trường thì chủng vi khuẩn đó có khả

năng di động

- Khả năng làm đông tụ sữa: Môi trường chứa 10% skim milk bổ sung bromocresol

purple là chỉ thị pH. Cấy vi khuẩn, để 300C trong 5-7 ngày. Chủng nào có khả năng đông tụ sữa

thì môi trường biến đổi từ hơi tím thành màu vàng nhạt, sữa đông lại.

- Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và

sinh axit của các chủng vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường dịch thể

(pH = 6) có các nồng độ muối 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8%, lắc 220 vòng/phút ở 30oC trong 3 ngày.

- Đánh giá khả năng năng chịu nhiệt: Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường dịch

thể có pH ổn định (pH =7.0), trong các máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ

khác nhau 20, 25, 30, 37, 450C.

- Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau: Tương tự như

trên, các chủng vi khuẩn cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có độ pH khác nhau (3, 4,

5, 6, 7, 8 và 9), trên máy lắc ổn nhiệt (37oC).

2.3.2.2. Phân loại dựa trên giải trình tự rADN 16S

- Xác định trình tự rADN 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama

và cs (2009).

- Đọc trình tự ADN

Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động 3100

Avant. Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal W 1.83. Các trình tự được so sánh

với trật tự ADNr 16S của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen, để xác định đến tên

loài.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình

3.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh axit lên men đồng hình

Với mục đích phân lập được các vi khuẩn lên men lactic đồng hình mạnh, chúng tôi sử

dụng các nguồn mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, bã dứa làm đối tượng cho

nghiên cứu, 134 chủng vi sinh vật đã được phân lập. Tất cả các chủng này đều có Catalaza âm

tính và là vi khuẩn Gram dương. Trong đó xác định được 131 chủng lên men đồng hình. Trong

số 3 chủng lên men dị hình, chủng L19 có khả năng sinh axit cao (dựa vào vòng trong của

CaCO3) cũng được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

132 chủng được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút/370C, sau 2 ngày quan sát thấy có 70 chủng

phát triển được tại nhiệt độ 370C. Các chủng này được xác định hàm lượng axit sinh ra trong

dịch nuôi bằng phương pháp chuẩn độ Therner. Sở dĩ có điều đó là do trong quá trình ủ chua

thức ăn cho động vật nhai lại, nhiệt độ thường tăng cao, nên các chủng vi khuẩn sử dụng làm

giống khởi động phải có khả năng chịu nhiệt.

Kết quả đánh giá khả năng sản sinh axit lactic được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1. Khả năng sản sinh axit của các vi khuẩn

TT Ký hiệu

chủng

Hàm lượng

axit (g/l)

TT Ký hiệu

chủng

Hàm lượng

axit (g/l)

TT Ký hiệu

chủng

Hàm lượng

axit (g/l)

1 1-1 21 25 4-7 17 48 7-11 13

2 1-2 8 26 4-10 21 49 7-13 14

3 1-9 11 27 4-12 18 50 7-14 15

4 1-12 9 28 4-13 18 51 8-3 18

5 1-14 15 29 4-14 21 52 8-4 9

6 2-2 19 30 5-3 15 53 8-5 18

7 2-5 21 31 5-5 16 54 8-8 12

8 2-9 20 32 5-6 18 55 8-10 20

9 2-10 21 33 5-10 17 56 8-11 16

10 2-11 19 34 5-11 15 57 9-1 19

11 2-12 19 35 5-14-1 19 58 9-2 16

12 2-13 20 36 5-16 15 59 9-3-1 17

13 2-14 19 37 6-2 11 60 9-4 21

14 3-3 19 38 6-3 15 61 9-6 20

15 3-4 19 39 6a 15 62 9-7 19

16 3-5 21 40 6b 17 63 9-8 16

17 3-8 21 41 6d-2 17 64 9-10 17

18 3-9 21 42 6e 16 65 9-11 18

19 3-10 21 43 6g 19 66 9-13-1 14

20 3-12 21 44 6h 18 67 9-14 18

21 3-14 20 45 7-1 16 68 9-17 21

22 4-2 20 46 7-3 17 69 L01 20

23 4-3 19 47 7-4 17 70 L19 21

24 4-6 21

Trong số 70 chủng nghiên cứu, đã chọn được 19 chủng vi khuẩn chịu được nhiệt độ là

370C, có khả năng sinh axit cao (20 - 21 g/l) được đánh giá sự sản sinh axit lactic trên thiết bị sắc

ký lỏng cao áp và khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi nhằm tìm ra các chủng sinh axit lactic

đồng hình cao lại có khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh.

