plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · 2016-01-29 · i pengaruh pemberian pakan...
TRANSCRIPT
PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI
MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI
TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN
METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA
LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Aditya Christian Firmanto
NIM : 118114161
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI
MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI
TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN
METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA
LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Aditya Christian Firmanto
NIM : 118114161
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI
MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI
TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN
METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA
LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)
Skripsi yang diajukan oleh:
Aditya Christian Firmanto
NIM : 118114161
telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
(Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.) Tanggal 3 Desember 2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI
MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI
TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN
METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA
LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)
Oleh :
Aditya Christian Firmanto
NIM : 118114161
Dipertahankan dihadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
(Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt.)
Panitia Penguji:
Tanda tangan
1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.
2. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.
3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
Halaman Persembahan
“Dunia tak akan selebar ini jika tidak ada ilmu yang
mendampingi. Dunia tak akan semegah ini bila tidak ada orang-
orang dengan usaha di dalamnya. Dunia tak akan seberlimpah
ini bila Tuhan tidak mengijinkan semua ini terjadi.”
Karya kecil ini, penulis persembahkan untuk pelebaran dunia dan
kemuliaan nama Tuhan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Aditya Christian F
Nomor Mahasiswa : 118114161
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air,
Kadar Protein Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan
Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju
Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan
data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya
maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya
sebagai penulis.
Dengan pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal, Januari 2016
Yang menyatakan
(Aditya Christian F)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis
dan susun ini tidak memuat karya atau bagian dari pekerjaan orang lain, kecuali
yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya
karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah
ini, maka saya bersedia menanggung segala resiko sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku
Yogyakarta, Desember 2015
Penulis,
Aditya Christian Firmanto
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas limpah karuniaNya
penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul “Pengaruh Pemberian
Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen Dan
Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis
Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar
(Cherax quadricarinatus)” dengan baik. Tugas akhir ini disusun untuk memenuhi
salah satu syarat mendapatkan gelar Sarjana Farmasi program studi Farmasi.
Selama penyusunan dan penyelesaian tugas akhir ini, penulis telah
mendapatkan banyak dukungan berupa doa, semangat, bantuan, kritik dan saran
dari berbagai pihak. Dalam kesempatan ini penulis hendak berterima kasih
kepada:
1. Bapak dan ibu serta adik atas doa, kasih saying, kesabaran, materi, motivasi,
nasehat dan pendapat yang diberikan pada penulis selama penyusunan tugas
akhir ini.
2. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
3. Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku dosen pembimbing yang telah
membimbing, memberikan diskusi, kritik dan saran kepada penulis mulai dari
penyusunan proposal, proses penelitian hingga penyusunan naskah tugas
akhir ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
4. Bapak dan Ibu Karjono selaku seperti pembimbing kedua dalam menyusun
skripsi, menimba ilmu tentang lobster dan belajar mengenai nilai-nilai
kehidupan.
5. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. sebagai dosen penguji dan atas
kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan,
kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini.
6. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. sebagai dosen penguji dan atas
kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan,
kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini.
7. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu, nasihat
dan bimbingan yang telah diberikan.
8. Ibu Agustina Setiawati M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium yang
bersedia direpotkan dengan banyak permintaan tanda tangan surat lembur.
9. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi: Mas Bimo, Pak Parlan,
Mas Kunto, Pak Wagiran, Mas Kayat dan Mas Agung atas bantuannya
selaman penelitian berlangsung.
10. Tante Yolanda Novia selaku partner skripsi yang mampu dan mau sabar
menjalani tiap proses sedih dan senang selama penyusunan skripsi.
11. Adik Vincentius Henzu selaku teman dan manager yang mau mengorbankan
banyak waktu, kesibukan, materi dan diri untuk mendukung bahkan
menghibur selama proses penyusunan skripsi ini walau tidak dibayar sepeser
pun.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
12. Mbak Gita Mentari selaku teman seperjuangan yang sudah bersedia
menyediakan tempat untuk menyusun naskah mentah selama 2 minggu.
13. Bibi Villianova dan Bibi Ratna sebagai teman yang setia mendukung dan
menunggu sidang pendadaran.
14. Adik Gaiety Suthami sebagai teman sekaligus tempat sampah selama proses
penyusunan skripsi.
15. Mas Wahyu Bramastyo sebagai mentor dan motivator dalam mengambil
setiap langkah selama proses penyusunan skripsi.
16. Teman-teman Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas
kerja sama dan kebersamaan selama proses perkuliahan.
17. Seluruh pihak yang telah membantu selama proses penelitian ini yang tidak
dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadariada banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini.
Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. Akhir
kata, penulis meminta maaf apabila ada kesalahan dalam penyusunan skripsi ini.
Semoga skripsi ini dapat berkontribusi baik untuk kemajuan ilmu pengetahuan
farmasi.
Yogyakarta, Desember 2015
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .................................................................................. i
PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .................. v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... vi
PRAKATA .................................................................................................. vii
DAFTAR ISI ............................................................................................... x
DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xv
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvii
INTISARI. ................................................................................................... xix
ABSTRACT .................................................................................................. xx
BAB I. PENDAHULUAN .......................................................................... 1
A. Latar Belakang ....................................................................................... 1
1. Rumusan masalah ............................................................................... 3
2. Keaslian penelitian ............................................................................. 3
3. Manfaat penelitian .............................................................................. 4
B. Tujuan Penelitian .................................................................................... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................... 5
A. Persiapan Habitat Lobster Air Tawar ..................................................... 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
1. Permodelan semi intensif ........................................................................ 5
2. Derajad keasaman (pH) dan kesadahan .................................................. 6
3. Dissolve of oxygen dan suhu ................................................................... 7
4. Sedimen ................................................................................................... 7
B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus) ......................... 8
C. Persiapan Pakan Lobster......................................................................... 9
1. Pakan lobster ........................................................................................... 9
2. Tetrasiklin HCl ........................................................................................ 10
D. Mikroorganisme ..................................................................................... 11
E. Protein ..................................................................................................... 12
F. Coomasie Brilliant Blue (CBB) .............................................................. 14
G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif.............................................. 15
H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ............................ 16
I. Validasi metode ....................................................................................... 17
1. Akurasi ............................................................................................... 18
2. Presisi ................................................................................................. 18
3. Linearitas ............................................................................................ 18
4. Selektivitas ......................................................................................... 19
5. Kriteria ................................................................................................ 19
J. Landasan Teori ........................................................................................ 19
K. Hipotesis ................................................................................................. 21
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................. 22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................. 22
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ........................................ 22
C. Bahan Penelitian ..................................................................................... 24
D. Alat Penelitian ........................................................................................ 24
E.Tata Cara Penelitian ................................................................................. 25
F. Analisis Hasil .......................................................................................... 41
G. Rancangan Penelitian ............................................................................. 45
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................... 46
A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar .......................................... 46
B. Tahap Persiapan Pakan Lobster ............................................................. 47
1. Validasi dan analisis kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam sediaan
kapsul ................................................................................................ 47
2. Optimasi dosis TCH ......................................................................... 48
3. Pembuatan dan pemberian perlakuan pakan antibiotik .................... 49
C. Tahap Ekstraksi Protein .......................................................................... 50
D. Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif .................. 51
E. Analisis Sampel ...................................................................................... 53
1. Analisis populasi mikroba dalam air habitat lobster .......................... 53
2. Analisis kadar protein dalam sedimen ................................................ 57
3. Pertumbuhan lobster air tawar terkait panjang dan berat lobster ....... 59
F. Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster ..................................... 60
1.Preparasi dan ekstraksi TC dalam daging lobster ............................... 61
2.Orientasi panjang gelombang TC ........................................................ 63
3. Penetapan puncak TC ......................................................................... 63
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
4.Optimasi fase gerak HPLC .................................................................. 65
G. Validasi Metode HPLC .......................................................................... 66
H. Penetapan Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster .................... 69
I. Keterbatasan Penelitian............................................................................ 70
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 71
A. Kesimpulan ............................................................................................ 71
B. Saran ....................................................................................................... 71
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 72
LAMPIRAN ................................................................................................ 76
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 104
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Taksonomi lobster air tawar .......................................................... 9
Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak .................................. 10
Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan................................................. 12
Tabel IV. Hasil validasi penetapan kadar TCH dalam kapsul .................... 48
Tabel V. Jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis TCH .................... 49
Tabel VI. %D kurva adisi protein ............................................................... 53
Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC ............... 66
Tabel VIII. %D kurva adisi TC ................................................................... 68
Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi TC .................................................... 68
Tabel X. Kadar tetrasiklin total dalam daging lobster ................................ 70
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl ........................................................... 11
Gambar 2. Struktur CBB R-250 ................................................................ 14
Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB ........................................... 15
Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi .......................... 51
Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein ....... 52
Gambar 6. Bakterosidal dan bakteriostatik antibiotik ............................... 54
Gambar 7. Log populasi mikroba kelompok kontrol dan antibiotik ......... 55
Gambar 8. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok
kontrol) .................................................................................... 55
Gambar 9. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok
perlakuan) ................................................................................ 56
Gambar 10. Kurva kadar protein dalam sedimen selama hari perlakuan ... 59
Gambar 11. Kurva perbandingan panjang lobster kontrol dan perlakuan .. 60
Gambar 12. Kurva perbandingan berat lobster kontrol dan perlakuan ....... 60
Gambar 13. Reaksi oksidasi trigliserida oleh asam .................................... 62
Gambar 14. Kromatogram standar TCH dalam pelarut fase gerak ............. 63
Gambar 15. Kromatogram blangko............................................................. 64
Gambar 16. Kromatogram standar TC basa ................................................ 64
Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak methanol:buffer
McIlvaine ................................................................................ 66
Gambar 18. Kromatogram TC dengan fase gerak asetonitril : buffer
McIlvaine ............................................................................... 66
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
Gambar 19. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC ............. 67
Gambar 20. Kompleks TC dengan ion logam ............................................. 69
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat permohonan working standar tetrasiklin HCl ...................... 77
Lampiran 2. COA working standar tetrasiklin HCl ......................................... 78
Lampiran 3. COA reagen coomasie R ............................................................ 79
Lampiran 4. COA albumin (BSA) ................................................................. 80
Lampiran 5. Hasil determinasi lobster air tawar .............................................. 81
Lampiran 6. Kurva baku penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ........... 84
Lampiran 7. Tabel hasil penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ............ 84
Lampiran 8. Hasil jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis tetrasiklin ..... 85
Lampiran 9. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 0 ................................ 86
Lampiran 10. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 3 .............................. 87
Lampiran 11. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 5 .............................. 89
Lampiran 12. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 7 .............................. 91
Lampiran 13. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 14 ............................ 93
Lampiran 14. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 28 ............................ 95
Lampiran 15. Tabel data jumlah populasi mikroba ......................................... 97
Lampiran 16. Tabel data tinggi derivat kurva baku solven protein ................... 97
Lampiran 17. Tabel data tinggi derivat kurva adisi protein .............................. 97
Lampiran 18. Contoh perhitungan %D .......................................................... 97
Lampiran 19. Contoh perhitungan %RSD ...................................................... 98
Lampiran 20. Contoh perhitungan LOQ ........................................................ 98
Lampiran 21. Contoh spektrum derivatif protein ............................................ 98
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
Lampiran 22. Data kadar protein dalam sedimen ............................................ 99
Lampiran 23. Tabel data panjang lobster air tawar.......................................... 99
Lampiran 24. Tabel data berat lobster air tawar .............................................. 99
Lampiran 25. Spektrum orientasi panjang gelombang tetrasiklin ..................... 99
Lampiran 26. Tabel data AUC kurva baku solven tetrasiklin ........................... 100
Lampiran 27. Tabel data AUC kurva adisi tetrasiklin ..................................... 100
Lampiran 28. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva baku solven ................... 100
Lampiran 29. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva adisi tetrasiklin .............. 100
Lampiran 30. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging
hari ke 14 .............................................................................. 101
Lampiran 31. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging
hari ke 28 .............................................................................. 101
Lampiran 32. Kandungan pakan dan merek dagang pakan ........................ 101
Lampiran 33. Proses perlakuan ................................................................... 101
Lampiran 34. Sedimen lobster air tawar ..................................................... 102
Lampiran 35. Perbandingan jumlah sedimen pada hari ke 28 .................... 102
Lampiran 36. Contoh perhitungan uji t tidak berpasangan (p<0,05) .......... 102
Lampiran 37. Tabel uji t tidak berpasangan terhadap panjang dan
berat ..................................................................................... 103
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xix
INTISARI
Budidaya lobster air tawar (Cherax quadricarinatus) merupakan
pemanfaatan sumber daya alam yang cukup diminati masyarakat karena mudah
dilakukan bahkan memiliki prospek yang baik di Indonesia dan manca negara.
Yang menjadi masalah adalah adanya akumulasi antibiotik dalam daging lobster
akibat penggunaan antibiotik untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster
dari penyakit. Tentunya penggunaan antibiotik dalam akuakultur akan
mempengaruhi kualitas air, maka perlu dilakukan analisis pengaruh pakan
berantibiotik pada populasi mikroba dalam air dan kadar protein sedimen sebagai
parameter kualitas air dan kadar akumulasi antibiotik dalam daging serta
pengaruhnya terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar.
Dalam penelitian ini dilakukan pemberian pakan berantibiotik
(Tetrasiklin HCl) dan pakan kontrol (tanpa antibiotik) sebagai pembanding, pada
lobster air tawar selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Populasi mikroba dalam air diuji
dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu), kadar protein sedimen
dianalisis dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif, dan
kadar akumulasi tetrasiklin daging menggunakan metode HPLC fase terbalik.
Analisis hasil dilakukan dengan membandingkan hasil populasi mikroba, kadar
protein dan laju pertumbuhan lobster kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
antibiotik.
Hasil penelitian menunjukkan fluktuatif populasi mikroba dalam air
tetapi menunjukkan tren polinomial log populasi mikroba yang tidak meningkat
maupun menurun. Kadar protein sedimen, panjang dan berat lobster meningkat
tetapi tidak berbeda antara kedua kelompok. Pada kelompok perlakuan antibiotik
terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster sebesar 53,0970 µg/g.
Kata kunci : Lobster air tawar, sedimen, tetrasiklin, spektrofotometri sinar
tampak, derivatif, HPLC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xx
xx
ABSTRACT
The freshwater lobster cultivation is one of the natural resources
utilization which has been interested by many people in community because it is
simple to do, even it has good prospect for future business in Indonesia and
foreign countries. The problem is that there is antibiotic accumulation in meat
because antibiotics usage in feeding lobster to maintain their health and
productivity of cultivated lobster. Surely, antibiotics usage in aquaculture will
influence the water quality, therefore the analysis of microbial population in water
and amount of protein in sediment as the parameter of the water quality,
antibiotics accumulation in meat and its effect to growth rate of freshwater lobster
are needed.
In this study, treatment had been given by feeding lobster using food
containing antibiotics (tetracycline HCl) and food without antibiotics as control
for a period of 3, 5, 7, 14 and 28 days. Microbial population in water was analysed
by using colony forming unit method, the amount of protein in sediment by using
CBB R method and spectrophotometry visible derivative, and antibiotics
accumulation in meat by using reverse-phase HPLC. The result was analysed by
comparing the amount of microbial population and protein, also length and weight
of freshwater lobter both control group and treatment group.
The result in this study showed fluctuation of microbial population in
water but there was no increasing or decreasing of log microbial population in
polynomial trend. The amount of protein in sediment, length and waeight of
freshwater lobster had been increasing but it showed no difference both control
group and treatment group. In treatment group, the accumulation of antibiotics in
meat was 53,0970 µg/g.
Keywords : Freshwater lobster, sediment, tetracycline, spectrophotometry visible,
derivative, HPLC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kebutuhan pangan yang meningkat menyebabkan masyarakat mencari
alternatif pemanfaatan sumber daya alam, mulai dari pertanian hingga perikanan.
