plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk file“dan selama ribuan langkah kaki kita...

AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH

MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) PADA CHORIOALLANTOIC

MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Ketut Noveryka Lendra

NIM : 108114171

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH

MERAH (Piper crocatum Ruiz &pav.) PADA CHORIOALLANTOIC

MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Ketut Noveryka Lendra

NIM : 108114171

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

"Kaki yang berjalan lebih jauh dari biasanya,

tangan yang akan berbuat lebih banyak dari biasanya,

mata yang akan menatap lebih lama dari biasanya,

leher yang akan sering melihat keatas,

lapisan tekad yang seribu kali lebih keras dari baja,

hati yang akan bekerja lebih keras dari biasanya,

serta mulut yang akan selalu berdoa,"

“Dan selama ribuan langkah kaki kita melangkah, selama hati yang berani inibertekad hingga semuanya bias terwujud sampai di sini, jangan pernah sekalipunkita menyerah mengejar mimpi-mimpi kita, berjuang, berusaha dan bercita-cita

untuk kehidupan yang lebih baik bagi tanah tempat kita berpijak ini”

Donny Dirgantoro - 5 cm

Skripsi ini kepersembahkan untuk :Tuhan Ida Sang Hyang Widhi Wasa,

Papa dan Mama tercinta,Saudara-saudaraku tersayang,

Teman-temanku,Dan Almamaterku...


v


vi

PRAKARTA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa ”Ida

Sang Hyang Widhi Wasa” atas segala anugerah dan bimbingan-Nya sehingga

penulis dapat menyelesaikan penelitian serta penulisan skripsi yang berjudul

“Aktivitas Antiangiogenesis Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper

crocatumRuiz &pav.) Pada Chorioallantoic Membrane yang Diinduksi bFGF”.

Skripsi ini disusun guna memenuhi persyaratan dalam penyelesaian jenjang studi

untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Keberhasilan penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari

bantuan, bimbingan serta dukungan dari berbagai pihak baik secara moril maupun

materiil. Untukitu, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan

terimakasih yang sebesar- besarnyakepada :

1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Drh. Sitarina Widyarini, MP, Ph.D. selaku Dosen Pembimbing I skripsi

yang telah meluangkan banyak waktu, tenaga dan pikirannya,

sertamemberikan perhatian, kesabaran, bimbingan, masukan dan motivasi

kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.

3. Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt.selaku Dosen Pembimbing II skripsi

yang telah meluangkan banyak waktu, tenaga dan pikirannya, serta

memberikan perhatian, kesabaran, bimbingan, masukan dan motivasi

kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.


vii

4. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah

banyak memberikan koreksi serta saran untuk kesempurnaan penulisan

skripsi ini.

5. Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen penguji yang telah memberikan

kritik dan saran yang membangun selama proses pembuatan skripsi.

6. Papa (I Wayan Lendera, Dipl. PT.) dan Mama (Eriana Herlisanti, S. Pd.)

yang tidak henti-hentinya memberikan doa, semangat, dukungan dan

bantuan finansial hingga akhirnya skripsi ini dapat terselesaikan.

7. Saudara-saudaraku tersayang, Gede Ayusari Lendra, S.T., M.Eng., Made

Dody Lendra, SST.FT., M.Fis., dan Nyoman Valida Lendra, S.Farm.,

Apt., terima kasih atas kebersamaan, doa, semangat dan nasehat yang

diberikan selama penulis menyelesaikan skripsi ini.

8. Pak Wagiran selaku laboran Farmakognosi Fitokimia dan Mas Agung

selaku laboran Farmasi Steril yang telah banyak membantu sehingga

penelitian dan penyusunan skripsi ini dapat terselesaikan.

9. Pak Iwan selaku laboran mikrobiologi Universitas Gadjah Mada yang

telah banyak membantu sehingga penelitian dan penyusunan skripsi ini

dapat terselesaikan.

10. Teman-teman seperjuangan skripsi Stien Dwiny, Retno Pamungkas, dan

Pande Putu Krisna Wedana terima kasih atas kebersamaan, semangat dan

kerjasamanya selama penelitian dan penyususnan skripsi hingga akhirnya

skripsi ini dapat terselesaikan.


viii

11. Sahabat-sahabatku tercinta Kezia, Naomita, Bakti, Aji, Rosi, dan Lilin

yang telah memberikan semanagat serta canda tawa kepada penulis selama

penyusunan skripsi ini.

12. I Putu Edy Rapiana, S.T.,yang selalu meluangkan waktunya untuk

menemani penulis serta kesabaran, doa dan semangat yang tiada hentinya

diberikan kepada penulis selama menyelesaikan skripsi ini.

13. Teman-teman FSM D 2010 dan FKK B 2010, terima kasih atas

kebersamaannya dan pengalaman yang tak terlupakan selama menjalani

kuliah dan praktikum bersama peneliti selama penyusunan skripsi.

14. Teman-teman kost odilia yang telah memberikan semangat kepada penulis

hingga terselesaikannya skripsi ini.

15. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, baik secara

langsung maupun tidak langsung telah banyak membantu terselesaikannya

skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa tidak ada manusia yang sempurna. Demikian

juga dengan tugas akhir ini yang belum sempurna dan masih banyak kekurangan.

Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun

dari semua pihak agar skripsi ini dapat menjadi lebih baik. Akhir kata, penulis

berharap semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama

demi kemajuan pengetahuan di bidangFarmasi.

Yogyakarta, 23 Juli 2014

Penulis


ix


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN..................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv

HALAMAN PERNYATAAN PUBLIKASI .............................................. v

PRAKARTA ............................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... ix

DAFTAR ISI............................................................................................... x

DAFTAR TABEL....................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xv

DAFTAR LAMPIRAN............................................................................... xvi

INTISARI.................................................................................................... xviii

ABSTRACT.................................................................................................. xix

BAB I. PENGANTAR................................................................................ 1

A. Latar Belakang ................................................................................. 1

1. Perumusan masalah .................................................................... 5

2. Keaslian penelitian ..................................................................... 6

3. Manfaat penelitian ...................................................................... 7

a. Manfaat teoritis..................................................................... 7

b. Manfaat metodologi ............................................................ 7

c. Manfaat praktis..................................................................... 7


xi

B. Tujuan Penelitian.............................................................................. 8

1. Tujuan umum ............................................................................. 8

2. Tujuan khusus............................................................................. 8

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................... 9

A. Obat Tradisional ............................................................................... 9

B. Sirih Merah ...................................................................................... 10

1. Taksonomi tumbuhan ................................................................. 10

2. Deskripsi tanaman ..................................................................... 10

3. Kandungan kimia ...................................................................... 11

4. Khasiat dan penggunaan ............................................................ 14

C. Ekstraksi .......................................................................................... 15

D. Kanker ............................................................................................. 16

a. Karsinogenesis............................................................................ 17

b. Angiogenesis .............................................................................. 19

c. basic Fibroblast Growth Factor (bFGF).................................... 22

E. Chorioallantoic Membrane .............................................................. 24

F. Landasan Teori ................................................................................. 25

G. Hipotesis ........................................................................................... 27

BAB III. METODE PENELITIAN............................................................. 28

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 28

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional .................................. 28

1. Variabel utama ........................................................................... 28

a. Variabel bebas ...................................................................... 28


xii

b. Variabel tergantung .............................................................. 28

2. Variabel pengacau ...................................................................... 28

a. Variabel pengacau terkendali ............................................... 28

b. Variabel pengacau tak terkendali ......................................... 28

3. Definisi operasional.................................................................... 29

C. Bahan Penelitian .............................................................................. 29

D. Alat Penelitian ................................................................................. 29

E. Tata Cara Penelitian ........................................................................ 30

1. Determinasi tanaman.................................................................. 30

2. Pengumpulan bahan uji .............................................................. 30

3. Preparasi ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz

& Pav.)........................................................................................ 30

4. Orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav.) ............................................................... 31

5. Sterilisasi alat ............................................................................. 31

6. Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth

Factor (bFGF) ............................................................................ 31

a. Preparasi bFGF sebagai induktor angiogenesis.................... 31

b. Preparasi sediaan larutan uji................................................. 32

7. Uji antiagiogenesis ..................................................................... 32

F. Analisis Data .................................................................................... 35

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 38

A. Determinasi Tanaman ...................................................................... 38


xiii

B. Preparasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz

& Pav.).............................................................................................. 38

C. Hasil Uji Angiogenesis Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav.) Pada Chorioalantoic Membrane (CAM).... 41

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN..................................................... 57

A. Kesimpulan....................................................................................... 57

B. Saran................................................................................................. 57

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 58

LAMPIRAN ............................................................................................... 64

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 86


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Rerata jumlah pembuluh darah baru dan standardeviasi

pada kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol

daun sirih merah ................................................................. 46

Tabel II. Hasil Uji Statistik pertumbuhan pembuluh darah baru

antar kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol

daun sirih merah .................................................................. 48

Tabel III. Persentase Pertumbuhan pembuluh darah baru

pada kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol

daun sirih merah .................................................................. 52


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Memperlihatkan Tahapan Kerja Uji CAM.......................... 35

Gambar 2. Skoring Semikuantitatif Respon Angiogenesis Secara

Mskroskopik ........................................................................ 36

Gambar 3. Respon Angiogenesis Pada CAM Secara Makroskopis

Yang Diberi Berbagai Perlakuan......................................... 45

Gambar 4. Diagram batang rata-rata jumlah pembuluh darah

baru pada kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak

etanol daun sirih merah ....................................................... 46

Gambar 5. Persentase Pertubuhan Pembuluh Darah Baru pada

kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih

merah .................................................................................. 53


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)... 62

Lampiran 2. Foto serbuk daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) 63

Lampiran 3. Hasil Determinasi Tanaman Sirih Merah ............................ 64

Lampiran 4. Data perhitungan rendemen ekstrak etanol daun ririh merah 65

a. Penimbangan .................................................................. 65

b. Rendemen ekstrak etanol daun sirih merah ................... 65

Lampiran 5. Data Perhitungan Pengenceran bFGF ................................. 66

a. Pengenceran bFGF.......................................................... 66

b. Kontrol bFGF.................................................................. 66

c. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah .................. 67

Lampiran 6. Perhitungan berat ekstrak etanol daun sirih merah dan

volume DMSO..................................................................... 68

a. Berat konsentrasi ekstrak untuk masing-masing

konsentrasi etanol daun sirih merah .............................. 68

b. Volume DMSO............................................................... 68

Lampiran 7. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis

Pada kelompok control dan perlakuan ekstrak etanol

Daun sirih merah. ................................................................ 69

a. Kontrol paper disc (PD) ............................................... 69

b. Kontrol pelarut ............................................................. 70

c. Kontrol bFGF ............................................................... 71


xvii

d. Konsentrasi etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml......... 72

e. Konsentrasi etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml........... 72

f. Konsentrasi etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml........... 73

Lampiran 8. Rerata jumlah pembuluh darah baru dan standar deviasi .... 69

a. Mean dan standar deviasi pembuluh darah baru dari

masing-masing perlakuan............................................. 69

lampiran 9. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru ................... 70

Lampiran 10. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru pada

Kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun

sirih merah ........................................................................... 71

Lampiran 11. Diagram batang pertumbuhan pembuluh darah baru pada

Kelompok kontrol dan kelompok konsentrasi ekstrak etanol

daun sirih merah........................................................................... 71

Lampiran 12. Uji Statistik dengan SPSS 16.0............................................. 72

a. Uji normalitas ................................................................. 72

b. Uji homogenitas.............................................................. 73

c. Uji Tukey......................................................................... 74

Lampiran 13. Diagram batang Jumlah Pembuluh Darah Baru Rata-Rata

Dari Masing-Masing Perlakuan.......................................... 76


xviii

INTISARI

Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz &pav.) memiliki manfaat untukmengobati berbagai macam penyakit, salah satunya adalah sebagai antikanker.Senyawa fitokimia yang diduga berpotensi sebagai antikanker adalah senyawaflavonoid. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesisekstrak etanol daun sirih merah terhadap Chorioallantoic Membrane (CAM) yangdiinduksi bFGF dan juga untuk mengetahui hubungan antara peningkatankonsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dengan aktivitas antiangiogenesis.

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancanganlengkap pola searah. Telur ayam yang digunakan adalah telur ayam berembrioyang berusia 9 hari dalam kondisi terinkubasi. Uji antiangiogenesis dilakukandengan member perlakuan terhadap CAM telur ayam berembrio yang diinduksibFGF yang kemudian ditambahkan ekstrak etanol70% daun sirih merah dengankonsentrasi 0,05; 0,1dan 0,2 mg/ml. Pengamatan dilakukan secara makroskopisdengan menghitung jumlah pembuluh darah baru pada CAM. Data yang didapatkemudian dianalisis menggunakan analisis satu arah Anova yang dilanjutkandengan uji Tukey untuk melihat adanya perbedaan yang bermakna antar kelompokperlakuan.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan didapatkan hasil bahwa ekstraketanol daun sirih merah mampu menghambat angiogenesis pada CAM dimanatidak adanya kekerabatan antar konsentrasi. Respon angiogenesis untukkonsentrasi 0,05; 0,1 dan 0,2 mg/ml masing-masing secara berurutan adalahsebesar (%) 62,83± 2,30; 52,85± 1,52; 44,27 ± 0,577. Kesimpulan dari penelitianini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah memiliki efekantiangiogenesis pada telur ayam berembrio dengan konsentrasi optimal adalah0,05 mg/ml.

Kata kunci : Piper crocatum Ruiz & pav., CAM, aktivitas antiangiogenesis.


xix

ABSTRACT

Celebes pepper leave (Piper crocatum Ruiz &pav.) has many medicinalactions, one of them is anticancer. Compounds as potential anticancer isflavonoids.The aim of this research is to investigate the antiangiogenic activity ofethanol extract celebes pepper leaves on Chorioallantoic Membrane(CAM)induced bFGF and to know the correlation between increasing concentrations ofethanol extract celebes pepper leaves with antiangiogenic activity.

This is an experimental research following complete random ofunidirectional pattern. Chicken eggs used are embryonated chicken eggs 9 daysold and incubated. Antiangiogenic test had been done by giving treatment toCAM embryonated chicken eggs induced bFGF with the ethanol 70 % extract ofcelebes pepper leaves with level 0.05; 0.1and 0.2 mg/ml. Macroscopic observationwas done by counting the number of new blood vessels in the CAM.Antiangiogenis test result was analyzed using one-way ANOVA and thenproceeded to Tukey test to see the significant difference between treatmentgroups.

