ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ HUỆ

PHÂN TÍCH ACID OLEANOLIC

VÀ THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG RỄ CÂY

SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)

THU HÁI Ở TÂY BẮC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ HUỆ

PHÂN TÍCH ACID OLEANOLIC

VÀ THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG RỄ CÂY

SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)

THU HÁI Ở TÂY BẮC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa : QH.2012.Y

Người hướng dẫn : TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn

thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với

những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GVHD, TS Nguyễn Hữu Tùng,

người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực

hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y

Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho

tôi hoàn thành khóa luận này.

Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2012.Y đặc biệt là các bạn

Bích, Ngần, Hào đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát cánh, giúp

tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày 8 tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Huệ

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

DAD Detector mảng điốt (Diode array detector)

Dd Dung dịch

EtOH Ethanol

FLD Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography)

MeOH Methanol

MOA KTP Hàm lượng acid oleanolic không thủy phân

MOA STP Hàm lượng acid oleanolic sau thủy phân

Msaponin tổng số Hàm lượng saponin tổng số

OA Acid oleanolic

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

SVD Sâm vũ diệp

TB Trung bình

THF Dimethylformamid

TT Thứ tự

UV Ultra violete

VIS Visible

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng Nội dung Trang

3.1 Tính thích hợp hệ thống 23

3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid oleanolic 25

3.3 Kết quả độ lặp lại của phương pháp 26

3.4 Kết quả độ đúng của phương pháp 27

3.5 Kết quả hàm lượng acid oleanolic trong dược liệu và cao sâm vũ diệp 28

3.6 Kết quả hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu và cao sâm vũ

diệp 29

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Nội dung Trang

1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 2

1.2 Cấu trúc hóa học các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp 4

1.3 Công thức tổng quát các saponin với phần sapogenin là acid

oleanolic của sâm vũ diệp 6

1.4 Cấu trúc hóa học của acid oleanolic 6

1.5 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 11

2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa,

Lào Cai 16

2.2 Cơ sở phương pháp thủy phân các saponin khung oleanan từ sâm

vũ diệp 19

3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 22

3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) 24

3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic (đánh giá độ đặc hiệu) 24

3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid

oleanolic 25

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN ........................................................................................ 2

1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP ..................................................................... 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................ 2

1.1.2. Phân bố và sinh thái ......................................................................................... 3

1.1.3. Thành phần hóa học ........................................................................................ 3

1.1.4. Tính vị, công năng ........................................................................................... 4

1.1.5. Công dụng ....................................................................................................... 4

1.1.6. Tác dụng dược lý ............................................................................................. 5

1.2. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN ............................................................................. 5

1.3. TỔNG QUAN VỀ ACID OLEANOLIC ........................................................... 6

1.3.1. Công thức hóa học ........................................................................................... 7

1.3.2. Tính chất lý hóa ............................................................................................... 7

1.3.3. Tác dụng sinh học của acid oleanolic .............................................................. 7

1.3.4. Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng HPLC ............................. 7

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ................. 10

1.4.1. Nguyên tắc của HPLC ................................................................................... 10

1.4.2. Một số thông số đặc trưng ............................................................................. 11

1.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC .................................................... 13

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 16

2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 16

2.1.2. Dung môi, hóa chất ....................................................................................... 16

2.1.3. Máy móc, dụng cụ ......................................................................................... 16

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 17

2.2.1. Phương pháp chiết xuất sâm vũ diệp ............................................................. 17

2.2.2. Phương pháp phân tích HPLC ....................................................................... 17

2.2.3. Phương pháp định lượng saponin tổng số ..................................................... 19

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 20

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 21

3.1. KẾT QUẢ ........................................................................................................... 21

3.1.1. Quy trình chiết xuất sâm vũ diệp .................................................................. 21

3.1.2. Xây dựng quy trình định lượng ..................................................................... 21

3.1.3. Định lượng acid oleanolic trong dược liệu và cao sâm vũ diệp .................... 27

3.1.4. Định lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp ...................................... 28

3.2. THẢO LUẬN ..................................................................................................... 30

3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích acid oleanolic bằng HPLC ...................... 30

3.2.2. Định lượng acid oleanolic và saponin trong dược liệu và cao sâm vũ diệp .. 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), còn gọi

là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất là một vị thuốc

quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [1,11]. Gần

đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa

phương ở Hà Giang, Lào Cai. Về mặt y học, dân gian hay sử dụng sâm vũ diệp làm

thuốc bổ và trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc

[1,11].

Thành phần chính trong rễ cây sâm vũ diệp là saponin thuộc khung oleanan với

hơn 10 chất khác nhau đã được công bố [1,28]. Các saponin này có phần sapogenin là

acid oleanolic. Acid oleanolic là thành phần có hoạt tính, quyết định tác dụng sinh học

của nhiều loài dược liệu như chống viêm [22,26], ức chế tế bào ung thư [34] và chống

đông máu [37], chống oxi hóa [25,35].

Tra cứu tài liệu thấy rằng ở trong nước có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa

học, tác dụng sinh học và dược lý của sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý

thuộc chi sâm Panax này. Đề tài cấp nhà nước thuộc chương trình Tây Bắc “Ứng dụng

các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ

hai loài cây thuốc sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax

stipuleanatus H.Tsai et K.M. Feng) vùng Tây Bắc” đặt ra mục tiêu chính là xác lập

được cơ sở khoa học của giải pháp công nghệ sinh học phân tử, hóa học và dược học

để phát triển sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang.

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích acid oleanolic và thành

phần saponin trong rễ cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái ở Tây

Bắc”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất

lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường,

tối ưu hóa quy trình chiết cũng như nghiên cứu về tác dụng dược lý sau này.

Các mục tiêu của đề tài gồm có:

1. Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic bằng HPLC và thẩm định

phương pháp phân tích.

2. Xác định hàm lượng acid oleanolic và hàm lượng saponin tổng số trong cao sâm

vũ diệp và rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc.

2

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ nhân sâm - Araliaceae), còn gọi là

Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất có thân thảo ưa

bóng và đặc biệt ưa ẩm, sống nhiều năm [1,11], cao 0,25 – 0,7 cm, đường kính thân 0,3

– 0,6 cm [1]. Rễ củ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại.

Thân mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa

khô [11]. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái mọc vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5 –

14 cm, rộng 1,5- 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có

răng cưa, có lông [1,11].

Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 –

90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn

thân, 5 cánh hoa, bầu 2-3 ô [1]. Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2

cm; khi chín màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa 1 – 2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần cầu,

màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1,11].