Kết quả được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2. Khả năng sản sinh axit lactic và kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn

Ký hiệu

chủng

Nồng độ (%)

axit lactic

Kích thước vòng kháng khuẩn (D-d, mm)

Shigella sp. Salmonella sp. E. coli M. luteus

1-1 17.3 18 30 26 20

2-5 19.5 34 34 20 14

2-9 21 20 30 26 14

2-10 20.8 28 34 24 18

2-13 16.8 10 34 28 18

3-5 19.6 10 30 26 14

3-8 19.6 16 20 30 16

3-9 18.4 12 22 28 14

3-10 19.5 22 34 30 18

3-12 19.4 20 34 28 16

4-6 15.3 30 34 28 20

4-10 18 20 34 30 20

4-14 19.8 24 34 28 18

8-10 19.6 10 30 20 18

9-4 18.6 28 34 30 20

9-6 18.8 22 30 30 20

9-17 19.8 20 30 30 20

L01 19.6 20 34 26 14

L19 19.8 20 34 20 24

Kết quả cho thấy hàm lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn nghiên cứu sinh ra không

chênh lệch nhiều, thấp nhất là chủng 4-6 (15,3%) và cao nhất là chủng 2-9. Mặt khác kết quả ở

bảng 2 cho thấy cả 19 chủng này đều có khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định, phổ kháng

khuẩn rộng (kháng được cả vi khuẩn Gram dương Micrococcus luteus và Gram âm E.coli,

Salmonella và Shigella) thể hiện qua vòng kháng khuẩn cao. Kết quả này cũng phù hợp với kết

quả nghiên cứu của Mai Thị Đàm Linh và cs (2008) trên các chủng lactic Lo, L1, L2 và Dr1 và

của Mourad Kacem và cs (2005) trên các chủng Lactobacillus plantarum OL2, OL9, OL15 và

Enterococcus feacalis OL20, các chủng này đều có phổ kháng khuẩn rộng.

Từ các kết quả bảng 1 và 2, chúng tôi đã chọn được 8 chủng vi khuẩn (2-9; 2-10; 3-5; 4-

14, 8-10; 9-17; L10; L19) là các chủng có hoạt tính cao và đại diện cho các mẫu phân lập (cỏ

Nghệ An, cỏ Mộc Châu, cỏ Ba vì, Ngô Mộc châu, dứa…) để phân loại và nghiên cứu các đặc

điểm sinh học.

3.1.2. Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn

Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS theo phương pháp cấy vạch tiếp

xúc với các chủng khác nhau. Sau 3 ngày ở nhiệt độ 37oC, ở tất cả các mẫu đều sinh trưởng tốt.

Điều này cho thấy cả 8 chủng lựa chọn đều không kháng nhau.

3.1.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng lựa chọn

Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS có chứa cơ chất tinh bột, CMC,

pectin, protein và xylan. Sau 3 ngày ở nhiệt độ 37oC, xác định hoạt tính enzyme bằng phương

pháp khuếch tán trên thạch.

Khả năng phân giải cơ chất được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất D-d, mm

Bảng 3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của các vi khuẩn

Ký hiệu

chủng

Hoạt tính enzym (D-d, mm)

Amylase CMC-ase Pectinase Protease Xylanase

2-9 9 12 8 8 13

2-10 7 10 0 0 12

3-5 8 10 11 5 11

4-14 9 10 9 6 10

8-10 7 9 0 8 12

9-17 13 11 6 12 13

L01 0 0 0 0 0

L19 13 16 18 17 17

Kết quả bảng trên cho thấy trừ chủng L01, thì hầu như cả 7 chủng nghiên cứu đều có khả năng

sinh các enzym ngoại bào, vòng phân giải cơ chất từ 5-18 (mm). Trong đó các chủng sinh

enzyme xylanase là cao nhất. Đặc biệt chủng L19 – chủng duy nhất lên men dị hình – phân giải

các cơ chất mạnh nhất, mạnh hơn cả các chủng lên men đồng hình. Như vậy, đây là một đặc

điểm rất tốt đối với các chủng được lựa chọn làm chất cấy trong quá trình ủ chua, bởi ngoài khả

năng sinh axit cao, kháng khuẩn các chủng nghiên cứu còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào

phân giải các cơ chất trong các đống ủ.