The results showed that the ethanolic extract of celebes pepper couldinhibit angiogenesis and did not correlation between concentration.concentration0.05; 0.1 and 0.2 mg/ml gave antiangiogenic response of (%) 62.83± 2.30; 52.85±1.52; 44.27 ± 0.577respectively. These results indicate a potential antiangiogeniceffect of the extract at the embryonated chicken eggs and optimum concentrationis 0.05 mg/ml

Keywords : Piper crocatum Ruiz & pav., CAM, Angiogenic Activity


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Penyakit kanker masih merupakan masalah besar bagi dunia yang

menyumbangkan penyebab kematian tertinggi setelah penyakit kardiovaskuler

dan infeksi, baik pada laki-laki maupun pada perempuan. Di Indonesia, kanker

merupakan penyebab kematian nomor lima setelah penyakit kardiovaskuler,

infeksi, pernafasan dan pencernaan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan

Makanan, 2000). Di AS dan beberapa negara berkembang lainnya, sekitar 25%

kematian disebabkan oleh kanker (Anonim,2005). Data dari U.S. National Health

Institute menyebutkan bahwa sepanjang tahun 2009 ini telah dilaporkan sebanyak

1.479.350 kasus kanker di AS, dengan angka kematian akibat kanker mencapai

562.340 atau 38,01 % dan angka ini belum termasuk kanker non-melanoma kulit.

American cancer society menyebutkan kanker menyumbangkan 13 % penyebab

kematian manusia di seluruh dunia atau sekitar 7,6 juta kematian akibat kanker

terjadi sepanjang 2007. Tingkat kejadianya pun semakin meningkat disebabkan

pola hidup instan yang dilakukan hampir semua penduduk dunia, bahkan World

Health Organization (WHO) memperkirakan pada tahun 2030 tingkat kematian

akibat kanker mencapai 12 juta orang. Pada tahun 2007, 72% angka kematian

akibat kanker ditemukan di negara berkembang (Anonim, 2009). WHO juga

melaporkan bahwa 1 penderita kanker meninggal setiap 11 menit dan muncul

1


2

penderita kanker baru setiap 3 menit. Diperkirakan setiap tahun ada 11 juta kasus

kanker baru dan 7 juta orang meninggal akibat kanker (Sankaranarayanan, 2008).

Kanker adalah suatu pertumbuhan sel yang abnormal dan bersifat ganas.

Sel kanker tumbuh dan berkembang dengan mengambil nutrisi dan oksigen dari

inang (host) dengan cara membentuk pembuluh darah baru (angiogenesis) dari

pembuluh darah yang sudah ada. Sel-sel kanker akan berkembang dengan cepat,

tidak terkendali, dan akan terus membelah diri, selanjutnya menyusup ke jaringan

sekitarnya (invasive) dan terus menyebar melalui jaringan ikat, darah, dan

menyerang organ-organ penting serta syaraf tulang belakang (Hanahan dan

Weinberg, 2000; Siswandono dan Soekardjo, 2000).

Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru yang

terjadi secara normal dan sangat penting dalam proses pertumbuhan dan

perkembangan. Angiogenesis juga merupakan langkah yang sangat penting dalam

karsinogenesis atau pertumbuhan sel kanker, sehingga terjadi perkembangan sel

kanker yang tidak terkendali dan bersifat ganas. Angiogenesis juga berkembang

menjadi sesuatu yang bersifat patologis dan berhubungan dengan kanker,

inflamasi, penyakit kulit dan penyakit mata. Kondisi patologi angiogenesis ini

dikarakterisasi oleh pembentukan pembuluh darah baru dan penghancuran sel

normal yang ada di sekitarnya. Terapi menggunakan inhibitor angiogenesis

merupakan suatu pendekatan yang relatif baru untuk terapi anti kanker. Hal ini

karena sel-sel tersebut umumnya stabil sehingga memungkinkan mereka kurang

berkembang menjadi obat yang resisten secara cepat (Kerbel dan Folkman, 2002).


3

Berbagai macam upaya untuk mengatasi kanker sudah banyak dilakukan

tetapi kurang efektif, sehingga dibutuhkan suatu usaha dalam menekan angka

pertumbuhan kanker, salah satunya adalah dengan menghambat proses

angiogenesis.Sejauh ini, berbagai macam cara untuk mengobati kanker belum

menunjukkan hasil yang memuaskan. Sampai saat ini, pembedahan dan

kemoterapi masih merupakan pilihan yang terbaik untuk terapi antikanker, namun

tingkat keberhasilannya masih rendah. Pembedahan tidak lagi efektif bagi sel

yang telah bermetastase. Radio terapi dan kemoterapi bekerja tidak selektif dan

tidak aman untuk sel normal. Agen antiangiogenesis sebagai terapi anti kanker

dapat berlaku spesifik dengan hanya menghambat pertumbuhan sel yang

terinduksi angiogenesis dan tidak berpengaruh pada sel dorman (King,2000).Oleh

karena itu, adanya penemuan obat baru sebagai senyawa antiangiogenesis, dengan

mengekplorasi bahan alam, sangat berpotensi untuk dikembangkan dengan

melalui perkembangan obat herbal secara tepat(Walaszek, Hanausek, dan Slaga,

2004).

Indonesia termasuk negara yang memiliki kekayaan flora nomor 2 di

dunia. Indonesia diyakini memiliki berbagai macam tumbuhan yang dapat

dimanfaatkan sebagai obat termasuk untuk pengobatan kanker. Kenyataannya

Indonesia masih tergolong rendah terutama dalam pemakaian tumbuhan sebagai

obat yang diintegrasikan dalam pelayanan kesehatan. Namun saat ini, popularitas

terapi herbal sudah mulai meningkat (Kamienski dan Keogh, 2006), salah satu

tanaman obat yang secara empiris biasa digunakan sebagai obat tradisional adalah

sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.). Selama ini penelitian yang banyak


4

dilakukan masih terbatas pada sirih saja, yang memiliki aktivitas sebagai

antiinflamasi dan imuno modulator. Sampai saat ini sirih merah lebih banyak

dikenal sebagai tanaman hias dan tumbuh merambat dipagar atau dipohon

(Pramono, 2002).

Sampai saat ini, penelitian tentang kemampuan daun sirih merah sebagai

antikanker belum banyak dipublikasikan. Namun di lingkungan masyarakat, daun

sirih merah ini sudah banyak digunakan sebagai obat tradisional dan telah diyakini

sebagai obat antikanker, dapat dilihat dari cukup banyaknya penderita kanker

yang sudah mengkonsumsi daun sirih merah baik dalam bentuk rebusan maupun

dalam bentuk lainnya (Pramono, 2002). Hal tersebutlah yang mendasari

dilakukannya penelitian ini dengan tujuan untuk melihat efek ekstrak etanol daun

sirih merah terhadap pertumbuhan pembuluh darah baru pada CAM telur ayam

berembrio yang diinduksi bFGF.Berdasarkan penelitian Neritika (2008), ekstrak

etanol daun sirih merah terbukti memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel

kanker payudara T47D. Pada Uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah

terhadap kultur sel raji yang dilakukan oleh Frandita (2009), menunjukkan bahwa

fraksi etanol daun sirih merah kemungkinan memiliki efek sitotoksisitas terhadap

kultur sel raji. Hal inilah yang mendasari pemilihan pelarut etanol pada penelitian

ini. Etanol mampu menarik senyawa aktif yang bersifat polar, dan diharapkan

mampu menarik senyawa flavonoid dari daun sirih merah karena seperti yang

telah diketahui, senyawa flavonoid mampu menghambat kanker dan diantaranya

melaui penghambatan angiogenesis.


5

Metode CAM dipilih pada penelitian ini karena membran korio alantois

merupakan membran yang sangat kaya dengan pembuluh darah dimana hal ini

berhubungan dengan sirkulasi embrionik melalui arteri dan vena alantois. Korio

alantois juga merupakan metode yang sangat sederhana untuk mempelajari

angiogenesis in vivo. Uji ini banyak digunakan untuk studi angiogenesis dan

invasi tumor dari kanker (Lokman, Elder, Ricciardeli dan Oehler, 2012).

Metode CAM memiliki beberapa kelebihan, antara lain adalah telur ayam

berembrio mudah didapatkan, relatif murah, mudah dikerjakan dan lebih praktis

(Ribatti,dkk., 1997). Selain memiliki kelebihan, penelitian menggunakan media

CAM juga mempunyai beberapa kelemahan yaitu keberadaan pembuluh darah

asal dan reaksi inflamasi yang tidak spesifik (Ribatti, dkk., 1997). Selain itu,

kuantifikasi hasil sering sangat subyektif sehingga sulit untuk membandingkan

hasil yang didapat.

1. Perumusan masalah

a. Apakah ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas

antiangiogenesis pada chorioallantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio

yang diinduksi bFGF dan pada konsentrasi berapa didapat konsentrasi

optimalnya?

b. Adakah kekerabatan antara konsentrasi ekstrak etanol daun sirih

merah dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM telur ayam berembrio yang

diinduksi bFGF?


6

2. Keaslian penelitian

Adapun beberapa penelitian yang berhubungan dengan aktivitas sirih

merah yang pernah dilakukan, antara lain:

a. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &

Pav.) Terhadap Kultur Sel Kanker Payudara T47D. Hasil penelitian menunjukkan

bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) memiliki

efek sitotoksisitas terhadap kultur sel T47D, dengan LC50 sebesar 587,7 µg/ml

(Neritika, 2008).

b. Uji Antiinflamasi Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &

Pav.) Pada Tikus Putih. Hasil penelitian pada penelitian ini adalah ekstrak metanol

daun sirih merah memiliki aktivitas antiinflamasi pada tikus putih yang diinduksi

karagenin dimana dosis yang digunakan adalah 25, 50 dan 100 mg/kg BB

(Fitriyani, Winarti Muslichah dan Nuri, 2011).

c. Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Sebagai Agen Anti

Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah memiliki kemampuan antibakteri

terhadap bakteri gram positif dan bakteri gram negatif khususnya terhadap

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (Juliantina, Citra, Nirwani,

Nurmaaitoh dan Bowo, 2009).

d. Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &

Pav.) Terhadap Kultur Sel Raji. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etanol

daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) kemungkinan memiliki efek


7

sitotoksisitas terhadap kultur sel raji dengan nilai LC50 sebesar 174,16 µg/ml

(Frandita, 2009).

e. Efek Antiproloferatif Estrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz

& Pav.) Terhadap Kultur Sel Kanker Payudara T47D Secara In vitro. Hasil

penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirih merah mampu

menghambat sel kanker payudara T47D (Wicaksono, dkk., 2009).

Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian

mengenai uji antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih merah pada

Chorioallantoic Membrane (CAM) telur ayam berembrio yang diinduksi bFGF.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis. Dapat memperkaya ilmu pengetahuan mengenai

adanya aktivitas anti angiogenesis pada daun sirih merah.

b. Manfaat metodologi. Dapat memberikan pengetahuan mengenai tata

cara pengujian aktivitas antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih merah

mengunakan metode chorioallantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio

yang diinduksi bFGF.

c. Manfaat praktis. Dapat memberikan informasi mengenai adanya

aktivitas antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz

& Pav.) sebagai pengobatan kanker.


8

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak

etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis.

2. Tujuan Khusus.

a. Untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak etanol

daunsirih merah.

b. Untuk mengetahui hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak

etanol daun sirih merah dengan aktivitas antiangiogenesis.


9

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Obat Tradisional

Obat tradisional Indonesia merupakan warisan budaya bangsa sehingga

perlu digali, diteliti dan dikembangkan agar dapat digunakan lebih luas oleh

masyarakat. Definisi obat tradisional ialah bahan atau ramuan bahan yang berasal

dari tumbuhan, hewan, mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan

tersebut, yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan

berdasarkan pengalaman (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,

2000).

Keamanan dan mutu obat tradisional tergantung dari bahan baku,

prosedur dan pelaksanaan pembuatan, peralatan yang digunakan, pengemasan

termasuk bahan serta personalia yang terlibat dalam pembuatan obat tradisional

(Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1994). Bahan-bahan ramuan

obat tradisional seperti bahan tumbuh-tumbuhan, bahan hewan, sediaan sarian

atau galenik yang memiliki fungsi, pengaruh serta khasiat sebagai obat, dalam

pengertian umum kefarmasian bahan yang digunakan sebagai simplisia. Simplisia

adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang belum mengalami

pegolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain berupa bahan yang

dikeringkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1999).

WHO merekomendasikan penggunaan obat tradisional termasuk herbal

dalam pemeliharaan kesehatan masyarakat, pencegahan dan pengobatan penyakit,

terutama untuk penyakit kronis, penyakit degeneratif dan kanker. WHO juga

9


10

mendukung upaya–upaya dalam peningkatan keamanan dan khasiat dari obat

tradisional (WHO,2003).

B. Sirih Merah

1. Taksonomi tumbuhan

Divisi : Spermatophyta

Anak Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Bangsa : Piperales

Suku : Piperaceae

Marga : Piper

Jenis : Piper crocatum Ruiz & Pav

(Backer and Van Der Brink, 1965).

2. Deskripsi tanaman

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna hijau

keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan

bagian atas meruncing, bertepi rata, permukaannya mengkilap dan tidak berbulu.

Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak

putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya

berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas

dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar. Sirih merah bisa

tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar


11

matahari, Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari secara terus

menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik

(Pramono 2002; Sudewo,2005).

3. Kandungan kimia

Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya adalah penelitian

pemeriksaan skrining fitokimia daun sirih merah dan hasilnya menunjukkan

bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, senyawa polifenolat,

tanin, dan minyak atsiri sebagai hasil metabolit sekunder yang tidak penting bagi

kelangsungan hidup tanaman, namun memiliki fungsi untuk berkompetisi dengan

tanaman lainnya. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Subarnas,

Susilawati, Mulyasari, (2008) sirih merah mengandung flavonoid, saponin,

alkaloid, polifenol, tanin, kuinon, steroid dan mono-seskuiterpen. Senyawa

flavonoid dan polifenolat bersifat antioksidan, antidiabetik, antikanker, antiseptik

dan antiinflamasi. Senyawa alkaloid mempunyai sifat antineoplastik yang juga

ampuh menghambat pertumbuhan sel-sel kanker (Sudewo,2005).

Kandungan kimia lainnya yang terdapat pada daun sirih merah adalah

hidroksikavikol, kavikol, kavibetol, karvakrol, eugenol, p-simen, sineol,

kariofilen, kadimen, estragol, terpenena dan fenil propanoid (Anonim, 2007).

Karena banyaknya kandungan senyawa kimia bermanfaat inilah daun sirih merah

memiliki manfaat yang sangat luas sebagi bahan obat. Karvakrol bersifat

desinfektan, antijamur, sehingga bisa digunakan untuk obat antiseptik pada bau

mulut dan keputihan, eugenol dapat digunakan untuk mengurang rasa sakit,


12

sedangkan tanin dapat digunakan untuk mengobati sakit perut (Anonim,2007).

Menurut Robinson (1995) flavonoid berfungsi sebagai antioksidan dan antibakteri

dengan cara membentuk senyawa kompleks dengan protein ekstraseluler, protein

terlarut, serta mengganggu integritas membran sel bakteri.