Salah satu pemanfaatan sumber daya perikanan yang cukup diminati adalah
budidaya lobster air tawar, karena budidaya lobster air tawar relatif mudah dan
memiliki profit yang cukup tinggi. Kemudahan dalam pengembangbiakan lobster
air tawar ini membuat minat masyarakat semakin meningkat (Lim, 2006).
Masalah yang ada dalam budidaya perikanan saat ini adalah kondisi
cuaca ekstrim dan kelembaban udara yang tinggi. Kondisi ini menyebabkan laju
pertumbuhan mikroba semakin tinggi dan berakibat pada penurunan produktivitas
lobster air tawar karena penyakit oleh mikroba. Mikroba yang banyak dilaporkan
menyebabkan penyakit hingga kematian pada golongan Crustaceae adalah Vibrio
spp (Ansari dan Raissy, 2010). Hal ini membuat peternak menggunakan antibiotik
sebagai alternatif untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster air tawar
dengan menghambat atau membunuh mikroba merugikan yang ada di habitat
(Kurniawan, 2010).
Penggunaan antibiotik sebagai pencegah penyakit pada ternak memiliki
kerugian, yaitu terjadi akumulasi antibiotik dalam tubuh ternak. Hal ini dibuktikan
dengan adanya penolakan hasil budidaya perikanan maupun peternakan oleh
beberapa negara, disebabkan oleh adanya akumulasi senyawa antibotik
Chloramphenicol dalam daging ternak. Akumulasi senyawa antibiotik dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
daging ini dikhawatirkan memberikan pengaruh yang buruk jika dikonsumsi
manusia dalam jangka panjang, sehingga penggunaan antibiotik dalam beberapa
hal seperti tambahan dalam pakan ternak sudah dibatasi bahkan dilarang (Weifen,
Hong, Changhu, dan Jamil, 2004).
Air dan sedimen merupakan komponen habitat yang mendukung
pertumbuhan dan perkembangan lobster. Tentunya parameter air yang layak untuk
lobster hidup juga diperlukan, seperti ketersediaan oksigen dan komponen organik
dalam air. Sedimen merupakan sisa pakan dan hasil ekskresi dari lobster air tawar
yang sebagian besar adalah protein, mengendap di dasar habitat. Sedimen ini akan
berada dalam habitat lobster dan memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan
lobster. Dalam hal ini, peran mikroba terhadapsiklus kimia air sangat diperlukan
untuk menjaga kualitas air. Dalam penelitian digunakan tetrasiklin HCl sebagai
perlakuan antibiotik, karena tetrasiklin HCl memiliki spektrum yang lebar dalam
menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun gram negatif (Krasner dan
Shors, 2014). Keberadaan pakan yang mengandung tetrasiklin dalam habitat, akan
berdampak pada kualitas sedimen yang terbentuk di dalam air. Adanya masalah
pada kualitas sedimen maupun kondisi air akan berpengaruh pada tumbuh
kembang lobster, maka perlu dilakukan penelitian terkait pengaruh pakan
mengandung antibiotik terhadap habitat dan laju pertumbuhan lobster dalam
jangka waktu tertentu.
Pengamatan pengaruh pakan mengandung antibiotik terhadap habitat
dilakukan dengan melihat jumlah populasi mikroba pada air, dan kandungan
protein pada sedimen dengan metode coomassie brilliant blue R dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
spektrofotometri sinar tampak derivatif (400-800 nm). Pengamatan laju
petumbuhan lobster dilakukan dengan mengukur panjang dan berat lobster dan
pengamatan akumulasi antibiotik dengan metode High Performance Liquid
Chromatograhpy (HPLC) fase terbalik dengan pengembangan. Validasi yang
dilakukan dalam penelitian ini meliputi akurasi (%D), presisi (%RSD),
sensitivitas (LOQ), dan linearitas (r). Analisis hasil dilakukan dengan
membandingkan antara perlakuan dan kontrol dengan hari perlakuan pakan
mengandung antibiotik.
1. Rumusan masalah
a. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi
mikroba dalam habitat lobster air tawar?
b. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam
sedimen lobster air tawar?
c. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan
lobster air tawar?
d. Apakah terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster air tawar?
2. Keaslian penelitian
Penelitian yang dipublikasikan terkait sedimen adalah bioremediasi
sedimen tambak lobster (Kurniawan, 2010), Measurement of Protein in
Nearshore marine Sedimens (Mayer et al, 1986). Determination of Tetracycline
Antibiotic Residues in Edible Swine Tissues by Liquid Chromatography with
Spectrofluorometric Detection and Confirmation by Mass Spectrometry (Pena et
al, 2007). Method Development and Validation of Tetracycline Antibiotics and
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
their Epimers in Marine Products as per the EU Guidelines (Vora, 2013). Sejauh
peneliti mengamati penelitian sebelumnya, belum ada yang mengamati pengaruh
pakan antibiotik tetrasiklin HCl terhadap populasi mikroba dalam akuakultur,
kada protein dalam sedimen dan akumulasi pada lobster air tawar dengan
pengembangan metode analisis tetrasiklin sebagai indikator laju pertumbuhan
lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi dan pengetahuan terkait pengaruh pakan berantibiotik terhadap
budidaya lobster air tawar. Selain itu hasil penelitian juga dapat
sumbangsih untuk penelitian lain terkait penggunaan tetrasiklin dalam
akuakultur agar ilmu dapat berkembang lebih baik.
b. Manfaat praktis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan
kualitas lingkungan hidup lobster air tawar yang berdampak pada kualitas
lobster.
B. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi mikroba
dalam habitat lobster air tawar.
2. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam
sedimen lobster air tawar.
3. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan lobster
air tawar.
4. Mengetahui kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster air tawar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Persiapan Habitat Lobster Air Tawar
1. Permodelan semi intensif
Budidaya dengan sistem semi intensif ini merupakan budidaya dengan
padat penebaran cukup tinggi, menggunakan kincir dan pakan buatan atau pelet.
Dalam kondisi demikian, beban bahan organik tambak menjadi tinggi. Bahan
organik berasal dari ekskresi udang, sisa pakan dan bangkai organisme
mengendap di dasar tambak. Untuk menanggulangi hal tersebut, pada tambak
semi intensif dilakukan pengaerasian dan pergantian air yang cukup, baik
kuantitas maupun frekuensinya. Upaya tersebut dilakukan guna mempertahankan
kualitas air bagi kelangsungan hidup dan pertumbuhan optimum organisme
(Effendy, 1998).
Salah satu hal yang berperan penting pada tahap awal budidaya lobster
adalah kualitas air. Secara umum kualitas air berhubungan dengan kandungan
bahan terlarut di dalamnya. Tingkat kandungan dari bahan tersebut akan
menentukan kelayakannya. Beberapa sifat fisika dan kimia air yang dapat
mempengaruhi hidup lobster air tawar adalah suhu, oksigen terlarut, CO2 bebas,
derajat keasaman (pH), alkalinitas, amoniak, nitrat, dan nitrit (Lukito dan
Prayugo, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
2. Derajat keasaman (pH) dan kesadahan
Derajat keasaman (pH) air ini penting sebagai parameter kualitas air
karena dapat mengontrol tipe dan laju kecepatan reaksi zat di dalam air. Derajat
keasaman (pH) air yang baik untuk pertumbuhan lobster air tawar berkisar 6-9,5.
Jika angka pH kurang dari 5, akan berpengaruh buruk bagi pertumbuhan lobster
air tawar karena dapat menyebabkan kematian. Sementara pH>9 akan
menurunkan nafsu makan pada lobster air tawar sehingga pertumbuhannya
menjadi lambat (Lukito dan Prayugo, 2007).
pH air dan kehadiran karbon dioksida juga berkaitan erat dengan
alkalinitas. Pada pH kurang dari 5, alkalinitas dapat mencapai angka 0. Semakin
tinggi angka pH air, semakin tinggi pula nilai alkalinitas sedangkan kadar CO2
bebas semakin rendah. Nilai alkalinitas akan menurun jika terjadi pengendapan
padatan suspensi dari bahan organik sehingga mengakibatkan peningkatan
kandungan CO2 bebas (Lukito dan Prayugo, 2007).
Kesadahan merupakan salah satu parameter kualitas air yang diperlukan
bagi lobster air tawar. Kesadahan ini ditunjukkan dengan kandungan ion Ca2+
dan
Mg2+
serta ion logam polivalen lainnya. Kesadahan juga menggambarkan
kandungan garam-garam alkalinitas tanah. Perairan dengan nilai kesadahan
kurang dari 50 mg/l CaCO3 masuk dalam perairan tidak sadah (lunak). Air dengan
kesadahan tinggi (100-200 mg/l) lebih optimum untuk habitat lobster (Lukito dan
Prayugo, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
3. Dissolve of oxygen (DO) dan suhu
Keberadaan oksigen di dalam air sangat dibutuhkan oleh organisme air.
Ketersediaan oksigen di dalam air dipengaruhi oleh suhu, tekanan udara dan
adanya tumbuhan air. Semakin tinggi suhu air akan menyebabkan kandungan
oksigen yang terlarut menjadi semakin sedikit. Semakin rendah tekanan udara
suatu lingkungan, kandungan oksigen di dalam air pun semakin rendah. Lobster
air tawar dapat hidup pada selang parameter air yang lebar, diketahui bahwa
lobster toleran terhadap kandungan oksigen terlarut sangat rendah. Lobster air
tawar memerlukan kadar oksigen terlarut lebih dari 4 ppm untuk dapat bertumbuh
dan berkembang (Lukito dan Prayugo, 2007).
Lobster air tawar memiliki sifat toleran terhadap suhu dingin bahkan
mendekati beku hingga suhu di atas 35°C. Pada kisaran suhu 20-30
°C, lobster air
tawar mampu bertahan hidup tetapi laju pertumbuhannya lambat. Sementara pada
suhu 23-25°C, pertumbuhannya menjadi lambat. Meskipun demikian, lobster air
tawar yang hidup di daerah tropis hendaknya dipelihara pada selang suhu
24-30°C(Lukito dan Prayugo, 2007).
4. Sedimen
Pada dasarnya sedimen dibagi menjadi dua bagian yaitu dasar dan
pematang tambak serta akumulasi sedimen (sludge yang terkumpul selama
pemeliharaan). Sedimen terakumulasi merupakan sisa pakan, feses, plankton yang
mati, dan erosi. Komponen dari sedimen ini harus dapat dikelola dengan baik
sehingga tidak menimbulkan residu bahan organik berlebih yang dapat
menimbulkan kerusakan lingkungan budidaya. Keberadaan bahan organik yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
berlebih dapat memicu terjadinya kondisi lingkungan yang anaerob (oksigen
rendah) sehingga terjadi penurunan mutu lingkungan yang pada akhirnya
berdampak pada respon pertumbuhan ternak yang rendah. Faktor-faktor yang
mempengaruhi kondisi prima suatu lingkungan budidaya salah satunya adalah
keberadaan pakan buatan dan implikasinya bagi media budidaya selama
pemeliharaan. Pakan merupakan masukan terbesar yang dapat mempengaruhi
akumulasi bahan organik di sedimen dan kualitas air tambak. Akumulasi sisa
pakan yang merupakan bahan organik akan menurunkan kualitas lingkungan
hidup ternak dengan menyumbang kandungan nitrogen dan fosfor sebagai sumber
polutan bagi ternak (Nur, 2011).
B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus)
Lobster air tawar crayfish atau sering disebut capit merah merupakan
spesies endemik kelompok udang yang hidup di perairan tawar kawasan
Queensland, Australia. Ciri-ciri morfologi lobster air tawar capit merah ini tubuh
berwarna hijau kemerahan dengan warna dasar bagian atas capit berupa garis
merah tajam, terutama pada induk jantan yang telah berumur lebih dari 7 bulan.
Lobster air tawar capit merah dapat hidup dan tumbuh pada suhu 21-37°C. Suhu
air optimum untuk hidup dan tumbuh lobster ini adalah 23-31°C. Sementara itu,
toleransi terhadap kandungan oksigen di dalam air adalah 1 ppm, pH keasaman
(6-9,5), dan amonia 1 ppm (Sukmajaya dan Suharjo, 2003).
Sistem pencernaan lobster air tawar capit merah terdiri dari mulut,
kerongkongan, lambung, usus, dan anus. Pakan yang masuk lobster akan
dihancurkan secara mekanik oleh gigi halus yang terletak di permukaan mulut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Di dalam lambung, enzim pencernaan diekskresikan untuk memecah pakan
menjadi bentuk yang lebih sederhana. Sisa pencernaan akan diekskresikan melalui
anus (Lukito dan Prayugo, 2007).
Kebanyakan jenis lobster mengkonsumsi pakan dengan bantuan rangsang
kimia (kemoreseptor). Pada saat pakan diberikan, atraktan (asam amino) dari
pakan akan dilepas ke air dan dideteksi oleh kemoreseptor yang menyebar di
seluruh tubuh lobster sehingga lobster dapat mencapai pakan yang dituju (Nur,
2011).
Tabel I. Taksonomi lobster air tawar (Lukito dan Prayugo, 2007)
Kingdom Animalia
Filum Arthropoda
Kelas Malacostraca
Ordo Decapoda
Famili Parastacidae
Genus Cherax
Spesies Cherax quadricarinatus
C. Persiapan Pakan Lobster
1. Pakan lobster
Pakan merupakan salah satu faktor yang penting dalam masa pembesaran
karena pertumbuhan lobster sangat dipengaruhi oleh pakan, dengan pemberian
pakan yang benar diharapkan lobster dapat bertumbuh dan berkembang dengan
kualitas baik (Bachtiar, 2006).
Pakan merupakan nutrien esensial untuk proses pertumbuhan,
pemeliharaan dan penggantian jaringan yang telah rusak, pengaturan beberapa
fungsi tubuh, serta mempertahankan kondisi kesehatan. Salah satu prinsip
penerapan pakan dalam budidaya adalah program pemberian pakan secara efektif.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Hal ini memerlukan pengetahuan tentang kebutuhan nutrien dari ternak yang akan
dipelihara, kebiasaan dan tingkah laku makan, serta kemampuan kultivan dalam
mencerna dan menggunakan nutrien esensial. Pakan yang diberikan harus
mengandung nutrien yang dibutuhkan ternak seperti protein dan asam amino
esensial, lemak dan asam lemak, energi, vitamin, serta mineral (Nur, 2011).
Pengaturan jumlah pakan dilakukan sesuai dengan nafsu makan,
pertumbuhan, dan mortalitas ternak. Jika pakan diberikan terlalu sedikit dapat
mengakibatkan pertumbuhan menjadi lambat, bahkan memicu kanibalisme
terutama pada pemeliharaan ternak dengan kepadatan tinggi. Jika pemberian
pakan diberikan secara berlebih maka akan terjadi penumpukan sisa pakan yang
dapat menyebabkan penurunan mutu air. Seberapa besar jumlah pakan yang
dikonsumsi oleh ternak dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu : jenis pakan,
ukuran ternak, suhu air, cuaca, kualitas air, dan status kesehatan ternak itu sendiri.
Perhitungan jumlah pakan harian yang diberikan pada ternak adalah dengan
mengalikan total biomas ternak dengan prosentase pakan sesuai dengan berat
ternak seperti tercantum pada tabel II (Nur, 2011).
Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak (Nur, 2011)
Berat udang (g) Pakan tambahan Pakan lengkap
0-3 10%-4% 15%-8%
3-15 4%-2,5% 8%-4%
15-40 2,5%-2% 4%-2%
2. Tetrasiklin HCl
Tetrasiklin HCl (TCH) merupakan antibiotik yang dihasilkan oleh jamur
Streptomyces aureofasiens dan S. rimosus. Tetrasiklin HCl bersifat bakteriostatik
dengan daya jangkauan (spektrum) luas. Tetrasiklin HCl ini menghambat sintesis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
protein dengancara mengikat sub unit 30 S pada ribosom sel bakteri sehingga
bakteri tidak dapat membentuk protein untuk berkembangbiak menjadi banyak
(Subronto dan Tjahjati, 2001).