3.2. Phân loại các chủng được tuyển chọn

3.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Việc phân loại các chủng vi khuẩn được tiến hành căn cứ vào kết hợp các kết quả nghiên

cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích, giải trình tự rADN 16S.

Bảng 5 trình bày các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu.

Tất cả 08 chủng vi khuẩn đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính,

không có khả năng di động và hình thái tế bào có 2 dạng: hình que và hình cầu. Các chủng phân

lập đều sinh trưởng được khi môi trường nuôi cấy có pH 4 - 8, nhiệt độ nuôi cấy 25 – 370C, nồng

độ NaCl 0 - 6 %, tuy nhiên sự sinh trưởng ở các mức độ khác nhau.

Bảng 5. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Các đặc tính Chủng vi khuẩn

2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19

Vi khuẩn Gram + + + + + + + +

Hình dạng tế bào que que que que que que cầu que

Hoạt tính Catalaza - - - - - - - -

Khả năng di động - - - - - - - -

Khả năng lên men và tạo axit từ

các nguồn hyđratcacbon:

D-glucoza + + + + + + + +

L-arabinoza + +

(yếu)

+

(yếu)

+ +

(yếu)

+ + -

D-fructoza + + + + + + + +

Galactoza + + + - + + + +

Glycerol +

(yếu)

- - - - - + +

(yếu)

Maltoza + + + + + + + +

D-mannitol + + + + + + + +

D-lactoza + + + + - + + +

D-raffinoza +

(yếu)

+

(yếu)

+ - + + + +

D-riboza + + + +

(yếu)

+ + +

(yếu)

+

Saccaroza + + + + + + + +

D-sorbitol +

(yếu)

+

(yếu)

+ + + +

(yếu)

+

(yếu)

+

Trehaloza + + + - - + + +

D-xyloza + - - - - - +

(yếu)

+

(yếu)

Lên men đồng hình + + + + + + + -

Sinh trưởng ở các pH

3 + (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+( rất

yếu)

+(rất

yếu)

4 - 8 + + + + + + + +

9 + (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+( rất

yếu)

+(rất

yếu)

Sinh trưởng trong NaCl (%)

0 - 6 + + + + + + + +

8 +

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

10 + (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

- + (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

- -

Các đặc tính Chủng vi khuẩn

2-9 2-10 3-5 4-14 8-10 9-17 L01 L19

Nhiệt độ sinh trưởng (0C)

20 + (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

+ (rất

yếu)

25 - 37 + + + + + + + +

45 +

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

+

(yếu)

Khả năng đông tụ sữa + + + + + + + -

Chú thích: (+) dương tính; (-) âm tính

3.2.2. Xác định trình tự 16S rADN và xây dựng cây phân loại

Các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, được thu sinh khối tế bào và tách ADN genom. Đoạn

gen mã cho 16S rARN được khuyếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F và

1525R, sau đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi

và mồi ngược. Kết quả đọc trình tự (phụ lục) được xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh

với ngân hàng dữ liệu GeneBank bằng công cụ Blast Search để xác định đến tên loài.

Trình tự 16S rADN của 8 chủng nghiên cứu được xác định. Cây phả hệ được xây dựng

dựa trên trình tự ADNr 16S của 1400 bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với

các loài đó biết thuộc các chi Enterococcus, Lactobacillus. Pediococcus acidilactici được sử

dụng làm nhóm ngoài. Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với các

loài của nhóm Lactobacillus plantarum; chủng L01 tạo nhánh khác cùng vị trí với Enterococcus

lactis (hình 1- phần phụ lục).

So sánh trình tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài

đã biết cho thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 và L19 có mức tương đồng 99,7-100 %

với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus

plantarum, Lactobacillus paraplantarum); chủng L01 có mức tương đồng 99,9 với Enterococcus

lactis (bảng 6).