Alkaloid merupakan komponen organik yang mengandung nitrogen yang

biasanya bersifat basa serta mempunyai aktivitas biologi (Pringgoutomo, 2007;

Sudewo,2005). Beberapa alkaloid diketahui memiliki aktivitas antikanker melalui

interaksi dengan RNA polimerase dan DNA topoisomerase. Senyawa alkaloid

seperti vinkristina dan vinblastina dapat menghambat RNA polimerase,

vinblastina berperan dalam penghambatan pembelahan sel, yaitu pada tahap

metafase (Grotewold,2006). Alkaloid juga memiliki kemampuan sebagai

antibakteri dengan cara mengganggu komponen penyusun peptidoglikan pada sel

bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan

menyebabkan kematian sel tersebut (Juliantina, dkk., 2009).

Flavonoid merupakan kandungan khas dari tumbuhan hijau, hampir

selalu ada di seluruh bagian tumbuhan termasuk daun karena diketahui sebagai

pigmen yang bertanggung jawab pada warna daun, akar, tepung sari, kulit kayu,

bunga, nektar, buah dan biji. Flavonoid terdapat pada seluruh dunia tumbuhan dan

saat ini flavonoid sedang banyak diperbincangkan karena peran aktifnya dalam

efek pencegahan konsumsi makanan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan terhadap

penyakit-penyakit kronik, termasuk tumor solid (Fotsis, dkk., 1997;

Markham,1988).


13

Beberapa penelitian tentang flavonoid merekomendasikan kemungkinan

aksinya sebagai senyawa kimia yang mampu menghambat kanker dan diantaranya

melaui penghambatan angiogenesis. Beberapa diantaranya adalah resveratrol dan

kuersetin. Keduanya mampu mengahambat aspek-aspek angiogenesis proliferasi,

migrasi sel endotelial dan pembentukan pipa pembuluh darah (Igura, Otha, Kroda

dan Kaji, 2001).

Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol umumnya

terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon (Harborne, 1987). Flavonoid telah

menunjukkan peran umumnya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik,

antivirus, antihistamin, antihipertensi, dan aktivitas vasodilatator. Potensi

antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan oksidatif pada

pengendalian sejumlah penyakit. Beberapa senyawa flavonoid dapat menghambat

monoamin oksidase (MAO), protein kinase, DNA polimerase, hipoksigenase serta

terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen kemopreventif kanker

(Robinson,1995; Grotewold,2006).

Tanin merupakan salah satu senyawa metabolit sekunder yang terdapat

pada tanaman dan disintesis oleh tanaman. Tanin tergolong senyawa polifenol

dengan karakteristiknya yang dapat membentuk senyawa kompleks dengan

makromolekul lainnya. Tanin dibagi menjadi dua kelompok yaitu tanin yang

mudah terhidrolisis dan tanin terkondensasi. Tanin yang mudah terhidrolisis

merupakan polimer gallic atau ellagic acid yang berikatan ester dengan sebuah

molekul gula, sedangkan tanin terkondensasi merupakan polimer senyawa


14

flavonoid dengan ikatan karbon-karbon (Westendarp, 2006; Sofyan, Ahmad,

danJayanegara, 2008).

Minyak atsiri adalah cairan jernih berbau seperti tanaman asalnya.

Biasanya terdapat dalam kelenjar minyak, pembuluh-pembuluh sekresi atau

rambut kelenjar dari kelenjar aromatis. Kegunaan minyak atsri bagi tanaman

sendiri adalah menolak kehadiran binatang. Kebanyakan minyak atsiri bersifat

anti bakteri dan anti jamur yang kuat. Minyak atsiri berperan sebagai antibakteri

dengan cara mengganggu proses terbentuknya membran atau dinding sel sehingga

tidak terbentuk atau terbentuk tidak sempurna (Juliantina, dkk., 2009).

4. Khasiat dan kegunaan

Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah

satu tanaman obat yang daunnya telah lama dikenal mempunyai khasiat obat

untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit atau tanaman multifungsi. Di

daerah Jawa khususnya Yogyakarta, secara turun temurun dapat digunakan untuk

menyembuhkan berbagai macam penyakit seperti diabetes melitus, asam urat,

hepatitis, batu ginjal, hipertensi, radang liver, radang prostat, radang mata, maag,

kelelahan, kanker, nyeri sendi, menurunkan kadar kolesterol, mencegah stroke dan

memperhalus kulit.

Daun sirih merah dapat diremas-remas dan kemudian dioleskan pada

perut, dapat mengurangi sakit panas dan sakit empedu. Pada penyakit empedu

cairan hasil perasan juga diminum. Cairan ini mungkin juga dapat menyembuhkan

penyakit dysiria (sukar buang air kecil) dan penyakit gonorrhoe (kencing nanah)


15

(Heyne,1987). Secara empiris sirih merah telah digunakan untuk mengobati

berbagai macam penyakit berbahaya, seperti kanker. Di daerah kalimantan barat

sirih merah telah lama digunakan dalam pengobatan kanker (Wicaksono, dkk.,

2009).

C. Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Senyawa aktif

yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan

minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, dan lain-lain. Dengan diketahuinya senyawa

aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara

ekstraksi yang tepat (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 2000).

Cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif yang

berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa lainnya

dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa berkhasiat

yang diinginkan (Anonim, 2000). Pelarut etanol walaupun memiliki harga yang

cukup mahal, tetapi dapat dipertimbangkan sebagai penyari karena lebih efektif

(kapang, khamir dan kuman lebih sulit tumbuh dalam etanol di atas 20 %), tidak

beracun, netral, absorbsinya baik, dapat bercampur air dengan segala

perbandingan. Dan memerlukan waktu yang cukup singkat untuk pengeringan

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).

Maserasi adalah proses penyarian simplisia menggunakan pelarut dengan

perendaman dan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur


16

ruangan (kamar). Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam

rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut, karena adanya perbedaan

kosentrasi larutan zat aktif didalam sel dan diluar sel maka larutan terpekat

didesak keluar. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, metanol,

etanol-air atau pelarut lainnya. Remaserasi berarti dilakukan penambahan pelarut

setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. Remaserasi

berarti dilakukan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat

pertama, dan seterusnya (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,

2000).

Selain maserasi, proses ekstraksi lainnya dapat dilakukan dengan cara

perlokasi, refluks, sokletasi, digesti, infus, dekok, destilasi uap.

D. Kanker

Kanker adalah suatu penyakit sel dengan ciri gangguan atau kegagalan

mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostatis lainnya pada organisme

multiseluler. Sel kanker mempunyai ciri khusus yang membedakan dengan sel

normal (Hanahan dan Weinberg,2000). Kanker ditandai dengan poliferasi sel yang

tidak terkontrol dengan mengarah pada invasi jaringan di sekitarnya serta

menyebar ke bagian lain dalam tubuh (metastasis). Mutagen yang menyebabkan

kanker adalah karsinogen.


17

a. Karsinogenesis

Karsinogenesis adalah suatu proses terjadinya kanker melalui mekanisme

multitahap yang menunjukkan perubahan genetik dan menyebabkan transformasi

progresif sel normal menjadi sel maligant (ganas) (Hanahan dan Weinberg, 2000).

Perubahan basa DNA (mutasi) merupakan perubahan seluler mendasar yang

menyebabkan terjadinya kanker. Kanker tidak berasal dari mutasi tunggal, namun

dibutuhkan akumulasi dari beberapa mutasi (3-20 mutasi) dalam karsinogenesis

(King, 2000; Lodish, dkk., 2000).

Karsinogenesis merupakan perubahan sel sehinggga sel dapat

melepaskan diri dari mekanisme pengaturan tubuh normal. Perkembangan sel-sel

kanker diawali oleh adanya klon sel yang telah mengalami perubahan genetik

pada gen-gen pengatur pertumbuhan. Sel-sel kanker pada stadium lanjut

umumnya telah mengalami perubahan genetik dalam jumlah yang relatif banyak

yang memacu sel-sel tersebut menjadi kehilangan kendali dalam

perkembangbiakannya (Dean, 1998).

Proses perkembangan kanker (karsinogenesis) terbagi menjadi 4 tahap

utama yaitu tahap inisiasi, tahap promosi, tahap progresif dan metastatis

(Schneider, 2000).

Inisiasi merupakan tahap awal dan cepat, pada tahap ini terjadi perubahan

genetik yang menetap akibat rangsangan bahan atau agen inisiator yang

menimbulkan proses inisiasi (Dalimartha,1999). Agen inisiator berupa suatu

senyawa kimia elektrofil atau senyawa yang dimetabolisme menjadi elektrofil,

kemudian setelah teraktivasi akan mengikat DNA menjadi bentuk yang tetap,


18

selanjutnya sel yang terinisiasi akan diaktivasi oleh tumor promoting agent dan

menyebabkan pertumbuhan tumor (Levi,2000).

Tahap promosi tidak melibatkan perubahan struktural dalam genom

secara langsung, tetapi perubahan ekspresi gen dari sel yang terinisiasi. Perubahan

ini diduga terjadi dari interaksi perubahan genetik pada stadium inisiasi dan faktor

lingkungan yang disebut promoting agents yang berfungsi untuk pertumbuhan

stadium promosi dan menghantarkan tumbuh lebih lanjut menjadi stadium

progresi (King, 2000).

Stadium progresi lebih sering terjadi dari sel promosi, ditandai

munculnya neoplasma ganas diikuti perubahan genetik nyata yang melibatkan

perubahan struktur dalam inti sel/pada fase ini juga akan terjadi aktivasi onkogen

dan kehilangan fungsi dari enzim topoisomerase sehingga akan menyebabkan

karsinoma dan metastasis (Meiyanto,1999).

Tahap selanjutnya adalah metastasis meliputi beberapa langkah,

termasuk penyebaran sel kanker dari tumor primer, memasuki sistem sirkulasi

atau sistem lymphatik dan pencapaian pada permukaan jaringan yang baru dan

berkembang di situ. Dengan cara ini sel kanker berpotensi untuk dibawa kesemua

tempat dalam tubuh dan berkembang dimanapun diseluruh tubuh

(Schneider,2000).

Hubungan angiogenesis dengan metastasis disebutkan sebagai salah satu

cara penyebaran tumor secara hematogen dan limfogen. Sel-sel tumor

mengadakan penetrasi dengan cepat dan ikut aliran darah ke seluruh tubuh dan

menyebar ke organ lain (Folkman,1976). Lebih lanjut dilaporkan bahwa


19

metastasis tumor sangat tergantung pada angiogenesis yang dikaitkan dengan

urutan penyebarannya, yaitu sel yang akan menjadi anak sebar tidak dapat keluar

dari tumor primer, sebelum tumor primer dialiri pembuluh darah. Sesudah

mencapai organ yang dituju, sel anak sebar harus mengalami angiogenesis agar

dapat tumbuh mencapai ukuran yang secara klinis dapat dideteksi (

Folkman,1996).

b. Angiogenesis

Konsep utama dari perkembangan tumor adalah ketergantungannya pada

angiogenesis. Angiogenesis atau neovaskularisasi merupakan pertumbuhan

pembuluh-pembuluh darah baru pada jaringan tubuh. Pada keadaan fisiologi

normal seperti pada penyembuhan luka, perkembangan embrio, reproduksi dan

menstruasi, proses angiogenesis ini sangat bermanfaat. Pada pertumbuhan

penyakit salah satunya penyakit kanker, proses ini juga sangat penting karena

angiogenesis memungkinkan sel mendapatkan suplai nutrisi dan oksigen sehinga

dapat terus bertahan hidup (Papetti dan Herman, 2002).

Salah satu strategi penghambatan perkembangan kanker adalah dengan

menghambat proses angiogenesis. Sel kanker tumbuh dan berkembang dengan

mengambil nutrisi dan oksigen dari inang (host) dengan cara membentuk

pembuluh darah baru (angiogenesis). Penghambatan proses angiogenesis dari

kanker menyebabkan sel kanker mengalami penghambatan pertumbuhan,

kelaparan, dan akhirnya mati (Hanahan dan Weinberg, 2000).


20

Angiogenesis juga berkembang menjadi sesuatu yang bersifat patologis

dan berhubungan dengan kanker, inflamasi, penyakit kulit dan penyakit mata.

Kondisi patologi angiogenesis ini dikarakterisasi oleh pembentukan pembuluh

darah baru dan penghancuran sel normal yang ada di sekitarnya. Terapi

menggunakan inhibitor angiogenesis merupakan suatu pendekatan yang relatif

baru untuk terapi anti kanker. Hal ini karena sel-sel tersebut umumnya stabil

sehingga memungkinkan mereka kurang berkembang menjadi obat yang resisten

secara cepat (Kerbel dan Folkman, 2002).

Secara umum angiogenesis dikontrol secara seimbang oleh faktor

proangiogenetik dan antiangiogenetik (Jain dan Carmeliet, 2001). Pada keadaan

sel yang normal, faktor-faktor ini berjalan seimbang, sedangkan pada sel yang

abnormal, faktor pemicu angiogenesis melampaui jumlah yang seharusnya.

Angiogenesis diketahui dapat diaktivasi oleh bermacam-macam pemicu fisiologis

seperti gangguan keseimbangan oksigen dan diregulasi oleh faktor hormonal.

Faktor-faktor pertumbuhan utama yang mengarahkan terjadinya angiogenesis

adalah Vascular Endhotelial Growth Factor (VEGF) dan basic Fibroblast Growth

Factor (bFGF). Regulator positif lainnya adalah Angiopoetin-1, Angiotropin,

Angiogenin, Epidermal Growth Factor, Granulocyte Colony-Stimulating Factor,

Interleukin-1 (IL-1) IL-6, IL-8, Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Tumor

Necrosis Factor- α (TNF-α) (Gupta dan Qin, 2003).

Tubuh yang sehat mengatur secara sempurna keseimbangan dari

modulator-modulator angiogenesis. Secara umum angiogenesis ‘dimatikan’,

dengan lebih banyak memproduksi inhibitor daripada stimulator angiogenesis


21

(Anonim, 2009). Stimulator angiogenesis dapat dibagi dalam 7 kategori :

1).Growth factors, 2). Proteases, 3). trace element, 4). oncogenes, 5).cytokines,

6). signal transduction molecules dan7). endogenous inducers (Brem,1999).

Faktor pertumbuhan mengontrol pembelahan sel yang dibutuhkan secara

cepat baik pada perkembangan CAM maupun pertumbuhan tumor yang

berhubungan dengan angiogenesis. Pada proses angiogenesis tersebut, faktor

angiogenesis akan merangsang ekspresi COX-2. Cyclooxygenase-2 (COX-2) akan

mengkatalisis perubahan asam arakhidonat menjadi prostaglandin (PG),

selanjutnya PG akan merangsang proliferasi sel endotelial (Leahy, Koki dan

Masferrer, 2003).