Tetrasiklin HCl memiliki rumus molekul C22H24N2O8.HCl dengan berat
molekul 480,6 g/mol. Rumus struktur kimianya sebagai berikut:
Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl (Anonim, 1995)
Organoleptis tetrasiklin HCl adalah serbuk hablur, kuning, tidak berbau,
agak higroskopis, stabil di udara tetapi pada pemaparan terhadap cahaya matahari
yang kuat dalam udara lembab menjadi berwarna gelap. Kelarutan tetrasiklin HCl
dalam air, alkali hidroksida dan dalam larutan karbonat sangat tinggi, sukar larut
dalam etanol, praktis tidak larut dalam kloroform dan eter. Tetrasiklin HCl
membentuk garam dengan ion Na+ dan Cl
- sehingga kelarutannya dalam air
meningkat (Anonim, 1995).
D. Mikroorganisme
Proses penanganan air limbah secara biologi terdiri dari campuran
mikroorganisme yang mampu memetabolisme limbah organik. Mikroorganisme
yang ditemukan dalam air dan air limbah digolongkan dalam 4 golongan yaitu,
virus, organisme prokarotik, organisme eukariotik, dan invertebrata sederhana
bersel jamak. Mikroorganisme golongan prokariotik ini menjadi perhatian khusus
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
dalam melihat kondisi air maupun penanganan air limbah. Bakteri merupakan
salah satu organisme prokariotik yang cukup penting dalam sistem penanganan air
limbah. Dua hal yang menjadi poin dalam air limbah yaitu bakteri patogen dan
bakteri yang dapat memetabolisme limbah. Pada umumnya bakteri menggunakan
bahan organik seperti protein sebagai sumber energi dan karbon dengan
merombak protein menjadi senyawa yang lebih sederhana. Beberapa spesies
bakteri mengoksidasi senyawa-senyawa anorganik seperti NH3 untuk energi dan
menggunakan CO2 sebagai sumber karbon (Jenie dan Rahayu, 1993).
Keragaman mikroba dalam lingkungan habitat air dan air limbah adalah
sebagai berikut :
Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan (Vaz-Moreira et al.,2014)
Lingkungan Genus
Habitat air dan
Air limbah
Acidovorax
Curvibacter
Sphingomonas
Aeromonas
Acinetobacter
Pseudomonas
Legionella
Rhodococcus
Cyanobacteria
Gordonia
Mycobacterium
Flavobacterium
Bacillus
Clostridium
Epsilonproteobacteria
Acidobacteria
Verrucomicrobia
Planctomycete
Chloroflexi
Gemmatimonadetes
Chlorobi
Nitrospirae
Spirochaetes
Chlamydiae
Aquificae
Thermotogae
Fusobacteria
Synergistetes
Tenericutes
Escherichia
Enterococcus
E. Protein
Protein merupakan makromolekul kompleks yang tersusun atas asam
amino berurutan, saling terikat secara kovalen melalui ikatan peptida. Sebanyak
20 asam amino yang menyusun bentuk protein memiliki sifat yang beragam
seperti hidrofobik, hidrofilik, asam, basa ataupun netral. Komposisi kimia asam
amino bertanggung jawab penting dalam menyumbang karakteristik dari protein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Seperti kereaktifan kimia, muatan ion dan hidrofobisitas. Pada pH rendah, protein
yang mengandung lisin maupun arginin akan bermuatan positif sedangkan pada
pH rendah kelompok protein yang mengandung aspartat, asam glutamat akan
bermuatan negatif. Berdasarkan polaritas dan muatannya, ada 8 asam amino
bersifat nonpolar dan hidrofobik, 5 diantaranya memiliki gugus hidrokarbon
alifatik (alanin, leusin, isoleusin, valin dan prolin), 2 asam amino memiliki cincin
aromatis (fenilalanin dan triptofan) dan 1 asam amino mengandung sulfur
(metionin). Asam amino non polar ini memiliki profil kelarutan dalam air yang
rendah, berbeda dengan asam amino bersifat polar seperti serin, treonin, tirosin,
asparagin dan glutamin, sistein serta glisin. Kelarutan asam amino polar di dalam
air sangat tinggi karena terjadinya interaksi asam amino dengan hidrogen dalam
air. Asam amino bermuatan negatif pada pH 6,0-7,0 mengandung kelompok
karboksil yang bersifat asam yaitu asam amino asam, asam aspartat dan asam
glutamat. Pada asam amino basa yang mengandung gugus bermuatan positif pada
pH 7,0 yaitu lisin, arginin, dan histidindengan tingkat kebasaan yang lemah. Pada
pH 6,0 lebih dari 50% histidin terprotonasi sedangkan pada pH 7,0 kurang dari
10% bermuatan positif (Rosenberg, 2005).
Protein memiliki sifat tergantung pada pH, maka untuk melakukan
analisis terhadap protein disarankan untuk memperhatikan pH larutan pada saat
proses analisis. Dalam melakukan kontrol pH, salah satunya dengan menggunakan
buffer atau larutan penyangga, yaitu suatu sistem larutan yang terbuat dari asam
maupun basa lemah dengan bentuk garamnya dalam medium air. Langkah isolasi
protein dapat dilakukan mulai dari pembuatan sifat protein yang larut dalam suatu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
pelarut sehingga dapat dilakukan homogenisasi dalam suatu buffer dan pada
akhirnya dipisahkan dengan sentrifugasi (Dennison, 2003).
F. Coomasie Brilliant Blue (CBB)
Gambar 2. Struktur CBB R-250 (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011)
Pengukuran protein total merupakan jenis pengukuran dalam supernatan
melalui ekstraksi dan klarifikasi dengan sentrifugasi. Kekurangan dari pengukuran
protein total ini adalah variasi protein yang beragam. Metode pengukuran paling
akurat yaitu analisis protein dengan hidrolisis, mengubah susunan protein menjadi
asam amino yang lebih kecil sehingga dapat dihitung total asam amino. Analisis
terhadap protein harus bersifat cepat dan sensitif dan tergantung pada interaksi
reagen dengan protein (Ahmed, 2004).
CBB merupakan suatu metode pewarnaan senyawa protein berdasarkan
interaksi struktur CBBterhadap protein sehingga protein dapat terwarnai CBB R
merupakan golongan coomassie brilliant dye yang memiliki dasar warna merah
kecoklatan-biru. Pada analisis protein dengan jumlah kecil dapat dilakukan
dengan menggunakan sistem koloidal pada CBB R-250 dengan sensitivitas yang
tinggi (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011).
CBB sebagai metode deteksi protein ditemukan oleh Bradford dan
menjadi metode analisis kuantitatif yang cepat, mudah dan sensitif daripada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
metode Lowry. Prinsip dari CBB ini mengadakan interaksi dengan struktur
protein. Bentuk muatan positif dari CBB ini akan terjadi lebih banyak dalam
kondisi asam dan dapat dideteksi pada panjang gelombang maksimal 470 nm.
Sebaliknya, dalam kondisi netral, CBB akan dominan dalam bentuk anion
(bermuatan negatif) dan akan mengadakan interaksi dengan struktur protein
sehingga dapat dideteksi (Kruger, 1994).
Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB (Georgiou et al., 2008)
CBB mengandung gugus sulfonat yang akan bereaksi dengan rantai
samping struktur protein yaitu arginine, lysine, dan histidine. Interaksi yang
terjadi mengakibatkan warna dari CBB tereduksi (memudar). Ikatan yang terjadi
antara protein dengan dye adalah ikatan ionik, elektrostatik, dan van der Waals.
Ikatan van der Waals merupakan ikatan yang paling dominan terjadi dalam
pewarnaan (Otlets, 2005).
G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif
Spektrofotometri sinar tampak merupakan metode pengukuran panjang
gelombang dan intensitas sinar tampak (visible) yang diabsorbsi oleh suatu zat.
Sinar tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada
kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi pada rentang panjang gelombang
400-800 nm dan dideteksi dalam bentuk absorbansi (Dachriyanus, 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Metode spektrofotometri derivatif atau metode kurva turunan adalah
salah satu metode yang dapat digunakan untuk analisis multikomponen secara
langsung tanpa harus melakukan pemisahan terlebih dahulu walaupun dengan
panjang gelombang yang berdekatan. Keuntungan dari metode spektrofotometri
derivatif adalah spektrum derivatif yang memungkinkan menganalisis
multikomponen dalam campuran yang spektranya saling tumpang tindih.
Spektrum derivatif memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum
serapan dan gambaran ini makin jelas dari spektra derivatif pertama ke derivatif
keempat sehingga dapat dilakukan analisis kuantitatif suatu komponen dalam
campuran dengan bahan yang panjang gelombangnya saling berdekatan
(Nurhidayati, 2007).
H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu
metode analisis kuantitatif dengan cara memisahkan dan menganalisis analit dari
komponen lain dalam matriks sampel dengan bantuan kolom sebagai fase diam
dan liquid sebagai fase gerak (Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010).
Sistem HPLC dimulai dari sampel dimasukan ke dalam tempat injeksi
yang menuju ke kolom kromatografi. Fase gerak menuju kolom dengan bantuan
pompa, zat-zat terlarut akan terpisah karena adanya interaksi yang bebeda antara
komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam di dalam kolom. Zat-
zat terlarut yang sudah terpisah akan meninggalkan kolom dan terdeteksi oleh
detektor. Hasil yang diperoleh dari proses tersebut adalah kromatogram yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
terdiri dari signal detektor dan waktu. Fase gerak biasanya terdiri dari beberapa
campuran pelarut sehingga memiliki daya elusi dan resolusi yang diinginkan.
Daya elusi dan resolusi tersebut ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,
polaritas fase diam dan sifat komponen-komponen sampel (Snyder et al., 2010).
Fase gerak yang digunakan pada HPLC fase terbalik (HPLC-RP) adalah
fase gerak yang bersifat polar, contohnya campuran larutan buffer dengan metanol
atau campuran air dengan asetonitril atau campuran metanol dengan asetonitril
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan fase gerak, yaitu
polaritas, kelarutan analit, stabilitas, pH dan kompatibilitas antar pelarut. Selain
itu, fase gerak dapat tercampur dengan baik dan tidak terdapat endapan apabila
terdiri dari campuran beberapa pelarut (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).
Kolom merupakan bagian yang sangat penting dalam pemisahan
komponen-komponen sampel yang terdapat di dalamnya. Oktadesilsilan (C18)
dan oktil silica (C8) merupakan fase diam yag paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran rendah, sedang maupun tinggi
(Gandjar dan Rohman, 2007).
I. Validasi Metode Analisis
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu
pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2006). Validasi
metode analisis merupakan prosedur yang digunakan untuk menunjukan bahwa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
metode analisis yang digunakan untuk kuantifikasi analit dalam matriks bersifat
reliable dan reprodusibel untuk mencapai tujuannya (Chan, Lam, Lee, dan Zhang,
2004).
1. Akurasi
Akurasi adalah suatu prosedur analisis untuk melihat kedekatan antara
nilai terukur atau nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran dengan nilai
sebenarnya (Ermer dan Miller, 2005). Akurasi dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali yang ditentukan dengan melakukan spiking ataupun dengan
cara metode penambahan baku (standard addition method) (Gandjar dan Rohman,
2007). Dalam bioanalisis, nilai akurasi dapat dinyatakan dalam % Difference
(%D) yaitu perbandingan antara selisih nilai konsentrasi awal dan terukur dengan
nilai konsentrasi awal. Kriteria terpenuhi jika %D dibawah 20% (Anonim, 2013).
2. Presisi
Presisi adalah prosedur analisis untuk melihat derajat kesesuaian hasil uji
individual dari beberapa penginjeksian suatu seri baku. Presisi diukur sebagai
persen Relative Standard Deviation (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007). Nilai
RSD yang diperbolehkan adalah kurang dari 20% (Anonim, 2013).
3. Linieritas
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-
hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang diberikan (Gandjar dan Rohman, 2007). Suatu metode dikatakan memiliki
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
linieritas yang baik jika nilai koefisien korelasri (r) > 0,99 atau r2
>0,997 (Chan et
al., 2004). Pada sumber lain mengatakan bahwa nilai koefisien korelasi (r2) yang
baik adalah lebih tinggi dari 0,995 (Anonim, 2013).
4. Selektivitas
Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur
dan membedakan dengan akurat respon analit dengan seluruh komponen sampel
yag mungkin ada dalam matriks sampel (Chan et a.l, 2004).
5. Kriteria validasi
Kriteria validasi untuk bioanalisis meliputi akurasi, presisi, LOQ, dan
linearitas serta pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi (Anonim, 2013).
J. Landasan Teori
Lobster air tawar merupakan golongan Crustaceae yang hidup di air
tawar dan kemampuannya untuk bertahan hidup lebih besar daripada udang air
payau maupun air laut. Ketersediaan protein dan kondisi habitat lobster sangat
mempengaruhi pertumbuhan lobster. Salah satu masalah dalam budidaya lobster
adalah penurunan produktivitas lobster karena penyakit oleh mikroba patogen
seperti Vibrio spp. Penggunaan antibiotik dalam pakan lobster dilakukan untuk
mencegah perkembangan mikroba patogen yang menyebabkan penyakit sehingga
kelangsungan hidup lobster lebih panjang tetapi terjadi kasus akumulasi antibiotik
dalam tubuh lobster seperti kloramfenikol.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Selain mikroba patogen, yang tumbuh dalam media air adalah mikroba
normal air. Keberadaan mikroba normal air berkontribusi baik dalam penanganan
limbah atau penumpukkan bahan organik dalam air sehingga kualitas air terjaga.
Tetrasiklin merupakan senyawa antimikroba dengan spektrum luas, yaitu dapat
menghambat pertumbuhan beragam jenis mikroba yang ada di alam, baik mikroba
patogen maupun mikroba normal air.Jumlah mikroba normal maupun patogen
ditentukan dengan melihat populasi mikroba dalam air.
Mikroba dapat merombak bahan organik seperti protein menjadi senyawa
lebih sederhana. Penambahan populasi mikroba akan menanggulangi bahan
organik yang ada di habitat lobster sehingga kualitas air terjaga. Analisis
kandungan protein dilakukan dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar
tampak derivatif. Metode CBB ini menggunakan reagen coomassie brilliant blue
dengan mekanisme pembentukkan warna terhadap protein primer. Protein akan
berinteraksi dengan reagen sehingga larutan protein menjadi berwarna, hal ini
menunjukkan banyaknya ikatan peptida yang terjadi. Metode spektrofotometri
sinar tampak ini digunakan untuk melihat absorbansi kompleks protein berwarna
dengan interval panjang gelombang cahaya visible (400-800 nm).
Adanya kandungan antibiotik seperti tetrasiklin dalam akuakultur dapat
menyebabkan akumulasi dalam tubuh lobster. Untuk melihat pengaruh tersebut
dilakukan analisis jumlah tetrasiklin dalam daging lobster dengan menggunakan
High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Validasi yang dilakukan
meliputi pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi, linearitas, akurasi dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
presisi serta sensitivitas. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik padajumlah
populasi mikroba air,kadar protein sedimen, laju pertumbuhan lobster, dan adanya
kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging dilakukan perbandingan antara
perlakuan dan kontrol yang diplotkan dalam grafik versus hari perlakuan.
K. Hipotesis
1. Pakan berantibiotik menyebabkan penurunan jumlah populasi mikroba dalam
habitat air lobster air tawar.
2. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan kadar protein dalam sedimen
lobster air tawar.
3. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan laju pertumbuhan lobster air
tawar.
4. Terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada
Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan
Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya
Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)”
merupakan penelitian eksperimental murni dengan membandingkan kurva
hubungan lama perlakuan dengan respon antara kelompok kontrol dan perlakuan
untuk melihat pengaruh yang disebabkan oleh tetrasiklin dalam pakan terhadap
kualitas habitat dan laju pertumbuhan lobster air tawar.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel Penelitian
a. Variabel utama
1) Variabel bebas : lama pemberian pakan berantibiotik
2) Variabel tergantung : jumlah populasi mikroba dalam air, jumlah
protein dalam sedimen, panjang lobster, berat lobster dan jumlah TCH
dalam daging lobster
b. Variabel pengacau
1) Variabel terkendali : volume air, cahaya matahari, kandungan klor,
kesadahan air, pH air dan oksigen terlarut dalam air.
2) Variabel tidak terkendali : lobster mati.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
2. Definisi Operasional
a. Pakan berantibiotik merupakan pakan lobster yang telah dimodifikasi
dengan menambahkan tetrasiklin HCl ke dalam sediaan pakan.
b. Lobster air tawarcrayfish (Cherax quadricarinatus) merupakan hewan
golongan Crustaceae yang hidup di perairan tawar dan dalam penelitian
digunakan sebagai hewan uji dengan kriteria yang ditentukan.
c. Rumah lobster merupakan pipa yang disusun dan diikat berjajar dan
digunakan sebagai tempat perlindungan untuk lobster, dibuat dari pipa
dengan panjang 6 cm dan diameter 2,5 cm sebanyak 8 pipa..
d. Aerasi merupakan sistem sirkulasi udara dari luar ke dalam air dengan
bantuan alat pompa elektrik dan selang.
e. Budidaya permodelan merupakan metode budidaya lobster dengan
merekayasa pembiakan yaitu memberikan sedimen dan rumah lobster serta
aerasi yang cukup sebagai tempat hidup lobster.
f. Sedimen merupakan suatu masa padat yang berasal dari sisa pakan
maupun hasil ekskresi dari lobster air tawar crayfish yang mengendap di
dasar akuarium.
g. Kelompok kontrol merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan
pakan tanpa antibiotik.
h. Kelompok perlakuan merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan
pakan berantibiotik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
i. Panjang dan berat lobster merupakan parameter yang diukur pertumbuhan
lobster, diukur dari kepala hingga ekor (panjang).
j. Populasi mikroba merupakan jumlah koloni mikroba yang ditentukan
dalam satuan cfu/cm2.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sedimen lobster air
tawar, pakan lobster merek Bintang®
, standar tetrasiklinHCl (kualitas p.a, China),
antibiotik tetrasiklin HCl merek Tetrasanbe®
, lobster air tawar jenis crayfish
(Cherax quadricarinatus), air sumur dengan kriteria (kesadahan 53 ppm, oksigen
terlarut 7-8 ppm, suhu 25,5°C, pH 6), reagen coomasie brilliant blue R-250
(kualitas p.a, Germany), phosphate buffer saline (PBS) pH 7 (NaCl, KCl,
Na2HPO4, dan K2HPO4), metanol (grade HPLC), etanol (kualitas p.a), akuabides,
NaOH (kualitas p.a), HCl (kualitas p.a), standar bouvine serum albumine (kualitas
p.a, Germany), daging lobster air tawar jenis crayfish, buffer McIlvainepH 4 (7,71
ml larutan Na2HPO4 0,2 N dalam 12,29 ml asam sitrat0,1 N), asetonitril (grade
HPLC).
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium (panjang 60
cm, lebar 30 cm dan tinggi 50 cm), kincir air atau aerator merek Amara®
, fan, DO
meter (pengukur dissolve oxygen), rumah lobster (pipa bertingkat), spuit, alat-alat
gelas (Pyrex, Germany), mistar merek Ziegel®
, timbangan analitik merek
OHAUS®
(e=1 mg), batang pengaduk, pipet tetes, pipet volume, micropipette,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
macropipette, flakon, pompa vacuum, corong Buchner, labu hisap, pH stick
universal, cawan porselen, stamper, mortir, kertas saring, oven, vortex, centrifuge,
milipore, degasser, spectrophotometer Visible SHIMADZU (UV-1800), rotary
evaporator, High Performance Liquid Chromatography merek SHIMADZU
(kolom C18).
E. Tata Cara Penelitian
1. Tahap preparasi lobster dan habitat
a. Persiapan alat dan bahan
Sebanyak 12 buah akuarium (60 x 30 x 50 cm) disiapkan dalam tempat
terhindar dari cahaya. Lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus
didapatkan dari peternak lobster Godean Yogyakarta dengan kriteria usia
3 bulan, panjang 5-5,5 cm dan berat 3-3,5 gram. Sedimen didapatkan dari
peternak lobster air tawar Godean Yogyakarta.
b. Determinasi lobster
Lobster air tawar yang digunakan sebagai hewan uji dideterminasi oleh
Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta dengan menggunakan sumber determinasi berjudul
Cherax quadricarinatus oleh Jones dan Wingfield, The Freshwater and
Land Crayfishes of Australia oleh Clark dan The Australian Freshwater
Crayfish (Crustaceae:Decapoda:Parasticidae) with Descriptions of New
Species oleh Riek.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
c. Preparasi habitat lobster
Sedimen yang terkumpul dihomogenkan dan ditimbang sebanyak 100
gram, lalu dimasukkan dalam akuarium dan diisi air sumur setinggi 10
cm dari dasar akuarium(setara 14 liter). Rumah lobster dan aerator
dimasukkan dalam akuarium (1 rumah dan aerator/akuarium). Lobster air
tawar dimasukkan dalam akuarium (15 ekor/akuarium). Media ini
selanjutnya digunakan untuk pemeliharaan lobster.
2. Tahap preparasi pakan lobster
a. Penetapan kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam kapsul Tetrasanbe®
1) Pembuatan stok standar TCH 1 mg/ml
Sebanyak 100 mg standar TCH ditimbang dan dimasukkan dalam
labu takar 100 ml ditambahkan akuabides hingga batas tanda.
2) Validasi metode
Pembuatan seri baku TCH 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; dan
0,5 mg/ml.. Larutan stok standar TCH 1 mg/ml dibuat seri, diambil
1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; dan 5,0 ml dimasukkan dalam labu
takar 10 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda. Lalu
dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400
nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel dan dibuat persamaan
regresi linear dan nilai r (linearitas). Selain itu dilakukan penetapan
akurasi dengan melihat %D, sensitivitas LOD dan LOQ, serta presisi
didapat dari sampel yang direplikasi 3 kali lalu dicari %RSD.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
3) Preparasi sampel kapsul
Sebanyak 10 kapsul TCH 500 mg dibuka dan dikeluarkan
serbuknya, ditimbang kemudian digerus dan dihomogenkan dalam
mortir. Sebanyak 25 mg sampel TCH ditimbang dan dimasukkan
dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas
tanda.
4) Penetapan kadar TCH dengan spektrofotometri uv
Blanko dibuat dari seluruh pelarut yang digunakan tanpa zat analit.
Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap
spektrofotometri uv. Sampel dideteksi absorbansi dengan
spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi
3 kali pada sampel.
b. Optimasi dosis TCH
Sebanyak 4 akuarium kosong (A, B, C, D) disiapkan. Sedimen sebagai
habitat awal lobster ditimbang masing-masing sebanyak 100 gram.
Sedimen dimasukkan dalam akuarium dan diberi air yang telah
disesuaikan dengan luas akuarium setinggi 10 cm dari dasar akuarium
(setara dengan 14 liter), kemudian diaduk hingga homogen. Kincir air
(aerator) dimasukkan ke dalam akuarium dan diaktifkan. TCH sebanyak
2,25 gram; 4,5 gram; dan 9 gram dimasukkan ke dalam akuarium B, C,
dan D secara berurutan, ditunggu selama 1 hari. Setelah 1 hari dilakukan
sampling pada pukul 06.00 WIB dan dilakukan pengecekan jumlah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
populasi mikroba oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan
Yogyakarta dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu).
c. Pembuatan dan pola pemberian pakan berantibiotik
1) Pembuatan pakan berantibiotik
Berdasarkan prosentase pakan lengkap dengan berat udang 3-15
gram maka diberikan adalah 8-4%. Sesuai dengan berat lobster,
digunakan prosentase sebesar 4% sehingga jumlah pakan lobster
diberikan sebanyak 1,8 gram/hari. Selanjutnya jumlah pakan ini
digunakan untuk membuat dosis pakan selama 5 hari. Sebanyak
0,2025 gram TCH ditimbang dan dilarutkan dalam akuabides
sebanyak 25 ml dalam labu takar. Sebanyak 45 gram pakan lobster
dilakukan penyemprotan dengan larutan TCH secara merata. Setelah
penyemprotan, pelet pakan lobster dikering udarakan hingga kering
(± 3jam) dengan menggunakan fan, dihindarkan dari cahaya.
2) Frekuensi pemberian pakan
Pakan mengandung tetrasiklin diberikan pada lobster 3 kali sehari
yaitu pada pagi hari 0,45 gram (25%), sore hari 0,45 gram (25%) dan
malam hari 0,9 gram (50%).
3. Tahap persiapankelompok kontrol dan kelompok perlakuan
a. Pembuatan kelompok kontrol
Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari)
dan 5 akuarium perlakuan pemberian pakan biasa (tanpa tetrasiklin)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari.
Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan
25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari.
b. Pembuatan kelompok perlakuan
Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari)
dan 5 perlakuan pemberian pakan berantibiotik dengan lama pemberian 3
hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan berantibiotik
dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan
sore serta 50% pada malam hari.
4. Tahap preparasi analit
a. Ekstraksi protein dalam sedimen
Proses ekstraksi pada penelitian ini mengacu pada penelitian oleh Mayer,
Schick, dan Setchell (1986). Sedimen kering ditimbang sebanyak 0,2
gram dan dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan NaOH 0,1 N
sebanyak 6 ml. Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu ditunggu
selama 2 jam (OT) pada suhu 60oC di dalam oven. Setelah OT, campuran
disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak
4 ml dan pH dinetralkan dengan HCl 2,5 N hingga pH 7-8, lalu
dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas.
Sampel ini selanjutnya dideteksi absorbansinya dengan menggunakan
metode CBB dan spektrofotometer sinar tampak derivatif.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
b. Ekstraksi tetrasiklin dalam daging lobster
1) Preparasi sampel ekstrak daging
Lobster pada perlakuan hari ke 14 (13,12 gram) dan 28 (9,02 gram)
diambil daging pada abdomen dan dibersihkan dari cangkang kulit
lobster. Daging dihaluskan menggunakan mortir dan ditimbang.
Daging halus dimasukkan dalam campuran HCl dan akuabides
dengan perbandingan 1 : 1 sebanyak 40 ml. Sampel ditutup dan
disimpan dalam suhu rendah dan terhindar dari cahaya matahari.
2) Ekstraksi tetrasiklin
Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge
3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml
dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan 3 ml asetonitril; 1,5 ml
buffer McIlvaine; 1 ml NaOH (pH 4) kemudian divortex dan
dievaporasi hingga asetonitril menguap seluruhnya (2 jam). Hasil
evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer
McIlvaine hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dipreparasi
untuk deteksi dengan metode HPLC.
5. Tahap persiapan metode penetapan kadar
a. Metode penetapan kadar protein dalam sedimen
Kadar protein dalam sedimen ditetapkan dengan menggunakan metode
CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang dikembangkan
oleh Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
b. Metode penetapan kadar tetrasiklin
1) Orientasi panjang gelombang tetrasiklin
Standar tetrasiklin HCl (TCH) ditimbang sebanyak 50 mg dan
dilarutkan dalam HCl : akuabides (1:1) ditambahkan hingga tanda
batas dalam labu takar 10 ml. Larutan TCH sebanyak 0,5 ml
diekstraksi. Kemudian hasil ekstraksi disaring dengan milipore dan
dilakukan degassing lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri
uv dengan interval panjang gelombang 200-400 nm.
2) Penentuan puncak tetrasiklin
a) Pembuatan larutan blangko
Larutan HCl : akuabides (1:1) disiapkan sebanyak 5 ml, diambil
0,5 ml lalu diberi perlakuan ekstraksi sama seperti perlakuan
sampel.
b) Pembuatan larutan standar TCH
Larutan TCH 0,2 ppm dalam asetonitril : buffer McIlvaine
disiapkan dan dideteksi dengan menggunakan HPLC.
c) Pembuatan larutan standarTC
Larutan standar TCH dalam HCl : akuabides disiapkan dan
diekstraksi hingga didapat konsentrasi 0,2 ppm dan dideteksi
dengan menggunakan HPLC.
3) Optimasi fase gerak HPLC
a) Kondisi HPLC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
(1) Fase diam : kolom C18 (oktadesil silika)
(2) Detektor : uv-sinar tampak
(3) Fase gerak :
(a) Asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4) 50:50%
(b) Metahol : buffer McIlvaine (pH 4; asam sitrat dan
natrium bifosfat) 50:50%
(4) Panjang gelombang : 270 nm (hasil orientasi)
(5) Flow rate : 0,5 ml/menit
b) Pembuatan fase gerak
(1) Pembuatan metanol : buffer McIlvaine (pH 4)
Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi
fase gerak yaitu campuran metanol dan buffer McIlvaine
dengan perbandingan 50:50% v/v. Metanol dan buffer
McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring
menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut
dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam
chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing
menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.
(2) Pembuatan asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4)
Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi
fase gerak yaitu campuran asetonitril dan buffer McIlvaine
dengan perbandingan 50:50% v/v. Asetonitril dan buffer
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring
menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut
dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam
chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing
menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.
c) Persiapan instrumen HPLC
Kolom HPLC dicuci dengan menggunakan metanol (HPLC
grade) selama 1 jam kemudian dilakukan conditioning dengan
fase gerak selama 1 jam dan dicek baseline hingga kolom siap
digunakan. Vial berisi standar TCH 20 ppm dimasukkan dalam
tray dan dicek AUC menggunakan HPLC detektor UV dengan
waktu elusi 13 menit.
6. Tahap validasi metode penetapan kadar
a. Validasi spektrofotometri sinar tampak derivatif
1) Linearitas
a) Pembuatan stok albumin (BSA) 40 mg/ml
Sebanyak 2 gram albumin (BSA) dimasukkan dalam labu takar
50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas.
b) Pembuatan seri baku albumin (BSA)
Sebanyak 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 µl
dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00;
2,40; 2,80; 3,40; 3,60; dan 4,00 mg/ml.
c) Analisis dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif
Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam
labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda
batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum
dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada 400-
800 nm.
d) Pembuatan kurva baku solven
Hasil spektrum yang keluar setiap seri baku dilakukan
derivatisasi kedua. Setiap konsentrasi pada hasil spektrum
derivatisasi diplotkan dan dicari nilai r dari persamaan regresi
liniernya.
2) Pembuatan kurva adisi
Sedimen ditimbang masing-masing 0,2 gram dimasukkan dalam
flakon (A, B, C, D, E, F) ditambahkan albumin 10, 30, 50, 70, dan
90 mg dalam flakon (B, C, D, E, F) secara berurutan. Kemudian
dilakukan preparasi dan ekstraksi sesuai dengan sampel sedimen lalu
dilakukan pengecekan tinggi derivat dengan menggunakan CBB dan
spektrofotometri sinar tampak derivatif.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
3) Akurasi
Akurasi dinyatakan dalam bentuk %D dari kurva adisi. Nilai %D
yang baik adalah kurang dari 20%
4) Presisi
Presisi didapatkan dari kurva adisi yang direplikasi sebanyak 3 kali
dan dihitung %RSD. Nilai %RSD yang baik adalah kurang dari 20%
5) Limit Of Quantification (LOQ)
LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus :
LOQ = 3,3 x SD/slope
b. Validasi metode HPLC
1) Linearitas
a) Pembuatan stok tetrasiklinHCl (TCH) 500 ppm
Sebanyak 5 mg TCH dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan
ditambahkan HCl : akuabides (1:1) hingga tanda batas.
b) Pembuatan seri TC
Seri konsentrasi TC dibuat 2, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, dan 120
ppm. Sebanyak 20, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 960 dan 1200
µl dari stok TCH (500 ppm) dimasukkan dalam labu takar 5 ml
ditambahkan HCl : akuabides hingga tanda batas. Tiap seri baku
diambil 0,5 ml dan diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan labu
takar 5 ml dan ditambahkan buffer hingga tanda batas.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
c) Analisis dengan HPLC
Setiap seri baku dimasukkan dalam vial HPLC. Sampel dicek
dengan menggunakan HPLCdengan kondisi optimasi.
d) Pembuatan kurva baku solven
Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri baku
diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya
y = bx+a.