Bảng 6. Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần nhất

Chủng Tỷ lệ ADNr 16S tương đồng (%) với loài chuẩn gần nhất

2-9 Lactobacillus pentosus (99,9%), Lactobacillus plantarum (99,8%), Lactobacillus

paraplantarum (99,8%)











L01 Enterococcus lactis (99,9 %)

L19 Lactobacillus pentosus (100%), Lactobacillus plantarum (99,9%), Lactobacillus


Kết quả cho thấy 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 và L19 có độ tương đồng gen

16S rRNA là 99.7%-100% so với gen 16S rRNA của các loài thuộc nhóm Lactobacillus

plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum);

Như vậy rất khó có thể kết luận được chúng thuộc chính xác loài nào nếu chỉ dựa trên trình tự

gen 16S rRNA. Đối với L. plantarum, L. paraplantarum và L. pentosus, để phân biệt các loài này

cần sử dụng một số kỹ thuật phân tử khác như lai ADN-ADN (Zanoni et al., 1987; Curk et al.,

1996), lai với các gen đặc hiệu như pyrDEF (Bringel et al., 1996), hay phân tích trình tự gen đặc

hiệu recA (Torriani et al., 2001). Do điều kiện không cho phép, chúng tôi chưa thể tiến hành

phân loại các chủng dựa vào các gen đặc hiệu trên. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu trước đây,

L. pentosus thường lên men xyloza trong khi L. plantarum và L. paraplantarum không lên men

nguồn cacbon này (Kandler & Weiss, 1986; Zanoni et al., 1987). Khác với L. plantarum và L.

paraplantarum, L. pentosus thường lên men glycerol (Zanoni et al., 1987; Bringel et al., 1996;

Curk et al., 1996). Khác với L. plantarum, L. paraplantarum thường không đồng hóa arabinose

và sorbitol (Curk et al., 1996). Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm sinh lý, sinh

hoá có thể xếp chủng L19 và 2-9 thuộc loài L. pentosus. Các chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17

thuộc loài L. plantarum. Chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis. Các chủng được lựa chọn

đều là những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các

chế phẩm probiotic. Đây là các chủng nằm trong danh sách các loài vi sinh vật được AFCO

(American Feed Control Officials) Mỹ cho phép sử dụng trong chế biến thức ăn.

4. Kết luận

- Từ các nguồn cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, đã phân lập được 134

chủng vi khuẩn. Dựa vào các khả năng lên men đồng hình, khả năng chịu nhiệt, khả năng sinh

axit lactic, bacteriocin và enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất, 8 chủng vi khuẩn (2-9; 2-10;

3-5; 4-14, 8-10; 9-17; L10; L19) được chọn cho nghiên cứu.

- Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá có thể

xếp chủng L19 và 2-9 thuộc loài L. pentosus. Các chủng 2-10, 3-5, 4-14, 8-10, 9-17 thuộc loài L.

plantarum. Chủng L01 thuộc loài Enterococcus lactis. Các chủng được lựa chọn đều là những

chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm

probiotic.

Tài liệu tham khảo

1. Mai Thị Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh và Nguyễn Thị Giang. 2008. Đặc điểm

sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà nội. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24, pp. 221 – 226.

2. Bringel, F., Curk, M. C. & Hubert, J. C. 1996. Characterization of lactobacilli by Southern-type hybridization

with a Lactobacillus plantarum pyrDFE probe. Int J Syst Bacteriol 46: 588–594.

3. Curk M.C., Hubert J.C. & Bringel F. 1996. Lactobacillus paraplantarum sp. nov., a new species related to

Lactobacillus plantarum. Int J Syst Bacteriol 46: 595–598.

4. Emanuel, V., Adrian, V., Ovidiu, P., Gheorghe, C. 2005. Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for

obtaining a product for the preservation of fodders. African Journal of Biotechnology 4(5) 403-408.

5. Kandler O. & Weiss N. 1986. Regular, nonsporing Gram-positive rods. In Bergey’s Manual of Systematic

Bacteriology, vol. 2, pp. 1208–1234. Edited by P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe & J. G. Holt.

Baltimore: Williams & Wilkins.

6. Kozaki M., Uchimura T. & Okada S. 1992. Experimental manual of lactic acid bacteria. Asakurasyoten, Tokyo,

Japan.