Proses angiogenesis terjadi dalam tiga fase. Fase yang pertama yaitu

produksi faktor perumbuhan oleh kanker yang akan berikatan dengan reseptornya

di sel endothelial pertumbuhan darah lama. Inisiasi ini menstimulasi terjadinya

destabilisasi dari pembuluh darah lama oleh angiopoetin. Fase kedua yaitu fase

proliferasi sel endothelial lokal yang kemudian bermigarasi dari faktor-faktor

pertumbuhan yaitu kanker dimana pada fase ini membutuhkan perubahan model

yang luas dari matriks ekstra seluler (MES) melalui digesti protease terhadap

glikoprotein. Apabila MES kontak dengan sel endothelial (yang telah menjadi

aktif) maka akan mengahasilkan khemotaksis, yang kemudian mengarahkan sel

endhotelial menuju kanker, sehingga terbentuk kapiler-kapiler baru di dalam dan

di sekitar kanker. Fase yang terakhir ialah maturasi dan differensiasi dari sel-sel

endothelial serta pembentukan basalis dan pengarahan sel-sel pendukung (King,

2000; Ng dan D’Amore, 2001).


22

Inhibitor angiogenesis dibagi menjadi dua kelas yaitu inhibitor secara

langsung dan tidak langsung. Inhibitor agiogenesis secara langsung dapat

mencegah sel-sel vaskular endotelial berpoliferasi dan bermigrasi atau

menghindar dari kematian sel pada respon spektrum dari protein proangigenik.

Contoh protein proangiogenik yaitu VEGF, bFGF, IL-8, plateled-derived growth

factor (PDGF) dan PD-EGF. Inhibitor angiogenesis langsung tidak begitu

menimbulkan resistensi karena targetnya adalah sel endotelial yang stabil secara

genetik. Contoh inhibitor angiogenesis secara langsung adalah vitaxin, angiostatin

dan yang lainnya. Inhibitor angiogenesis yang tidak langsung, umunya dapat

mencegah ekspresi atau menghambat aktivitas dari protein tumor yang

mengaktifkan angiogenesis, atau juga menghambat ekspresi reseptor protein

tumor pada sel endotelial seperti bFGF, VEGF dan TGF. Protein-protein yang

dihasilkan oleh sel tumor merupakan produk dari ongkogen yang mengarahkan

pada angiogenesis (Kerbel dan Folkman, 2002).

c. basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)

Basic fibroblast grow factor (bFGF) disebut juga FGF-2 adalah suatu

polipeptida yang menginduksi proliferasi, migrasi dan produksi protease pada

kultur sel endothelial sel dan neovaskularisasi in vivo. bFGF mampu berinteraksi

dengan sel endothelial melalui reseptor FGF tirosin kinase dan reseptor heparan

sulphate proteoglycan (HSPGs) di permukaan sel dan di matriks ekstraseluler.

Jadi, bFGF berkaitan dengan matriks ekstraseluler endothelial in vitro dan in vivo

(Ribatti, dkk., 1997).


23

bFGF produksinya sedikit pada sel normal namun meningkat pada

keadaan kanker dan pada sel normal yang beroksigen rendah. Faktor pertumbuhan

VEGF dan FGF mempunyai efek sinergis pada sel endothelial dan dapat disimpan

sebagai kompleks inaktif dengan proteoglikan matriks ekstraseluler seperti

heparan dan bentuk aktifnya akan dilepaskan oleh digesti matriks ekstraseluler.

Angiogenesis tidak hanya berkaitan dengan proliferasi tapi juga proteolisis dan

kemotaksis, sehingga FGF merupakan suatu faktor angiogenik yang poten,

mampu menstimulasi proliferasi, sekresi protease, dan kemotaksis sel endothelial

(King,2000).

Fibroblast Growth Factor (FGF) merupakan faktor angiogenik yang juga

dapat membentuk kompleks dengan heparin. Kompleks heparin-FGF membentuk

suatu struktur yang tahan terhadap panas dan protease. Ikatan dengan heparin juga

menyebabkan terjadinya bentuk dimer dan oligomer dari FGF, yang akan

meningkatkan efisiensi aktivasi sel menyusul terjadinya ikatan antara FGF dengan

reseptornya. b-FGF terdapat pada membran basal, matriks ekstraseluler sub

endotel pembuluh darah. b-FGF berperan dalam pembentukan tumor, memediasi

proses angiogenesis, dan juga penyembuhan luka (King, 2000).

Protein Vascular Endothelial Growth Factor Recetor (VEGFR) dan

Cyclooxygenase 2 (COX-2)adalah protein yang berperan penting dalam proses

angiogenesis. COX-2 terbukti diekspresikan berlebihan pada sel kanker. Enzim ini

memacu pembentukan prostaglandin yang akan menstimulasi sintesis Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) sehingga dapat berikatan dengan reseptornya

yaitu Vascular endothelial Growth factor Receptor (VEGFR) untuk menginduksi


24

proses angiogenesis (OtaBamba, Kato, Kawamoto, Yoshida dan Fujiwara, 2003).

Oleh karena itu, penghambatan terhadap kedua protein ini dapat menghambat

pembentukan pembuluh darah baru pada sel kanker.

E. Chorioallantoic Membrane

Alantois merupakan salah satu membran ekstra embrionik. Membran ini

mempunyai fungsi yang cukup penting karena dapat membantu keperluan selama

perkembangan janin embrional tetapi tidak tergabung dalam tubuh hewan dewasa

karena akan mati pada saat penetasan tiba. Alantois terbentuk dari lapisan

endoderma dan mesoderma splanchnis ekstra embrional. Dalam

perkembangannya akan bergabung dengan korion membentuk membran korio

alantois (Patten danCarlson, 1978).

Membran korio alantois akan muncul pada hari ke-4 atau hari ke-5 yang

diikuti dengan pertumbuhan pembuluh darah yang meluas diatas permukaan

kuningtelur dan segera menutupi seluruh daerah tersebut (Kninghton, Ausprunk,

Tapper, dan Folkman, 1977). Membran yang sangat kaya dengan pembuluh darah

ini berhubungan dengan sirkulasi embrionik melalui arteri dan vena alantois.

Karena adanya sirkulasi ini, maka pertukaran oksigen dan karbon dioksida yang

dibutuhkan oleh embrio akan berlangsung. Selain berfungsi sebagai sistem

sirkulasi, tempat pernapasan dan bertanggung jawab terhadap perkembangan

embrio, bagian ini juga berfungsi sebagai tempat pembuangan dan pencernaan

(Patten dan Carlson, 1978).


25

Chorioallantoic Membrane (CAM) merupakan metode yang sangat

sederhana untuk mempelajari angiogenesis in vivo. Uji ini banyak digunakan

untuk studi angiogenesis dan invasi tumor dari kanker kolorektal, prostat, otak

dan rahim (Lokman, dkk., 2012).

Penelitian tentang angiogenesis menggunakan metode CAM memiliki

beberapa kelebihan, yaitu pada membran ini terdapat banyak pembuluh darah,

sehingga pengamatan terhadap angiogenesis mudah dilakukan metodenya

sederhana dan tidak mahal. Namun demikian terdapat pula kelemahan pada

metode ini seperti keberadaan pembuluh darah asal yang dapat mengganggu

pengamatan (Ribatti, dkk., 1997).

F. Landasan Teori

Salah satu cara penghambatan perkembangan kanker adalah dengan

menghambat proses angiogenesis. Sel kanker tumbuh dan berkembang dengan

mengambil nutrisi dan oksigen dari inang (host) dengan cara membentuk

pembuluh darah baru. Penghambatan proses angiogenesis dari kanker inilah yang

menyebabkan sel kanker mengalami penghambatan pertumbuhan, kelaparan dan

akhirnya mati (angiogenesis) (Hanahan dan Weinberg, 2000).

Berdasarkan penelitian Neritika (2008), ekstrak etanol daun sirih merah

terbukti memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel kanker payudara T47D. Pada

Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah Terhadap Kultur Sel Raji yang

dilakukan oleh Frandita (2009), menunjukkan bahwa fraksi etanol daun sirih

merah kemungkinan memiliki efek sitotoksisitas terhadap kultur sel raji. Hal


26

inilah yang mendasari pemilihan pelarut etanol pada penelitian ini. Etanol mampu

menarik senyawa aktif yang bersifat polar, dan diharapkan mampu menarik

senyawa flavonoid dari daun sirih merah karena seperti yang telah diketahui,

senyawa flavonoid mampu menghambat kanker dan diantaranya melaui

penghambatan angiogenesis.

Pada penelitian ini, pelarut etanol digunakan karena etanol dapat

dipertimbangkan sebagai penyari dimana etanol memiliki sifat yang lebih efektif

(kapang, khamir, dan kuman lebih sulit tumbuh dalam etanol di atas 20%), tidak

beracun, absorpsinya baik, dapat bercampur air pada segala perbandingan, dan

dibutuhkan waktu yang singkat untuk pengeringan. Etanol dapat melarutkan

alkaloid, minyak atsiri, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid,

steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin. Dengan demikian zat

pengganggu yang larut hanya terbatas (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan, 1986).

Metode CAM dipilih karena pada metode ini terdapat banyak pembuluh

darah, sehingga pengamatan terhadap angiogenesis mudah dilakukan (Patten dan

Carlson, 1978). Daun sirih merah telah diketahui memiliki berbagai khasiat yang

disebabkan oleh kandungan senyawa aktif antara lain flavonoid, alkaloid, tanin

dan minyak atsiri. Beberapadari flavonoid terlihat efektif sebagai antikanker dan

agen kemopreventif kanker, sedangkan beberapa senyawa alkaloid diketahui

memiliki aktivitas antikanker melalui interaksi dengan RNA polimerase dan DNA

topoisomerase (Sudewo,2005).


27

G. Hipotesis

1. Ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis pada

chorioalantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio yang diinduksi bFGF.

2. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun sirih merah pada CAM telur ayam

berembrio yang diinduksi bFGF maka aktivitas antiangiogenesisnya semakin

besar.


28

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan

rancangan lengkap pola searah. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Steril Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Gadjah Mada.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variabel bebas berupa konsentrasi ekstrak etanol daun

sirih merah.

b. Variabel tergantung. Variabel tergantung berupa banyaknya pembuluh

darah baru.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali

yaitutempat tumbuh tanaman, cara panen, cara pengeringan dan pembuatan

simplisia, serta jumlah (gram) daun segar yang digunakan.

b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali

yaitu cuaca, musim, dan kelembaban ruangan.

28


29

3. Definisi Operasional

a. Pembuluh darah baru adalah pembuluh darah yang tipis disekitar

paper disc.

b. Antiangiogenesis adalah pengahambatan pertumbuhan pembuluh

darah baru.

C. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan antara lain : daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav.), Chorioallantoic Membrane (CAM) yang berasal dari

telur ayam Standard Patogen Free (SPF) dalam kondisi terinkubasi, larutan

bFGF, Phosphate Buffer Saline (PBS), Dimethyl Sulfoxide (DMSO), aquadest

steril, aquabidest steril, etanol 70%, larutan yodium, kertas payung, kapas, cotton

buds, paper disc berisi ampisilin, kertas Whatman filter.

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : oven, ayakan,

bejana maserasi, rotary evaporator, shaker, corong Buchner, chamber, labu alas

bulat, Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, mikropipet, inkubator, lampu spiritus,

teropong telur, mini drill, gunting bengkok, gunting bedah, pinset, scalpel,

kamera, kaca pembesar dan alat-alat gelas.


30

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan bahan yang

digunakan benar-benar ekstrak daun sirih merah dengan cara mencocokkan

tanaman dengan kunci determinasi (Backer dan Brink, 1965).

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji penelitian ini adalah simplisia daun sirih merahyang diperoleh

dari Sleman, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada bulan November 2013.

3. Preparasi ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.).

Daun sirih merah yang telah dikumpulkan, dibersihkan di bawah air

mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada daun tersebut.

Setelah itu dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 500C. Tujuan

pengeringan yaitu untuk mengurangi kandungan air dan mencegah pertumbuhan

mikroba yang mungkin terjadi. Simplisia yang kering kemudian digiling dengan

blender hingga menjadi serbuk halus, kemudian di ayak dengan ayakan. Serbuk

simplisa daun sirih merah ditimbang sebanyak 100 gram dan dituang kedalam

bejana maserasi. Kemudian ditambah etanol 200 mL dan dicampur homogen.

Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama 2 hari. Kemudian disaring

dengan kertas Whatman filter dengan corong Buchner. Lalu filtrat diuapkan

pelarutnya dengan suhu 500C hingga diperoleh ekstrak kental daun sirih merah.


31

4. Orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih merah

Orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan dengan

menggunakan pelarut Dimethyl Sulfoxide (DMSO). Pelarut ini umum digunakan

sebagai pelarut untuk uji antiangiogenesis menggunakan metode CAM, dapat

disterilkan dan toksisitasnya rendah. DMSO ditambahkan pada beberapa mg

ekstrak sampai ekstrak larut, kemudian diencerkan dengan aquabidest steril.

Konsentrasi DMSO yang digunakan sekecil mungkin <2% (konsentrasi sitotoksik

DMSO 2%). Pada penelitian ini konsentrasi yang digunakan adalah 0,2 %

(Lampiran 6).

5. Sterilisasi alat

Alat-alat yang digunakan untuk uji antiangiogenesis dicuci bersih dan

dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilkan dengan

pemanasan basah dalam autoklaf, suhu 121oC selama 15-30 menit.

6. Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)

a. Preparasi bFGF Sebagai Induktor Angiogenesis. bFGF yang

digunakan sebanyak 25 ng/µl menggunakan larutan Phosphate Buffer Saline(PBS)

pH 7,4 kemudian diencerkan sehingga didapat kadar 1 ng/µl. Preparasi bFGF ini

dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF). Kadar bFGF yang

diberikan untuk setiap telur perlakuan terinduksi adalah 10 ng.


32

b. Preparasi Sediaan Larutan Uji. Ekstrak etanol daun sirih merah

dilarutkan dengan DMSO – aquabidest steril kemudian dibuat seri konsentrasi

(0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml dan 0,2 mg/ml). Konsentrasi pelarut (DMSO – aquabidest

steril) disesuaikan dengan hasil orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih

merah. Preparasi dilakukan secara aseptis dalam Laminar Air Flow.

7. Uji antiangiogenesis

Satu atau beberapa hari sebelum diberi perlakuan telur diinkubasi dalam

inkubator laboratorium pada suhu 37oC agar dapat menyesuaikan diri dengan

lingkungan barunya. Telur ayam usia 9 hari diberikan perlakuan. Tahap awal

perlakuan yaitu dengan membersihkan telur dari kotoran yang menempel di

cangkang telur menggunakan alkohol 70%. Telur diberi tanda pada kerabang telur

yang meliputi batas ruang udara, lokasi embrio dan daerah yang akan dibuat segi

empat (jendela) berukuran 1x1 cm di atas embrio menggunakan pensil. Lokasi

embrio diketahui melalui candling mengunakan cahaya lampu pada telur.