2) Pembuatan kurva adisi
a) Pembuatan seri TC
Daging lobster bebas tetrasiklin dihaluskan dengan
menggunakan mortar dan stamper. Daging ditimbang masing-
masing 1 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E.
Sebanyak 20, 100, 300, 700, 1000 µl dari stok TCH 500 ppm
dimasukkan dalam flakon B, C, D , E. HCl : akuabides (1:1)
ditambahkan sebanyak 4980 (A), 4900 (B), 4700(C), 4300(D),
4000(E) µl dengan micropipette ke dalam flakon.
b) Analisis tetrasiklindengan HPLC
Masing-masing seri baku (A,B,C,D,E) dalam flakon divortex
selama 3 menit lalu ditambahkan NaCL 0,1 g dan dilakukan
sentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatant sampel
A,B,C,D,E diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon
lalu diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
5 ml ditambahkan buffer hingga batas tanda. Larutan disaring
dengan milipore dan dilakukan degassing untuk diinjeksikan ke
HPLC.
c) Pembuatan kurva adisi
Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri adisi
diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya
y = bx+a. Kurva adisi dibandingkan dengan kurva baku solven.
3) Akurasi
Akurasi didapatkan dari perhitungan %D kurva adisi.
4) Presisi
Presisi didapat dari perhitungan %RSD 3 replikasi kurva adisi.
5) Selektivitas
Selektivitas dilihat dari nilai resolusi pada pengecekan AUC kurva
adisi.
6) Limit Of Quantification (LOQ)
LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus :
LOQ = 3,3 x SD/slope
7. Analisis sampel
a. Analisis kuantitatif jumlah populasi mikroba pada sampel air
1) Preparasi sampel air kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
a) Sampling air dilakuakan pada pukul 06.00 WIB. Air dalam
akuarium diaduk hingga homogen dan ditunggu selama 5 menit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
hingga partikel sedimen mengendap kemudian dilakukan
pengambilan air, 2 cm diatas sedimen secara random dengan
spuit yang telah dimodifikasi (100 ml), dimasukkan dalam botol
steril yang disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai
Kesehatan Yogyakarta.
b) Penetapan jumlah populasi mikroba dilakukan oleh Bagian
Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan
menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan
colony counter.
b. Analisis kuantitatif protein pada sampel sedimen
1) Preparasi NaOH 0,1 N dan HCl 2,5 N
NaOH (kualitas p.a) ditimbang sebanyak 0,4 gram, ditambahkan
akuabides dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. HCl (kualitas
p.a) diambil 2,083 ml diencerkan dengan akuabides dalam labu takar
10 ml hingga batas tanda.
2) Preparasi phosphate buffer saline(PBS)
Sebanyak 4 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,72 gram Na2HPO4, dan
0,12 gram KH2PO4 ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar
500 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas.
3) Preparasi reagen coomasie brilliant blue
Sebanyak 10 mg CBB ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml PBS
dan 10 ml etanol, disebut campuran A. Sebanyak 3 ml campuran A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 8 ml PBS dan
3,75 ml etanol kemudian ditambahkan akuabides hingga tanda batas.
4) Preparasi protein dalam sedimen
Air akuarium didekantir dan sedimen diambil seluruhnya,
dimasukkan dalam botol sampel. Sedimen disaring menggunakan
corong Buchner dan pompa vacuum hingga kering. Sedimen kering
dimasukkan dalam mortir dan digerus dengan stamper hingga
homogen. Sedimen ditimbang sebanyak 0,2 gram dimasukkan dalam
flakon dan ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml dengan
menggunakan makropipet. Campuran diaduk dan divortex hingga
homogen lalu dimasukkan dalam oven dengan suhu 600C, ditunggu
selama 2 jam. Setelah 2 jam, dikeluarkan dari oven dan disentrifuge
dengan kecepatan putar 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan
diambil sebanyak 4 ml ditambahkan HCl 2,5 N hingga pH 7-8
kemudian dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan PBS
hingga tanda batas.
5) Analisis kuantitatif protein
Blanko dibuat dari seluruh pelarut dan reagen yang digunakan tanpa
ada sampel. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline
terhadap spektrofotometer sinar tampak. Sampel dalam labu takar
diambil sebanyak 1 ml dimasukkan dalam labu takar 5 ml. Reagen
CBB ditambahkan dalam labu takar hingga tanda batas dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
dilakukan operating time hingga 15 menit. Setelah 15 menit,
campuran dimasukkan dalam kuvet dan dicek absorbansi dengan
spektrofotometer sinar tampakpada spektrum 400-800 nm. Spektra
yang keluar diderivatisasi level kedua kemudian dilakukan
pengukuran tinggi puncak derivat.
c. Pengukuran panjang dan berat lobster
Lobster yang ada dalam akuarium dikeluarkan seluruhnya dan ditimbang
berat serta diukur panjangnya. Pengukuran berat dengan menggunakan
timbangan analitik dan pengukuran panjang dengan mengukur dari ujung
kepala sampai ekor. Kelompok kontrol dan perlakuan dibandingkan nilai
slope dari kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang dan
berat lobster hari ke 0.
d. Analisis kuantitatif tetrasiklin dalam daging lobster
Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge
3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil 0,5 ml dimasukkan
dalam flakon lalu ditambahkan asetonitril sebanyak 1,5 ml kemudian
ditambahkan 1,5 ml buffer McIlvaine (pH 4). pH campuran dinaikkan
dengan menggunakan NaOH 2,5 N sebanyak 1 ml lalu ditambahkan
asetonitril 1,5 ml. Campuran dievaporasi dengan rotary evaporator
dengan suhu 40oC selama 2 jam. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu
takar 5 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas, lalu disaring dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
milipore dan dilakukan degassing selama 5 menit lalu dimasukkan dalam
vial. Sampel dideteksi dengan HPLC.
F. Analisis Hasil
1. Validasi metode spektrofotometri uv
a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh
dari absorbansi tetrasiklin HCl dari data penentuan kurva baku dalam
regresi linear.
b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :
%D = (C terhitung – C diketahui) / C terhitung x 100%
c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :
%RSD = SD / rata-rata x 100%
d. Sensitivitas. Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung LOD
dicari dengan rumus 3,3 x SD/slope dan LOQ dengan 10 x SD/slope.
2. Validasi metodespektrofotometri sinar tampak derivatif
a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh
dari tinggi derivat spektrum protein (BSA) dari data penentuan kurva baku
dalam regresi linear.
b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :
% D = [C diketahui – C terhitung] / C diketahui x 100%
c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :
%RSD = SD / rata-rata x 100%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
d. Sensitivitas. Sensitivitas dapat dicari dengan menghitung LOQ
(konsentrasi terkecil kurva adisi yang masih bisa terkuantifikasi baik).
3. Validasi metode HPLC
a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang
diperoleh dari data AUC penentuan kurva baku ke dalam regresi linear.
b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :
%D = [C diketahui-C terhitung] / C diketahui x 100%.
c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :
%RSD = SD / rata-rata x 100%.
d. Sensitivitas. Sensitivitas dicari dengan menghitung LOQ (konsentrasi
terkecil pada kurva adisi yang masih dapat terkuantifikasi baik).
4. Analisis jumlah populasi mikroba air
a. Evaluasi hasil. Hasil uji jumlah populasi mikroba (cfu/cm2) dikelurkan
oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Evaluasi
hasil didapat dari perbandingan kurva hari perlakuan versus log jumlah
populasi mikroba kelompok kontrol dan log jumlah populasi mikroba
kelompok perlakuan. Kurva kelompok kontrol dan perlakuan
dibandingkan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
5. Analisis protein dengan metode CBB dan spektrofotometri sinar tampak
derivatif
a. Hitung kadar protein. Kadar protein dihitung dengan memasukkan respon
tinggi derivat dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan
faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi dalam gram sedimen.
b. Evaluasi hasil. Evaluasi hasil didapat dari perbandingan kurva hari
perlakuan versus selisih kadar protein kelompok (kontrol dan perlakuan)
dan kadar protein hari ke 0. Slope dari kurva kelompok kontrol dan
perlakuan dicari dan dibandingkan.
6. Penentuan panjang dan berat lobster (pertumbuhan lobster)
a. Panjang lobster. Data panjang lobster diolah dengan membandingkan
slope kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok
(kontrol dan perlakuan) dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan
perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari
dan dilakukan perbandingan.
No Hari
Jumlah populasi
mikroba Kontrol (K)
Jumlah populasi
mikroba Perlakuan (P)
cfu/cm2 cfu/cm
2
1 0
2 3
3 5
4 7
5 14
6 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
b. Berat lobster. Data berat lobster diolah dengan membandingkan slope
kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok
(kontrol dan perlakuan) dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan
perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari
dan dilakukan perbandingan.
7. Penetapan kadar tetrasiklin dalam daging
Kadar tetrasiklin dihitung dengan memasukkan respon AUC dalam
persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran
sehingga didapatkan konsentrasi awal dalam daging.
No Hari
Panjang Lobster
Kontrol (K)
Panjang Lobster
Perlakuan (P)
Selisih Dengan
Hari ke 0
Cm Cm K P
1 0
2 3
3 5
4 7
5 14
6 28
No Hari
Berat Lobster
Kontrol (K)
Berat Lobster
Perlakuan (P)
Selisih Dengan
Hari ke 0
Gram Gram K P
1 0
2 3
3 5
4 7
5 14
6 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
G. Rancangan Penelitian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh
tetrasiklin (antibiotik) dalam pakan terhadap perkembangan lobster air tawar
dalam habitat hidup lobster dibandingkan dengan kontrol dalam jangka waktu
tertentu. Ada empat parameter yang diteliti dalam penelitian ini, meliputi jumlah
populasi mikroba dalam air, kandungan protein dalam sedimen, panjang dan berat
lobster serta penetapan kadar tetrasiklin dalam daging lobster sebagai indikator
adanya akumulasi. Penelitian ini diawali dengan persiapan habitat dan pakan serta
pembagian kelompok lobster.
A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar
Dalam penelitian ini digunakanbudidaya permodelan yaitu dengan
melakukan modifikasi terhadap model pembiakan semi intensif, meliputi
pemberian sedimen dalam habitat, pemberian perlindungan (rumah lobster) dan
tidak ada penggantian air selama perlakuan. Alat dan bahan yang dibutuhkan
untuk persiapan habitat adalah sedimen, air, rumah lobster, dan aerator. Sedimen
berasal dari sisa pakan maupun hasil ekskresi lobster air tawar crayfish yang
mengendap sehingga habitat yang dibuat menyerupai habitat di alam. Dalam
pemeliharan lobster air tawar crayfish ini diperlukan media yang layak untuk
tumbuh kembangnya, seperti kesadahan, ketersediaan oksigen, derajat keasaman,
suhu dan kandungan kimia dalam air. Menurut Lukito dan Prayugo (2007), lobster
air tawar crayfish dapat hidup dalam air dengan kondisi kesadahan 50 mg/L
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
CaCO3, kadar oksigen terlarut air sumur >4 ppm, suhuberkisar antara 25-29
°C
dan derajat keasamaan berkisar antara 6-9,5. Air yang digunakan dalam budidaya
lobster air tawar crayfish ini merupakan air sumur yang sudah memenuhi kriteria
kualitas air sehingga selanjutnya digunakan sebagai media pemeliharan selama
perlakuan. Tindakan kontrol terhadap kondisi air tetap dilakukan seperti aerasi
dan pencegahan paparan sinar matahari dengan tujuan menjaga ketersediaan
oksigen dalam media pemeliharaan selama proses perlakuan dan mencegah
rusaknya struktur tetrasiklin akibat sinar matahari. Lobster yang digunakan
dideterminasi oleh Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas
Gadjah Mada dan dinyatakan sebagai lobster air tawar jenis crayfish (Cherax
quadricarinatus).
B. Tahap Persiapan Pakan Lobster
Pakan yang digunakan merupakan pakan jadi dengan penambahan
senyawa tetrasiklin HCl sebagai pencegah penyakit pada lobster. Tetrasiklin HCl
yang digunakan adalah tetrasiklin dengan kualitas teknis sehingga perlu dilakukan
penetapan kadar tetrasiklin HCl terlebih dahulu agar diketahui kadarnya. Selain
itu, untuk mendapatkan daya penghambatan pertumbuhan mikroba yang optimal,
maka dilakukan optimasi terhadap dosis tetrasiklin HCl yang digunakan.
1. Validasi dan analisis kadartetrasiklinHCl (TCH) dalam sediaan kapsul
Penetapan kadar TCH dalam kapsul dilakukandengan menggunakan
metode spektrofotometri uv. Sebelum dilakukan penetapan kadar TCH maka perlu
dilakukan validasi terhadap metode yang digunakan meliputi linearitas, akurasi,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
presisi, LOD dan LOQ. Berdasarkan ketentuan FDA (2013), metode penetapan
kadar senyawa tunggal yang baik memiliki kriteria linearitas (r2>0,995), akurasi
(%D <20%), dan presisi (%RSD <20%). Sesuai tabel hasil validasi metode
penetapan kadar senyawa tunggal TCH dalam sampel kapsul, metode ini
memenuhi kriteria.
Tabel IV. Hasil validasi penetapan kadar TCH dalam kapsul
Parameter Hasil
Linearitas 0,15-0,5 mg/ml, r
2 =0,9953,
y = 1,5176x + 0,0668
Akurasi (%D) 0,6326%
Presisi (%RSD) 6,2821%
LOD 0,0321 mg/ml
LOQ 0,0972 mg/ml
Analisis kadar TCH dalam kapsul dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometri uv pada panjang gelombang maksimum 276 nm. Kadar TCH
yang didapat adalah sebesar 94,1357% b/b. Farmakope Indonesia (1995)
menyatakan bahwa kadar TCH dalam kapsul yang dapat diterima adalah kadar
dalam interval 90-125%, maka kapsul TCH dapat digunakan untuk perlakuan
dalam penelitian ini.
2. Optimasi dosis TCH
Dosis TCH yang digunakan untuk perlakuan sebesar 4,5 g/kg pakan
kering (Johnson, 2010) dan dilakukan optimasi dosis TCH sebesar 2,25 g/kg; 4,5
g/kg; dan 9,0 g/kg pakan. Dosis yang paling efektif yaitu dosis yang memberikan
jumlah populasi mikroba paling kecil, ditetapkan dengan melihat jumlah koloni
mikroba yang tumbuh (cfu/cm2) dalam air habitat lobster yang diberi perlakuan
antibiotik. Antibiotik merupakan senyawa kimia yang memiliki aktivitas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
menghambat pertumbuhan mikroba sehingga dengan melihat jumlah populasi
mikroba dalam air, dapat ditentukan dosis antibiotik yang menghambat
pertumbuhan mikroba paling efektif.
Tabel V. Jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis TCH
Perlakuan Jumlah populasi mikroba (cfu/cm2)
Tanpa tetrasiklin 2,4 x 103
2,25 g/kg 4,8 x 105
4,5 g/kg 25
9,0 g/kg 2,3 x 103
Sesuai dengan hasil jumlah populasi mikroba pada sampel air, dipilih
dosis TCH paling efektif adalah 4,5 g/kg pakan dengan jumlah populasi mikroba
paling kecil yaitu 25 cfu/cm2.