3

1.1.2. Phân bố và sinh thái

Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước

ta. Trong tự nhiên, sâm vũ diệp phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận

Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta [1,11]. Sa Pa ở Việt Nam

cũng là điểm phân bố cuối cùng của sâm vũ diệp ở phía nam. Năm 1973, cây đã được

phát hiện ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sa Pa, ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố

của sâm vũ diệp đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây được coi là

cực hiếm [1]. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử

nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [11].

Sâm vũ diệp là cây thân thảo ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, thường mọc rải rác hay

tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù. Hàng năm vào cuối

tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ

mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi

này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực

đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh quan sát

được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây

mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường

bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp. Sau khi quả

chín, từ tháng 9 – 10, toàn bộ phần thân mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ những vết

sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1].

1.1.3. Thành phần hóa học

Sâm vũ diệp là một trong 4 loài thuộc chi Panax được ghi nhận tại Việt Nam.

So với hai đối tượng sâm Việt Nam (P. vietnamensis) và tâm thất (P. notoginseng) đã

được nghiên cứu nhiều một cách có hệ thống từ thực vật học, thành phần hóa học, tác

dụng sinh học, …thì chưa có nhiều kết quả nghiên cứu trên cây sâm vũ diệp.

Thành phần hóa học của lá và rễ cây sâm vũ diệp được phát hiện có nhiều

saponin. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin khung

dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin

đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [16].

Rễ sâm vũ diệp chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như

chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [1].

4

Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc phân lập một

nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C

(1-3), là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn,

Việt Nam [28].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp

1.1.4. Tính vị, công năng

Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc,

chỉ huyết, tán ứ [1].

1.1.5. Công dụng

Theo đông y, sâm vũ diệp có tác dụng bổ, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu,

nhất là đối với phụ nữ sau khi đẻ. Sâm vũ diệp còn được dùng cầm máu, tán ứ, tiêu

sưng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thương mau

lành. Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất

tốt, có tác dụng kích thích sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả

thân và lá nấu cao. Cao này pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng như rễ.

5

Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp là thuốc chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã

tổn thương [1].

1.1.6. Tác dụng dược lý

Về kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý, mặc dù rễ của

sâm vũ diệp được dùng trong một số bài thuốc truyền thống cả ở nước ta và Trung

Quốc nhưng chưa có nhiều tài liệu, công trình khoa học được công bố. Liên quan đến

tác dụng sinh học, một số hợp chất được xác định là thành phần của sâm vũ diệp có tác

dụng sinh học bao gồm kháng viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch,

chống tiểu đường, bảo vệ tế bào thần kinh, … có thể phần nào giải thích cho lợi ích về

mặt dược học trong việc sử dụng sâm vũ diệp trong y học truyền thống.

1.2. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN

Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid gặp nhiều trong thực vật.

Theo truyền thống, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chất chung

đặc trưng của nhóm hợp chất này bao gồm:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước.

- Làm vỡ hồng cầu ngay cả khi ở nồng độ loãng.

- Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên…

- Kích thích niêm mạc mắt gây hắt hơi, đỏ mắt.

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid.

Cấu trúc của saponin cũng như các glycosid khác, gồm có 2 phần là phần đường

và phần aglycon (còn được gọi là sapogenin). Saponin có cấu trúc triterpen với khung

cơ bản 30C hoặc steroid với khung cơ bản 27C dẫn xuất từ khung cholestan. Trên các

khung cơ bản của sapogenin các sapogenin khác nhau bởi mức độ oxi hóa trên khung

hay vị trí, số lượng của các nhóm thế. Nhóm thế trong sapogenin thường là hydroxyl,

đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat. Nhóm OH có thể tự do hay glycosid hóa với đường.

Một vài trường hợp nhóm có thể được acyl hóa với các acid hữu cơ. Số lượng và vị trí

nhóm thế trên khung cũng không nhiều. Ở vị trí C3 của sapogenin gần như luôn có

nhóm OH. Nhóm OH này trong đa số trường hợp có định hướng β. Đây cũng là vị trí

gắn với đường của đa số saponin. Với số lượng không nhiều các sapogenin, sự đa dạng

của saponin chủ yếu do thành phần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử.

Ngoài ra, còn có thể gặp các dây nối trên khung.

6

Đa số saponin có từ 1 – 2 mạch đường (được gọi là monodesmosid và

bidesmosid – desmos = mạch). Ở các monodesmosid, phần đường gắn vào sapogenin

hầu hết là ở vị trí C – 3 bằng dây nối glycosid. Saponin có thể có thêm mạch đường thứ

hai. Tổng số đơn vị đường trong một saponin có thể tới 11 đơn vị, nhưng số đường trên

một mạch được biết tới nay tối đa là 8. Số đơn vị đường trong saponin thường là 1 – 4

đường. Đường trong saponin là các đường thông thường như β-D-glucose, β-D-xylose,

α-L-rhamnose và α-L-arabinose… [14].

Nhiều công trình nghiên cứu trước đây đã cho thấy thành phần chính của rễ cây

sâm vũ diệp là saponin thuộc nhóm triterpenoid khung oleanan với phần sapogenin đã

được xác định là acid oleanolic [1,28].

Hình 1.3. Công thức tổng quát các saponin với phần sapogenin là OA của sâm vũ diệp

1.3. TỔNG QUAN VỀ ACID OLEANOLIC

1.3.1. Công thức hóa học

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của acid oleanolic

- Công thức phân tử: C30H48O3 [21].

- Tên khoa học: (3β) – Hydroxyolean – 12 – en – 28 – oic [21].

- Phân tử lượng: 456,711 g/mol [21].

7

1.3.2. Tính chất lý hóa

Bột kết tinh màu trắng, không tan trong nước, tan trong 65 phần ether, 108 phần

alcol 95%, 35 phần alcol 95% sôi, 118 phần cloroform, 118 phần aceton, 235 phần

methanol. Nhiệt độ nóng chảy 310ºC, góc quay cực bằng + 83,3º; pKa = 2,52 [21].

1.3.3. Tác dụng sinh học của acid oleanolic

Acid oleanolic - aglycon của nhiều saponin trong dược liệu, được biết đến như

là thành phần có hoạt tính, quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu như

dược liệu chi panax như sâm Hàn Quốc (Panax ginseng), tam thất (Panax

notogingseng), Calendula officinalis (Arteraceae), Panax japonicus (Araliaceae),

Oleandra neriifolia L, Sapindus mukorossi (Sapindaceae), Cochinchina momordica,

Glycyrrhiza uralensis và Achyranthes bidentata … Trong một số nghiên cứu trên thế

giới, acid oleanolic có tác dụng kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm, chống oxi hóa

[27,30,37], chống ung thư [34], chống viêm [22,26], bảo vệ gan [19], lợi tiểu thải trừ

Natri, có lợi trong ngừa cao huyết áp nặng, hạ đường huyết, chống oxi hóa [25,35],

điều hòa miễn dịch [29,31].