Kerabang telur pada bagian kutub yang mengandung ruang udara dan kerabang di

atas embrio dibersihkan dengan larutan yodium. Selanjutnya pada ruang udara

tersebut dibuat lubang kecil dan pada daerah yang dibuat segi empat (jendela)

dibuat luka dengan menggunakan mini drill dan scalpel.

Udara dari ruang udara diaspirasi dengan bola karet penghisap sampai

berpindah dari kutub kerabang bagian atas telur. Perlakuan ini dilakukan dengan

posisi telur horizontal, di ruang gelap, dan melalui candling, sehingga ruang udara

buatan yang terbentuk di atas embrio dapat terlihat.


33

Kerabang telur di atas embrio dipotong dengan mini drill untuk

membuat lubang segiempat dengan luas 1x1 cm. Melalui lubang ini bFGF dan

ekstrak uji diimplantasi ke dalam paper disc. Subyek uji berupa telur dibagi secara

acak dalam 6 kelompok (masing-masing perlakuan terdiri dari 3 telur), sebagai

berikut :

a. Kelompok I adalah telur dengan implantasi paper disc.

b. Kelompok II adalah kelompok dengan implantasi paper disc + pelarut

(DMSO – aquabidest steril).

c. Kelompok III kelompok kontrol bFGF + pelarut adalah kelompok

telur dengan implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO –

aquabidest steril) sebanyak 10µl.

d. Kelompok IV, V dan VI merupakan telur yang digunakan untuk

melihat efek penghambatan ekstrak etanol daun sirih merah dengan 3 variasi

konsentrasi (0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml dan 0,2 mg/ml). Kelompok ini adalah

kelompok telur implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + larutan ekstrak

etanol daun sirih merah dengan masing-masing konsentrasi sebanyak 10µl.

Setelah diberi perlakuan implantasi paper disc sesuai kelompok

perlakuan, lubang kecil pada daerah kutub dan lubang segiempat ditutup dengan

paraffin solidum yang dicairkan. Kemudian telur diinkubasi pada suhu 37oC

dengan kelembaban relatif 60% selama 3 hari atau 72 jam dengan inkubator,

kemudian telur dimasukkan ke dalam kulkas selama 24 jam. Telur dibuka (umur

12 hari) pada dengan cara menggunting cangkang telur menjadi dua bagian

dimulai dari cangkang yang dekat dengan rongga udara menggunakan gunting


34

bedah secara hati-hati agar tidak merusak membran korio alantois telur, setelah itu

membran korio allantois dibersihkan secara hati-hati dengan aquabidest steril.

Membran korio allantois yang melekat pada bagian cangkang yang terdapat paper

disc diamati secara makroskopik. Pengamatan makroskopis dilakukan secara

langsung dan tidak langsung. Pengamatan makroskopik secara langsung

dilakukan dengan bantuan kaca pembesar dan dikuantifikasi dengan menghitung

jumlah pembuluh darah baru yang terbentuk pada paper disc dan di sekitar paper

disc dan secara tidak langsung dengan foto kamera hasil CAM. Pembuluh darah

baru yang dihitung yaitu pembuluh darah yang tipis pada paper disc dan di sekitar

paper disc.Gambar 1. (a-g) memperlihatkan cara kerja uji angiogenesis dengan

metode CAM.

(a) (b) (c) (d)

(e) (f) (g)

Gambar 1. Memperlihatkan tahapan kerja uji CAM. (a). Telur ayam berembriodalam inkubator, (b). Prosescandling, (c). Menyedot rongga udara, (d).Membuat jendela pada telur, (e). Mengimplankan ekstrak uji dan bFGFke dalam paper disc, (f). Memasukkan paper disc, (g). Menutup jendeladengan parafin (Chrisnanto, 2009).


35

F. Analisis Data

Analisis hasil uji penghambatan angioenesis pada CAM terinduksi bFGF

dilakukan secara makroskopis dengan mengamati respon penghambatan dari

ekstrak etanol daun sirih merah pada paper disc dan disekitar paper disc yang

melekat pada CAM.

Efek penghambatan tersebut diamati secara deskriptif berdasarkan

pemberian skor dengan menghitung banyaknya jumlah pembuluh darah baru yang

terbentuk pada paper disc dan disekitar paper disc menggunakan bantuan kaca

pembesar (lup). Setiap pembuluh darah baru diberi nilai satu. Kondisi

pertumbuhan pembuluh darah dapat dilihat pada gambar (Gambar 2.), dimana

skor 0 merupakan pertumbuhan pembuluh darah yang tidak mengalami

perubahan, skor 1 merupakan keadaan dimana terjadi sedikit peningkatan

kepadatan pembuluh darah baru, dan skor 2-5 merupakan pertumbuhan pembuluh

darah yang mengalami peningkatan secara bertahap. Untuk mengurangi

subyektifitas hasil pengamatan, maka pengamatan dilakukan oleh 4 orang

sehingga hasilnya berupa rata-rata pengamatan yang dilakukan 4 orang.

Pengamatan terhadap pembuluh darah baru yang terbentuk padapaper disc dan

disekitar paper disc harus dibedakan dengan pembuluh darah utama/asal dari

CAM. Pembuluh darah utama pada CAM mempunyai ukuran yang lebih besar,

sedangkan pembuluh darah baru merupakan pembuluh darah yang lebih

halus/kecil (Ribatti, Nico, Vacca dan Presta, 2006).


36

Gambar 2. Skoring semikuantitatif respon angiogenesis secara makroskopik.Skor 0. Menggambarkan kondisi pembuluh darah yang tidakberubah, skor 1. Terjadi sedikit peningkatan kepadatanpembuluh darah baru, skor 2, 3, 4, dan 5, menunjukkan adanyapeningkatan yang terjadi secara bertahap (Ribatti, dkk.,2006).

Data berupa persentase terbentuknya pembuluh darah baru

(angiogenesis) pada CAM dengan ekstrak etanol daun sirih merah. Selanjutnya

dihitung sebagai persentase pertumbuhan relatif terhadap kontrol bFGF + pelarut

dengan menggunakan rumus:

% pertumbuhan pembuluh darah = x 100%

Dimana :

a = jumlah rata-rata pembuluh darah baru pada perlakuan ekstrak

b = jumlah pembuluh darah baru pada kontrolbFGF + pelarut


37

Data penelitian uji antiangiogenesis berupa banyaknya pembuluh darah

baru pada dan sekitar paper discdianalisis menggunakan analisis satu arah Anova

yang kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat adanya perbedaan

yang bermakna antar kelompok perlakuan.


38

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman sirih merah dilakukan untuk mengetahui dan

memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini sehingga

dapat menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan tanaman uji.

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Fakultas

Biologi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, dengan cara mencocokkan

tanaman dengan kunci determinasi (Backer dan Brink, 1965). Hasil determinasi

menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah

tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) (Lampiran 3).

B. Preparasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah

Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari

tanaman yang tumbuh di daerah Sleman, Yogyakarta. Pemanenan pada tanaman

dilakukan dalam waktu dan tempat yang sama, hal ini dilakukan untuk

meminimalkan variasi kandungan kimia yang ada. Daun sirih merah yang diambil

adalah daun sirih merah pada usia tertentu yakni tidak terlalu tua dan tidak terlalu

muda dengan harapan dapat memiliki kandungan kimia yang optimal.

Daun sirih merah yang telah terkumpul kemudian dibersihkan dengan air

mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel seperti tanah,

debu, serangga, mikroba dan benda asing lainnya karena dapat mempengaruhi

kemurnian daun sirih merah.

38


39

Setelah daun sirih merah dicuci bersih, kemudian daun ditiriskan dan

dikeringkan dengan menggunakan lemari pengering. Suhu pengeringan dan lama

pengeringan harus diperhatikan yaitu 500C untuk menghindari rusaknya

kandungan kimia yang terdapat dalam simplisia. Pengeringan ini bertujuan untuk

mengurangi kadar air yang terdapat pada simplisia. Jika masih terdapat kandungan

air yang banyak pada simplisia, ini dapat menyebabkan terjadinya pertumbuhan

mikroorganisme dan dapat dimungkinkan simplisia akan ditumbuhi kapang yang

dapat menghasilkan toksin. Selain itu, air juga merupakan media terjadinya reaksi

enzimatik. Reaksi enzimatik ini dapat menyebabkan kandungan metabolit

sekunder yang terdapat pada daun akan dipecah menjadi senyawa baru.

Pengeringan dengan menggunakan oven lebih menguntungkan dibandingkan

pengeringan dengan menggunakan sinar matahari. Keuntungan pengeringan

dengan oven antara lain suhunya dapat diatur dan waktu yang dibutuhkan untuk

pengeringan lebih cepat karena tidak tergantung oleh cuaca. Menurut Monoi

(2006) sirih merah yang dikeringkan dengan menggunakan oven memiliki kadar

air dibawah 10%. Ini dapat diartikan bahwa daun sirih merah aman disimpan

karena kadar air dibawah 10% dapat mencegah terjadinya proses enzimatik dan

kerusakan oleh mikroba sepeti kapang, khamir dan bakteri.

Daun yang telah kering kemudian diserbuk dengan tujuan untuk

memperluas area kontak antar bahan yang akan disari dengan cairan penyari

sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat tersari secara maksimal.

Setelah dilakukannya penyerbukan kemudian dilakukan pengayakan untuk


40

memisahkan partikel atau material yang didasarkan pada perbedaan ukuran. Hal

ini dilakukan agar proses ekstraksi semakin efektif dan efisien.

Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Penekanan utama

pada maserasi adalah tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dan

jaringan yang akan diekstraksi. Proses ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan

menggunakan etanol 70% sebagai larutan penyari. Etanol 70% diharapkan dapat

menyari secara optimal seluruh kandungan zat aktif serbuk daun sirih merah. Pada

penelitian sebelumnya diketahui bahwa penggunaan ekstrak etanol 70% sirih

merah dapat memberikan efek sitotoksik terhadap beberapa kultur sel kanker

(Neritika, 2008). Selain itu, etanol merupakan penyari universal yang dapat

melarutkan banyak senyawa dalam sampel. Beberapa kelebihan etanol sebagai

pelarut penyari adalah lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol

20% keatas, tidak beracun, netral, absorbansinya baik, dapat bercampur dengan

air pada segala perbandingan, dan panas yang diperlakukan untuk pemekatan

lebih selektif (Hargono, dkk., 1986).

Maserasi merupakan salah satu cara penyarian yang sangat sederhana.

Prinsip maserasi yaitu proses penyarian dan perendaman simplisia menggunakan

pelarut yang sesuai dengan beberapa kali penggijogan/pengadukan pada

temperatur ruangan (suhu kamar 250C). Perendaman menyebabkan larutan

penyari menembus dinding sel sehingga zat aktif akan terlarut. Zat aktif di dalam

sel akan terdesak ke luar sel akibat adanya perbedaan konsentrasi zat aktif. Proses

ini akan terus berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi di dalam dan di

luar sel (Hargono, dkk., 1986). Pengadukan pada proses maserasi, dilakukan


41

dengan bantuan shaker. Fungsi pengadukan adalah untuk meratakan cairan

penyari yang sudah jenuh oleh komponen terlarut, sehingga akan terjadi gradien

konsentrasi. Selain itu, penyarian juga dapat berlangsung lebih efektif akibat

meningkatnya kontak antara cairan penyari dengan sampel yang terjadi pada

proses pengadukan. Perendaman dilakukan dalam waktu 2 hari kemudian ekstrak

diuapkan agar larutan penyari menguap pada suhu 600C-650C dengan

menggunakan waterbath sehingga nantinya dapat diperoleh ekstrak kental.

Rendemen ekstrak etanol daun sirih merah kemudian dihitung, dimana bobot

ekstrak yang didapat dibagi bobot bahan yang digunakan kemudian dikalikan

100%. Hasil rendemen ekstrak etanol daun sirih merah yang diperoleh adalah

15,68%.

Keuntungan metode maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang

digunakan sederhana. Metode ini juga tidak menggunakan panas sehingga zat

aktif yang tidak tahan panas tidak mudah rusak dan dapat terekstraksi.

Kekurangannya adalah membutuhkan waktu pengerjaan yang lama tergantung

waktu perendaman dan juga membutuhkan pelarut yang cukup banyak.

C. Hasil Uji AngiogenesisEkstrak Etanol Daun Sirih Merah Pada

Chorioallantoic Membrane (CAM)

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanol daun

sirih merah mempunyai aktivitas antiangiogenesis melalui penghambatan

angiogenesis yang dilakukan dengan mengunakan metode CAM yang terinduksi

bFGF dan untuk mengetahui hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak


42

etanol daun sirih merah dengan aktivitas antiangiogenesisnya. Membran korio

alantois telur ayam berembrio merupakan salah satu media yang paling umum

digunakan untuk mempelajari respon angiogenesis karena memiliki banyak

kelebihan dibandingkan dengan media yang lain.

Kelebihan menggunakan media CAM antara lain adalah telur ayam

berembrio mudah didapatkan, relatif murah, mudah dikerjakan di laboratorium

dan lebih praktis (Ribatti, dkk., 1997). Kelebihan lainnya adalah dalam telur ayam

berembrio terdapat lingkungan tertutup dan terlindungi oleh cangkang telur,

sehingga aman, mudah dipegang dan mudah dipelihara selama masa inkubasi di

laboratorium. Lingkungan tertutup pada telur menjadi lebih konstan karena

adanya cairan ekstra embrionik dan beberapa membran pembungkus dalam telur

ayam berembrio (Evans, 1991). Selain kelebihan yang telah disebutkan tadi,

penelitian menggunakan media CAM juga mempunyai beberapa kelemahan yaitu

keberadaan pembuluh darah asal dan reaksi inflamasi yang tidak spesifik (Ribatti,

dkk., 1997). Selain itu, kuantifikasi hasil sering sangat subyektif sehingga sulit

untuk membandingkan hasil yang didapat.

Telur ayam berembrio yang digunakan untuk uji respon angiogenesis

dapat dilakukan setelah terbentuknya CAM pada hari ke-4 dan implantasi larutan

uji ke dalam CAM dapat dilakukan pada telur ayam berembrio yang berumur 5-16

hari (Patten dan Carlson, 1978). Pada penelitian ini, telur ayam berembrio dibeli

pada hari ke-4 dan kemudian diinkubasikan didalam inkubator dengan suhu 37-

400C. Hal ini dilakukan agar telur ayam tersebut dapat menyesuaikan diri dengan

lingkungan barunya sebelum diberi perlakuan. Perlakuan pada telur ayam


43

berembrio dilakukan pada umur 9 hari, hal ini sesuai dengan pendapat Folkman

(1998) bahwa pada umur 9 hari, rongga udara telur sudah terlihat lebih jelas dan

embrio sudah tidak rentan terhadap pengaruh dari luar sehingga pengamatan

aktivitas antiangiogenik dapat dilakukan.

Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah Dimethyl Sulfoxide

(DMSO). DMSO digunakan sebagai pelarut karena merupakan pelarut yang

umum digunakan pada rute pemberian in vivo dari substansi yang tidak larut air

(Santos, 2003). Pelarut ini memiliki toksisitas yang rendah, dapat disterilkan dan

umum digunakan sebagai pelarut untuk uji antiangiogenesis. Konsentrasi

sitotoksik dari pelarut DMSO adalah 2%, oleh karena itu sebisa mungkin

konsentrasi yang digunakan sekecil mungkin atau <2%. Pada penelitian ini,

konsentrasi DMSO yang digunakan adalah 0,2% (Lampiran 6).

Inhibitor angiogenesis yang digunakan adalah basic Fibroblast Growth

Factor (bFGF) yang kemudian diinduksi ke CAM. Mekanisme yang terjadi

adalah bFGF akan berinteraksi dengan sel endotelial melalui reseptor tirosin

kinase dan reseptor heparan sulfate proteoglycan (HSPGs) di permukaan sel.

Keseimbangan antara penyimpanan dan pelepasan bFGF di matriks ekstra seluler

mungkin adalah suatu pengaturan efek biologi dari faktor pertumbuhan ini di

endotelium. bFGF yang digunakan pada penelitian ini memiliki konsentrasi 25

ng/µl kemudian diencerkan dengan mengunakan larutan Phosphate Buffer

Saline(PBS) pH 7,4 sehingga didapat kadar 1 ng/µl, dan kadar yang akan

diberikan untuk setiap telurnya adalah 10 ng (Lampiran 5).


44

bFGF merupakan salah satu faktor pertumbuhan yang sangat penting

dalam menginisiasi terjadinya angiogenesis dan telah banyak dipakai sebagai

induktor angiognesisdalam berbagai penelitian sebelumnya (Ribatti, dkk., 1997).

Dalam hal ini bFGF yang digunakan merupakan recombinanthuman bFGF yang

merupakan protein rekomendasi antara bFGF manusia dengan suatu protein

tertentu sebagai penanda. bFGF ini dapat menstimulasi angiogenesis dari jaringan

hospes dengan cara bekerja secara langsung pada endotel pembuluh darah yaitu

dengan mempengaruhi migrasi, poliferasi dan pembentukan dinding pembuluh

darah. Pada membran korio alantois itu sendiri, terdapat bFGF yang berperan

penting dalam pertumbuhan pembuluh darah selama perkembangan embrio ayam

(Ribatti, dkk., 2006). Pemberian bFGF pada penelitin ini dimaksudkan untuk

menginduksi terjadinya angiogenesis, sebagaimana yang terjadi pada keadaan

kanker, sehingga pengamatan efek antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih

merah lebih jelas dan kemungkinan mekanismenya lebih terarah.

Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah yang akan digunakan adalah

0,05; 0,1; dan 0,2 mg/ml. Ekstrak etanol yang digunakan kemudian dilarutkan

dengan DMSO – aquabidest steril sesuai dengan perhitungan (Lampiran 6).

Paper disc dalam penelitian ini digunakan sebagai media untuk

mengimplankan induktor angiogenesis dan ekstrak etanol daun sirih merah.

Penggunaan paper disc memiliki kelemahan terutama berkaitan dengan daya

serapnya, oleh sebab itu volume implantasi sediaan uji disesuaikan dengan daya

serap paper disc yang digunakan. Pengamatan pembuluh darah baru juga dapat

terganggu dengan adanya pembuluh darah asal dimana paper disc diimplankan


45

dan adanya reaksi inflamasi non-spesifik sehingga menyulitkan ketika dilakukan

kuantifikasi respon angiogenesis. Namun kelemahan-kelemahan tersebut sedapat

mungkin dikontrol dengan adanya kelompok kontrol paper disc.

Uji ini dilakukan pada membran korio alantois telur ayam berembrio

dengan enam kelompok perlakuan dan masing-masing kelompok terdiri dari tiga

telur/replikasi. Enam kelompok perlakuan tersebut adalah kelompok I : kontrol

paper disc, kelompok II : kontrol pelarut+ paper disc, kelompok III : kontrol

bFGF+ pelarut+ paper disc, kelompok IV-VI : ekstrak etanol daun sirih merah +

paper discdengan konsentrasi berturut-turut adalah 0,05;0,1; dan0,2 mg/ml.

Pengamatan dilakukan secara makroskopis pada membran korio alantois

embrio ayam berumur 12 hari dimana sebelumnya telah diinkubasi terlebih dahulu

dalam inkubator selama 3 hari dengan suhu 37-400C dan dimasukkan ke freezer

selama 24 jam pada hari berikutnya dengan tujuan mematikan embrio

ayam.Pengamatan secara makroskopis ini dilakukan dengan menghitung jumlah

pembuluh darah baru yang terbentuk radial pada paper disc dan di sekitar paper

disc. Pembuluh darah yang terbentuk merupakan pembuluh darah percabangan

dari pembuluh darah asal/pembuluh darah utama yang secara makroskopis terlihat

sangat halus. Gambar 3 merupakan contoh gambaran makroskopis respon

angiogenesis pada korio alantois membran baik pada kelompok kontrol maupun

pada kelompok perlakuan.


46

Gambar 3. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah.

Pengamatan secara makroskopis ini dilakukan oleh 4 orang dengan

tujuan untuk mengurangi subyektifitas pengamatan dan hasil perhitungan jumlah

pembuluh darah dari beberapa orang tersebut kemudian di rata-ratakan (Tabel I.).

Tabel I. Rerata jumlahpembuluh darah barudan standar deviasi padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah

Kelompok Perlakuan(n= 3)

Rerata Jumlah pembuluh darahbaru ± SD

Kontrol paper disc 14,33± 1, 15

Kontrol pelarut 13,00 ± 2,00

Kontrol bFGF + pelarut 23,33± 0,58Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 14,66± 2,30Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 12,33± 1,52Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 10,33± 0,57

Ekstrak etanol daunsirih merah 0,05

mg/ml + PD

Ekstrak etanoldaun sirih merah0,1 mg/ml + PD


paper disc (PD) pelarut + PD pelarut + PD bFGF+ pelarut + PD

46












mg/ml + PD




46












mg/ml + PD





47

Gambar 4. Diagram batang rata-rata jumlah pembuluh darah baru padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah

Data yang diperoleh kemudian diuji statistik menggunakan analisis satu

arah Anova yang kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat adanya

perbedaan yang bermakna antar kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan.

Langkah pertama yang dilakukan pada uji statistik adalah menentukan apakah

kelompok uji tersebut terdistribusi normal atau tidak. Data dikatakan terdistribusi

normal apabila p>0,05.

Berdasarkan hasil uji tersebut data yang didapat menunjukkan bahwa

data terdistribusi normal dengan nilai masing-masing kelompok adalah kontrol

paper disc 0,766; kontrol pelarut 1,00; kontrol bFGF+ pelarut 0,766; konsentrasi

ekstrak etanol daun sirih merah 0,05; 0,1; dan 0,2 mg/ml secara berturut-turut

adalah 0,766; 0,991 dan 0,766.


48

Apabila data sudah terdistribusi normal, maka dapat dilanjutkan dengan

uji homogenitas dimana data dikatakan homogen apabila (p>0,05). Hasil yang

didapat menunjukkan bahwa data mempunyai varian yang homogen dengan hasil

0,176 sehingga analisis statistik dapat dilanjutkan dengan uji Tukey (Tabel II).

Tabel II. Hasil uji statistik pertumbuhan pembuluh darah baru antarkelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah

Kelompokperlakuan

(n= 3)

Kontrolpaperdisc

Kontrolpelarut

KontrolbFGF+pelarut

Ekstraketanol daunsirih merah0,05 mg/ml



Kontrol paperdisc - TB BB TB TB TB

Kontrol pelarut TB - BB TB TB TB

KontrolbFGF+pelarut

BB BB - BB BB BB

Ekstrak etanoldaun sirih

merah 0,05mg/ml

TB TB BB - TB BB

Ekstrak etanoldaun sirihmerah 0,1

mg/ml

TB TB BB TB - TB

Ekstrak etanoldaun sirihmerah 0,2

mg/ml

TB TB BB BB TB -

Keterangan :TB : Berbeda Tidak Bermakna (p > 0,05)BB : Berbeda Bermakna (p < 0,05)

Pengamatan makroskopis terhadap CAM kelompok kontrol paper

disc(Gambar 3) menunjukkan bahwajumlah pembuluh darah di dalam paper disc

maupun pada daerah di sekeliling paper disc merupakan pertumbuhan pembuluh

darah secara normal denganrerata jumlah pembuluh darah baru ± SD14,33 ± 1,15

(Tabel I). Berdasarkan hasil pengamatan tersebut, maka paper disc dapat


49

digunakan sebagai pembawa dalam metode ini, karena penggunaan paper disc

tidak mempengaruhi angiogenesis pada CAM dankontrol paper disc juga dapat

digunakan sebagai pembanding dengan kelompok perlakuan.

Pada kelompok kontrol pelarut (Gambar 3), menunjukkan hasil rerata

jumlah pembuluh darah baru ± SD adalah 13,00 ± 2,00 (Tabel I). Berdasarkan

hasil pengamatan tersebut, dapat dilihat bahwa kelompok kontrol pelarut memiliki

perbedaan yang tidak bermakna dengan kelompok kontrol paper discdengan hasil

statistik 0,879 (p>0,05) (Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa pelarut yang

digunakan tidak memberikan efek angiogenesis pada CAM yang artinya pelarut

dapat terus digunakan sebagai pelarut ekstrak.

Selanjutnya pada pengamatan kelompok kontrol bFGF+ pelarut (Gambar

3), tampak banyak sekali pertumbuhan pembuluh darah baru atau neovaskularisasi

yang terbentuk baik didalam paper disc maupun pada daerah disekitar/disekeliling

paper disc dengan rerata jumlah pembuluh darah baru ± SDadalah 23,33 ± 0,58

(Tabel I). Pertumbuhan pembuluh darah baru yang terbentuk, membentuk pola

radial menuju ke arah paper disc yang telah dimuati bFGF, disekitar paper disc

sendiri juga banyak terdapat percabangan pembuluh darah baru dari pembuluh

darah yang telah terbentuk sebelumnya/pembuluh darah utama. Kelompok kontrol

bFGF menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan kelompok kontrol paper

disc dan kontrol pelarut dengan hasil statistik 0,000 (p<0,05) (Tabel II). Hal ini

menunjukkan bahwa pemberian bFGF dapat memicu pertumbuhan pembuluh

darah baru atau memicu terjadinya angiogenesis pada CAM.


50

Pada kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml

menunjukkan hasil rerata jumlah pembuluh darah baru ± SD adalah 14,66 ± 2,30

(Tabel I). Dilihat secara statistik, konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05

mg/ml menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan kelompok kontrol bFGF

dengan hasil statistik 0,000 (p<0,05) dan menunjukkan perbedaan tidak bermakna

dengan kontrol paper disc dimana hasil statistik adalah 1,000 (p>0,05) (Tabel II).

Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 memberikan

respon antiangiogenesis pada CAM dimana keadaannya hampir sama dengan

kontrol paper disc.

Selanjutnya pada kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah

0,1 mg/ml, hasil rerata jumlah pembuluh darah baru ± SDyaitu 12,33 ± 1,52

(Tabel I). Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml dengan kontrol

bFGF menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan hasil statistik 0,000

(p<0,05). Dibandingkan dengan kontrol paper disc, konsentrasi ekstrak etanol

daun sirih merah 0,1 mg/ml menunjukkan perbedaan tidak bermakna dengan hasil

statistik adalah 0,600 (p>0,05) (Tabel II). Hasil ini menunjukkan bahwa

konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml memberikan respon

antiangiogenesis pada CAM. Dilihat dari rerata ekstrak etanol daun sirih merah

0,1 mg/ml dengan kontrol paper disc didapatkan penurunan jumlah pembuluh

darah baru dimana jumlah pembuluh darah baru pada ekstrak etanol daun sirih

merah 0,1 mg/ml lebih sedikit dibandingkan dengan kontrol paper disc.

Hasil rerata jumlah pembuluh darah baru ± SD pada kelompok

konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/mladalah 10,33 ± 0,57 (Tabel


51

I). Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml dengan kontrol bFGF

menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan hasil statistik 0,000 (p<0,05)

dan menunjukkan perbedaan tidak bermakna dengan kontrol paper disc dimana

hasil statistik adalah 0,060 (p>0,05) (Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa

ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml memberikan respon antiangiogenesis

pada CAM. Dilihat dari rerata ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml dengan

kontrol paper disc didapatkan penurunan jumlah pembuluh darah baru dimana

jumlah pembuluh darah baru pada ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml lebih

sedikit dibandingkan dengan kontrol paper disc.

Pada kelompok perlakuan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah

0,05 mg/ml dengan kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1

mg/ml terdapat perbedaan tidak bermakna dengan hasil statistik 0,450 (p>0,05)

(Lampiran 13). Hal ini menunjukkan bahwa tidak adanya kekerabatan antara

konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml dengan konsentrasi

ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml.

Pada kelompok perlakuan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah

0,05 mg/ml terdapat perbedaan bermakna dengan kelompok perlakuan konsentrasi

ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml dimana hasil statistiknya adalah 0,038

(p<0,05). Hasil statistik ini menunjukkan bahwa adanya kekerabatan antar

konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml dengan konsentrasi

ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml.

Pada kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml

terdapat perbedaan tidak bermakna dengan kelompok konsentrasi ekstrak etanol


52

daun sirih merah 0,2 mg/ml dengan hasil statistik 0,600. (Lampiran 6). Hasil ini

menunjukkan tidak adanya kekerabatan antara konsentrasi ekstrak etanol daun

sirih merah 0,1 mg/ml dengan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2

mg/ml.

Hasil statistik yang didapat pada kelompok perlakuan menunjukan

adanya responpenghambatan pembuluh darah baru (antiangiogenesis) terhadap

kontrol bFGF, apabila dibandingkan dengan kelompok kontrol paper disc. Hal ini

membuktikan bahwa pemberian ekstrak etanol daun sirih merah dapat

menghambat pertumbuhan pembuluh darah baru. Dari ketiga konsentrasi yang

diberikan, konsentrasi yang paling efektif/bagus adalah ekstrak etanol daun sirih

merah dengan konsentrasi 0,05 mg/mL. Hal ini dilihat dari hasil rerata yang

ditunjukkan oleh konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/mL

mendekati hasil rerata dari kontrol paper disc.Hasil rerata pada konsentrasi

ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 dan 0,2 mg/mL mengalami menurunan jumlah

pembuluh darah baru jika dibandingkan dengan kontrol paper disc sehingga dapat

dikatakan untuk kedua konsentrasi ini menunjukkan hasil yang kurang optimal.

Hasil antar konsentrasi menunjukkan tidak adanya kekerabatan dengan

aktivitas antiangiogenesis pada CAM. Hal ini mungkin dikarenakan sampel yang

digunakan terlalu sedikit, sehingga nilai dari standar deviasi masing-masing

konsentrasi menjadi sangat tinggi sehingga perbedaan antar konsentrasi menjadi

tidak bermakna. Oleh karena itu, perlu pengembangan lebih lanjut dengan

menggunakan varian konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah agar nantinya

didapat kekerabatan antar konsentrasi.


53

Tabel III. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompokkontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah

KelompokPerlakuan(n= 3)

Pertumbuhan pembuluhdarah baru (%)

Kontrol paper disc 61,42

Kontrol pelarut 55,72

Kontrol bFGF + pelarut 100Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 62,83Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 52,85Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 44,27

Tabel III menunjukkan respon angiogenesis relatif menggunakan rata-

rata pertumbuhan pembuluh darah baru dari masing-masing kelompok konsentrasi

ekstrak etanol daun sirih merah dibandingkan dengan rata-rata kelompok kontrol

bFGF + pelarut.

Gambar 5. Persentase pertumbuhan pembuluh darah barupada kelompok kontroldan kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah.

0

20

40

60

80

100

120

kontrol blankkontrol pelarutkontrol bFGFKonsentrasi 0,05 mg/mlKonsentrasi 0,1 mg/mlKonsentrasi 0,2 mg/ml

pers

enta

se p

embu

luh

dara

h ba

ru

61,42 55,72

100

62,8352,85

44,27


54

Dapat dilihat pada tabel III dan gambar 4 bahwa persentase pertumbuhan

pembuluh darah baru dari ekstrak etanol daun sirih merah 0,05; 0,1 dan 0,2 mg/ml

secara berturut-turut adalah 62,83%; 52,85% dan 44,27%. Aktivitas angiogenesis

dari larutan uji pada CAM embrio ayam dilihat dari proses pembentukan

pembuluh darah baru (neovaskularisasi) pada paper disc maupun disekitar paper

disc. Semakin besar presentase pertumbuhan pembuluh darah baru maka aktivitas

antiangiogenesisnya semakin kecil. Hasil pada penelitian ini menunjukkan bahwa

konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis

dilihat dari semakin kecilnya persentase pertumbuhan pembuluh darah baru yang

diperoleh yang ditandai dengan berkurangnya densitas pembuluh darah baru pada

paper disc maupun disekitar paper disc.

Sirih merah diketahui memiliki banyak kandungan senyawa yaitu

flavonoid, alkaloid, saponin, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri

(Sudewo, 2005). Ekstrak etanol daun sirih merah kemungkinan mengandung

senyawa-senyawa yang bertindak sebagai inhibitor angiogenesis yang dapat

menurunkan jumlah pertumbuhan pembuluh darah baru. Beberapa kandungan

senyawa yang digunakan pada proses angiogenesis adalah senyawa golongan

flavonoid dan alkoloid (Igura, dkk.,2001; Grotewold, 20006). Diduga senyawa

flavonoid yang terkandung dalam sirih merah inilah yang berperan dalam proses

antiangiogenesis. Flavonoid diketahui mempunyai aktivitas sebagai antikanker.

Salah satu mekanisme flavonoid dalam menghambat pertumbuhan sel kanker

adalah dengan menghambat angiogenesis (Igura, dkk.,2001). Pada penelitian ini,

penyari yang digunakan bukan merupakan penyari murni yaitu etanol 70%


55

sehingga kandungan senyawa aktif yang dapat larut dan tertarik dari ekstrak

tersebut belum diketahui secara pasti. Oleh karena itu, perlunya pengembangan

lebih lanjut untuk melakukan isolasi senyawa agar nantinya kandungan spesifik

pada sirih merah dapat diketahui secara pasti dan mekanisme aktivitas

antiangiogenesis dari senyawa tersebut juga dapat diketahui.

Rao, Gaikwad dan Barik (2010) juga melaporkan salah satu senyawa dari

tumbuhan yang memiliki potensi sebagai antikanker adalah flavonoid. Flavonoid

diketahui secara luas memiliki efek antikanker dan dapat menginduksi apoptosis.

Salah satu mekanisme flavonoid dalam menghambat pertumbuhan sel kanker

adalah dengan menghambat angiogenesis. Pada penelitian yang dilakukan Fotsis

dkk.,(1997) diketahui bahwa flovonoid yang terhidroksilasi mampu menghambat

angiogenesis secara in vitro. Tumbuhan dari spesies piper juga sangat potensial

untuk dikembangkan sebagai agen antikanker. Beberapa penelitian yang telah

dilakukan menunjukkan bahwa tumbuhan dari genus piper memiliki efek

sitotoksik. Ekstrak klorofom piper aborescens terbukti memiliki efek sitotoksik

terhadap kultur sel payudara , sel kanker prostat, dan sel kanker leukimia (Parmar,

dkk.,1997; Tsai dan Ho, 2005; Tabudravudan Jaspars, 2005). Minyak atsiri daun

Piper gaudichaudianum juga memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker (Peres,

dkk.,2009). Peperomia sui juga dilaporkan memiliki efek sitotoksik secara in vitro

(Cheng dan Chen, 2008).


56

Hasil penelitian memperlihatkan bahwa ekstrak etanol 70 % daun sirih

merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dengan konsentrasi 0,05; 01 dan 0,2 mg/ml

mempunyai aktivitas antiangiogenesis, dimana konsentrasi yang paling bagus

ditunjukkan oleh konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml dengan

hasil rerata yang hampir sama dengan kontrol paper disc.


57

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis pada

chorioalantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio yang diinduksi bFGF

dengan konsentrasi 0,05; 0,1 dan 0,2 mg/ml, dengan konsentrasi optimal

adalah 0,05 mg/ml.

2. Tidak adanya kekerabatan antara konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah

dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM telur ayam berembrio yang

diinduksi bFGF.

B. Saran

Dari hasil penelitian uji aktivitas antiangiogenesis ekstrak etanol daun

sirih merah yang diinduksi bFGF dengan metode CAM, maka disarankan untuk :

1. Melakukan penelitian lebih lanjut dengan memberikan variasi konsentrasi

ekstrak etanol daun sirih merah.

2. Melakukan isolasi senyawa untuk mengetahui senyawa spesifik yang

memiliki aktivitas antiangiogenesis dalam daun sirih merah.

57


58

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, DepartemenKesehatan Republik Indonesia.

Anonim, 2005, Kanker, http://www.groups.or.id/kanker.html, Diakses tanggal 9September 2013.

Anonim, 2007, Sirih Merah Sebagai Tanaman Obat Multifungsi,http://balitro.litbang.deptan.go.id, diakses tanggal 5 Juni 2014.

Anonim, 2009, Cancer, World Health Organization,http://www.who.int/cancer/en/, diakses tanggal 2 Agustus 2013.

Backer and Brink, V.B., 1965, Flora of Java, Wolters Mood Hoff N. V.,Netherlands, pp 167-173.

Brem, S., 1999, Angiogenesis and Cancer Control : From Concept to TherapeuticTrial, Moffitt Cancer Center & Reserch institute(http://www.medscape.com/cancercontrol/1999//v06.n02.brem/cc0605.02.brem-01.html), diakses tanggal 1 Agustus 2013.

Cheng, M., and Chen, I., 2008, Secondary Metabolites from Peperoma Sui, Chil,Chem, Soc, 53, 1539-1542.

Chrisnanto, E., 2008, Efek Antiangiogenesis Ekstrak Etanolik Kulit Buah JerukKeprok (Citrus reticulata) Terhadap Membran Korio Alantois (CAM)Ayam Terinduksi bFGF,Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Dalimartha, S., 1999, Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker, CetakanKedua, Penebar Swadaya Press, Jakarta.

Dean, M., 1998, Cancer as a Complex Developmental Disorder, CancerRes,58:5633-5636.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan Galenik,Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1994, Petunjuk PelaksanaanPembuatan Obat Tradisional Yang Baik (CPOTB), Departemen KesehatanRepublik Indonesia, Jakarta.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1999, Pengujian BahanKimia Sintetik Dalam Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta.


59

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 2000, Pedoman PelaksanaanUji Klinik Obat Tradisional, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,Jakarta.

Evans, C. W., 1991, The Metastatic Cell, 1st ed., Champman and Hall, London,pp. 191-289.

Fitriyani, A., Winarti, L., Muslichah, S., & Nuri, 2011, Uji Antiinflamasi EkstrakMetanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Pada TikusPutih, Majalah Obat Tradisisonal, pp. 16(1), 34-42.

Folkman, J., 1976, The vascularization of Tumors, Scientific American, 6: 59-73

Folkman, J., 1996, Fighting Cancer by Attahing its Blood Supply, SciAmerican, 9:116-119.

Folkman, J. 1998. Angiogenic Therapy of the Human Heart Circulation. Vol.97.pp. 628–9.

Fotsis, T., Pepper, M., Aktas, E., Breit, Rasku, Wahala, K., dan Schweigere, L.,1997, Flavonoids, dietary-derived inhibitors of cell proliferation and invitro angiogenesis, Cancer Res, 57, 2916-2921

Frandita, E., 2009, Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, FakultasFarmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Gritter & Roy, 1991, Pengantar Kromotografi,Edisi 2, ITB, Bandung.

Grotewold, E., 2006, The Science of Flavonoids, Springer Science_BussinessMedia Inc., USA

Gupta, K. M., dan Qin, R. Y., 2003, Mechanism and its Regulation of Tumor-induced Angiogenesis, World Journal Gastroenterol, 9(6), 1144-1155.

Hanahan, D and Weinberg, R.A., 2000, The Hallmark of Cancer, Cell.,100:57-68.

Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia, ITB, Bandung, pp. 156.

Hargono, D., Farouq, Sutarno, S., Pramono, S., Rahayu, T., Tanuatmadja, U.,Sumarsono, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta.

Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid 3, Fepertemen Kehutanan,Jakarta.


60

Igura ,K., Otha T., Kuroda, Y., Kaji K., 2001, Resveratrol and Quercetin inhibitangiogenesis in vitro,Cancer Lett, 171 (1): 11-6

Jain, R.K., and Carmeliet,P.F., 2001, Vessel of Death,Sci Am., 28-30

Juliantina R. F., Citra, D. A., Nirwani, B., Nurmasitoh, T.,Bowo, E. T., 2009.“Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum) Sebagai Agen Anti BakterialTerhadap Bakteri Gram positif dan Gram Negatif”, Jurnal Kedokteran danKesehatan Indonesia.

Kamienski, M., Keogh, J., 2006, Pharmacology Demystifieda Self-TeachingGuide, New York : The McGraw-Hill Companies, Inc.s

Kerbel, R., Folkman, J., 2002, Clinical Translation of Aniogenesis Inhibitors,Nature, Vol 2

King, R. J.B., 2000. Cancer Biology Ed. 2, Person Education. England.

Kninghton, D., Ausprunk, D., Tapper, and Folkman, 1997, Avascular andVascular Phases of Tumor Growth in The Chick Embrio, Br.J.Cancer 35,pp 347-356.

Leahy, K.M., Koki, A.T., and Masferrer, J.L., 2003, Role of Cyclooxygenase inAngiogensis,http://Bentham.org/cmcsample/masferner/masferner.htm,diakses pada tanggal 3 Februari 2014.

Levi, E.P., 2000, Chronic Toxicity: Carcinogenesis, Mutagenesis, Teratogenesis,in Hodgson, E., dan Levi, E.P. (Ed) A Text book of Modern Toxicology,Mc. Graw Hill international Edition, Singapore.

Lodish, H., Berk, S., Zipursky, Lawrence, S., Matsurada, Baltimore and Darnel,J., 2000, Molekuler Cell Biology Fouth Ed., W. H. Freeman andCompany, New York, pp. 1054-1062.

Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., and Oehler, M. K., 2012, ChickChorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Studythe Effect of Newly Identified Molecules un Ovarian Cancer Invasion andMetastasis, Int J Mol Sci, 13(8), 9959-9970.

Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoida.Terjemahan KosasihPadmawinata. ITB, Bandung.

Meiyanto, M., 1999, Kurkumin Sebagai Obat Kaner : Menelusuri MekanismeAksinya, MFI, 10(4), 224-236.


61

Manoi, F., 2006, Pengaruh Cara Pengeringan Terhadap Mutu SimplisiaSambiloto, Buletin Littro, Vol.17(1),1-5.

Neritika, K., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav.) terhadap Kultur Sel Kanker Payudara T47D,Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Ng, Y.S., dan D’Amore, P., 2001, Review Therapeutic angiogenesis forcardiovascular disease Curr Control Trials Cardiovasc Med., 2, 278-285.

Ota, S., Bamba, H., Kato, A., Kawamoto, A., Yoshida, Y. Dan Fujiwara, K.,2003, iiReview article : COX-2, prostanoids and colon cancer, AlimentPharmacol Ther 2002., 16 (Suppl.2), 102-106.

Papetti, M., dan Herman, I.M., 2002, Mechanism of Normal and Tumor-derivedAngiogenesis, Am J Physiol Cell Physio, 282, 947-970.

Parmar, V., Jain, S., Bisht, K., Jain, R., Taneja, P., Tyagi, O., Prasad, A., Wengel,J., Olsen, C., Boll, P., 1997, Phytochemistry of the genus Piper.Phytochem, 46(4);597-673.

Patten , B.M. and Carlson, B.M., 1978, Extraembryonic Membranes inFoundations of Embryology, Tata McGraw-Hill Publishing CompanyLTD, New Delhi.

Pramono, E., 2002, The commercial use of traditional knowledge and medicinalplants in Indonesia. Submitted for multi-stakeholder dialoque on trade,intellectual property and biological resources, Asia.

Pringgoutomo, S., 2007, Riwayat perkembangan pengobatan dengan tanamanobat di dunia timur dan barat. Buku ajar Kursus Herbal Dasar untukDokter, Balai Penerbit FKUI Jakarta, pp.1-5.

Rao, B., Gaikwad, P., and Barik, A., 2010 Antioxidant Activities of Phenols inDifferent Solvents Using DPPH Assay, Res Chem Intermed, 36: 1927-1933.

Ribatti, D., Gualandris, A., Bastaki, M., Vacca, A., Lurlaro, M., Roncali, L. andPresta, M., 1997, New Model for The Study of Angiogenesis andAntiangiogenesis in The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane: TheGelatin Sponge/Chorioallantoic Membrane Assay, Vascular Res, pp. 34,455-463.

Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., & Presta, M., 2006, The Gelatin Sponge-Chorioallantoic Membrane Assay, Nature Publishing Group, pp. 88-89.


62

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi, ITB,Bandung, pp. 152-154.

Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Cetakan I, Penertbit Pustaka Pelajar,Yogyakarta, pp. 353-354

Sankaranarayanan, R., 2008, Cervical Cancer: scope of the problem,WHO,International Agency for Reserch on cancer, recorder Presentationin Bangkok, Thailand for the 12th Biennial Meeting of InternationalCancer Society (IGCS), 25028.

Santos, N. C., 2003, Multidiciplinary Utilizator of Dimetil Sulfoxide :Pharmacological, cellular and Molecular Aspec, InstitodeBioquimical/Institode Medicina Molekular, Portugal

Schneider, A. K., 2000, Cancer Genetics, Encyclopedia of Human Biology,EdisiII, 312-315, Academic Press, London.

Siswandono, Soekardjo, B., 2000. Kimia Medisinal. Surabaya: AirlanggaUniversity Press.

Sofyan, Ahmad, Jayanegara, A., 2008. “Penentuan Aktivitas Biologis TaninBeberapa Hijauan Secara In Vitro Menggunakan ‘ Hohenheim Gas Test’dengan Polietilen Glikon Sebagai Determinan”. Jurnal Media PeternakanVol. 31 No. 1 tahun 2008.

Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, edisi II,diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang sudiro, ITB,Bandung.

Subarnas, A., Susilawati, Y., Mulyasari, E., 2008, Aktivitas Antiinflamasi EkstrakEtanol Daun Sirih Merah Pada Tikus Putih Jantan, Laporan Penelitian,Fakultas Farmasi, Universitas Padjajaran, Jatinangor.

Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, edisi I, PT. AgromediaPustaka, Jakarta, pp.39-42.

Tabudravu, J., and Jaspars, M., 2005, Anticancer Activities od Constituents ofKava (Piper methysticum), South Pasific Nature Sci, 23: 26-29.

Tsai, T., Ho, S., 2005, Antioxidan and anti-inflammatory Activities of SeveralCommonly Used Species, J. Food Sci, 70: (1) C93-C97.

Walaszek,Z., Hanausek, M., dan Slaga, T.J., 2004, Mechanisms ofChemoprevention, Suppl.Am.Coll.Phys., 125,128-133.


63

Westendarp, H., 2006, Effects of Tannins in Animal Nutrition, Dtsch, Tierarztl,Wochenschr, pp. 113: 264-268.

Wicaksono, B.D., Handoko, Y.A., Arung, E.T., Kusuma, I.R., Yulia, D.,Pancaputra, A.N., dkk., 2009, Antiproliferasi Effect of the MethanolExtract of Piper crocatum Ruiz & Pav Leaves on Human Breast (T47D)cellsin-vitro, Trop J of Pharmaceut Res, 8(4): 345-352.

WHO, 2003, Traditional medicine,http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/, diakses tanggal 12Agustus 2013.


64

LAMPIRAN


65

Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)


66

Lampiran 2. Foto serbuk daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)


67

Lampiran 3. Hasil Determinasi Tanaman Sirih Merah


68

Lampiran 4. Data Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah

a. Penimbangan bobot ekstrak daun sirih merah

Bobot cawan = 43,18 gram

Bobot cawan + ekstrak = 58,86 gram

Bobot ekstrak = 15,68 gram

Bobot daun sirih merah yang digunakan = 100 gram

b. Rendemen Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah

Rendemen ekstrak etanol daun sirih merah = 100%= , 100%= 15,68 %


69

Lampiran 5. Data Perhitungan Pengenceran bFGF

a. Pengenceran bFGF

Konsentrasi awal bFGF (C1) adalah 25 ng/µl

Konsentrasi bFGF yang diinginkan (C2) adalah 1 ng/µl

Dosis setiap telur adalah 10 ng.

== / = 10 µl

Setiap telur diinduksi dengan volume induksi bFGF sebesar 10 µl.

Telur yang digunakan untuk masing-masing perlakuan adalah 3 telur.

b. Kontrol bFGF

Total telur = 10 telur

Volume bFGF yang dibutuhkan =

= 10 10 μl = 100 μl1 1 = 2 21 25ng/μl = 100 μl 1 ng/μl1 = 100 μl 1 ng/μl25 ng/μl1 = 4 μl

Larutan bFGF (25 ng/µl) diambil 4 µl kemudian ditambah dengan pelarut

bFGF yaitu PBS.

Volume PBS yang ditambahkan = 100µl – 4 µl = 96 µl.


70

Lampiran 6. Perhitungan Berat Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dan

Volume DMSO

a. Berat Ekstrak Untuk Masing-Masing Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun

Sirih Merah Konsentrasi 0,05 mg/ml== 0,05mgml 100= 5 = 0,05 ditambah 0,2 ml DMSO add sampai 100 ml

Konsentrasi 0,1 mg/ml== 0,1mgml 100= 10 = 0,1 ditambah 0,2 ml DMSO add sampai 100 ml

Konsentrasi 0,2 mg/ml== 0,2mgml 100= 20 = 0,2 ditambah 0,2 ml DMSO add sampai 100 ml

b. Volume DMSOKonsentrasi awal DMSO (C1) adalah 99,5%.

Konsentrasi yang diinginan (C2) adalah 0,2%.1 1 = 2 21 99,5% = 100 0,2%1 = 100 0,2%99,5%1 = 0,2Untuk membantu melarutkan ekstrak, setiap konsentrasi ekstrak ditambahkan

0,2 ml DMSO.


71

Lampiran 7. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah.

a. Kontrol paper disc (PD)

(Replikasi I) (Replikasi II)

(Replikasi III)


72

b. Kontrol pelarut


(Replikasi III)


73

c. Kontrol bFGF


(Replikasi III)


74

d. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml


(Replikasi III)


75

e. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml


(Replikasi III)


76

f. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml


(Replikasi III)


77

Lampiran 8. Rerata jumlah pembuluh darah baru dan standar deviasi

a. Mean dan Standar Deviasi Pembuluh Darah Baru dari Masing-MasingPerlakuan

Kelompok JumlahPengamatan

Jumlah Mean( )

StandarDeviasiPembuluh

Darah

Kontrol paper disc 315

14,33 1,151513

Kontrol Pelarut 313

13 21115

Kontrol bFGF 324

23,33 0,582323

Konsentrasi I(0,05 mg/ml) 3

1614,66 2,3012

16

Konsentrasi II(0,1 mg/ml) 3

1412,33 1,5211

12

Konsentrasi III(0,2 mg/ml) 3

1010,33 0,5711

10


78

Lampiran 9. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru

ℎ ℎ ℎ = 100%Dimana :

a = jumlah pembuluh darah baru rata-rata konsentrasi ekstrak etanol daun

sirih merah

b = jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol bFGF

Konsentrasi I (0,05 mg/ml)

Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = ,, 100 % = 62,83%

Konsentrasi II (0,1 mg/ml)


Konsentrasi III (0,2 mg/ml)



79

Lampiran 10. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah

KelompokPerlakuan(n= 3)

Pertumbuhan pembuluhdarah baru (%)

Kontrol paper disc 61,42

Kontrol pelarut 55,72

Kontrol bFGF + pelarut 100Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 62,83Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 52,85Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 44,27

Lampiran 11. Diagram batang pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompokkontrol dan kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah.

61.42 55.72

100

62.8352.85

44.27

kontrolblank

kontrolpelarut

kontrolbFGF

Konsentrasi0,05 mg/ml



Persentase pertumbuhan pembuluhDarah Baru (%)


80

Lampiran 12. Uji Statistik dengan SPSS 16.0

a. Uji Normalitas

NPar Tests

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

kontrolpaperdisc

Kontrolpelarut

KontrolbFGF

konsentrasi_I

konsentrasi_II

konsentrasi_III

N 3 3 3 3 3 3NormalParametersa

Mean 14.3333 13.0000 23.3333 14.6667 12.3333 10.3333Std.Deviation

1.15470 2.00000 .57735 2.30940 1.52753 .57735

Most ExtremeDifferences

Absolute .385 .175 .385 .385 .253 .385Positive .282 .175 .385 .282 .253 .385Negative -.385 -.175 -.282 -.385 -.196 -.282

Kolmogorov-Smirnov Z .667 .303 .667 .667 .438 .667Asymp. Sig. (2-tailed) .766 1.000 .766 .766 .991 .766

a. Test distribution isNormal.


81

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

kontrolpaperdisc

Kontrolpelarut

KontrolbFGF

konsentrasi_I

konsentrasi_II

konsentrasi_III

N 3 3 3 3 3 3NormalParametersa

Mean 14.3333 13.0000 23.3333 14.6667 12.3333 10.3333Std.Deviation

1.15470 2.00000 .57735 2.30940 1.52753 .57735

Most ExtremeDifferences

Absolute .385 .175 .385 .385 .253 .385Positive .282 .175 .385 .282 .253 .385Negative -.385 -.175 -.282 -.385 -.196 -.282

Kolmogorov-Smirnov Z .667 .303 .667 .667 .438 .667Asymp. Sig. (2-tailed) .766 1.000 .766 .766 .991 .766


82

b. Uji Homogenitas

OnewayTest of Homogeneity of Variances

Jumlah pembuluh darah baru

LeveneStatistic df1 df2 Sig.

1.859 5 12 .176

ANOVAJumlah pembuluh darah baru

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

BetweenGroups

306.667 5 61.333 26.927 .000

Within Groups 27.333 12 2.278Total 334.000 17

DescriptivesJumlah pembuluh darah baru

N MeanStd.

DeviationStd.

Error

95% ConfidenceInterval for Mean

Minimum

Maximum

LowerBound

UpperBound

kontrol paperdisc 3 14.3333 1.15470 .66667 11.4649 17.2018 13.00 15.00

kontrol pelarut 3 13.0000 2.00000 1.15470 8.0317 17.9683 11.00 15.00kontrol bFGF 3 23.3333 .57735 .33333 21.8991 24.7676 23.00 24.00konsentrasi I 3 14.6667 2.30940 1.33333 8.9298 20.4035 12.00 16.00konsentrasi II 3 12.3333 1.52753 .88192 8.5388 16.1279 11.00 14.00konsentrasi III 3 10.3333 .57735 .33333 8.8991 11.7676 10.00 11.00Total 18 14.6667 4.43250 1.04475 12.4624 16.8709 10.00 24.00


83

c. Uji TukeyPost Hoc Tests

Multiple Comparisons

Jumlah pembuluh darah baruTukey HSD

(I) perlakuan (J) perlakuan

MeanDifference

(I-J)Std.

Error Sig.

95% ConfidenceInterval

LowerBound

UpperBound

kontrol paperdisc

kontrol pelarut 1.33333 1.23228 .879 -2.8058 5.4725

kontrol bFGF -9.00000* 1.23228 .000 -13.1391 -4.8609

konsentrasi I -.33333 1.23228 1.000 -4.4725 3.8058

konsentrasi II 2.00000 1.23228 .600 -2.1391 6.1391

konsentrasi III 4.00000 1.23228 .060 -.1391 8.1391

kontrol pelarut kontrol paper disc -1.33333 1.23228 .879 -5.4725 2.8058

kontrol bFGF -10.33333* 1.23228 .000 -14.4725 -6.1942

konsentrasi I -1.66667 1.23228 .752 -5.8058 2.4725

konsentrasi II .66667 1.23228 .993 -3.4725 4.8058

konsentrasi III 2.66667 1.23228 .320 -1.4725 6.8058

kontrol bFGF kontrol paper disc 9.00000* 1.23228 .000 4.8609 13.1391

kontrol pelarut 10.33333* 1.23228 .000 6.1942 14.4725

konsentrasi I 8.66667* 1.23228 .000 4.5275 12.8058

konsentrasi II 11.00000* 1.23228 .000 6.8609 15.1391

konsentrasi III 13.00000* 1.23228 .000 8.8609 17.1391

konsentrasi I kontrol paper disc .33333 1.23228 1.000 -3.8058 4.4725

kontrol pelarut 1.66667 1.23228 .752 -2.4725 5.8058

kontrol bFGF -8.66667* 1.23228 .000 -12.8058 -4.5275

konsentrasi II 2.33333 1.23228 .450 -1.8058 6.4725

konsentrasi III4.33333* 1.23228 .038 .1942 8.4725


84

konsentrasi II kontrol paper disc -2.00000 1.23228 .600 -6.1391 2.1391

kontrol pelarut -.66667 1.23228 .993 -4.8058 3.4725

kontrol bFGF -11.00000* 1.23228 .000 -15.1391 -6.8609

konsentrasi I -2.33333 1.23228 .450 -6.4725 1.8058

konsentrasi III 2.00000 1.23228 .600 -2.1391 6.1391

konsentrasiIII

kontrol paper disc -4.00000 1.23228 .060 -8.1391 .1391

kontrol pelarut -2.66667 1.23228 .320 -6.8058 1.4725

kontrol bFGF -13.00000* 1.23228 .000 -17.1391 -8.8609

konsentrasi I -4.33333* 1.23228 .038 -8.4725 -.1942

konsentrasi II -2.00000 1.23228 .600 -6.1391 2.1391*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsetsjumlah_pembuluh_darah_baru

Tukey HSD

perlakuan N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3

konsentrasiIII

3 10.3333

konsentrasi II 3 12.3333 12.3333kontrol pelarut 3 13.0000 13.0000kontrol paperdisc

3 14.3333 14.3333

konsentrasi I 3 14.6667kontrol bFGF 3 23.3333Sig. .060 .450 1.000Means for groups in homogeneous subsets aredisplayed.


85

Lampiran 13. Diagram batang Jumlah Pembuluh Darah Baru Rata-RataDari Masing-Masing Perlakuan


86

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Aktivitas AntiangiogenesisEkstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &Pav.) Pada Chorioallantoic Membrane yang Diinduksi bFGF”memiliki nama lengkap Ketut Noveryka Lendra. Penulis lahirdi Tabanan pada tanggal 8 November 1992 yang merupakananak keempat dari empat bersaudara. Lahir dari pasangan IWayan Lendera, Dipl. PT dan Eriana Herlisanti, S. Pd.Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalahdimulai dari TK Immaculata (1997-1998), SD Negeri 6 Delod

Peken (1998-2004), SMP Negeri 3 Tabanan (2004-2007), SMA Negeri 1 Tabanan(2007-2010), dan pada tahun 2010 penulis menempuh pendidikan S1 di FakultasFarmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Selama menempuh kuliah, penulis aktif dalam berbagai kepanitiaan.Penulis tergabung dalam UKM KMHD Swastika Taruna USD. Selain itu, penulispernah menjadi seksi Kesehatan Dies Natalis Keluarga Putra Bali (KPB)Purantara (2010), Bendahara Seminar Nasional Pemberdayaan Pasien Dalam SelfManagement Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup (2011),Bendahara kegiatan Tirta Yatra KMHD (2012), dan menjadi Bendahara AcaraPelepasan Wisuda Fakultas Farmasi (2012).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk file“dan selama ribuan langkah kaki kita...

Documents