3. Pembuatan dan pemberian perlakuan pakan antibiotik
Pembuatan pakan dan sistem pemberiannya ditentukan sesuai dengan
jumlah lobster dan cara lobster mencerna makanan yang diberikan. Lobster
crayfish ini merupakan hewan nocturnal yaitu bersifat aktif pada malam hari
sehingga pemilihan waktu pemberian porsi pakan lebih besar pada malam hari
(Lukito dan Prayugo, 2007). Pembuatan pakan berantibiotik ini dilakukan dalam
interval 5 hari sekali untuk 5 akuarium dengan tujuan menstabilkan efektivitas
antibiotik dalam pakan lobster, karena pembuatan pakan lebih dari 5 hari terjadi
pertumbuhan jamur pada pakan. Pemberian pakan berantibiotik pada lobster
dilakukan selama 1 bulan (28 hari) pada 6 akuarium yang berbeda yaitu 1
akuarium sebelum perlakuan (hari ke 0) dan 5 akuarium perlakuan selama 3, 5, 7,
14, dan 28 hari. Sebagai pembanding, 6 akuarium untuk kelompok kontrol (pakan
tanpa antibiotik) yaitu 1 akuarium (hari ke 0) dan 5 akuarium diberi pakan tanpa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
antibiotik selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Sampling dilakukan dengan mengambil
sampel air, sedimen dan lobster yaitu pada hari setelah jangka waktu perlakuan
pada pukul 06.00 WIB agar kondisi saat sampling sama.
C. Tahap Ekstraksi Protein
Kadar protein dalam sedimen ini ditetapkan dengan menggunakan
metode pewarnaan yaitu metode coomassie brilliant blue R (CBB R) dan
dideteksi dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak derivatif. Protein
dalam penelitian ini berada dalam matriks sedimen sehingga perlu dilakukan
preparasi sampel supaya protein dapat keluar dari matriks sedimen dan terbentuk
struktur protein yang lebih sederhana sehingga dapat dideteksi dengan
menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak deriatif.
Protein dalam sedimen ini diekstraksi dengan menggunakan basa yaitu
NaOH dengan cara merusak matriks sedimen dan melepas protein ke dalam air.
Selain itu, basa juga mengakibatkan denaturasi protein menjadi senyawa lebih
sederhana. Sebagian besar protein di alam memiliki struktur tersier bahkan
quarterner. Struktur tersier ini terbentuk akibat adanya interaksi antar asam amino
di rantai polipeptida. Adanya proses denaturasi (gambar 4) mengakibatkan
interaksi-interaksi gugus yang membentuk struktur tersier menjadi lemah
sehingga kemungkinan untuk terputus sangat besar dan pembentukan protein
struktur primer dapat terjadi (Campbell, Reece, Mitchell, 2002).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi (Campbellet al., 2002)
D. Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif
Menurut Harmita (2006), validasi merupakan suatu tindakan penilaian
terhadap parameter tertentu dalam prosedur penetapan, yang digunakan untuk
membuktikan bahwa parameter yang dipilih sudah memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya. Suatu validasi terhadap metode dapat dilakukan dengan melihat
aspek akurasi, presisi, linearitas dan sensitivitas yang menunjukkan suatu metode
menghasilkan parameter atau data yang valid dan dapat dipertanggung jawabkan.
Pada penetapan kadar protein dalam sedimen dengan menggunakan
metode CBB dan spektrofotometri sinar tampakini divalidasi terkait linearitas
yaitu dengan pembuatan kurva baku dan persamaan regresi linear. Linearitas
menunjukkan respon atau parameter yang didapat sudah sesuai jika nilai koefisien
korelasi (r) mendekati angka satu. Pada metode penetapan kadar protein ini
didapatkan persamaan regresi y = 0,0589x + 0,1018 dan R² = 0,9709.
Pada penelitian ini dilakukan juga pembuatan kurva adisi untuk melihat
pengaruh matriks dalam sedimen terhadap penetapan kadar protein dalam
sedimen. Kurva adisi yang dibuat terdiri dari 6 titik yaitu mulai dari adisi 0, 10,
30, 50, 70, dan 90 mg BSA. Kurva adisi yang didapat memiliki persamaan regresi
linear y = 0,5813x + 0,054 dan R² = 0,9907.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Ada tidaknya efek matriks dalam sedimen dapat diketahui dengan
membandingkan kurva baku solven dengan kurva adisi pada gambar 5. Kurva
adisi memberikan respon yang meningkat lebih tinggi daripada respon pada kurva
baku solven. Hal ini menunjukkan adanya intervensi dari matriks sedimen pada
penetapan kadar protein sehingga untuk menentukan kadar protein dalam sedimen
ini digunakan persamaan regresi linear kurva adisi supaya merepresentasikan
kondisi yang sebenarnya.
Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein
Akurasi penetapan kadar protein dinyatakan dalam %D yaitu persen
difference. %D pada penetapan kadar protein ini didapatkan dari perbandingan
selisih konsentrasi diketahui dan konsentasi terhitung, dengan konsentrasi
diketahui dari kurva adisi. Berdasarkan FDA (2013), kriteria %D adalah <20%.
Pada tabel VI, menunjukkan hasil %D kurang dari 20% mulai dari adisi 30 mg
sedangkan adisi 10 mg tidak memenuhi kriteria akurasi sehingga dieksklusi dan
persamaan regresi linear yang digunakan mulai dari titik adisi 30 mg dengan
konsentrasi 0,16 mg/ml hingga adisi 90 mg dengan konsentrasi 0,48 mg/ml.
y = 0.055x + 0.1122
R² = 0.9826
y = 0.5813x + 0.054
R² = 0.9907
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 1 2 3 4
Tin
gg
i d
eriv
at
(cm
)
Konsentrasi (mg/ml)
Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi
Kurva baku
solven
Kurva adisi
Linear (Kurva
baku solven)
Linear (Kurva
adisi)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
Tabel VI. %D kurva adisi protein
Adisi (mg) Konsentrasi (mg/ml) %D
10 0,05 67,9161
30 0,16 18,8720
50 0,27 13,5893
70 0,37 4,8465
90 0,48 2,5106
Presisi penetapan kadar protein ini dinyatakan dalam %RSD dari kurva
adisi. Berdasarkan FDA (2013), suatu metode dikatakan memiliki keterulangan
atau presisi yang baik jika nilai %RSD <20%. Pada penetapan kadar protein
dalam sedimen dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar
tampak derivatif ini menunjukkan %RSD sebesar 12,554% sehingga kriteria
terpenuhi. Sensitivitas metode merupakan tingkat kepekaan suatu metode dalam
mendeteksi senyawa tertentu pada konsentrasi terkecil. Sensitivitas dinyatakan
dengan nilai LOQ. LOQ persamaan kurva adisi ini sebesar 0,0922 mg/ml.
E. Analisis Sampel
1. Analisis populasi mikroba dalam air habitat lobster
Antibiotik merupakan senyawa alami maupun buatan yang dapat
mempengaruhi pertumbuhan mikroba (bakteri) di alam. Terdapat dua macam
mekanisme dalam mempengaruhi pertumbuhan mikroba yaitu bakteriosidal dan
bakteriostatik. Pada gambar 6, dinyatakan bahwa bakteriostatik tidak menurunkan
log jumlah bakteri yang hidup tetapi menekan pertumbuhan bakteri sehingga
grafik log jumlah bakteri hidup menjadi datar. Berbeda dengan grafik log jumlah
bakteri hidup pada penambahan senyawa bakteriosidal yang mengalami
penurunan akibat bakteri mati (Scholar dan Pratt, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Gambar 6. Bakterosidal dan bakteriostatik antibiotik (Scholar dan Pratt, 2000)
Menurut Krasner dan Shors (2014), antibiotik memiliki spektrum
aktivitas bakteriostatik atau bakteriosidal pada jenis bakteri tertentu. Beberapa
antibiotik efektif menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan yang lain
efektif menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif. Tetrasiklin merupakan
senyawa antibiotik dengan mekanisme bakteriostatik dan memiliki spektrum yang
luas dalam mempengaruhi pertumbuhan mikroba (gram positif dan gram negatif).
Penetapan jumlah populasi mikroba dalam air habitat lobster air tawar
dilakukan dengan menghitung jumlah koloni mikroba yang tumbuh dan dilakukan
oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan
menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan colony counter.
Perhitungan jumlah koloni mikroba ini tidak spesifik terhadap mikroba tertentu
melainkan menghitung semua mikroba yang hidup yang dapat bertumbuh
membentuk koloni.
Pada tabel III, menunjukkan ada beragam jenis bakteri yang dapat hidup
di lingkungan air limbah bahkan dalam air bersih sekalipun dan meliputi mikroba
normal alam dan mikroba yang bersifat patogen.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
Gambar 7. Log jumlah populasi mikroba kelompok kontrol dan antibiotik
Gambar 7, menyatakan log jumlah populasi mikroba. Pada hari ke 0
hingga hari ke 7, kelompok kontrol maupun kelompok antibiotik memiliki nilai
log jumlah populasi mikroba tidak jauh berbeda. Pada hari ke 14 hingga 28 terjadi
perbedaan log jumlah populasi mikroba antara kontrol dan perlakuan yaitu log
jumlah populasi mikroba pada kelompok antibiotik lebih tinggi dibandingkan
dengan kelompok kontrol. Hasil ini menunjukkan ketidaksesuaian efek tetrasiklin
sebagai antimikroba. Pada kasus ini, peneliti belum bisa mengambil kesimpulan
terhadap terjadinya peningkatan log jumlah populasi mikroba pada kelompok
antibiotik.
Gambar 8. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok kontrol)
0.0000
2.0000
4.0000
6.0000
8.0000
0 3 5 7 14 28
Kontrol Antibiotik
0.0000
1.0000
2.0000
3.0000
4.0000
5.0000
6.0000
7.0000
0 20 40
Lo
g j
um
lah
po
pu
lasi
mik
ro
ba
Hari
Kontrol
Poly.
(Kontrol)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Gambar 9. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok antibiotik)
Pada gambar 8, tren polinimial yang terjadi adalah penurunan log jumlah
populasi mikroba selama perlakuan hingga 28 hari. Jika dibandingkan dengan
gambar 9, tren polinomial yang terjadi dikatakan tidak mengalami penurunan
maupun peningkatan yang nyata. Mengacu pada penelitian terdahulu oleh
Hossain, Sharker, Haque, Reza, dan Mondal (2014), jumlah populasi bakteri
mengalami peningkatan pada ikan yang diberi antibiotik selama penyimpanan di
ruang pendingin. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi penurunan efek antibiotik
terhadap populasi bakteri.
Jika gambar 8 dan gambar 9 dibandingkan maka dapat dikatakan terjadi
perbedaan tren polynomial terhadap log jumlah populasi mikroba selama hari
perlakuan. Menurut Scholar dan Pratt (2000), pada gambar 6, tren log jumlah
koloni bakteri terhadap waktu pada perlakuan bakteriostatik tidak menunjukkan
peningkatan maupun penurunan. Pada gambar 9 menunjukkan tren yang mirip
yaitu tidak terjadi peningkatan maupun penurunan. Hasil ini dapat menyatakan
adanya kemungkinan efek tetrasiklin terjadi tetapi perlu penelitian lebih lanjut
terhadap bakteri secara spesifik yang ada dalam air habitat lobster. Keberadaan
mikroba di lingkungan sangat bervariasi. Tetrasiklin merupakan antibiotik dengan
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
0 20 40 Lo
g j
um
lah
po
pu
lasi
mik
ro
ba
Hari
Antibiotik
Poly.
(Antibiotik)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
spektrum luas menghambat pertumbuhan mikroba tertentu tetapi tidak pasti dapat
menghambat pertumbuhan semua jenis mikroba.
2. Analisis kadar protein dalam sedimen
Penetapan kadar protein dalam sedimen dilakukan dengan tujuan
mengamati kadar protein yang masih ada di dalam sedimen yang belum dirombak
oleh mikroba maupun pakan lobster air tawar yang belum dimakan. Penetapan
kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode CBB R dan dideteksi
dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang telah dikembangkan oleh
Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini. Sebelum dilakukan
penetapan kadar, validasi dilakukan pada metode CBB R dan spektrofotometri
sinar tampak derivatif. Validasi yang dilakukan meliputi akurasi, presisi, dan
sensitivitas.
Kadar protein dalam sedimen akan menunjukkan eksistensi pengaruh
pakan berantibiotik terhadap kualitas habitat lobster air tawar. Adanya kuman atau
mikroba dalam suatu habitat akan mempengaruhi ketersediaan nutrisi yaitu
protein dalam air yang berguna untuk pertumbuhan lobster. Mikroba normal alam
akan membantu penguraian protein dan bahan organik lain menjadi komponen
yang lebih sederhana sehingga siklus kimia normal (kandungan bahan organik)
dalam air dapat terdaur ulang. Kehadiran antibiotik dalam habitat akan
mempengaruhi perkembangan mikroba khususnya bakteri. Berkurangnya jumlah
populasi mikrobanormal dalam air akan mempengaruhi kualitas hidup lobster.
Kadar protein dalam sedimen ini ditetapkan dengan menggunakan
metode pewarnaan yaitu metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
derivatif. Pewarnaan CBB ini bertujuan untuk memberikan profil warna terhadap
protein sehingga protein dapat dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang sinar tampak.
Pada gambar 3, reaksi yang terjadi antara protein dan reagen CBB ini
adalah ikatan ionik, elektrostatik dan van der Waals antara asam sulfonat dan
rantai samping protein (arginin, lisin, dan histidin) yang akan menyebabkan
reduksi warna menjadi biru (Otlets, 2005). Selain ketiga mekanisme reaksi itu,
CBB juga berinteraksi dengan bagian hidrofobik protein seperti pada gambar 3.
Protein yang berinteraksi secara bebas dengan struktur CBB adalah struktur
protein primer seperti pada gambar 4. Pada penelitian ini perubahan warna yang
terjadi adalah warna ungu menjadi biru. Semakin tinggi jumlah protein yang
berinteraksi dengan CBB semakin memudar warna ungu dari CBB.
Pada penetapan kadar protein dalam sampel sedimen didapatkan hasil
berupa kadar protein (mg) dalam tiap gram sedimen. Kadar protein yang
didapatkan dievaluasi dengan menyelisihkan kadar protein pada kontrol dan
perlakuan dengan hari ke 0 lalu diplotkan dalam kurva dan dibandingkan. Jika
dilihat pada gambar 10, tren menunjukkan peningkatan kadar protein dalam
sedimen pada kedua kelompok. Tren kedua kelompok perlu diuji t supaya dapat
menyatakan ada perbedaan atau tidak. Setelah diuji t tidak berpasangan dengan
taraf kepercayaan 95% didapatkan hasil bahwa kadar protein kelompok kontrol
tidak berbeda nyata dengan kadar protein kelompok antibiotik, tertera pada
lampiran 36.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Gambar 10. Kurva kadar protein dalam sedimen selama hari perlakuan
3. Pertumbuhan lobster air tawar terkait panjang dan berat lobster
Menurut Lukito dan Prayugo (2007), lobster dengan umur 2-3 bulan
(juvenile) merupakan fase pertumbuhan optimum sehingga membutuhkan banyak
nutrisi dengan kata lain lobster mengkonsumsi pakan dalam jumlah besar. Pada
aspek pertumbuhan lobster dilakukan pengukuran pada panjang dan berat lobster.