1.3.4. Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng HPLC

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong dược liệu

bao gồm cả phương pháp truyển thống cũng như phương pháp hiện đại. HPLC là một

trong những phương pháp hiện đại được sử dụng phổ biến hiện nay.

Sau đây là một vài nghiên cứu định lượng OA trong một vài loài dược liệu

a) Định lượng OA trong bột quả cây Macrocarpium officinalis [32]

- Cột: Kromosil C18 (250 × 4,6 mm; 5 μm)

- Detector: UV (210 nm)

- Pha động: Methanol: Dd H3PO4 - H2O (88:0,05:11,95)

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20µl

- Đường chuẩn: 0,51–2,55 μg/ml, R2 = 0,9998

- Độ đúng: 97,9%

8

- Độ lặp lại: RSD = 4,83% (n=5)

b) Định lượng OA trong lá cây mã đề (Plantago major) [36]

- Cột: LiChrosorb RP18 (250 mm x 4,6 mm,5 μm), Nhiệt độ phòng (22°C)

- Pha động: MeOH–H2O–THF (94:5:1), chỉnh pH 5 bằng acid acetic.

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Detector: DAD (220 nm)

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

- Đường chuẩn: 2,5-100 µg/ml, R2= 0,9997

- Độ đúng: 98,9 -101,6%

c) Định lượng OA trong phần trên mặt đất của cây Mitracarpus scaber [18]

- Cột: SPHERISORB®ODS (250× 4,6 mm,5 μm), nhiệt độ cột 25ºC

- Pha động: MeOH–H2O–THF (94:5:1), chỉnh pH 5 bằng acid acetic

- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút

- Detector: UV (215 nm).

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

- Đường chuẩn: 0,5-10 µg/ml, R2 = 0,98 – 0,99.

- Độ đúng: 97,4%, RSD = 1,49% (n=5)

d) Định lượng OA trong cây Rabdosia rubescens [33]

- Cột: C18 column (250 mm x 4 mm, 5µm), nhiệt độ cột 40oC

- Pha động: ACN: acid phosphoric 0,1%/nước = 88:12

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

- Detector: UV (205 nm)

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

- Đường chuẩn: 3-2000 µg/ml, R2 = 0,999

- Độ đúng: 93,47%, n=6, RSD = 2,90%

9

e) Định lượng OA từ cao khô đinh lăng [7]

- Cột: Germmini Luna C18 (250 x 4,6 mm; 5µm)

- Pha động: MeOH : MeCN : isopropanol : dung dịch acid acetic 2 mM (5:3:1:1)

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

- Detector: UV 210 nm

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

- Detector: UV 210 nm

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

- Đường chuẩn: 5-35 µg/ml, R2 = 0,9991

- Độ đúng: 101,6%, RSD = 4,06%, n=5

f) Định lượng OA từ lá đinh lăng [6]

- Cột: Cột ACE3 – C18 (4,6 mm x150 mm; 3,5 µm), Nhiệt độ cột 20ºC

- Đệm trietylamin (TEA/HCl, pH 3): MeOH chứa 0,1% acid formic (10:90)

- Tốc độ dòng 0,5 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Đường chuẩn: 1-50 µg/ml, R2 = 0,9991

- Độ lặp lại: RSD = 0,5%, n = 3

g) Định lượng OA từ lá của Eriobotrya japonica Lindl [20]

- Cột: Alltech Apollo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm), Nhiệt độ cột 20ºC

- Pha động: MeOH : nước (95:5)

- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút

- Detector: UV (215 nm)

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Đường chuẩn: 25 – 30 µg/mL, R2 = 0,996

- Độ lặp lại: RSD =3,21%, n=5

10

h) Định lượng OA trong đinh lăng lá xẻ (Polyscias fruticosa (L.)Harms) [12]

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu

- Cột sắc ký: Prontosil LC8 (150 x 4,6 mm, 3 μm).

- Pha động: CH3CN – H2O (72:28)

- Detector SPD phát hiện ở bước sóng 203 nm

- Tốc độ dòng: 0,768 ml/ phút

- Thể tích bơm mẫu: 20 μl

- Đường chuẩn: 24-300 μg/ml; R2 = 0,9998

- Độ đúng: 99,17%; RSD=1,51%

- Độ lặp lại: RSD = 2,66%, n=6

Trên đây là một trong những thông tin quan trọng giúp chúng tôi tham khảo và

áp dụng để định lượng acid oleanolic trong sâm vũ diệp.

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.4.1. Nguyên tắc của HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân tách

các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp

suất cao. Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn dưới dạng

tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được

liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân

loại theo kích cỡ. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng

giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động.

Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó.

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá trình

tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá

trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được

tách ra trên sắc ký đồ [2,3,5,9,10,15].

11

1.4.2. Một số thông số đặc trưng

Hình 1.5. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng

a)Thời gian lưu

tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống

sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.

t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký

tR’(Thời gian lưu thực): tR

’= tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi

tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).

W : là chiều rộng đáy pic.

W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.

b) Hệ số dung lượng k’

Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:

R R 0 R

0 0 0

' -t t t tk'= = = -1

t t t

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ

lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân

bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm

12

giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian

lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2-5 là tốt nhất.

c) Hệ số chọn lọc

R,B 0B

R,A 0A

' -t tkα= =

' -t tk (k’

B k’A)

khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng.

Để tách riêng hai chất thường chọn nằm trong khoảng 1,05 đến 2.

d) Hiệu lực cột

Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và chiều

cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân

bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả định như

một pha tĩnh có chiều cao H.

2

RtN =16

W

Hay

2

R

1 /2

tN = 5 ,5 4

W

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính

bằng công thức: L

H = N

e) Hệ số bất đối AF (tailing factor)

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ

Trong đó:

- W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

2a

WAF 1/20

13

- a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía

trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 AF 2

Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối

f) Độ phân giải (resolution)

Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện

sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

k1

k

α

1α

4

N

WW

tt1,18

WW

tt2R '

B

'B

1/2A1/2B

AR,BR,

AB

AR,BR,S

Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng,

chỉ xen phủ nhau 0,3%

- Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%

- RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau [2,3,5,9,10,15]

1.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC

a) Yêu cầu chung

Các quy trình phân tích HPLC cần phải thẩm định là các quy trình chưa được

công bố trong tiêu chuẩn Dược điển các nước. Nội dung về thẩm định phương pháp

được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được quy định trong các Dược điển.

Thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC cần đánh giá khi thẩm định phương

pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: độ đặc hiệu/chọn lọc, độ tuyến

tính – khoảng xác định, độ chính xác.

b) Nội dung thẩm định

* Độ đặc hiệu

Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có

mặt các thành phần như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Phương pháp HPLC được

coi là có tính đặc hiệu đối với chất cần phân tích nếu:

14

- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa

thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời

gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.

*Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ đáp ứng của pic (diện tích pic hay chiều

cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng

độ từ thấp đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính.

Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax+b với hệ số

tương quan tuyến tính R.

Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ;

- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác

định của phương pháp;

-Các mẫu thử có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn ban

đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau;

Một quy trình HPLC thông thường dùng định lượng phải có hệ số tương quan

tuyến tính của đường chuẩn R > 0,999.

*Độ chính xác (accuracy)

Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả thí nghiệm riêng biệt so với giá

trị thực khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất, biểu thị

bằng giá trị RSD (%). Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ đúng.

- Độ lặp lại (precision)

Độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng giá trị RSD (%) kết quả phân

tích các mẫu độc lập trong cùng điều kiện phân tích. Trong thực tế, thường bố trí thí

nghiệm xác định độ lặp lại của phương pháp cùng với thí nghiệm đánh giá độ đúng của

phương pháp, tuy nhiên, trong một số trường hợp, có thể chấp nhận đánh giá độ lặp lại

của phương pháp trên các mẫu độc lập có nồng độ tương ứng giá trị.

15

- Độ đúng (trueness)

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của

mẫu đã biết. Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt

được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/ hoặc khối

lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử.

Độ đúng thường được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Thêm chất

chuẩn chất cần phân tích đã biết hàm lượng vào mẫu giả dược. Phân tích mẫu theo qui

trình phân tích. Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp (giá trị trung bình và

RSD). Trong một số trường hợp, không thể có được các mẫu giả dược phù hợp, có thể

chấp nhận thêm chất chuẩn chất cần phân tích đã biết hàm lượng vào mẫu thử. Lượng

chất chuẩn thêm vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng hoạt

chất có trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyển tính của phương pháp. Tiến hành xác

định độ đúng của phương pháp tương tự như trường hợp thêm chuẩn vào mẫu giả

dược.

16

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 3 năm tuổi được

trồng ở Sa Pa, Lào Cai và thu hái vào tháng 3-2016 và được giám định tên khoa học

bởi TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Mẫu tiêu

bản (PB-001/2016) được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN.

Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai

2.1.2. Dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn OA của Wako Chemicals, Nhật Bản (1g, độ tinh khiết 98%, mã sản phẩm

155-01701)

- Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu

chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC

- Ethanol 70% được pha từ Ethanol PA

- Acid acetic 0,15%/ nước được pha từ acid acetic PA (Merk, Đức)

- Methanol dùng cho HPLC (Merk Đức).

- Nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

2.1.3. Máy móc, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1260 Technologies

- Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức

17

- Máy cô quay Rovapor R- 210 (Buchi - Đức)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm

- Cân phân tích

- Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu

- Nồi đun cách thủy

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong…

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp chiết xuất sâm vũ diệp

Nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều

cho thấy sâm vũ diệp có chứa các saponin với phần sapogenin đã được xác định là OA.

Vì vậy, để chiết xuất OA trong sâm vũ diệp, chúng tôi tiến hành tham khảo các tài liệu

về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu [4,11,13,14] để tìm ra phương pháp

chiết xuất phù hợp nhất với đối tượng nghiên cứu là rễ cây sâm vũ diệp.

Chúng tôi đã chọn ra quy trình chiết xuất sâm vũ diệp được thực hiện như sau:

- Phương pháp chiết: đun hồi lưu cách thủy

- Dung môi chiết xuất: ethanol 70%

- Số lần chiết: 3 lần

- Thời gian chiết: 3 giờ/lần

2.2.2. Phương pháp phân tích HPLC

a) Lựa chọn điều kiện sắc ký

Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng OA trong

trong cao sâm vũ diệp. Cụ thể, chúng tôi khảo sát các điều kiện như sau:

- Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo;

- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần,

tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau;

18

- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD,

DAD để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình

phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm;

- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.

b) Thẩm định phương pháp phân tích

* Độ đặc hiệu

Chuẩn bị các mẫu sau:

- Mẫu trắng: dung dịch MeOH

- Mẫu OA chuẩn pha trong MeOH

So sánh các pic trên các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.

*Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn OA pha trong MeOH có nồng độ từ 1 – 200

μg/ml. Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số

tương quan R.

* Độ chính xác

Độ lặp lại

Tiến hành phân tích 6 mẫu dung dịch chuẩn OA, xác định kết quả định lượng

theo đường chuẩn pha trong MeOH, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại

bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.

Độ đúng

Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho

nồng độ OA vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.

Tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch sau:

- Dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp.

- Dung dịch thử: dung dịch cao sâm vũ diệp pha trong MeOH

19

- Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn

bằng khoảng 40% lượng OA có trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký

theo quy trình đã xây dựng.

Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn sẽ tính được

phần trăm tìm lại so với lượng chuẩn thêm vào mẫu thử.

2.2.3. Phương pháp định lượng saponin tổng số

Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường gắn trên aglycone được thủy

phân trong môi trường acid để chuyển hết về dạng glycone. Do đó, saponin tổng số

được định lượng thông qua acid oleanolic [6].

3

COOR228

R1O

H+, toC

3

COOH28

HO

Hình 2.2. Cơ sở phương pháp thủy phân các saponin khung oleanan từ sâm vũ diệp

- Chuẩn bị mẫu phân tích OA: Cân cao SVD hòa tan trong MeOH. Lọc qua màng lọc

0,2 micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.

- Chuẩn bị mẫu phân tích OA tổng số: Cân cao SVD cho vào bình cổ nhám. Thêm

nước nóng, ủ tại 90ºC trong 10 phút. Thêm HCl đậm đặc và đun hồi lưu cách thủy

trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết bằng dicloromethan. Pha dicloromethan cô quay tới gần

cạn. Hòa tan phần cặn bằng MeOH, lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm.

- Quy trình HPLC phân tích và định lượng OA và saponin tổng số: Điều kiện sắc ký

như đã khảo sát

- Phương pháp tính toán hàm lượng OA và saponin tổng số trong mẫu được thực hiện

theo phương pháp ngoại chuẩn:

+ Pha dãy dung dịch chuẩn OA.

+ Từ sắc ký đồ thu được của các điểm chuẩn, lấy tín hiệu diện tích pic của từng

điểm chuẩn được các giá trị diện tích pic, dựng đường tuyến tính diện tích pic theo

20

nồng độ thu được hàm số bậc nhất: y = ax + b (y là diện tích pic, x là nồng độ dung

dịch chuẩn OA).

+ Từ sắc ký đồ của các mẫu phân tích, lấy diện tích pic của OA thu được giá trị

S mẫu. Giá trị S mẫu được áp vào đường tuyến tính y = ax + b sẽ thu được giá trị nồng

độ OA trong mẫu. Quá trình thủy phân mẫu giúp chuyển các saponin về dạng acid

oleanoic. Do đó, hàm lượng saponin tổng số (Msaponin tổng số) được tính bằng cách lấy

hàm lượng OA sau thủy phân (MOA STP) trừ cho hàm lượng OA không thủy phân (MOA

KTP)

Msaponin tổng số = MOA STP – MOA KTP

Trong đó, hàm lượng acid oleanolic được tính theo phương pháp ngoại chuẩn.

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả:

- Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007

- Giá trị trung bình:

n

1iixx

n

1

- Độ lệch chuẩn: 1n

S1i

2

xx i

- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100x

SRSD

21

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ

3.1.1. Quy trình chiết xuất sâm vũ diệp

Mẫu rễ SVD (500 g) sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được ngâm chiết kỹ

bằng dung môi ethanol 70% 3 lần (mỗi lần 1500 ml) sử dụng thiết bị chiết hồi lưu

trong 3 giờ/lần. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất

loại dung môi dưới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết tổng ethanol, độ ẩm 4,7%.

3.1.2. Xây dựng quy trình định lượng

a) Điều kiện sắc ký

Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động, tỷ

lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ

thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:

- Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 mm x 100 mm; 3,5 μm)

- Pha động: A (methanol): B (acid acetic 0,15%/ nước) với tỉ lệ A:B = 85:15

- Detector DAD: bước sóng 203 nm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20 μl

- Nhiệt độ buồng cột: 25oC

- Dung môi pha mẫu: methanol

Kết quả là chúng tôi thu được sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid oleanolic

(Hình 3.1) với điều kiện sắc ký như trên.

22

Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch acid oleanolic chuẩn

b) Thẩm định phương pháp phân tích

* Chuẩn bị dung dịch

- Dung dịch chuẩn

+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn OA, hòa tan

và định mức trong bình định mức 10 ml bằng MeOH được dung dịch chuẩn gốc nồng

độ 1000 μg/ml.

+ Từ dung dịch chuẩn 1000 μg/ml tiến hành pha loãng thành các dung dịch

chuẩn có nồng độ 6,25 – 12,5 – 25 – 50 – 75 – 100 – 125 – 150 – 200 μg/ml.

- Dung dịch thử: Các mẫu cao khô dược liệu sâm vũ diệp (được xử lý theo quy trình ở

mục 3.1.1) pha trong MeOH.

- Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH (không có chất chuẩn OA, cao sâm vũ diệp)

*Tính thích hợp hệ thống

Chuẩn bị một mẫu dung dịch OA chuẩn nồng độ 125 μg/ml. Tiêm sắc ký lặp lại

6 lần với điều kiện như ở mục trên.

Xác định các thông số sau mỗi lần tiêm: thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất

đối và số đĩa lý thuyết của OA trên sắc ký đồ. Kết quả được thực nghiệm được trình

bày ở bảng sau.

23

Bảng 3.1. Tính thích hợp hệ thống

Thí nghiệm Thời gian lưu

(phút)

Diện tích pic

(mAU.s)

Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết

1 10,589 736,04333 0,96 7216

2 10,722 740,36865 0,96 7105

3 10,736 737,54474 0,97 7128

4 10,749 734,65082 0,97 7174

5 10,746 738,55981 0,98 7176

6 10,753 733,58203 0,96 7160

TB 10,716 736,7916 0,967 7159

RSD (%) 0,538

0,3131 0,77 0,50

Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn

tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là

0,538% và 0,3131 % đều nhỏ hơn 2 %, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao

động từ 0,96 đến 0,98) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 7159 thể

hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng hệ thống HPLC mà

chúng tôi sử dụng là thích hợp để định tính, định lượng acid oleanolic.

* Độ đặc hiệu

Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích OA theo chương trình

khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic OA trong sắc

ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở

trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của OA (tR = 10,633 phút)

(hình 3.3). Vậy phương pháp phân tích acid oleanolic xây dựng được có độ đặc hiệu

cao.

24

Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu)

Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic (đánh giá độ đặc hiệu)

*Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 6,25 – 12,5 – 25 – 50 – 75 – 100 –

125 – 150 – 200 μg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3

lần), ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic tương ứng. Lập phương trình hồi quy

tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic

tương ứng trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu (bảng 3.2). Phương

trình hồi quy tuyến tính thu được thể hiện trong (hình 3.4).

25

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid oleanolic

Thí nghiệm Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s)

1 6,25 36,3144

2 12,5 75,7244

3 25 137,4189

4 50 314,7456

5 75 432,5359

6 100 534,8627

7 125 702,6413

8 150 850,8107

9 200 1078,3951

Phương trình hồi quy y = 5,4298x + 13,8966

Hệ số tương quan R2 = 0,9973

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic

Kết quả bảng 3.2 và đồ thị hình 3.4 cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát

6,25 –200 µg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ

OA với hệ số tương quan rất cao (R2 = 0,9973), độ tuyến tính chặt.

y = 5,4298x + 13,8966R² = 0,9973

0.0

200.0

400.0

600.0

800.0

1000.0

1200.0

0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ oleanolic acid

Biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của acid oleanolic

26

*Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích OA đến khi tín hiệu của

chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt

khoảng 2-3. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng

với từng chất.

Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác

định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.

Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện với OA là 1,5625

µg/ml, tương ứng có giới hạn định lượng là 5,1563 µg/ml.

*Độ chính xác

Độ lặp lại

Tiến hành định lượng 6 mẫu dung dịch chuẩn OA nồng độ 50 µg/ml và chạy sắc

ký với điều kiện như mục 3.2.1. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn

tương đối giữa giá trị của các lần định lượng. Kết quả xác định độ lặp lại được trình

bày trong bảng sau.

Bảng 3.3. Kết quả độ lặp lại của phương pháp

Thí

nghiệm

Nồng độ dung dịch

OA chuẩn (µg/ml)

Diện tích pic OA

(mAU.s)

Nồng độ tính toán

(µg/ml)

1 50 302,7134 53,191

2 50 290,8605 51,008

3 50 296,4321 52,034

4 50 297,1183 52,161

5 50 293,7704 51,544

6 50 302,1475 54,008

Trung bình 52,324

RSD (%) 1,92

Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại chấp nhận được, với giá trị RSD

(%) khi tiến hành phân tích 6 dung dịch chuẩn OA nhỏ hơn 2%.