7. McDonald P, Henderson N, Heron S. 1991. The Biochemistry of Silage, Second Edition. Chalcombe

Publications, Marlow, Buckinghamshire, England.

8. Machin. D. H. 2005. The potential use of tropical silage for livestock production with special reference to

smallholders. FAO Electronic Conference on Tropical Silage

9. Mourad Kacem, Halima Zadi-Karam and Nour-Eddine Karam. 2005. Isolation of lactic acid bacteria from

naturally fermented Algerian olives. J.King Saud Univ., Vol. 18, Science (2), pp. 89-98.

10. Nocek, J. E., andW. P. Kautz. 2006. Direct-fed microbial supplementation on ruminal digestion, health and

performance of pre- and postpartum dairy cattle. J. Dairy Sci. 89:260–266.

11. Sadahiro Ohomono, Osamu TANAKA, Hiroko K. KITAMOTO and Yimin CAI. 2002. Silage and and Micobial

Performance, Old Story but New Problems. Review. JARQ. 36 (2). 59-71. (2002). http://www. Jrcas.affrc.go.jp.

12. Sakiyama, Y., Nguyen, K. N. T., Nguyen, M. G., Miyadoh, S., Duong, V. H. & Ando, K. (2009) Kineosporia

babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam. Int J Syst Evol Microbiol 59, 550-554

13. Torriani S., Felis G.E. & Dellaglio F. 2001. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L.

paraplantarum by recA sene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene-derived primers. Appl

Environ Microbiol 67: 3450-3454.

14. Wallace, R. J., and C. T. Newbold. 1993. Rumen fermentation and its Manipulation: The development of yeast

cultures as feed additives. Pages 173–192 in Biotechnology in the Feed Industry. Proc. Alltech’s Ninth Annu.

Symp. Alltech Tech. Publ., Nicholasville, KY.

15. Weinberg, Z. G., O. Shatz, Y. Chen, E. Yosef, M. Nikbahat, D. Ben-Ghedalia, and J. Miron. 2007. Effect of

Lactic Acid Bacteria Inoculants on In Vitro Digestibility of Wheat and Corn Silages. Dairy Sci. 90:4754–4762

16. Zanoni, P., Farrow, J. A. E., Phillips, B. A. & Collins, M. D. (1987). Lactobacillus pentosus (Fred, Petersen,

and Anderson) sp. nov., nom. rev. Int J Syst Bacteriol 37: 339-341.

Phụ lục

1. Môi trường nuôi cấy vi sinh

1.1. Môi trường MRS (g/l)

Glucoza-20,0; K2HPO4-2,0; CaCO3-5,0; CH3COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni xitrat-2,0;

Pepton-10,0; MgSO4.7H2O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO4.4H2O- 0,28; Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0;

Nước cất vừa đủ- 1lít; pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút

Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO3

1.2. Môi trường thạch thường (g/l): nuôi vi sinh vật kiểm định

Cao thịt - 2,0; Pepton- 5,0; NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1000ml (pH= 7,0); khử

trùng ở 121oC/15 phút.

2. Cây phân loại của các chủng nghiên cứu

Hình 1. Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu và các loài có quan hệ họ hàng gần

Pediococcus acidilactici_ EF059987

Lactobacillus brevis_M58810

Lactobacillus acidifarinae_AJ632158

Lactobacillus parabuchneri_AB205056

100

Lactobacillus malefermentans_AM113783

54

Lactobacillus versmoldensis_AJ496791

Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556

Lactobacillus paraplantarum_AJ306297

L19

Lactobacillus plantarum_AJ965482

Lactobacillus pentosus_D79211

64

4-14

9-17

2-9

3-5

8-10

56

2-10

75

63

72

66

72

62

100

53

Enterococcus lactis_DQ255948

L01

Enterococcus faecium_AJ301830

86

Enterococcus durans_AJ276354

Enterococcus hirae_Y17302

94

64 Enterococcus mundtii_AF061013

82

Enterococcus pseudoavium_ AF061002

98

Enterococcus gallinarum_ AF039900

Enterococcus faecalis_AB012212

54

56

52

100

55

0.02

phÂn lẬp vÀ tuyỂn chỌn cÁc chỦng vi sinh …vcn.vnn.vn/uploads/files/bao cao khoa hoc...

Documents