Lobster air tawar mengkonsumsi pakan untuk memenuhi kebutuhan nutrisi untuk
bertumbuh menjadi lebih besar. Pengukuran panjang dan berat lobster ini
dilakukan untuk melihat pengaruh tetrasiklin dalam pakan terhadap laju
pertumbuhan lobster air tawar. Evaluasi data dilakukan dengan membandingkan
panjang dan berat antara kelompok kontrol dan perlakuan (telah diselisihkan
dengan hari 0) dalam kurva. Pengukuran panjang dan berat dilakukan pada lobster
air tawar padahari ke 0 sampai 14. Data panjang dan berat lobster pada hari ke 28
dieksklusi karena terjadi kematian masal lobster pada kelompok perlakuan
antibiotik. Pada gambar 11, menunjukkan laju pertambahan panjang lobster air
tawar kelompok antibiotik meningkat sama dengan kelompok kontrol. Pada
gambar 12, menunjukkan laju pertumbuhan berat lobster air tawar kedua
y = 5.7389x - 38.564
y = 5.2599x - 23.353
-40.0000
-20.0000
0.0000
20.0000
40.0000
60.0000
80.0000
100.0000
120.0000
140.0000
0 10 20 30
seli
sih
kad
ar
pro
tein
den
gan
H
-0
Hari
Kelompok kontrol
kelompok antibiotik
Linear (Kelompok
kontrol)
Linear (kelompok
antibiotik)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
kelompok meningkat pula. Setelah dilakukan uji t tidak berpasangan dengan taraf
kepercayaan 95% terhadap kedua kelompok didapatkan hasil bahwa laju
pertumbuhan lobster kelompok kontrol tidak berbeda nyata dengan lobster
kelompok antibiotik. Hal ini menunjukkan bahawa lobster air tawar pada kedua
kelompok memiliki aktivitas makan yang sama.
Gambar 11. Kurva perbandingan panjang lobster kelompok kontrol dan antibiotik
Gambar 12. Kurva perbandingan berat lobster kelompok kontrol dan antibiotik
F. Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster
Tujuan penetapan kadar TC dalam daging lobster ini adalah untuk
melihat adanya TC yang terakumulasi dalam daging lobster setelah diberi
y = 0.039x - 0.1682
y = 0.0488x - 0.1455
-0.2000
-0.1000
0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
0.7000
0 5 10 15
Pa
nja
ng
(cm
)
Hari
Kontrol
Antibiotik
Linear (Kontrol)
Linear
(Antibiotik)
y = 0.0083x + 0.2441
y = 0.0145x + 0.3645
0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
0.7000
0 5 10 15
Ber
at
(gra
m)
Hari
Kontrol
Antibiotik
Linear (Kontrol)
Linear
(Antibiotik)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
perlakuan selama 28 hari. Penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan dengan
menggunakan metode HPLC yaitu penetapan kadar suatu senyawa dengan cara
memisahkan dan menganalisis analit dari komponen lain dalam matriks sampel
dengan bantuan kolom sebagai fase diam dan liquid sebagai fase gerak (Snyder,
Kirkland, dan Dolan, 2010). Pada penelitian ini, peneliti ingin menghitung kadar
TC dalam bentuk TC basa sehingga perlu dilakukan preparasi sampel sebelum
proses ekstraksi sehingga analit dapat terambil dalam bentuk TC basa. Sebelum
dilakukan penetapan kadar TC dengan metode HPLC ini perlu dilakukan orientasi
dan optimasi agar hasil yang digunakan merupakan hasil yang paling optimum
maka dilakukan orientasi penentuan puncak TC, panjang gelombang TC dan
optimasi fase gerak.
1. Preparasi dan ekstraksi TC dalam daging lobster
Ekstraksi TC dalam sampel daging yang sudah digerus dilakukan dengan
menggunakan HCl : akuabides (1:1). HCl merupakan asam kuat dengan nilai
derajat keasaman 1. Sifat eksotermis dari HCl mengakibatkan energi panas dapat
terjadi dalam suatu sistem larutan (Frankel, 2012). Penggunaan HCl : akuabides
ini ditujukan untuk mengambil TC dalam bentuk garam tetrasiklin HCl (TCH)
dari matriks daging dengan mekanisme pemecahan struktur lemak daging lobster
dan denaturasi protein sehingga TC dapat terlarut dalam HCl : akuabides. Reaksi
denaturasi protein dapat dilihat pada gambar 4. Reaksi oksidasi lemak yaitu pada
trigliserida oleh asam dapat dilihat pada gambar 13.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Gambar 13. Reaksi oksidasi trigliserida oleh asam (Frankel, 2012)
Analit yang dituju dalam sampel daging adalah tetrasiklin basa (TC)
karena digunakan HPLC fase terbalik yang mana analit harus bersifat non polar
dibandingkan dengan fase geraknya agar bisa terpisah dengan baik, maka perlu
dilakukan pembentukan TC bersifat basa dengan polaritas lebih rendah dari
bentuk garamnya yaitu tetrasiklin HCl (TCH). Preparasi selanjutnya, TC yang
sudah terambil (dalam bentuk TCH) dari matriks daging direaksikan dengan
NaOH sehingga terjadi reaksi kesetimbangan dengan reaksi sebagai beikut :
Tetrasiklin HCl + NaOH Tetrasiklin + NaCl + H2O
(garam) (basa) (basa) (garam)
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ekstraksi cair-cair yaitu
asetonitril dan buffer McIlvaine (pH 4) dengan bantuan NaCl dengan tujuan TC
basa akan terlarut dalam asetonitril dan zat lain terlarut dalam buffer McIlvaine.
Ekstraksi menggunakan asetonitril dan buffer McIlvaine dengan penambahan
garam NaCl dilakukan dengan tujuan mengadakan efek salting out yaitu menarik
air sehingga terjadi pemisahan antara air dan asetonitril. Pada awalnya tujuan
peneliti mengambil fase asetonitril untuk kemudian dilakukan penguapan, tetapi
tidak terjadi pemisahan secara sempurna sehingga pada sampel secara langsung
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
dilakukan proses penguapan dengan menggunakan rotary evaporator dengan
anggapan bahwa zat lain ikut menguap bersama asetonitril.
2. Orientasi panjang gelombang TC
Orientasi panjang gelombang TC dilakukan pada 20 ppm standar TCH
dalam HCl (dengan proses ektraksi) dengan melihat spektrum absorbansi TC
(setelah dilakukan perlakuan ekstraksi) dengan menggunakan spektrofotometri uv.
Pada orientasi panjang gelombang TC ini didapatkan panjang gelombang
maksimal pada 270 nm dapat dilihat pada lampiran 25.
3. Penetapan puncak TC
Penetapan puncak TC dilakukan dengan menggunakan standar TCH
yang dilarutkan dalam asetonitril : buffer McIlvaine dan dilakukan deteksi dengan
menggunakan HPLC. Kromatogram standar TCH ditunjukkan pada gambar 14,
terdapat puncak pada waktu retensi 5,1 sehingga waktu retensi 5,1 dipilih sebagai
waktu retensi TCH dalam fase gerak.
Gambar 14. Kromatogram standar TCH dalam pelarut fase gerak
Penetapan puncak TCH dalam daging yang diekstraksi yaitu TC basa
juga dilakukan untuk menentukan puncak TC basa. Kromatogram hasil deteksi
TCH
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
TC basa dengan menggunakan HPLC yaitu pada gambar 16. Pada gambar 16,
menunjukkan adanya 3 puncak tertinggi pada waktu retensi 3,9; 5,7; dan 10,0.
Selanjutnya dilakukan perbandingan dengan kromatogram blangko yaitu pelarut
dengan perlakuan ekstraksi tanpa TCH. Pada gambar 15, ternyata pada waktu
retensi 3,9 juga terdapat puncak seperti pada kromatogram standar TC (gambar
16). Kromatogram standar TC (gambar 16) menunjukkan ada dua puncak tertinggi
yang tidak ditemukan pada kromatogram blangko sehingga 2 puncak pada waktu
retensi 5,7 dan 10,0. Jika gambar 16 dibandingkan dengan gambar 14 maka dapat
ditentukan bahwa pada waktu retensi 5,7 adalah puncak dari TCH dan pada waktu
retensi 10,0 adalah puncak dari TC basa. Sesuai dengan sifat polaritas tetrasiklin
basa (TC) dan garam tetrasiklin HCl (TCH) akan menentukan waktu retensinya
juga. TCH bersifat lebih polar dibanding TC basa sehingga akan terelusi lebih
dulu.
Gambar 15. Kromatogram blanko (tanpa TCH)
Gambar 16. Kromatogram standar TC basa
TCH TC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Pembentukan dua puncak ini dapat disebabkan karena ketidak
sempurnaan dalam ekstraksi sehingga untuk menetapkan kadar tetrasiklin dalam
daging dengan kondisi adanya dua puncak tetrasiklin, maka dilakukan
penjumlahan antara puncak pada waktu retensi 5,7 dan 10,0 untuk
merepresentasikan tetrasiklin total yang ada dalam sampel daging lobster. Dalam
antisipasi kegagalan ekstraksi perlu dilakukan optimasi kembali terhadap ekstraksi
yang digunakan dalam penelitian ini.
4. Optimasi fase gerak HPLC
Optimasi fase gerak dilakukan untuk mendapatkan formula fase gerak
yang tepat untuk memisahkan TC basa dan senyawa lain sehingga TC basa dapat
terdeteksi tanpa adanya penumpukan peak. Optimasi fase gerak ini dilakukan pada
20 ppm standar TCH (telah dilakukan preparasi dan ekstraksi) dengan
menggunakan fase gerak metanol : buffer McIlvaine (pH 4) dan acetonitiril :
buffer McIlvaine (pH 4). Asetonitril dan metanol merupakan pelarut yang sering
digunakan untuk melarutkan senyawa tetrasiklin. Pada kromatogran gambar 18,
terdapat 2 puncak paling tinggi pada penggunaan fase gerak asetonitril : buffer
McIlvaine (pH 4). TC basa dengan konsentrasi yang sama dideteksi dengan
menggunakan HPLC dan fase gerak metanol : buffer McIlvaine (pH 4)
menghasilkan kromatogram pada gambar 17. Berdasarkan kromatogram yang
dihasilkan dengan menggunakan kedua pelarut, asetonitril : buffer McIlvaine
dipilih sebagai fase gerak yang paling optimum untuk memisahkan analit pada
penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak metanol : buffer McIlvaine
Gambar 18. Kromatogram TC dengan fase gerak asetonitril : buffer McIlvaine
G. Validasi Metode HPLC
Validasi metode penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan untuk
menjamin metode HPLC dalam menetapkan kadar TC. Validasi yang dilakukan
meliputi linearitas, akurasi, presisi, sensitivitas (LOQ) dan selektivitas (resolusi).
Pada penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan juga perbandingan kurva
baku solven dan kurva adisi. Persamaan regresi linear yang didapat yaitu pada
tabel VII. Nilai slope pada kedua kurva (tabel VII) memiliki selisih yang besar
sehingga matriks sampel dapat mempengaruhi penetapan kadar TC.
Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi
Kurva R2 Slope Persamaan regresi linear
Baku solven 0,9919 209507 y = 209507x – 46814
Adisi 0,9976 90169 y = 90169x + 8799
TCH TC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Gambar 19. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC
Pada gambar 19, terlihat bahwa kurva baku solven memiliki respon yang
lebih tinggi daripada kurva adisi terhadap deteksi HPLC. Dalam penelitian ini,
efek matriks yang terjadi adalah menurunkan kadar TC sehingga digunakan kurva
adisi untuk melakukan penetapan kadar TC dalam daginng, agar dapat
merepresentasikan kondisi yang sebenarnya.
Linearitas pada kurva baku solven dinyatakan dengan nilai R2
sebesar
0,9919 dengan persamaan regresi linear y = 209507x-46814 sedangkan pada
kurva adisi didapatkan nilai R2
sebesar 0,9976 dengan persamaan regresi linear y
= 90169x+8799. Sensitivitas pada metode dilakukan dengan menyatakan nilai
LOQ pada kurva adisi yaitu sebesar 1 ppm. LOQ metode HPLC menggunakan
kurva adisi yang didapat sebesar 0,53 ppm sehingga konsentrasi 0,2 ppm pada
kurva adisi tidak masuk dalam LOQ.
Akurasi dinyatakan dengan persen difference (%D) yang didapatkan dari
kurva adisi dapat dilihat pada tabel. Ketentuan dari FDA, menyatakan metode
yang akurat memiliki nilai %D dan %RSD kurang dari 20%. Akurasi pada kurva
adisi yang digunakan pada tabel VIII, menyatakan %D lebih dari 20% pada
konsentrasi 0,2 dan 1 ppm. Hasil menunjukkan akurasi yang tidak sesuai kriteria.
-500000
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 5 10 15 A
UC
Konsentrasi (ppm)
Kurva adisi
Kurva baku solven
Linear (Kurva adisi)
Linear (Kurva baku solven)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Tabel VIII. %D kurva adisi
Konsentrasi (ppm) %D
0,2 134,7459
1 30,2421
3 0,7057
7 0,3219
10 0,3422
Penetapan presisi dilakukan pada kurva adisi terhadap 4 titik mulai dari
1-10 ppm dan didapatkan %RSD <20% yaitu 17,2625% sehingga presisi masih
masuk kriteria pada konsentrasi 1-10 ppm. Karena keterbatasan waktu pada
penetapan kadar TC dalam daging lobster ini, maka tetap digunakan persamaan
regresi linear dari konsentrasi 0,2-10 ppm karena AUC sampel yang tidak masuk
interval kurva adisi bila digunakan kurva adisi dari 1-10 ppm maka hasil
penelitian ini hanya dapat dinyatakan secara kualitatif.
Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode dalam memisahkan
analit secara tepat dan spesifik, parameter yang diamati adalah resolusi. Menurut
Snyder et al. (2010), suatu metode analisis dikatakan selektif apabila memiliki
resolusi ≥ 1,5. Nilai ini menunjukan pemisahan antara puncak kromatogram sudah
terjadi secara sempurna.
Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi sampel TC
Sampel Waktu retensi Resolusi Rata-rata nilai resolusi
1 5,8 0,191
2,213 10,1 2,223
2 5,8 2,223
10,1 3,656
3,208 3
5,8 2,203
10,1 3,744
Tabel X menunjukan rata-rata resolusi dari puncak TC dengan puncak
lain yang terdekat adalah ≥ 1,5, yaitu 2,213 pada waktu retensi 5,8 dan 3,208
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
pada 10,1. Hal ini menunjukan bahwa metode analisis yang digunakan memiliki
kriteria selektivitas terpenuhi karena dapat memisahkan senyawa analit dari
senyawa-senyawa lain yang ada pada matriks.
H. Penetapan Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster
Penetapan kadar tetrasiklin (TC) dalam daging dilakukan pada lobster air
tawar perlakuan hari ke 14 dan ke 28 untuk melihat ada tidaknya peningkatan
kadar akumulasi TCH yang cukup terlihat dalam daging lobster. TCH memiliki
sifat larut yang cukup baik di dalam air sehingga kemungkinan untuk mengendap
dan terakumulasi dalam tubuh lobster sangat kecil. TCH memiliki harga logP
sebesar -1,37 yang menunjukkan kelarutan di dalam air yang tinggi (Hansh, Leo,
dan Hoekman, 1995). Tetapi TCH memiliki sifat tidak stabil dengan ion logam
seperti Mg dan Ca. TC dapat berikatan kovalen dengan ion logam menjadi suatu
kompleks kelat sehingga fungsinya sebagai anti mikroba tidak muncul. Kompleks
kelat TCH-Ca ini sulit didegradasi sehingga tetap berada dalam habitat dan
kemungkinan untuk termakan oleh lobster sangat besar sehingga terjadi akumulasi
dalam daging lobster.
Gambar 20. Kompleks TC dengan ion logam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Kadar TCH dalam daging yang ditetapkan adalah pada hari perlakuan 14
dan 28 daging lobster. Pada hari perlakuan ke 14, data kadar TC dalam daging
dieksklusi karena memiliki %RSD yang besar(presisi kadar tidak terpenuhi). Pada
perlakuan hari ke 28 didapatkan presisi sebesar 1,41901 dan rata-rata kadar
akumulasi TC sebesar 53,0970 ug/g.