27

Độ đúng:

Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn.

- Dung dịch thử

- Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu cao dược liệu 25 µg OA chuẩn.

Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký như quy trình đã được trình bày ở mục 3.2.1. Lặp

lại thực nghiệm 6 lần khác nhau. Dựa vào đường chuẩn xây dựng, tính được lượng OA

trong các mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả độ đúng của phương pháp

Thí

nghiệm

Mẫu đã có

(µg)

Mẫu thêm vào

(µg)

Tổng lượng tìm lại

(µg)

Tỷ lệ thu hồi

(%)

1 110,63 25 135,39 99,05

2 109,35 25 134,34 99,99

3 106,25 25 131,84 102,35

4 111,06 25 135,75 98,74

5 112,97 25 137,31 97,37

6 104,76 25 130,64 103,53

Trung bình 100,17

RSD (%) 2,13

Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tốt:

- Độ đúng trung bình cao: 100,17%

- Độ đúng của mỗi lần đều nằm trong khoảng từ 97,37% đến 103,53%

3.1.3. Định lượng acid oleanolic trong dược liệu và cao sâm vũ diệp

Chuẩn bị mẫu phân tích acid oleanolic: cân 6 mẫu cao sâm vũ diệp, hòa tan

bằng MeOH. Siêu âm, lọc qua màng lọc kích thước 0,2 micro trước khi tiêm vào hệ

thống HPLC

28

- Điều kiện sắc ký: như mục 3.2.1.

- Xác định thời gian lưu, diện tích pic tương ứng với thời gian lưu của OA trên sắc ký

đồ thu được.

- Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để phân

tích hàm lượng OA trong mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu đề tài cho kết quả ở

bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả định lượng acid oleanolic trong dược liệu và sâm vũ diệp

Thí

nghiệm

Khối lượng

cao (g)

Nồng độ

mẫu thử

(µg/ml)

Diện tích pic

OA (mAU.s)

Hàm lượng

OA trong cao

(%)

Hàm lượng OA

trong dược liệu

khô (%)

1 0,0921 100.000 195,0779 0,033 0,0064

2 0,0839 100.000 191,8679 0,033 0,0063

3 0,0955 100.000 207,1301 0,036 0,0068

4 0,1054 100.000 203,1252 0,035 0,0067

5 0,0896 100.000 197,9458 0,034 0,0065

6 0,0942 100.000 205,0432 0,035 0,0068

Trung bình 0,034 0,0066

RSD (%) 2,95

Kết quả trình bày ở bảng 3.5 cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm

vũ diệp là 0,034% và trong dược liệu sâm vũ diệp là 0,0066%.

3.1.4. Định lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp

Chuẩn bị mẫu phân tích OA: Cân cao sâm vũ diệp hòa tan trong MeOH. Lọc

qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC

Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng số: Cân khoảng 0,2 g cao dược liệu cho

vào bình cổ nhám. Thêm 50ml nước nóng, ủ tại 90ºC trong 10 phút. Thêm 7,5 ml HCl

đậm đặc và đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x 100 ml

29

dicloromethan. Pha dicloromethan cô quay tới gần cạn. Hòa tan phần cặn bằng 2ml

MeOH, lọc qua màng lọc 0,2 micro trước khi tiêm.

- Điều kiện sắc ký: như mục 3.1.2

- Tính kết quả:

+ Ghi lại diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử không thủy phân,

tính nồng độ OA có trong mẫu thử dựa trên đường tuyến tính đã lập. Từ đó tính hàm

lượng OA trong cao SVD.

+ Tương tự tính hàm lượng OA trong mẫu thử sau thủy phân.

+ Từ đó tính hàm lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp.

Msaponin tổng số = MOA STP – M OA KTP

Kết quả tính toán hàm lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp trong bảng sau:

Bảng 3.6. Kết quả hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu và cao sâm vũ diệp

STT Khối lượng

cao (g)

Khối lượng cắn

STP (g)

Nồng độ cao STP

(µg/ml)

MOA STP

trong cao SVD (%)

1 0,2171 0,036 18000 0,380

2 0,2223 0,038 19000 0,407

3 0,2055 0,035 17500 0,409

Trung bình 0,398

Msaponin tổng số trong cao SVD (%) 0,364

Msaponin tổng số dược liệu SVD (%) 0,0698

Kết quả trình bày ở bảng 3.6 cho thấy hàm lượng saponin tổng số dược liệu và

cao sâm vũ diệp lần lượt là 0,0698% và 0,364%.

30

3.2. THẢO LUẬN

3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích acid oleanolic bằng HPLC

Với điều kiện phòng thí nghiệm cũng như những trang thiết bị hiện có của Khoa

Y Dược, chúng tôi tham khảo các tài liệu đã được công bố và xây dựng phương pháp

phân tích acid oleanolic trong dược liệu sâm vũ diệp bằng phương pháp HPLC như

sau:

-Điều kiện sắc ký:

+ Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 mm x 100 mm; 3,5 μm)

+ Pha động: A (methanol): B (acid acetic 0,15%) với tỉ lệ A:B = 85:15

+ Detector DAD: bước sóng 203 nm

+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Thể tích tiêm mẫu: 20 μl

+ Nhiệt độ buồng cột: 25oC

+ Dung môi pha mẫu: methanol

- Đường chuẩn: y = 5,4298x+13,8966; R2 = 0,9973, khoảng nồng độ 6,25 – 200 µg/ml

- Độ lặp lại: RSD = 1,92%; n= 6

- Độ đúng: RSD =2,13%; n=6

- Giới hạn phát hiện: 1,5625 µg/ml

- Giới hạn định lượng: 5,1563 µg/ml

Kết quả cho thấy phân tích acid oleanolic bằng HPLC với điều kiện sắc như trên

cho độ tin cậy cao. Phương pháp này có thể được ứng dụng để phân tích acid oleanolic

trong sâm vũ diệp và các loài dược liệu khác.

3.2.2. Định lượng acid oleanolic và saponin trong dược liệu và cao sâm vũ diệp

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) là dược liệu quý, đang được nghiên

cứu và phát triển. Trong đó việc đánh giá chất lượng, phân tích thành phần hoạt chất

trong sâm vũ diệp là có ý nghĩa vô cùng quan trọng và cần thiết. Trên cơ sở các tài liệu

thu thập được cho thấy ở nước chưa có công bố nào phân tích cụ thể định lượng hàm

lượng acid oleanolic và saponin trong sâm vũ diệp.

31

Áp dụng phương pháp phân tích HPLC đã khảo sát ở trên, chúng tôi tiến hành

định lượng acid oleanolic và saponin trong sâm vũ diệp thu được kết quả như sau:

- Hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp và rễ sâm vũ diệp lần lượt là:

0,034% và 0,0066% tương đương với 340 và 66 μg/g (hay 0,34 mg/g và 0,066 mg/g).

Kết quả cho thấy rằng sâm vũ diệp chứa hàm lượng nhỏ acid oleanolic. Tham khảo tài

liệu số [7] hàm lượng acid oleanolic trong cao khô đinh lăng trung bình 0,23 mg/g và

rễ cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) thu hái ở Nam Định trung bình là

0,086 mg/g thì hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp cao hơn và trong dược

liệu sâm vũ diệp thấp hơn; tham khảo tài liệu [12] hàm lượng acid oleanolic trong rễ

cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) thu hái ở Phú Yên là 0,063%, hàm

lượng acid oleanolic trong rễ cây sâm vũ diệp thấp hơn. Sự khác nhau này có thể là

điều kiện sắc ký, độ tuổi, địa điểm trồng dược liệu. Đây là kết quả đầu tiên phát hiện và

định lượng thành phần acid oleanolic trong sâm vũ diệp. Chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành

nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong cao và rễ cây sâm vũ diệp được trồng ở

những nơi khác nhau.

- Thành phần chính trong rễ cây sâm vũ diệp là saponin khung oleanan. Trên cơ sở đó,

chúng tôi tiến hành phân tích định lượng saponin trong sâm vũ diệp dựa trên đương

lượng acid oleanolic trước và sau khi thủy phân [6]. Phân tích hàm lượng saponin trong

dược liệu sâm vũ diệp theo hàm lượng OA cho kết quả là 0,0698% hay 698 μg/g, cao

hơn so với hàm lượng saponin trong rễ tơ cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) nuôi cấy

là 396,2 μg/g [6].

Hàm lượng saponin có sự thay đổi theo độ tuổi cho nên khảo sát động thái tích

lũy cũng là một hướng nghiên cứu mà nhóm chúng tôi đang tiếp tục tiến hành.

32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Qua thời gian thực hiện đề tài chúng tôi đã thu được các kết quả theo các mục

tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau:

1. Xây dựng được phương pháp định lượng acid oleanolic và thẩm định được

phương pháp HPLC về các mặt: độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ chính xác, độ

đặc hiệu. Kết quả là phương pháp có độ chính xác và độ đặc hiệu cao. Trong

khoảng nồng độ khảo sát acid oleanolic có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ

giữa nồng độ và diện tích pic.

- Phương pháp có tính chọn lọc với acid oleanolic, pic của acid oleanolic tách

riêng ra khỏi các pic khác.

- Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng

độ acid oleanolic trong khoảng nồng độ khảo sát với R2 = 0,9973.

- Phương pháp có độ đúng tốt (nằm trong khoảng từ 97,37% đến 103,53%), độ

lặp lại đảm bảo (RSD = 1,92%).

2. Đã định lượng được thành phần acid oleanolic trong sâm vũ diệp bằng phương

pháp HPLC – DAD. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong

mẫu cao sâm vũ diệp và dược liệu sâm vũ diệp lần lượt là 0,034% và 0,0066%

tương đương với 340 µg/g và 66 µg/g.

3. Đã định lượng được thành phần saponin trong sâm vũ diệp bằng phương pháp

HPLC – DAD. Kết quả thu được hàm lượng saponin tổng trong dược liệu và cao

sâm vũ diệp lần lượt là 0,0698% và 0,364% tương đương 698 và 3640 µg/g.

KIẾN NGHỊ

Đây là những nghiên cứu bước đầu phân tích acid oleanolic và saponin trong

sâm vũ diệp. Chúng tôi tiếp tục phát triển kết quả và thực hiện những nghiên cứu tiếp

theo bao gồm:

1. Khảo sát thành phần saponin sâm vũ diệp được trồng ở những nơi khác nhau.

2. Đánh giá động thái tích lũy của saponin trong sâm vũ diệp theo các độ tuổi.

3. Áp dụng phương pháp này để định lượng oleanolic và saponin có trong một số

loài dược liệu khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

[1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong

cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà

xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 711 - 714.

[2] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng

thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107 – 113, tr. 216-250.

[3] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất

bản Y học, tr. 79-82, 84-110.

[4] Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 114, 204 –

214.

[5] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học

cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 8-99, 162-196, 234-242.

[6] Nguyễn Trung Hậu, Trần Văn Minh (2015), “Nuôi cấy mô lá đinh lăng

(Polyscias fruticosa L.Harms) tạo rễ tơ và nhận biết hoạt chất saponin tích

lũy”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học An Giang, 7(1), tr. 75-83.

[7] Chử Thị Thanh Huyền (2008), “Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong

đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Luận văn thạc sĩ Dược học.

[8] Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y

Học, Hà Nội, tr.808 – 809.

[9] Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ y tế.

[10] Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản khoa học

và kỹ thuật, tr. 199 – 222; 493 – 685.

[11] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên

cứu về phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”. Tạp

chí dược liệu, 11(5), tr. 177-180.

[12] Nguyễn Thị Phương Thảo, Võ Thị Bạch Tuyết, Nguyễn Minh Đức (2011),

“Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng lá xẻ

(Poluscias fruticosa (L.) Harms) bằng sắc ký lỏng hiệu năng”, Y học TP. Hồ

Chí Minh, 15(1), tr. 593 – 597.

[13] Ngô Văn Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y

dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 109 – 114

[14] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, Nhà xuất bản Y học –

Bộ Y tế, tr. 191 – 213

[15] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích II,

tr. 17, 99-146, 173-222.

TIẾNG ANH

[16] Wang DQ, Fan J, Feng BS, Li SR, Wang XB, Yang CR, Zhou J (1989).

“Studies on saponins from the leaves of Panax japonicas var. bipinnatifidus

(Seem.) Wu etFeng”, Yao XueXueBao, 24(8), 593-599.

[17] Joachim Ermer, JohnH. McB. Miller (2005), Method validation of

pharmaceutical analysis, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,

Weinheim Publication, pp. 195 – 212.

[18] Fernand Gbaguidi, Georges Accrombessi, Mansourou Moudachirou, Joëlle

Quetin-Leclercq (2005), “HPLC quantification of two isomeric triterpenic

acids isolated from Mitracarpus scaber and antimicrobial activity on

Dermatophilus congolensis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 39(5), pp. 990–995.

[19] Hikino H, Kiso Y, Amagaya S and Ogihara Y (1984), “Antihepatotoxic

actions of papyriogenins and papyriosides, triterpenoids of tetrapanax

papyrifr leaves”, Journal of Ethnopharmacology, 12 (2), pp. 231-235.

[20] Xiao – Hong Xu, Qing Su, Zhi – He Zang (2012), “Simultaneous determination

of acid oleanolic và ursolic acid by RP – HPLC in the leaves of Eriobotrya

japonica Lindl”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 2(3), pp. 238-240

[21] Maryadele J. O’Neil, Patricia E. Heckelman, Cherie B. Koch, Kristin J.

Roman, Catherine M. Kenny, Maryann R. D’Arecca (2006), The Merck

Index fourteenth edition, Merck & CO., Inc., USA.s, pp.1176.

[22] Takagi K, Park EH and Kato H (1980), “Antiinflammatory activities of

hederagenin and crude saponin isolated from Sapindus mukorossi

Gaertn”, Chemical and Pharmacological Bulletin, 28 (4), pp. 1183-1188.

[23] Guoliang Li, Xiaolong Zhang, Jinmao You, Cuihua Song, Zhiwei Sun, Lian

Xia, Yourui Suo (2011), “Highly sensitive and selective pre – colume

derivatization high–performance liquid chromatography approach for rapid

determination of triterpenes oleanolic and ursolic acids and application to

Swertia species: Optimization of triterpenic acids extraction and pre –

column derivatization using response surface methodology”, Analytica

Chimica Acta, 688(2), pp. 208 – 218.

[24] Zhitao Liang, Zhihong Jiang, David Wangfun Fong, Zhongzhen Zhao

(2009), “Determination of acid oleanolic and ursolic acid in Oldenlandia

diffusa and its substitute using high performance liquid chromatography”,

Journal of food and drug analysis, 17( 2), pp. 69-77.

[25] Somova LO, Nadar A, Rammanan P, Shode FO (2003), “Cardiovascular,

antihyperlipidemic and antioxidant effects of oleanolic and ursolic acids in

experimental hypertension”, Phytomedicine.

[26] Gupta MB, Bhalla TN, Gupta G, Mitra CR and Bhargav KP (1969),

“Antiinflammatory activity of natural products (I) Triterpenoids”,

European Journal of Pharmacology, 6 (1), pp. 67-70.

[27] Roshila Moodley, Hafizah Chenia Sreekanth B. Jonnalagadda and Neil

Koorbanally (2011), “Antibacterial and anti-adhesion activity of the

pentacyclic triterpenoids isolated from the leaves and edible fruits of Carissa

macrocarpa”, Journal of Medicinal Plants Research, 5(19), pp 4851 –

4858.

[28] Tung NH, Quang TH, Ngan NTT, Minh CV, Anh BK, Long PQ, Cuong NM,

Kim YH (2011), “Oleanolic triterpenesaponins from the roots of Panax

bipinnatifidus”, 59(11), pp. 1417-1420.

[29] Xiaoming Song, Songhua Hu (2009), “Adjuvant Activities of Saponins From

Traditional Chinese Medicinal Herbs”, 27 (36), pp. 4883-4890.

[30] Anna Szakiel, Dariusz Ruszkowski, Anna Grudniak, Anna Kurek, Krystyna I.

Wolska, Maria Doligalska, Wirginia Janiszowska (2008), “Antibacterial and

Antiparasitic Activity of Acid oleanolic and its Glycosides isolated from

Marigold (Calendula officinalis)”, 74(14), pp. 1709-1715.

[31] Raphael TJ, Kuttan G (2003), “Effect of naturally occurring triterpenoids

glycyrrhizic acid, ursolic acid, acid oleanolic and nomilin on the immune

system”, Phytomedicine, 10(6-7), pp.483-489.

[32] Huahong Wang, Zhezhi Wang, Wubao Guo (2008), “Comparative

determination of ursolic acid and acid oleanolic of Macrocarpium officinalis

(Sieb. et Zucc.) Nakai by RP – HPLC”, Industrial crops and products, 28(3),

pp. 328 – 332.

[33] Yu-Chiao Yang, a Ming-Chi Weib and Ting-Chia Huangc (2012),

“Optimisation of an Ultrasound-assisted Extraction Followed by RP-HPLC

Separation for the Simultaneous Determination of Acid oleanolic, Ursolic Acid

and Oridonin Content in Rabdosia rubescens”, Phytochemical Analysis, 23(6),

pp. 627-636.

[34] Naoki Yoshimi, Aijin Wang, Yukio Morishita, Takuji Tanaka, Shigeyuki

Sugie, Kiyoshi Kawai, Joji Yamahara and Hideki Mori (1992), “Modifying

effects of fungal and herb metabolites on azoxymethane - induced

intestinal carcinogenesis in rats”, Japanese Journal of Cancer Research,

83 (12), pp.1273-1278.

[35] Zhang Z, Jiang M, Xie X, Yang H, Wang X, Xiao L, Wang N (2017), “Acid

oleanolic ameliorates high glucose-induced endothelial dysfunction via PPARδ

activation”, Sci Rep, 7, pp.1-8

[36] Marina Zacchigna, Francesca Cateni, Mariangela Faudale, Silvio Sosa, Roberto

Della Loggia (2009). “Rapid HPLC analysis for quantitative determination of

the two isomeric triterpenic acids, acid oleanolic and ursolic acid in Plantago

majo”, Scientica Pharmaceutica, 77(1), pp. 79–86.

[37] Ahmed Zaki, Ahmed Ashour, Amira Mira, Asuka Kishikawa, Toshinori

Nakagawa, Qinchang Zhu1 and Kuniyoshi Shimizu (2016), “Biological

Activities of Acid oleanolic Derivatives from Calendula officinalis Seeds”,

Phytother Research, 30(5), pp. 835-841.

[38] Yong – Xing Zhao, Hai – Jing Hua, Lin – Liu (2009), “Development and

validation of an HPLC method for determination of acid oleanolic content and

partition of acid oleanolic in submicron emulsions”, Pharmazie, 64(8), pp. 491

– 494.

PHỤ LỤC

Phụ lục 01 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic – Kiểm tra tính thích hợp hệ

thống

Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic – Xây dựng đường hồi quy

tuyến tính

Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch trắng (MeOH)

Phụ lục 04 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp

Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp sau thủy phân

Phụ lục 01. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic - Kiểm tra tính thích hợp

hệ thống

Phụ lục 02: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic –

Xây dựng đường hồi quy tuyến tính

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 6,25 µg/ml

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 12,5 µg/ml

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 25 µg/ml

Hình 10. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 50µg/ml

Hình 11. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 75 µg/ml

Hình 12. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 100 µg/ml

Hình 13. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 125 µg/ml

Hình 14. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 150 µg/ml

Hình 15. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 200µg/ml

Phụ lục 03: Sắc ký đồ dung dịch trắng (MeOH)

Phụ lục 04. Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp

Phụ lục 05. Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp sau thủy phân