Tabel X. Kadar tetrasiklin total dalam daging lobster
Replikasi Kadar TC (ug/g) Rata-rata (ug/g)
1 53,9382
53,0970 2 52,8686
3 52,4842
I. Keterbatasan Penelitian
Penelitian ini memiliki banyak kekurangan yaitu pada penetapan kadar
tetrasiklin dalam daging lobster tidak digunakan standar internal sebagai faktor
koreksi terhadap proses ekstraksi. Proses ekstraksi yang tidak dioptimasi sehingga
terjadi dua puncak pada kromatogram. Kurva baku adisi yang digunakan untuk
menetapkan kadar protein dalam sedimen dan tetrasiklin dalam daging lobster
tidak memenuhi kriteria. Pada pembagian lobster dalam akuarium sebelumnya
tidak diukur panjang dan berat per akuarium melainkan diambil rata-rata
keseluruhan lobster. Selain itu tidak dilakukan pengecekan kualitas air per
sampling.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan berpengaruh terhadap jumlah
populasi mikroba.
2. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan tidak berpengaruh terhadap kadar
protein dalam sedimen.
3. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan tidak berpengaruh terhadap laju
pertumbuhan lobster air tawar.
4. Terjadi akumulasi antibiotik tetrasiklin sebesar 53,0970 µg/g.
B. Saran
1. Perlu dilakukan pengamatan dan evaluasi jumlah populasi mikroba secara
spesifik pada jenis bakteri untuk dapat menyatakan efek tetrasiklin.
2. Perlu dilakukan optimasi kembali terkait ekstraksi tetrasiklin dalam daging.
3. Perlu dilakukan pengecekan kualitas air per hari perlakuan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed, H., 2004, Principles and Reactions Of Protein Extraction, Purification,
and Characterization, CRC Press, USA. Pp. 35-37.
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Reublik
Indonesia, Jakarta, pp. 781-782, 1061.
Anonim, 2013, Bioanalytical Method Validation, CDER, Food and Drug
Administration.
Ansari, M., dan Raissy, M., 2010, In vitro Susceptibility of Commonly Used
Antibiotics against Vibrio spp. Isolated from Lobster (Panulirus
homarus), African Journal of Microbiology Research,4(23), 2629-2631.
Bachtiar, Y., 2006, Usaha Budi Daya Lobster Air Tawar di Rumah, P.T.
AgroMedia Pustaka, Jakarta, pp. 42.
Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitchell, L. G., 2002, Biologi, Erlangga,
Jakarta, pp. 77-80.
Chan, C. C., Lam, H.,dan Zhang, X. M., 2004, Analytical Method validation and
Instrument Performance Verification, John Wiley & Sons, Inc., New
York, pp. 16-17, 105, 156.
Dachriyanus, (2004), Analisis Struktur Senyawa Organik Secara
Spektrofotometri, Cetakan pertama, CV. Trianda Anugrah Pratama,
Padang, pp. 1-2.
Dennison, Clive., 2003, A Guide to Protein Isolation, 2nd
edition, Kluwer
Academic Publishers, Netherlands, pp.13-19, 23-28
Effendy, 1998, Memelihara Ikan Mas Koki Dalam Akuarium, Kanisius,
Yogyakarta.
Ermer, J. dan Miller, J.H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical
Analysis, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, New York, pp. 21-
24.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Frankel, E. N., 2012, Lipid Oxidation, 2nd
edition, Woodhead Publishing, USA,
pp. 10-12.
Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, pp. 378-417, 456-480.
Glencross, H., Ahmed N., dan Wang Q., 2011, Biomedical Science Practice
Experimental and Professional Skills, Oxford University Press, New
York, pp.359,360.
Georgiou, C. D., Grintzalis, K., Zervoudakis, G., dan Papapostolou, I., 2008,
Mechanism of Coomassie brilliant blue G-250 Binding to Proteins: A
Hydrophobic Assay for Nanogram Quantities of Proteins, Anal Bioanal
Chem, 391, 391–403.
Harmita., dan Radji, M., 2006, Buku Ajar Analisis Hayati, Penerbit Buku
Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 125-126.
Hansch, C., Leo, A., D. Hoekman,1995, Exploring QSAR - Hydrophobic,
Electronic, and Steric Constants, Washington, DC, American Chemical
Society, pp. 177.
Hossain, Sharker, Haque, Reza, dan Mondal (2014), Effects of antibiotic on the
bacterial microflora in two commercially important catfish species,
Clarias batrachus and Heteropneustes fossilis in Bangladesh, Journal of
Coastal Life Medicine, 2(11): 845-848.
Jenie, Betty S.L dan Rahayu, W. P., 1993, Penanganan Limbah Industri Pangan,
Kanisius, Yogyakarta, pp.27-28.
Johnson, B., 2010, Oxytetracycline (Terramycin® 200 for Fish) Medicated Feed
Clinical Field Trials- INAD 8069,
http://www.fws.gov/fisheries/aadap/inadsavailable/medicatedfeeds/Oxyte
tracycline-shrimp/index.html, diakses tanggal 2 Desember 2015.
Kazakevich, Y. dan Lobrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists,
John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 145-157.
Krasner, R. I., 2014, The Microbial Challenge : A Public Health Perspective, 3rd
edition, Jones & Bartlett Learning, USA, pp. 399-400.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
Kruger N. J., 1994, The Bradford method for protein quantitation, in Methods in
Molecular Biology, Vol. 32 : Basic Protein and Peptide Protocols (J.M.
Walker, ed.), Humana Press, New Jersey, pp. 9-15.
Kurniawan, D.,2010, Bioremediasi Sedimen Tambak Udang, Laporan Penelitian,
Fakultas Perikanan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman, Samarinda.
Lim, K., 2006, Pembenihan Lobster Air Tawar : Meraup Untung Dari Lahan
Sempit, AgroMedia Pustaka, Jakarta.
Lukito, A., dan Prayugo, S., 2007, Panduan Lengkap Lobster Air Tawar, Penebar
Swadaya, Jakarta, pp. 6-9, 56-74.
Mayer, L, M., Schick, L, L., dan Setchell, F, W., 1986, Measurement of Protein in
Nearshore Marine Sediment, Inter-Research, 30,159-165.
Nur, A., 2011, Manajemen Pemeliharaan Udang Vaname, Direktorat Jendral
Perikananan Budidaya Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau
Jepara, Jakarta, pp. 2-10, 13-19, 23.
Nurhidayati, L., 2007, Spektrofotometri Derivatif dan Aplikasinya dalam Bidang
Farmasi, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 5(2), 93-99.
Otlets, S., 2005, Methods of Analysis of Food Components and Additives, Taylor
& Francis Group, United States, pp. 79.
Rosenberg, I. M., 2005, Protein Analysis and Purification Benchtop Techniques,
Second Ed, Springer Scince and Business Media, USA, pp. 20-27.
Scholar, E. M., dan Pratt, W. B., 2000, The Antimicrobial Drugs, 2nd
edition,
Oxford University Press, New York, pp. 260-261.
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., dan Dolan, J. W., 2010, Introduction Modern Liquid
Chromatography, 3rd
ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 1-5,
54-55, 88-144.
Subronto dan Tjahjati, 2001, Pedoman Pengobatan pada Hewan Ternak, Bentang
Pustaka, Yogyakarta, pp. 137, 145-147.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Sukmajaya, Ir. Y. dan Suharjo, I., 2003, Mengenal lebih Dekat Lobster Air Tawar,
Komoditas Perikanan Prospektif, PT Agromedia Pustaka Utama,
Tangerang, pp. 56, 57.
Vaz-Moreira, I., Nunes, O. C., dan Manaia, C. M., 2014, Bacterial Diversity And
Antibiotic Resistance In Water Habitats: Searching The Links With The
Human Microbiome, Federation of European Microbiology Societies,
38, 761–778.
Weifen,W., Hong, L., Changhu, X., dan Jamil, K., 2004, Elimination of
Chloramphenicol, Sulphamethoxazole And Oxytetracycline In Shrimp,
Penaeus Chinensis Following Medicated-Feed Treatment, Environment
International, 30, 367-373.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Lampiran 1. Surat permohonan working standar tetrasiklin HCl
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Lampiran 2. COA working standar tetrasiklin HCl
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Lampiran 3. COA reagen coomasie R
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
Lampiran 4. COA albumin (BSA)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
Lampiran 5. Hasil determinasi lobster air tawar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
Lampiran 6. Kurva baku penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul
Konsentrasi (mg/ml) Absorbansi
0.15 0.293
0.2 0.374
0.25 0.432
0.3 0.527
0.35 0.621
0.4 0.667
0.45 0.733
0.5 0.833
Lampiran 7. Tabel hasil penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul
y = 1.5176x + 0.0668 R² = 0.9953
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 0.2 0.4 0.6
Ab
sorb
ansi
Konsentrasi (mg/ml)
Kurva Baku
Penimbangan
Sampel g Keterangan Absrobansi
Konsentrasi
(mg/ml)
Konsentrasi
(% b/b)
0.2514 Replikasi 1 0.4290 0.2387 94.9349
0.251 Replikasi 2 0.4230 0.2347 93.5110
0.2512 Replikasi 3 0.4250 0.2360 93.9612
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Lampiran 8. Hasil jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis tetrasiklin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Lampiran 9. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Lampiran 10. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Lampiran 11. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
Lampiran 12. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Lampiran 13. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
Lampiran 14. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
Lampiran 15. Tabel data jumlah populasi mikroba
Perlakuan
selama
(hari)
Kelompok Kontrol
Kelompok Antibiotik
Populasi
Mikroba
Log Populasi
Mikroba
Populasi
Mikroba
Log Populasi
Mikroba
0 370000 5,5682 370000 5,5682
3 3200000 6,5051 2900000 6,4624
5 30000 4,4771 31000 4,4914
7 290000 5,4624 98000 4,9912
14 2200 3,3424 1000000 6,0000
28 32000 4,5051 340000 5,5315
Lampiran 16. Tabel data tinggi derivat kurva baku solven protein
Konsentrasi (mg/ml) Tinggi derivate (cm)
0,4 0,13
0,8 0,15
1,2 0,18
1,6 0,20
2,0 0,23
2,4 0,25
2,8 0,28
3,2 0,28
3,6 0,30
Lampiran 17. Tabel data tinggi derivat kurva adisi protein
Adisi
(mg)
Konsentrasi
(mg/ml)
Tinggi
derivat
10 0,05 0,13
30 0,16 0,15
50 0,27 0,20
70 0,37 0,28
90 0,48 0,33
Lampiran 18. Contoh perhitungan %D
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
Lampiran 19. Contoh perhitungan %RSD
x (mg/ml) y (cm) RF (y/x) SD Rata-rata
0,16 0,15 0,9375
0,10825 0,78125 0,27 0,2 0,75
0,37 0,28 0,75
0,48 0,33 0,6875
Lampiran 20. Contoh perhitungan LOQ
Persamaan regresi linear y = bx+ a
y = 90169x + 8799
Standar deviasi 14394,40
Slope (b) 90169
Lampiran 21. Contoh spektrum derivatif protein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
Lampiran 22. Data kadar protein dalam sedimen
Hari
perlakuan
Kadar protein (mg/g) Kadar protein
(selisih dengan hari ke 0)
kontrol antibiotik kontrol antibiotik
0 117,7318 117,7318 0 0
3 108,2719 117,9104 -9,4599 0,1786
5 117,9104 132,3681 0,1786 14,6363
7 101,8463 92,2078 -15,8855 -25,5240
14 149,0747 123,3722 31,3429 5,6404
28 246,7443 246,7443 129,0125 129,0125
Lampiran 23. Tabel data panjang lobster air tawar
Hari Kontrol Antibiotik Selisih dengan hari ke 0
Panjang (cm) Panjang (cm) Kontrol Antibiotik
0 5,2500 5,2500 0 0
3 5,3067 5,3867 0,0567 0,1367
5 5,3133 5,3067 0,0633 0,0567
7 5,1385 5,2867 -0,1115 0,0367
14 5,7000 5,8533 0,4500 0,6033
28 5,5071 mati 0,2571 -
Lampiran 24. Tabel data berat lobster air tawar
Hari Kontrol Antibiotik Selisih dengan hari ke 0
Berat (gram) Berat (gram) Kontrol Antibiotik
0 3,2500 3,2500 0 0
3 3,5293 3,8273 0,2793 0,5773
5 3,6660 3,5887 0,4160 0,3387
7 3,3685 3,5760 0,1185 0,3260
14 3,6536 3,8860 0,4036 0,6360
28 3,9829 mati 0,7329 -
Lampiran 25. Spektrum orientasi panjang gelombang tetrasiklin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
Lampiran 26. Tabel data AUC kurva baku solven tetrasiklin
Konsentrasi (ppm) AUC
0,2 59168,7
1,2 234696,3
2,4 470502,0
3,6 604299,0
4,8 954569,0
6,0 1242458,0
7,2 1319205,3
9,6 2033852,3
12,0 2506746,3
Lampiran 27. Tabel data AUC kurva adisi tetrasiklin
Adisi (ppm) Konsentrasi (ppm) AUC
2 0.2 2533
10 1 126237
30 3 277397
70 7 642014
100 10 907403
Lampiran 28. Contoh kromatogram kurva baku solven
Lampiran 29. Contoh kromatogram kurva adisi tetrasiklin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
Lampiran 30. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 14
Lampiran 31. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 28
Lampiran 32. Kandungan pakan dan merek dagang pakan
Lampiran 33. Proses perlakuan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
Lampiran 34. Sedimen lobster air tawar
Lampiran 35. Perbandingan jumlah sedimen pada hari ke 28
Lampiran 36. Contoh perhitungan uji t tidak berpasangan (p<0,05)
H0 X1=X2 X1(kadar protein kelompok kontrol)
H1 X1≠X2 X2(kadar protein kelompok antibiotik)
H0 = kadar protein kelompok kontrol tidak berbeda nyata dengan kadar protein
kelompok antibiotik.
H1 = kadar protein kelompok kontrol berbeda nyata dengan kadar protein kelompok
antibiotik.
Rumus :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
103
Perhitungan :
Kesimpulan :
H1 diterima jika t hitung ≥ t tabel
1,1577< 2,306
Maka H1 ditolak sehingga kadar protein kelompok kontroltidak berbeda nyata dengan
kadar protein kelompok antibiotik.
Lampiran 37. Tabel uji t tidak berpasangan terhadap panjang dan berat losbter
Parameter df (n=4) S t hitung Keterangan t tabel
Panjang 6 0,023825 -2,7814 < 2,447
Berat 6 0,020480 -5,7025 <
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
104
BIOGRAFI PENULIS
Penulis dengan nama lengkap Aditya Christian
Firmanto dilahirkan di Pati pada tanggal 19 April 1993
sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Penulis
skripsi berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan
Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein
Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan
Menggunakan Pengembangan Metode Analisis
Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan
Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)”
menempuh pendidikan formal yang ditempuh penulis
adalah TK Petiwi Wedarijaksa (1997-1999), SD
Kanisius Pati (1999-2005), SMP Kanisius Pati (2005-
2008), SMA Negeri 1 Pati (2008-2011). Pada tahun
2011, penulis melanjutkan pendidikan di program studi S1 Fakultas Famasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis pernah menjadi
asisten dosen pada praktikum Kimia Dasar dan Kimia Organik. Selain itu, penulis
juga aktif dalam kegiatan kemahasiswaan kampus antara lain sebagai anggota
Paduan Suara Mahasiswa Sanata Dharma, pernah mengikuti beberapa perlombaan
antara lain Bali International Choir Competition mendapat medali emas (2012),
pernah mengisi acara kebudayaan di Hongaria(2014) dan pernah mengikuti
beberapa kepanitiaan antara lain Inisiasi Sanata Dharma sebagai divisi expo
(2013), Pharmacy Performance sebagai divisi keamanan (2011) serta pernah
mengikuti beberapa seminar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI