prof. dr Miroslav Radenkovid, ass. dr Marko Stojanovid

Serelaksin i istaroksim: nove farmakoterapijske mogućnosti u lečenju akutne srčane insuficijencije? prof. dr Lazar Davidovid, dr Perica Mutavdžin

Aneurizmatska bolest doc. dr Miloš Bajčetid

Mitohondrijske bolesti: histohemijske i ultrastrukturne karakteristike doc. dr Marija Matid

Antioksidantni vitamini prof. dr Nebojša Jovid, doc. dr Jasna Jančid

Neurološki pregled deteta

Izdanje 64 / Broj 1-2 / Decembar 2013

UNIVERZITET U BEOGRADU

MEDICINSKI FAKULTET

UNIVERSITY OF BELGRADE

SCHOOL OF MEDICINE

EDITORIJALI

YU ISSN 0369-1527 / UDK 61 (05) MEDICINSKI PODMLADAK JE INDEKSIRAN

U SRPSKOM CITATNOM INDEKSU

MEDICINSKI

PODMLADAK medical youth

MEDICINSKI PODMLADAK

naučni časopis za studente i mlade istraživače

MEDICAL YOUTH

scientific journal for students and young researchers

Glavni i odgovorni urednik Editor in Chief

Zamenik glavnog i odg. urednika Deputy editor

Sekretar Secretary

Redakcija Editorial Board

Izdavački savet Publishing board

Lektor za srpski jezik Reader Lektor za engleski jezik Reader

Osnivač i vlasnik Founder & Owner

Naslovna strana Cover Priprema i štampa Prepress and press

Tiraž Circulation Posebna zahvalnost Acknowledgement

Nebojša Markovid

Milica Živkovid

Milenko Bogdanovid

Mihailo Beladevid Mihail Baša Čarna Jovanovid Stefan Barišid

Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu Dr Subotida 8 11000 Beograd, Srbija

Email: medicinskipodmladak@med.bg.ac.rs Tel: +381 11 36 36 382 Fax: +381 11 36 36 382 ISSN-YU 0369-1527 UDK 61 (05)

500 primeraka

http://www.cgtrader.com/3d-models/character-people/anatomy/human-heart-vray

„Human heart 3D model“

Stefan Barišid

Prof. dr Tatjana Simid Prof. dr Nebojša Lalid Miloš Brankovid

„Grafostil“, Kragujevac

UNIVERZITET U BEOGRADU

MEDICINSKI FAKULTET

UNIVERSITY OF BELGRADE

SCHOOL OF MEDICINE

Prof. Nataša Midid Ass. Danka Sinadinovid

Akademik prof. dr Nebojša Lalid Prof. dr Tatjana Simid Prof. dr Živan Maksimovid Prof. dr Petar Bulat Prof. dr Vesna Bjegovid Prof. dr Slobodan Savid Prof. dr Gordana Teofilovski Parapid Prof. dr Aleksandra Isakovid Prof. dr Marina Svetel Prof. dr Nađa Marid

Assoc. prof. dr Darija Kisid Assoc. prof. dr Silvio de Luka Assoc. prof. dr Dimtrije Nikolid Assoc. prof. dr Marina Atanackovid Nebojša Markovid, glavni i odgovorni urednik časopisa Medicinski podmladak

Milenko Bogdanovid, član redakcije časopisa Medicinski podmladak

Sašenka Vidičevid, predsednik CSNIRS-a

Andrija Jekid, potpredsednik CSNIRS-a

UVODNA REČ foreword

Poštovani čitaoci, Pred vama je 64. dvobroj studentskog stručno-naučnog časopisa

Medicinski podmladak. Ponosni smo na činjenicu da smo časopis studenata medicine sa najdužom tradicijom na Balkanu. Kako verujemo da znanje i prave vrednosti ne poznaju granice, ono na čemu smo tokom ove godine vredno radili, bila je i promocija Medicinskog podmlatka na međunarodnim studentskim kongresima. Nadamo se da ćete rezultate naših nastojanja biti u prilici da vidite u nekom od narednih brojeva i da ćemo tada moći da se pohvalimo i radovima studenata iz drugih zemalja.

U ovom broju vam predstavljamo 13 radova studenata našeg

fakulteta, koji su, prošavši nekoliko krugova selekcije, izabrani kao najkvalitetniji i najaktuelniji u ovom trenutku. Autorima čestitamo i verujemo da će njihov primer motivisati i druge studente da se upuste u naučno-istraživački rad.

Pored toga, pred vas donosimo i pet editorijala koji su tu da nas na

koncizan način upute u aktuelnosti u oblastima kardiologije, farmakologije, histologije, biohemije i neurologije. Zahvaljujemo se našim nastavnicima, prof. dr Miroslavu Radenkoviću, prof. dr Lazaru Davidoviću, prof. dr Nebojši Joviću, doc. dr Milošu Bajčetiću, doc. dr Mariji Matić, doc. dr Jasni Jančić, ass. dr Marku Stojanoviću i dr Perici Mutavdžinu, koji su uložili trud i vreme i svojim editorijalima doprineli kvalitetu ovog broja.

Nadamo se da smo uspeli u našim namerama da ovo izdanje učinimo

edukativnim, naučno relevantnim i aktuelnim. Takođe, verujemo da ćemo svojim trudom i idejama, ostajući dosledni tradiciji, odgovoriti izazovima našeg vremena i načiniti naš časopis još boljim i međunarodno prepoznatljivim. Da bi smo to i ostvarili, dragocena nam je pomoć i podrška naših nastavnika i kolega, koja ni do sada nije izostajala, na čemu im se i ovim putem srdačno zahvaljujemo.

S poštovanjem, Redakcija studentskog stručno-naučnog časopisa Medicinski

podmladak.

SADRŽAJ contents

UVODNA REČ foreword

Nebojša Markovid, glavni i odgovorni urednik časopisa „Medicinski podmladak“

EDITORIJALI review articles

Serelaksin i istaroksim: nove farmakoterapijske mogudnosti u lečenju akutne srčane insuficijencije 5

Aneurizmatska bolest 11

Mitohondrijske bolesti: histohemijske i ultrastrukturne karakteristike 16

Antioksidantni vitamini 25

Neurološki pregled deteta 32

prof. dr Miroslav Radenkovid, ass. dr Marko Stojanovid

doc. dr Marija Matid

doc. dr Miloš Bajčetid

prof. dr Lazar Davidovid, dr Perica Mutavdžin

prof. dr Nebojša Jovid, doc. dr Jasna Jančid

STUDENTSKI RADOVI Students’ Papers

Lipidni status i indeks telesne mase kao prognostički faktori u pacijenata sa amiotrofičnom 44 lateralnom sklerozom Nemanja Belid, Mihail Baša

Efekti metionin-holin deficijentne dijete na aktivnost acetilholinesteraze u mozgu i jetri 5 1 C57BL6 miševa Ivana Cerovid, Nenad Kokošar, Stefan Krstid

Posledice bakterijskog meningitisa kod dece 59Ivana Dajid, Miloš Babid

SADRŽAJ contents

STUDENTSKI RADOVI Students’ Papers

Uticaj polimorfizma neurotrofičkog faktora BDNF na kliničko ispoljavanje Parkinsonove bolesti 6 4 Maja Đorđevid, Aleksandra Šljivar

Značaj krioglobulinemije u hroničnoj infekciji virusom hepatitisa C 7 0 Jovan Grujid

Faktori rizika i etiologija ishemijskog moždanog udara u osoba mlađih od 45 godina: analiza 7 5 petogodišnjeg perioda 2008-2012 Mirjana Kneževid, Milan Radovanovid

Uticaj risperidona na koncentraciju i metabolizam glutationa u mozgu pacova perinatalno 83 tretiranih fenilciklidinom Dušan Matid

Pojava srčane insuficijencije kod bolesnika sa akutnim infarktom miokarda sa ST elevacijom 91lečenih primarnom perkutanom koronarnom intervencijom Irena Oštrid, Andrija Pavlovid

Uticaj vitamina D3 i dehidroaskorbinske kiseline na pokazatelje oksidativnog stresa u korteksu 97i hipokampusu pustinjskih miševa izloženih prolaznoj globalnoj ishemiji mozga Zlatko Pravdid, Đurđa Jovanovid

Uloga modulacije PI3K/Akt signalnog puta u in vitro modelu Parkinsonove bolesti 104Ratko Radeta, Sašenka Vidičevid

Modulacija efekata nitrinergičke neurotransmisije izolovanog duodenuma pacova primenom 114 D-L-homocistein tiolaktona Nataša Stankovid, Milan Radovanovid, Stefan Dugalid

Socioekonomski profil i kliničke karakteristike pacijenata sa Mijastenijom gravis kasnog početka 133Aleksandra Šljivar, Maja Đorđevid

Profil masnih kiselina u nealkoholnoj masnoj bolesti jetre miševa izazvanoj ishranom 123 deficijentnom u metioninu i holinu Milica Stoiljkovid, Marija Stojanovid

SERELAKSIN I ISTAROKSIM: NOVE FARMAKOTERAPIJSKE MOGUĆNOSTI U LEČENJU

AKUTNE SRČANE INSUFICIJENCIJE?

Miroslav Radenković i Marko Stojanović

Institut za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologiju

Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu

Sažetak

Srčana insuficijencija predstavlja

kompleksni klinički sindrom, koji je u direktnoj

korelaciji sa izraženim morbiditetom i

mortalitetom na globalnom nivou. Uprkos

postignutom napretku u tretmanu ovog oboljenja

prognostički parametri kod obolelih i dalje ostaju

loši, što ukazuje na neophodnost daljih ispitivanja

u pronalaženju novih nefarmakoloških postupaka i

farmakoloških protokola u popravljanju krajnjeg

kliničkog ishoda. Sa tim u vezi, novi pristupi u

terapiji srčane insuficijencije usmereni su kako na

ćelijske transdukcione mehanizme, tako i na do

sada nedovoljno istražene mehaničke i strukturne

aspekte vezane za genezu ovog oboljenja. Ovo bi

obuhvatalo različite abnormalnosti molekularnih

mehanizama, električne provodljivosti ili procesa

remodelovanja srčanih komora. Farmakološki

tretman akutne srčane insuficijencije i dizajniranje

adekvatnih kliničkih studija u cilju pronalaženja

novih farmakoterapijskih mogućnosti predstavlja

poseban izazov, uzimajući u obzir akutni tok

bolesti i visoku stopu mortaliteta. Stoga su

najnovija ispitivanja farmakoterapije akutne srčane

insuficijencije usmerena na prekliničku i kliničku

evaluaciju potencijalno efikasnih i bezbednih

lekova, koji bi redukovali simptome bolesti i

istovremeno prouzrokovali održivo poboljšanje

kliničke slike. Uzimajući u obzir predhodne

činjenice, osnovni cilj ovog rada usmeren je na

kratki prikaz najnovijih saznanja u kliničkim

ispitivanjima novih supstanci u lečenju akutne

srčane insuficijencije, od kojih su izdvojene

serelaksin – peptid sa vazoaktivnim svojstvima i

istaroksim – jedinjenje sa pozitivnim inotropnim i

luzitropnim dejstvom.

Uvod

Uprkos značajnom napretku u

farmakoterapiji hronične srčane insuficijencije,

koji je postignut tokom prethodnih dekada, može

se reći da paralelni progres u razvoju novih lekova

u tretmanu akutne srčane insuficijencije nije pratio

gore navedeni trend. Ovome u prilog govore i

negativni rezultati kliničkih ispitivanja druge i

treće faze sa agonistima B-tipa natriuretskog

peptida, kao i antagonistima endotelina,

vazopresina ili adenozina (1). Iako diuretici

Henleove petlje nikada nisu detaljno ispitivani u

strogo kontrolisanim, prospektivnim i

randomiziranim kliničkim studijama, koje bi

takođe uključivale i veliki broj ispitanika, ovi

lekovi i dalje ostaju gotovo najvažnija opcija za

intravenski tretman akutne srčane insuficijencije

(2). Do sada sprovedena klinička ispitivanja

vezana za akutnu srčanu insuficijenciju nisu uvek

imala jasno definisane ciljeve i adekvatni dizajn,

što se često završavalo odabirom neodgovarjućih

ispitanika, parcijalnom evaluacijom dobijenih

rezultata i redukovanom mogućnošću za realnu

identifikaciju efekta supstanci sa potencijalnim

farmakološkim efektom u ovom ozbiljnom

patofiziološkom poremećaju (3). Pored ovoga,

kratko trajanje bolesti sa visokim mortalitetom u

toku prvih nekoliko meseci od trenutka inicijalne

hospitalizacije, kao i ponovljeni prijem na

hospitalno lečenje ubrzo nakon otpusta iz bolnice i

dalje predstavljaju veliki problem u razvoju

savremene, efikasne i bezbedne terapije akutne

srčane insuficijencije.

Serelaksin - humani rekombinantni relaksin

(RLX030)

Humani rekombinantni relaksin - serelaksin

(C256H408N74O74S8, Slika 1) predstavlja derivat

5Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

relaksina, vazoaktivnog peptida prirodnog porekla,

čije je pojačano oslobađanje zabeleženo tokom

graviditeta sa pozitivnim dejstvima na ukupnu

vaskularnu rezistenciju u organizmu trudnica,

evidentnom stimulacijom dilatacije bubrežnih

krvnih sudova i izraženim proangiogenetskim, ani-

inflamatornim i antifibroznim efektima (4, 5).

Vezivanje relaksina za pripadajuće G-protein

zavisne RXFP1 relaksinske receptore dovodi do

aktivacije različitih intraćelijskih signalnih puteva,

od kojih posebno mesto zauzimaju stvaranje

cAMP, kao sekundarnog glasnika i azot oksida

(NO), kao efektornog molekula (6). Sa tim u vezi,

danas je poznato da je vazodilatacija izazvana

relaksinom primarno izražena na krvnim sudovima

sa već povećanim tonusom (6), što ovaj peptid

stavlja u grupu veoma važnih vazoaktivnim

supstanci sa potencijalnim vazoprotektivnim

dejstvom u prisustvu različitih poremećaja

esencijalnih homeostatskih mehanizama

uključenih u kontinuiranu regulaciju vaskularnog

tonusa. U odnosu na funkciju srčanog mišića, na

različitim animalnim modelima pokazano je da

relaksin prevenira oštećenja nastala sukcesivnim

procesima ishemije i reperfuzije, zatim da redukuje

fibrozne promene vezane za hipertenziju i

kardiomiopatiju, kao i da samanjuje propadanje

srčanih ćelija i poremećaje kontraktilne funkcije u

sklopu infarkta miokarda (5).

Slika 1. Hemijska formula serelaksina.

Inicijalna ispitivanja adekvatnog doziranja

relaksina bila su obuhvaćena studijom IIb faze pod

nazivom Pre-RELAX-AHF (Relaxin for the

treatment of patients with acute heart failure) (7,

8). Naime, 234 pacijenata primljenih unutar 16 sati

sa simptomima akutne dekompenzovane srčane

insuficijencije je randomizovano u četiri grupe sa

različitim dozama relaksina (10, 30, 100, and 250

μg/kg/dnevno), kao i placebo grupu ispitanika.

Klinički su evaluirani promene dispnoje, zatim

bubrežne funkcije, kao i bezbednost primene.

Protokolom je bilo predviđeno obustavljanje

primene leka u slučaju pada sistolnog pritiska

ispod 100 mmHg ili pada sistolnog pritiska za 40

mmHg u odnosu na bazalnu vrednost. Ključni

rezultati ovog ispitivanja su pokazali optimalno

poboljšanje dispnoičnih tegoba i znakova

kongestije, kao i sigurnost primene pri doziranju

od 30 μg/kg/dnevno, takođe sa održivim nalazom

popravljanja dispnoje. U odnosu na sistolni krvni

pritisak, najbolji rezultati su detektovani u grupi

ispitanika sa sistolnim pritiskom iznad 140 mmHg,

dok statistička razlika nije bila evidentna u grupi

pacijenata sa normalnim vrednostima sistolnog

pritiska u odnosu na placebo. U navedenoj dozi od

30 μg/kg/dnevno zabeleženo je značajno

smanjenje kombinacije kardiovaskularnog

mortaliteta i ponovne hospitalizacije usled srčane

ili bubrežne insuficijencije, kao i redukcija stope

mortaliteta kardiovaskularne geneze u toku 180

dana.

Serelaksin je do sada ispitivan u kliničkim

studijama prve i druge faze (9), ali su do sada

najvažniji rezultati dobijeni u trećoj fazi evaluacije

ovog leka. Naime, efekti serelaksina u akutnoj

srčanoj insuficijenciji ispitivani su u populaciji od

1161 pacijenta u kliničkoj studiji treće faze pod

nazivom RELAX-AHF (Serelaxin, recombinant

human relaxin-2, for treatment of acute heart

failure), koja je po svom karakteru bila

prospektivna, multicentrična, randomizirana,

placebo-kontrolisana i dvostruko slepa (10-13).

Ispitanici su randomizirani u grupu koja je dobijala

serelaksin kontinuiranom intravenskom infuzijom

u toku 48 sati i u dozi od 30 μg/kg/dnevno u

odnosu na placebo grupu. Pacijenti su bili

uključeni u ispitivanje ukoliko su hospitalizovani

unutar 16 sati od pojave simptoma akutne

dekompenzovane srčane insuficijencije, sa

sistolnim pritiskom iznad 125 mmHg,

poremećajem bubrežne funkcije i povećanim

vrednostima moždanog natriuretskog peptida u

serumu. Ipak, u toku samog sprovođenja

ispitivanja bilo je indikovano da se doza prepolovi

u slučaju pada krvnog pritiska za 40 mmHg, dok je

ispitivanje u potpunosti obustavljano u slučaju

pada sistolnog krvnog pritiska ispod 100 mmHg.

6 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Definisana su i praćena dva primarna ishoda:

promena dispnoje od bazalne zabeležene vrednosti

sve do petog dana praćene vizuelnom analognom

skalom (VAS), kao i umereno ili značajno

popravljanje dispnoje detektovane sedmostepenom

Likert-ovom skalom u toku 6, 12 i 24 časa.

Sekundarni ciljevi su obuhvatali broj dana

preživljavanja van bolničke ustanove do dana broj

60, kao i kombinovanovano praćenje smrtnog

ishoda kardiovaskularnog porekla ili ponovne

hospitalizacije usled srčane ili bubrežne

insuficijencije pre dana broj 60.

Rezultati RELAX-AHF studije su pokazali

da je serelaksin prouzrokovao značajno

popravljanje dispnoje u odnosu na placebo praćene

vizuelnom analognom skalom (p=0.007), ali ne i

Likert-ovom skalom (p=0.7). U grupi pacijenata

tretiranih serelaksinom je zabeležena veća

učestalost pojave hipotenzije, koja je zahtevala

korekciju doze (p<0.0001), dok je veći broj

neželjenih događaja vezanih za poremećaj

bubrežne funkcije evidentiran kod ispitanika

randomiziranih u placebo grupu (p=0.03). Iako

nije bilo evidentnih razlika između ispitivanih

grupa u odnosu na sekundarne ciljeve studije, ipak

je posle 180 dana mortalitet bez obzira na uzrok

bio manji u grupi ispitanika tretiranih serelaksinom

u korelaciji sa placebom (placebo=65 smrtnih

ishoda, serelaksin=42 smrtna ishoda, p=0.019), što

je takođe zabeleženo i u odnosu na

kardiovaskularni mortalitet (placebo=55 smrtnih

ishoda, serelaksin=35 smrtnih ishoda, p=0.028)

(10). Treba istaći da je dobijeni rezultat od

potencijalnog kliničkog značaja jer se otvara

prihvatljiva mogućnost primene kratkotrajnog

terapijskog protokola serelaksinom sa produženim

pozitivnim efektima i prolongiranim protektivnim

dejstvom na srčani mišić (14).

Istaroksim

Istaroksim [(E,Z)-3-((2-aminoetoksi) imino)

androstan-6,17-dion] (Slika 2) je farmakološki

aktivna supstanca za intravensku primenu sa

inotropnim i luzitropnim efektima. Naime, na

nivou srčane mišićne ćelije istaroksim inhibira

Na(+)/K(+)-ATPazu sarkoleme i na taj način

dovodi do porasta kalcijumovih jona u citosolu, ali

i dodatne stimulacije izoforme-2a Ca2+

-ATPaze

(SERCA-2a) sarkoplazmatskog retikuluma (15,

16). Iako bi opisani mehanizam za posledicu

mogao imati inicijalno popravljanje sistolne

funkcije, ovo bi u isto vreme moglo negativno

uticati na dijastolnu funkciju, a kasnije i na sledeću

sistolu. Ipak, stimulacija SERCA-2 omogućava

premeštanje jona kalcijuma u sarkoplazmatski

retikulum i prevenciju pojave aritmija usled

porasta kalcijuma u citosolu (8, 17). Drugim

rečima, istaroksim stimuliše akumulaciju

kalcijumovih jona u citosolu tokom sistole, čime

prouzrokuje pozitivno inotropno dejstvo, dok u

toku dijastole ubrzava sekvestraciju kalcijuma u

sarkoplazmatski retikulum, čime se ispoljava

pozitivni luzitropni efekat (18). Sa tim u vezi,

rezultati različitih prekliničkih farmakodinamskih

studija su pokazali da istaroksim snažno ubrzava

porast i pad pritiska u levoj srčanoj komori i

smanjuje pritisak i ukupni volumen na kraju

dijastole bez istovremenih promena srčane

frekvence i krvnog pritiska, što sve ukazuje na

povoljan farmakološki profil istaroksima u

ispoljavanju pozitivnog inotropnog efekta i

ubrzane relaksacije srčanog mišića bez dodatnog

utroška energije (19, 20). Na posletku, u odnosu da

digoksin (kardiotonički glikozid), istaroksim

pojačava kontraktilnost srčanog mišića za 60 %

bez pojave ektopičnih kontrakcija, što nije slučaj

sa digoksinom, koji dovodi do pojačanja

kontraktilnosti za najviše 20 % uz istovremeno

signifikantno veći toksični potencijal u odnosu na

istaroksim (21).

Slika 2. Hemijska formula istaroksima.

U inicijalnoj studiji prve i druge faze, koja je

po svojim osobinama bila multicentrična,

7Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

dvostruko slepa i placebo-kontrolisana, pacijenti sa

hroničnom srčanom insuficijencijom stabilnog

toka (ejekciona frakcija leve komore ≤ 40 %)

dobijali su četiri jednočasovne infuzije istaroksima

u dozama od 0.005–5.0 μg/kg/min (17, 22).

Konkretnije, pacijenti su randomizirani u tri grupe

od po šest ispitanika. Prva grupa je primila tri

jednočasovne infuzije malih doza istaroksima

(0.005, 0.0167, i 0.05 μg/kg/min) i placebo, druga

grupa je primila srednji opseg doza (0.167, 0.5, i

1.0 μg/kg/min) i placebo, a treća grupa dozni

raspon sa velikim dozama (1.67, 3.33 i 5

μg/kg/min) i placebo. Na ovaj način, svaki

ispitanik je bio sopstvena kontrola. Osnovni cilj

ispitivanja je bio evaluacija sigurnosti primene i

podnošljivosti leka. Istaroksim je ispoljio

adekvatnu efikasnost u dozama iznad 1.0

μg/kg/min sa dobrom podnošljivošću u dozama do

3.33 μg/kg/min. Kardiografski nalazi su pokazali

pojačanje kontraktilnosti miokarda, dok su se

prateći hemodinamski efekti primene leka

povlačili posle jednog do dva sata nakon

obustavljanja infuzionog tretmana. Najčešća

neželjena dejstva su bila dozno-zavisna i odnosila

su se na gastrointestinalne tegobe, kao i bol na

mestu injekcije, odnosno primene infuzionog

rastvora (23).

U randomiziranoj, dvostruko slepoj i

placebo-kontrolisanoj studiji druge faze pod

nazivom HORIZON-HF (Hemodynamic Effects of

Istaroxime in Patients With Worsening HF and

Reduced LV Systolic Function), u kojoj su

evaluirani hemodinamski, ehokardiografski i

neurohumoralni efekti intravenske primene tri

doze istaroksima (0.5 μg/kg/min, 1 μg/kg/min i 1.5

μg/kg/min), pokazano je da istaroksim dovodi do

poboljšanja hemodinamskih parametara uz

prihvatljiv bezbednosni profil ispitivanog leka

(24). Ovo ispitivanje je obuhvatilo 120 pacijenata

starosne dobi između 18 i 25 godina sa akutnom

srčanom insuficijencijom i redukovanom

sistolnom funkcijom. Konkretnije, kriterijumi za

uključivanje u studiju su bili sledeći: plućni

kapilarni pritisak - PCWP (pulmonary capillary

wedge pressure) iznad 20mm, ejekciona frakcija

leve komore ispod 35%, sistolni krvni pritisak

između 90 i 150 mmHg i srčana frekvenca između

60 i 110 otkucaja u minutu. Pacijenti koji nisu bili

uključeni u studiju imali su sledeće karakteristike:

intravenska primena inotropnih lekova,

koncentracija digoksina u serumu iznad 0.5 ng/ml,

nedavni akutni koronarni sindrom ili koronarna

revaskularizacija, atrijalna fibrilacija, inplantirana

električna pomagala, koncentracija kreatinina u

serumu iznad 3 mg/dl i izraženi poremećaj

vrednosti enzima jetre. U grupi ispitanika koja je

dobijala istaroksim zabeleženo je brzo poboljšanje

u donosu na primarni ishod od interesa (PCWP),

bez obzira na primenjenu dozu leka sve do

završetka šestog sata od početka primene.

Istaroksim je takođe prouzrokovao statistički

evidentno smanjenje srčane frekvence i značajno

povećanje sistolnog pritiska uz umereno

popravljanje elektrokardiografskih parametara

dijastolene funkcije leve komore (25). Sa druge

strane, nije bilo značajnijih promena u vrednostima

praćenih biohemijskih parametara između

ispitivanih grupa tretiranih istaroksimom u odnosu

na placebo. Farmakokinetska ispitivanja u okviru

sprovedenog istraživanja su pokazala da je

istaroksim supstanca sa kratkim biološkim

poluvremenom eliminacije (< 1h) i da se u većoj

meri ne izlučuje putem bubrega (26). Najčešća

neželjena dejstva su bila ispoljena od strane

gastrointestinalnog sistema, a takođe je kod

značajnog broja ispitanika zabeležen bol na mestu

injekcije.

Zaključak

Serelaksin je farmakološki aktivna

supstanca, za koju je u dosadašnjim ispitivanjima

lečenja akutne srčane insuficijencije pokazano da

redukuje dispnoju i srčanu kongestiju, ali da sa

druge strane kod tretiranih pacijenata može da

prouzrokuje smanjenje krvnog pritiska kao rezultat

vazodilataornog mehanizma dejstva. Osim

protektivnog dejstva na nivou srčanog mišića,

serelaksin prouzrokuje i renoprotektivno, kao i

zaštitno dejstvo vezano za funkciju jetre.

Istaroksim je supstanca sa povoljnim

farmakodinamskim, farmakokinetskim i

bezbednosnim profilom u tretmanu akutne strčane

insuficijencije, što je do sada potvrđeno velikim

brojem eksperimentalnih ispitivanja na animalnim

modelima, kao i početnim rezultatima sprovedenih

8 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

kliničkih studija. Za sada se na osnovu ne tako

velikog broja nalaza može reći da bi intravenska

primena istaroksima u razumljivoj meri odgovarala

pacijentima sa akutnom srčanom insuficijencijom

praćenom sniženim krvnim pritiskom. Na

posletku, može se zaključiti da iako akutna srčana

insuficijencija danas predstavlja predmet veoma

obimnih i detaljnih prekliničkih i kliničkih studija,

budućim kliničkim ispitivanjima bi tek trebalo da

se utvrdi da li efikasnost i bezbednost primene

novih lekova u razvoju odgovaraju inicijalno

postavljenim ciljevima primene, kao i rezultatima

dobijenim u in vitro uslovima i ranim fazama

kliničkih ispitivanja.

Literatura

1. Mentz RJ, Felker GM et al. Learning from recent

trials and shaping the future of acute heart failure

trials. Am Heart J 2013;166(4):629-35.

2. Cotter G, Milo O, Davison B. The pathophysiology

of AHF —New insights from recent studies of novel

diuretics and vascular modulating therapies. WJCD

2013; 3: 133-45.

3. Pöss J, Link A, Böhm M. Acute and chronic heart

failure in light of the new ESC guidelines. Herz 2013;

DOI: 10.1007/s00059-013-3986-9.

4. Nakou ES, Vardas PE. Newtherapeutic options in

heart failure.What's on the horizon? An overview, Int J

Cardiol 2013;

http://dx.doi.org/10.1016/j.ijcard.2013.10.038.

5. Givertz MM, Teerlink JR et al. Acute

decompensated heart failure: update on new and

emerging evidence and directions for future research. J

Card Fail. 2013;19(6):371-89.

6. Radenković M. Relaksin – značaj za vaskularni

sistem. Med Podml 2009; 60 (1-2): 115-18.

7. Teerlink JR, Metra M et al. Relaxin for the treatment

of patients with acute heart failure (Pre-RELAX-AHF):

a multicentre, randomised, placebo-controlled, parallel-

group, dose-finding phase IIb study. Lancet

2009;373(9673):1429-39.

8. Ezekowitz JA. Novel pharmacologic therapies in

development for acute decompensated heart failure.

Curr Cardiol Rep 2013;15(2):329.

9. Miyares MA, Davis KA. Serelaxin, a 'Breakthrough'

Investigational Intravenous Agent for Acute Heart

Failure. Pharmacy & Therapeutics 2013; 38 (10): 606-

11.

10. Teerlink JR, Cotter G et al. Serelaxin, recombinant

human relaxin-2, for treatment of acute heart failure

RELAX-AHF): a randomised, placebo-controlled trial.

Lancet 2013;381(9860):29-39.

11. Metra M, Cotter G et al. Effect of serelaxin on

cardiac, renal, and hepatic biomarkers in the Relaxin in

Acute Heart Failure (RELAX-AHF) development

program: correlation with outcomes. J Am Coll Cardiol

2013;61(2):196-206.

12. Metra M, Ponikowski P et al. Effects of serelaxin

in subgroups of patients with acute heart failure: results

from RELAX-AHF. Eur Heart J 2013;34(40):3128-36.

13. Zamani P, Greenberg BH. Novel vasodilators in

heart failure. Curr Heart Fail Rep 2013;10(1):1-11.

14. Schmieder RE. RELAX-AHF: consistency across

subgroups and new hypotheses generated. Eur Heart J

2013;34(40):3100-1.

15. Ferrandi M, Barassi P et al. Istaroxime stimulates

SERCA2a and accelerates calcium cycling in heart

failure by relieving phospholamban inhibition. Br J

Pharmacol 2013;169(8):1849-61.

16. Huang CL. SERCA2a stimulation by istaroxime: a

novel mechanism of action with translational

implications. Br J Pharmacol 2013;170(3):486-8.

17. Farmakis D, Filippatos G. Istaroxime: is the remedy

better than the disease? Cardiovasc Drugs Ther

2011;25(2):115-7.

18. Pöss J, Link A, Böhm M. Pharmacological

treatment of acute heart failure: current treatment and

new targets. Clin Pharmacol Ther 2013;94(4):499-508.

19. Hasenfuss G, Teerlink JR. Cardiac inotropes:

current agents and future directions. Eur Heart J

2011;32(15):1838-45.

20. Gheorghiade M, Ambrosy AP, Ferrandi M, Ferrari

P. Combining SERCA2a activation and Na-K ATPase

inhibition: a promising new approach to managing

acute heart failure syndromes with low cardiac output.

Discov Med 2011;12(63):141-51.

21. Aditya S, Rattan A. Istaroxime: A rising star in

acute heart failure. J Pharmacol Pharmacother

2012;3(4):353-5.

9Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

22. Ghali JK, Smith WB et al. A phase 1-2 dose-

escalating study evaluating the safety and tolerability of

istaroxime and specific effects on electrocardiographic

and hemodynamic parameters in patients with chronic

heart failure with reduced systolic function. Am J

Cardiol 2007;99(2A):47A-56A.

23. Luciani P, Fevre M, Leroux JC. Development and

physico-chemical characterization of a liposomal

formulation of istaroxime. Eur J Pharm Biopharm

2011;79(2):285-93.

24. Shah SJ, Blair JE et al. Effects of istaroxime on

diastolic stiffness in acute heart failure syndromes:

results from the Hemodynamic, Echocardiographic, and

Neurohormonal Effects of Istaroxime, a Novel

Intravenous Inotropic and Lusitropic Agent: a

Randomized Controlled Trial in Patients Hospitalized

with Heart Failure (HORIZON-HF) trial. Am Heart J

2009;157(6):1035-41.

25. Selby VN, Teerlink JR. What's new in the treatment

of acute heart failure? Curr Cardiol Rep

2013;15(9):393.

26. Khan H, Metra M et al. Istaroxime, a first in class

new chemical entity exhibiting SERCA-2 activation

and Na-K-ATPase inhibition: a new promising

treatment for acute heart failure syndromes? Heart Fail

Rev 2009;14(4):277-87.

10 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

SAVREMENI TRETMAN ANEURIZMI ABDOMINALNE AORTE

Prof Dr Lazar Davidović¹ ², Dr Perica Mutavdžić ¹

¹ Klinika za vaskularnu i endovaskularnu hirurgiju KCS

² Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Uvod

Aneurzma je lokalizovano trajno proširenje

krvnog suda najmenja 50% u odnosu na normalan

dijametar1. Abdominalna aorte predstavlja

najčešću lokalizaciju na kojoj se aneurizma sreće.

Prirodni tok aneurizmatske bolesti abdominalne

aorte (AAA) vodi komplikacijama. To su:

kompresija, tromboza, embolizacija i ruptura (1-9).

Aortna aneurizma može vršiti pritisak na bilo koju

susednu strukturu, a najčešće su to nervi i vene.

Zato kompresija može dati lokalizovane bolove,

neuralgije, venske tromboze i uzrokovati

disfunkciju organa koje pritiska. Mnogo opasnije

komplikacije su tromboza ili distalna embolizacija

koje, ako se ne dijagnostikuju i reše blagovremeno,

dovode do ireverzibilne ishemije donjih

ekstremiteta i njihovog gubitka. Najfatalnija

komplikacija aneurizme je ruptura koja uglavnom,

dovodi do teškog hemoragijskog šoka(2-8).

Slika 1. (levo) Tromb u aneurizmatskoj vreći. (sredina) embolija račve desne zajedničke ičijačne arterije

delovima tromba iz AAA. (desno). Retroperitonealni hematom kod bolesnika sa rupturiranom AAA.

Zbog prethodno rečenog, pored svih

simptomatskih, elektivna operacija se indikuje kod

asimptomatskih AAA koje (10-12):

1. su veće od 4.5cm u prečniku;

2. izazivaju palpatornu osetljivost trbuha;

3. izazivaju osećaj napetosti;

4. dovode do gubitka težine;

Tretman

Tretman AAA može biti neoperativan,

hirurški i endovaskularni.

Neoperativni tretman

Shodno prethodnim navodima neoperativni

tretman AAA je indikovan kod asimptomatskih

bolesnika sa aneurizmom prečnika ispod 4.5cm

(10-12). Ovaj tretman podrazumeva eliminaciju

riziko-faktora koji doprinose nastanku i rastu

AAA. Konkretno misli se na pušenje, gojaznost,

hiperlipidemiju i hipertenziju. Takvi bolesnici

zahtevaju jedno godišnje utrazvučno praćenje,

kako bi se blagovremeno verifikovao rast AAA

(10-12).

Hirurški tretman

Marta meseca 1951 godine, francuski

hirurg Dubost je resecirao AAA, a protok

rekonstruisao kadaveričnim homoarterijskim

graftom (13). U meĎuvremenu je ova operacija

pojednostavljena i usavršena. Savremeno

standardno hirurško lečenje AAA započinje

transperitonealnim (medijalna ksifopubična

laparotomija) ili ekstraperionealnim (levostrana

11Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

lumbotomija) pristupom. U slučaju standardnih

infrarenalnih AAA koje su ujedno i najčešće,

uglavnom se primenjuje transperitonealni pristup.

Nakon što se učini laparotomija, privremeno se

nagore eviscerira omentum majus i transverzalni

kolon, a desno tanka creva. Na taj se način dolazi

do retroperitoenuma. Sledi mobilisanje trećeg i

četvrtog dela duodenuma presecanjem Trajcovog

ligamenta. Potom se se identifikuje i markira

proksimalni aneurizmatski vrat (najčešće

infrarenalni segment aorte), a potom obe ilijačne

arterije (2-8). Pet minuta pošto se bolesniku

administrira heparin (100 ij po kg/TT) klemuju se

promsimalni aneurizmatski vrat i obe ilijačne

arterije. Aneurizma se potom otvara po prednjem

zidu i iz nje odstrani parijetalni tromb.

Shema 1. (levo) Nakon klemovanja proksimalnog aneurizmatskog vrata i ilijačnih arterija, aneurizma se

otvara po prednjem zidu; (desno).Potom se iz aneurizmatske vreće odstranjuje tromb.

Restauracija protoka se vrši implantacijom tubularnog ili bifurkacionog grafta, zavisno od stanja

ilijačnih arterija(1-12).

Slika 2. (levo) Restauracija protoka tubularnim graftom kod bolesnika sa neizmenjenim ilijačnim

arterijama; (desno) Restauracija protoka bifurkacionim graftom kod bolesnika sa istovremeno obolelim

ilijačnm arterijama

B

12 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Prvu operaciju AAA u tadašnjoj Jugosalviji

a na II-oj hirurškoj klinici, izveli su profesori

Stojanović, Vujadinović i Marković 1965 godine

(14).

Endovaskularni tretman

Prvi endovaskularni tretman AAA (EVAR)

izveo je argentninski vaskularni hirurg Parodi

1991. godine (15), dok je prva takva procedura u

Srbiji izvedena 2007 godine (16). Endovaskularni

tretman AAA (EVAR) podrazumeva implantaciju

stent grafta pristupom kroz femoralne arterije u

aneurizmatsku kesu. Nakon toga on se ekspandira i

fiksira za proksimalni i distalni aneurizmatski vrat

i tako aneurizmu isključuje iz cirkulacije (15).

Slika 3. A. MSCT pokazuje aneurizmu abdominalne aorte pre tretmana; B. Plasman stent grfat kroz

aneurizmatsku kesu; C. Stanje nakon ekspanzije stent grafta čime je aneurizma eksludirana iz cirkulacije;

D. Kontrolni MSCT dva dana nakon procedure pokazuje uredan nalaz.

To je značajno manje rizična procedura od

klasične, „otvorene“ hirurgije, posebno kod

bolesnika opterećenih značajnim komorbiditetom.

Njome se izbegava otvaranje trbuha, klemovanje

aorte, hemodinamske oscilacije, krvavljenje i može

se izvoditi u regionalnoj anesteziji. Zbog svega

toga je ova procedura praćena značajno manjim

mortalitetom u prvih 30 postoperativnih dana, uz

istovremeno značajno skraćenje hospitalizacije

(17-19).

MeĎutim i ova procedura pored prednosti i

ima limite i nedostatke, a samim tim, indikacije i

kontraindikacije. Prvi limit je vezan za anatomiju

aneurizmatskog vrata (10-12). On mora biti dug

bar 1.5 cm ili će stent graft prekriti ishodišta

renalnih arterija. Aneurizmatski vrat može

maksimalno biti savijen pod uglom do 60º i ne sme

biti konusan. Sledeći limit su konfiguracija i

prečnik ilijačnih i femoralnih arterija. Da bi se

kroz njih iz prepone mogao plasirati

endovaskularni graft, one ne smeju biti suviše

izvijugane a njihov prečnik mora biti bar 7 mm jer

je prečnik sistema koji nosi graft 22 do 26 F (17-

21). Obzirom da se za svakog bolesnika posebno

kreira adekvatan stent graft, za njegovu nabavku

potrebno je vreme. Iz tih razloga, posebno u našim

uslovima, EVAR je veoma teško ili gotovo

nemoguće izvesti u urgentnim slučajevima.

EVAR je kontraindikovan ako su prisutne

aortoenterične fistule (infekcija), potkovičasti

bubreg (prekrivanje akcesornih renalnh arterija),

odnosno inflamatorne i mikotične aneurizme

(infekcija). EVAR je takoĎe kontraindikovan kod

bolesnika sa nedovoljno razvijenom Riolanovom

arkadom, a gde će se tokom procedure stent

graftom prekriti donja mezenterična i obe

unutrašnje ilijačne arterije, jer može doći do

fatalne ishemije sigmoidnog kolona (10-12,17-21).

Bubrežna insuficijencija i osetljivost na kontrast

koja je danas ekstremno retka, jesu relativne

kontraindikacije.

Bez obzira na usavršavanja, sistem

fiksiranja stent graftova i dalje nije dovoljno dobar.

Zbog toga se par godina nakon implantacije često

javljaju deformacija, migracija pa čak i infekcija

stent grafta (10-12,17-21). Neke od ovih

komplikacija se mogu rešiti novom

endovaskularnom procedurom, a neke zahtevaju

hitnu hiruršku konverziju. Jednostavnije rečeno

srednjoročni, a posebno udaljeni rezultati EVAR-a

su značajno lošiji nego nakon klasičnog hirurškog

lečenja (22,23).

13Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

Primena EVAR-a više od bilo kojih

prethodnih procedura zahteva i odgovarajuću

ekonomsku analizu. Cena stent grafta od oko 9000

€ skoro 30 puta prevazilazi cenu standardnog

aortnog grafta čija je cena oko 300 €.

Imajući u vidu sve medicinske i

ekonomske aspekte smatramo da je endovaskularni

tretman aneurizmi abdominalne aorte opravdan

samo kod visoko rizičnih bolesnika gde je klasično

hirurško lečenje opterećeno neopravdano visokim

perioperativnim rizikom, i to pod uslovom da

nema limita i kontraindikacija (12).

Zaključak

Treatman bolesnika sa AAA je mnogo

uspešniji ako se izvede pre nego što dodje do

rupture. To znači da je veoma važno blagovremeno

otkriti asimptomatske slučajeve. Zbog toga su

neophodni skrining ultrazvučni pregledi. Oni su

pojednostavljeno, indikovani kod sledeće tri

kategorije bolenika (10-12).

1. Muškarci stariji od 65 godina.

2. Muškarci stariji od 55 godina sa

pozitivnom porodičnom anamnezom

3. Žene starije 65 godina, pušači sa

pozitivnom porodičnom anamnezom

Literatura

1. Johnston KW, Rutherford RB, Tilson

MD, et al. Suggested standards for

reporting on arterial aneurysms. J Vasc

Surg 1991, 13:452.

2. Marković M, Davidović L, Maksimović

Ž, et al. Ruptured Abdominal Aortic

Aeneurysm. Predictors of Survival in

229 Consecutive Surgical Patients.

HERZ 2004, 29(1): 123-9.

3. Davidović L, Marković M, Kostić D, et

al. Ruptured Abdominal Aortic

Aneurysms: Factors Influencing Early

Survival. Ann Vasc Surg 2005, 19(1):

29-34.

4. Davidovic L, Kostic D, Cvetkovic S, et

al. Aorto- Caval Fistulas. Cardiovasc

Surg 2002, 10 (6):555-60.

5. Cinara I, Davidovic L, Kostic D et al.

Aorto-Caval Fistulas: a Review of

Eighteen Years Experience. Acta Chir

Belg 2005, 105 (6):616-20.

6. Davidovic L, Markovic M, Jakovljevic

N, et al. Unusual forms of ruptured

abdominal aortic aneurysms. Vascular

2008, 16 (1): 17-24.

7. Markovic M, Davidovic L, Savic N, et

al: Intraoperative Cell Salvage versus

Allogeneic Transfusion during

Abdominal Aortic Surgery: Clinical and

Financial Outcomes. Vascular

2009;17(2): 83-92.

8. Davidovic L, Dragas M, Cvetkovic S,

Kostic D, Cinara I, Banzic I. Twenty

years of experience in the treatment of

spontaneous aorto-venous fistulas in a

developing country. World J Surg 2011,

35 (8):1829-34.

9. L. Davidović , M. Marković, N. Ilić N,

D. Kostic, D. Simic, I. Tomic. Repair of

abdominal aortic aneurysm in the

presence of the horse shoe kidney. Intern

Angiol 2011, 30 (6): 534-40.

10. Moll FL, Powell JT, Friedrich G, et al.

Management of abdominal aortic

aneurysms clinical practice guidelines of

the European Society for Vascular

Surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg

2011, 41: S1-S58.

11. Chaikof EL, Brewster DC, Dalamn RL,

et al. The care of patients with and

abdominal aortic aneurysm: The Society

for Vascular Surgery practice

guidelines. J Vasc Surg 2009, 50 (8S):1-

50.

12. Nacionalni vodič dobre kliničke prakse

zadijagnostikovanje i lečenje

aneurizmatske bolesti trbušne aorte.

Beograd 2012.

13. Dubost C, Allary M, Olconomos N.

Resection of an aneurysm of the

abdominal aorta. Reesetablishement of

the contiuity by a preserved human

arterial graft with result after five

months. Arch Surg 1952, 64:405-8.

14. Stojanović Stojanović V, Vujadinović B,

Marković A. Slučaj aneurizme

abdominalne aorte hirurški izlečen. Srp

Arh Cel Lek 1966, 94:117.

15. Parodi JC, Criado FJ, Barone HD et al.

Endoluminal aortic aneurysm repair

utilizing the Parodi Balloon-expandable

stent-graft device: A progress report.

Ann Vasc Surg 1995, 2:153.

16. Davidović L, Čolić M, Končar I, et al:

Endovaskularno lečenje aneurizmi aorte:

14 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

preliminarni rezultati. Srp Arh Celok

Lek 2009;137 (1-2):10-17.

17. EVAR trial participants. Endovascular

aneurysm repair and outcome in patients

unfit for open repair of abdominal aortic

aneurysm (EVAR trial 2): Randomized

controlled trial. Lancet 2005; 365:2187-

92.

18. Greenhalgh RM, Brown LC, Kwong

GP, et al. Comparison of endovascular

aneurysm repair with open repair in

patients with abdominal aortic aneurysm

(EVAR trial 1), 30-day operative

mortality results: randomized controlled

trial. Lancet 2004; 364:843-8.

19. Prinssen M, Verhoeven EL, Buth J, et

al; Dutch Randomized Endovascular

Aneurysm Management (DREAM) Trial

Group. A randomized trial comparing

conventional and endovascular repair of

abdominal aortic aneurysms. N Engl J

Med 2004; 351:1607-18.

20. LB. Davidović, Đ. Radak, I. Končar, D.

Sagić, M. Čolić, I. Banzić. Endovascular

aortic repair: initial experience in the

Serbian bi-centric study. Eur Surg 2011,

43(5):302-308.

21. Koncar I, Colic M, Ilic N, Cvetkovic S,

Dragas M, Cinara I, Kostic D,

Davidovic L. Endovascular aortic repair:

first twetny years. Srp Arh Celok Lek

2012, 140 (11-12):792-799.

22. De Bruin JL, Baas AB, Buth JA, et al.

Long-term outcome of opne or

endovascular repair of abdominal aortic

aneurysms. N Engl J Med 2010,

362:1881-0.

23. Stather PW, Sidloff D, Dattani N, et al.

Systematic rewiev and meta-analysis of

the early and late outcomes of openad

and endovascular repair of abdominal

aortic aneurysms. Br J Surg 2013,

100:863-72.

15Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

MITOHONDRIJALNE BOLESTI – HISTOHEMIJSKE I ULTRASTRUKTURNE

KARAKTERISTIKE

Autori: Miloš Bajčetić1, Milica Labudović Borović

1, Jelena Kostic

1, Ivan Zaletel

1 i Vesna Lačković

1

Institut za histologiju i embriologiju “Aleksandar Đ. Kostić“, Medicinski fakultet, Univerzitet u

Beogradu

Mitohondrijalne bolesti (mitohondropatije)

predstavljaju brojnu i klinički veoma heterogenu

grupu oboljenja, odnosno sindroma u čijoj osnovi

leži poremećaj funkcije respiratornog lanca

mitohondrija, koji nastaje kao posledica mutacija

kako na nivou nukleusne DNK (nDNK) tako i

mitohondrijalne DNK (mtDNK). Iako disfunkcija

mitohondrija dovodi do smanjene produkcije ATP-

a, u ćelijama svih tkiva, odnosno organa i

organskim sistemima, kliničkom slikom najčešće

dominiraju simptomi oštećenja tkiva koja u

najvećoj meri zavise od oksidativnog metabolizma

– nervnog i mišićnog.

Morfofunkcionalne karakteristike mitohondrija

Mitohondrije su ćelijske organele koji

igraju važnu ulogu u brojnim ćelijskim procesima.

Njihov broj varira zavisno od ćelijskog tipa i kreće

se od nekoliko desetina do nekoliko hiljada. Kako

su mitohondrije u živim ćelijama vrlo dinamične

strukture, njihov oblik na elektronskoj

mikroskopiji je promenljiv i varira od ovoidnog

(prečnika manjeg od 1μm) do tankih končastih,

meĎusobno umreženih formacija (dužine do 10 μm

i 0.5 μm širine).

Sa spoljašnje strane mitohondrije su

ograničene sa dve visoko specijalizovane

membrane izmeĎu kojih se nalazi intermembranski

prostor. Spoljašnja membrana sadrži brojne

molekule porina, transportnog proteina koji

omogućava da membrana bude propustljiva za

molekule mase do 5000 daltona, zbog čega je

hemijski sastav intermembranskog prostora

ekvivalentan citosolu. Sa druge strane, unutrašnja

membrana, je daleko manje permeabilna. U

njenom lipidnom dvosloju se osim proteinskih

kompleksa respiratornog lanca nalaze i transportni

proteini koji omogućavaju selektivni prolaz

manjim molekulima kao što su, na primer, piruvat

i masne kiseline. Unutrašnja mitohondrijalna

membrana obrazuje brojne karakteristične nabore

– kriste, koje značajno uvećavaju njenu površinu.

Tako, u hepatocitima, koje prosečno imaju 1000

do 2000 mitohondrija, unutrašnje membrane čine

1/3 svih membrana ćelije. Na drugoj strani broj

kristi u mitohondrijama srčanih mišićnih ćelija je

tri puta veći nego kod hepatocita, što je u direktnoj

vezi sa energetskim potrebama kardiomiocita (1).

Centralni deo mitohondrija ispunjava matriks u

kojem se nalazi visoko koncentrisana smesa

velikog broja enzima, uključujući i one neophodne

za oksidaciju piruvata i masnih kiselina, kao i

enzime Krebsovog ciklusa. Matriks takoĎe sadrži

nekoliko identičnih kopija mtDNK, ribozome,

molekule tRNK kao i brojne enzime neophodne za

ekspresiju mitohondrijalnih gena.

Mitohondrije su od vitalne važnosti za

homeostazu ćelije. Uključene su u brojne

intracelularne signalne sisteme, apoptozu,

intermedijarni metabolizam, sintezu steroidnih

hormona, metabolizam amino kiselina, lipida,

holesterola i nukleotida, i mnoge druge procese

(2). Osim navedenih, svakako najvažnija je uloge

mitohondrija u energetskom metabolizmu ćelije tj.

u produkciji ATP-a procesom oksidativne

fosforilacije.

Oksidativna fosforilacija je višestepeni

proces u kome učestvuju proteinski kompleksi

respiratornog lanca. Respiratorni lanac (slika 1)

sačinjava grupa od 5 enzimskih kompleksa

smeštenih na unutrašnjoj membrani mitohondrija i

sastavljenih od većeg broja subjedinica (najveći je

kompleks I sa više od 40 polipeptidnih

komponenti). Redukovani kofaktori NADH i

FADH, koji nastaju kao produkti intermedijarnog

metabolizma ugljenih hidrata, proteina i lipida,

predaju elektrone kompleksu I (NADH

dehidrogenaza) i kompleksu II (sukcinat

dehidrogenaza). Energija koja se oslobaĎa

prilikom transporta elektrona izmeĎu kompleksa

koristi se od strane kompleksa I, III (citohrom bc1

kompleks) i IV (citohrom c oksidaza) za pumpanje

protona (H+) iz mitohondrijalnog matriksa u

intermembranski prostor. Ovako stvoren protonski

gradijent koristi kompleks V (ATP sintaza) za

sintezu ATP od ADP i neorganskog fosfata. Za

prenos elektrona izmeĎu kompleksa respiratornog

lanca zadužena su dva elektronska nosača:

ubikvinon (koenzim Q) koji transportuje elektrone

sa kompleksa I i II na kompleks III i citohrom c,

koji elektrone prebacuje sa kompleksa III na

kompleks IV.

16 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Slika 1. Respiratorni lanac. Označene su samo subjedinice koje kodira mitohondrijalna DNK

Specifičnosti mitohondrijalne DNK

Mitohondrije su jedine ćelijske organele

koje imaju sopstvenu, mitohondrijalnu DNK

(mtDNK). Veći deo mitohondrijalnih proteina,

uključujući većinu proteinski subjedinica

respiratornog lanca, kodira nuklearna DNK, dok

manjim delom u tom procesu učestvuje mtDNK.

Za razliku od nukleusnog genoma, mtDNK

je dvostruko uvijeni, cirkularni molekul (slika 2)

sa 16569 baznih parova (3), koji sadrži samo 37

gena (4). Dva gena kodiraju ribozomalne RNK

subjedinice (12S i 16S rRNK), dok 22 gena

kodiraju transportne RNK (tRNK) (5). Ostalih 13

gena kodiraju proteinske subjedinice respiratornog

lanca (6). Oni obuhvataju 7 subjedinica kompleksa

I (ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 i ND6), 1

subjedinicu kompleksa III (Cyt b), 3 subjedinice

kompleksa IV (COX I, COX II i COX III) i 2

subjedinice kompleksa V (ATP6 i ATP8) (3).

Ostale subjedinice enzimskih kompleksa

respiratornog lanca su pod kontrolom nuklearnog

genoma (kompleks II u potpunosti kodira

nuklearna DNK).

U svakoj mitohondriji se nalazi, prosečno,

5 kopija mtDNK (7) koje se nasleĎuju matroklino i

koje imaju sopstveni replikativni sistem, nezavisan

od onog koji koristi nuklearni genom. S obzirom

na izloženost mtDNK delovanju slobodnih

radikala, koji nastaju u toku oksidativne

fosforilacije, nedostatak introna i histona, kao i na

slabu razvijenost reparatornih mehanizama

procenjuje se da je mtDNK najmanje 10 puta

podložnija somatskim mutacijama od nuklearne

DNK (8). Imajući ovo u vidu mtDNK se smatra

"slabom tačkom" humanog genoma što se

povezuje sa nastankom mnogih

neurodegenerativnih i malignih bolesti, kao i sa

procesom starenja.

Slika 2.Humana mitohondrijalna DNK. 12s i 16s rRNK (zeleno), NADH-dehidrogenaze – ND (crveno),

citocrom c okidaze – COX (svetlo plavo), citochrom b – Cyt b(narandžasto) i ATP sinthaze – A (žuto), 22

tRNK (plavo;. Označeni su sindromi odnosno bolesti koje nastaju usled mutacije odgovarajućih delova

mtDNK (uraĎeno prema DiMauro i Schon, 2008).

17Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

Mitohondrijalne bolesti

Mitohondropatije obuhvataju klinički,

histološki, biohemijski i genetski izrazito

heterogenu grupu bolesti odnosno sindroma koje

nastaju kao posledica strukturnih, biohemijskih ili

genetskih poremećaja mitohondrija.

Iako mitohondropatije obuhvataju nekoliko

različitih grupa oboljenja, sam termin specifično se

odnosi na poremećaje nastale na nivou

respiratornog lanca (9). Poremećaji respiratornog

lanca uzrokuju smanjenje kapaciteta mitohondrija

da proizvode ATP, što ćeliju dovodi u stanje

konstantnog energetskog deficita. Kao jedna od

posledica ovakve disfunkcije dolazi do povećane

konverzije piruvata u laktat, što se sistemski

manifestuje hroničnom laktatnom acidozom.

Mitohondrijalna disfunkcija može da se odrazi na

svaki energetski-zavisan proces i organ,

pokazujući multisistemski karakter, ali su, ovim

poremećajem, ipak, najviše pogoĎeni nervni i

mišićni sistem, zbog čega se često ove bolesti

nazivaju i mitohondrijalne encefalomiopatije (10).

Bolesti respiratornog lanca mogu nastati

usled defekta u mitohondrijalnoj ili nuklearnoj

DNK. Iste mutacije mtDNK mogu biti uzrok

različitih mitohondrijalnih oboljenja, dok ista

klinička slika može biti uzrokovana različitim

mutacijama mtDNK. Postojanje slabe korelacije

izmeĎu genotipa i fenotipa obolelih, kao i veoma

varijabilne fenotipske ekspresije mitohondropatija

znatno otežava postavljanje dijagnoze ovih

oboljenja.

Do sada je opisan veliki broj sindroma i

bolesti, kod kojih delecije ili tačkaste mutacije

mtDNK dovode do disfunkcije respiratornog lanca

(slika 2). MeĎu najvažnijim su: mitohondrijalna

encefalopatija sa laktatnom acidozom i epizodama

sličnim moždanom udaru (MELAS), mioklonusna

epilepsija sa iskrzanim crvenim vlaknima

(MERRF), Kearne-Sayreov sindrom (KSS),

progresivna eksterna oftalmoplegija (PEO),

neuropatija sa ataksijom i retinitis pigmentosa

(NARP) i Leberova hereditarna optička

neuropatija (LHON).

Mitohondrijalna encefalopatije sa laktatnom

acidozom i epizodama sličnim moždanom

udaru – MELAS

Sindrom mitohondrijalne encefalopatije sa

laktatnom acidozom i epizodama sličnim

moždanom udaru (eng. stroke-like episodes) –

MELAS, ubraja se meĎu najčešće nasledne bolesti

uzrokovane mutacijom mtDNK (11). Prve

pacijenata sa ovim sindromom opisali su Pavlakis i

saradnici 1984. godine, kada su u medicinsku

praksu uveli sam akronim MELAS (12). Naslednu

osnovnu u najvećem broju slučajeva čini tačkasta

mutacija MTL1 gena, koji kodira tRNK za leucin,

na poziciji 3243 mitohondrijalnog genoma, gde

dolazi do zamene adenina guaninom

(m.3243A>G) (13). Iako najčešća, ovo nije jedina

mutacija koja je povezana sa MELAS sindromom.

Otkriveno je još najmanje 29 tačkastih mutacija,

što MELAS čini poligenetskim oboljenjem (14).

MELAS predstavlja multisistemsko

oboljenje koje karakterišu tri gotovo

nepromenljive karakteristike: 1. epizode sličnih

moždanim udarima koje počinju pre 40. godine

života (često u periodu izmeĎu 4. i 15. godine); 2.

encefalopatija koju karakteriše pojava epileptičnih

napada i demencije, odvojeno ili zajedno; 3.

laktatna acidoza i histopatološki nalaz iskrzanih

crvenih vlakana (eng. ragged red fibers – RRF) na

biopsiji skeletnog mišića (15).

Termin "epizode slične moždanom udaru"

se koristi kako bi se naglasilo neishemijsko

poreklo neuroloških manifestacija pacijenata sa

MELAS-om. Uočeno je da regioni CNS-a koji su

zahvaćeni ovim akutnim, tranzitornim epizodama

ne odgovaraju anatomskoj distribuciji velikih

cerebralnih krvnih sudova, već da iregularna

distribucija promena pre ukazuje na metaboličko

ili mikroangiopatsko poreklo promena. Najčešće se

viĎaju asimetrične patološke promene

predominantno u temporalnim, parijetalnim i

okcipitalnim režnjevima korteksa, dok je duboka

bela masa relativno očuvana (10).

Osobe sa MELAS-om su najčešće nižeg

rasta i normalnog ranog psihomotornog razvoja.

Prvi simptomi se mogu javiti u periodu od 2. do

60. godine starosti, ali se kod 70% pacijenata

javljaju izmeĎu od 2. i 20. godine života (13).

Najčešće se prvo javljaju generalizovani klonično-

tonični epileptični napadi ili rekurentne glavobolje,

uz pojavu slabosti proksimalne muskulature

ekstremiteta i nepodnošenje fizičkog napora (10).

Dosadašnja istraživanja pokazuju da se povećani

nivo laktata u serumu ili cerebrospinalnoj tečnosti

javlja u 94% slučajeva, epileptični napadi u 96%, a

epizode sličnih moždanom udaru u 90% (13).

Često se dešava da suptilniji znaci

mitohondrijalne disfunkcije mogu ostati

neprepoznati pre pojave neuroloških oštećenja.

Epileptični napadi su često udruženi sa epizodama

sličnih moždanom udaru, u vidu tranzitorne

18 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

hemipareze ili kortikalnog slepila. Ponavljane

epizode sličnih moždanom udaru imaju

progresivan kumulativni efekat na oštećenje CNS-

a, tako da već u adolescenciji ili mlaĎem odraslom

dobu može doći do progresivne encefalopatije uz

pojavu simptoma demencije. Kod pacijenata sa

MELAS-om nije retka pojava diabetes mellitusa.

U slučaju potpuno razvijene kliničke slike, smrtni

ishod se javlja i pre navršenih 20 godina starosti.

Iako kliničkom slikom kod MELAS-a

dominiraju neurološki znaci, mogu se. takoĎe,

sresti i brojne visceralne i sistemske manifestacije

(psihijatrijske, endokrinološke, kardiološke,

bubrežne, dermatološke i gastrointestinalne).

Patološke promene koje nastaju usled

mitohondrijalne disfunkcije mogu u različitom

stepenu zahvatiti bilo koji organ ili organski

sistem, tako da je klinička slika MELAS-a veoma

varijabilna i kreće se od asimptomatskih nosioca

mutacije do pacijenata sa karakterističnom slikom

MELAS-a. Potpuno ispoljen klinički fenotip se

može videti samo kod malog broja pacijenata, dok

većinu čine asimptomatski pacijenti (10).

Histopatološki nalaz kod MELAS-a

Glavni patohistološki nalaz kod MELAS

pacijenata je pojava iskrzanih crvenih vlakana

(RRF) na optičkoj mikroskopiji biopsije mišića.

Primenom modifikovanog Gomori trihromnog

bojenja skeletnih mišićnih vlakana (16) RRF se

uočavaju kao iregularno rasporeĎeni, crveno

prebojeni delovi sarkoleme (17) koji predstavljaju

polja akumuliranih mitohondrija. Akumulacije

mitohondrija nastaju usled njihove kompenzatorne

proliferacije i smeštene su subsarkolemalno u vidu

iregularnih crvenih mrlja. Nalaz RRF je glavni

patohistološki marker koji upućuje na postojanje

mitohondropatije, ali nije specifičan za MELAS,

jer se javlja i kod drugih mitohondropatija

(MERRF, KSS).

Histohemijsko bojenje na sukcinat

dehidrogenazu (SHD – kompleks II koji kodira

isključivo nDNK) predstavlja senzitivniji marker

proliferacije mitohondrija. Većina RRF vlakana

pokazuje SDH pozitivnost, koja se može uočiti i u

RRF negativnim vlaknima, što predstavlja

suptilniju indikator proliferaciju mitohondrija.

Dva važna patohistološka svojstva koja

izdvajaju MELAS od drugih mitohondropatija jesu

varijabilna COX reaktivnost i promene na krvnim

sudovima. Naime, nalaz biopsije mišića kod većine

mitohondrijalnih oboljenja pokazuje nedostatak

aktivnosti COX enzima (COX negativna skeletna

mišićna vlakna), dok kod MELAS-a vlakna mogu

pokazivati smanjenu, normalnu ili čak povećanu

COX histohemijsku aktivnost (18). Ovaj nalaz

ukazuje na relativno očuvanu aktivnost

respiratornog lanca kod MELAS-a u poreĎenju sa

ostalim mitohondropatijama. Moguće objašnjenje

ovog fenomena je da COX aktivnost u

pojedinačnoj mitohondriji može biti smanjena, ali

da usled masivne proliferacije mitohondrija

ukupna COX aktivnost može biti normalna ili čak

povećana. Druga važna karakteristika MELAS-a

jesu promene na krvnim sudovima, koji pokazuju

snažnu SDH i COX pozitivnost (19), usled

proliferacije mitohondrija u glatkim miocitima i

endotelnim ćelijama.

Mioklonična epilepsija sa iskrzanim crvenim

vlaknima – MERRF

Sindrom MERRF (engl. Myoclonic

Epilepsy with Ragged Red Fibers) predstavlja

multisistemsko oboljenje koje karakteriše

mioklonična epilepsija, ataksija i nalaz iskrzanih

crvenih vlakana (RRF) na biopsiji skeletnih

mišićnih vlakana. Genetsku osnovu MERRF-a

predstavlja mutacija mtDNK, od kojih je najčešća

mutacija MT-TK gena koji kodira tRNKLys, gde

se u oko 80% slučajeva radi o tranzicionoj mutaciji

adenina u guanin u nukleotidu 8344 (m.8344A>G)

(20). U 10% slučajeva se javljaju mutacije

m.8356T>C, m.8363G>A ili m.8361G>A.

Mutacije su obično prisutne u ćelijama svih

tkiva i moguće ih je detektovati analizom mtDNK

iz leukocita krvi. MeĎutim usled pojave

heteroplazmije, tkivna distribucija mutirane

mtDNK može biti različita, pa se kod

oligosimptomatskih pacijenata ili asimptomatskih

nosioca mutacija, one ne mogu detektovati u

leukocitima, već samo u drugim tkivima – kulturi

fibroblasta kože, sedimentu urina, ćelijama oralne

mukoze, folikula dlake ili, najpouzdanije, u

skeletnom mišiću.

Kod pacijenata sa MERRF-om prvi

simptomi se javljaju u detinjstvu (nakon

normalnog ranog razvoja), u vidu miokloničnih

epileptičnih napada, posle kojih dolazi do pojave

generalizovanih epileptičnih napada, uz pojavu

ataksije, progresivne mišićne slabosti i demencije.

Osim navedenih, u česte kliničke manifestacije

spadaju i senzorineuralni gubitak sluha, periferna

neuropatija, demencija, nizak rast, nepodnošenje

napora i atrofija optičkog živca (21). Pored

pacijenata sa potpuno ispoljenom kliničkom

slikom, postoje i oligosimptomatski oblici

19Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

sindroma, kod kojih najčešće dominira mišićna

slabost. TakoĎe, zabeleženi su slučajevi kod kojih

dolazi do "preklapanja" dva sindroma (overlap

sindromi), kao što je pojava moždanih udara kod

pacijenata sa potpuno ispoljenom kliničkom

slikom MERRF-a (MELAS/MERRF overlap)

(22). Pacijenti nosioci mutacije m.8344A>G,

karakteristične za MERRF, mogu ispoljavati i

atipičnu kliničku sliku, poput bola u mišićima u

mirovanju, koji može biti inicijalni simptom kod

dece (23), ili se mogu javiti mioklonus, epilepsija i

ataksija, bez nalaza RRF na biopsiji mišića (24),

kao i pojava parkinsonizma, neuropatije i

miopatije uz mutaciju m.8344A>G (25). Nije

uočena jasna povezanost genotipa i kliničkog

fenotipa pacijenata sa MERRF-om, jer

raznovrsnost kliničke slike u velikoj meri zavisi od

heteroplazmije, efekta praga i tkivne distribucije

mutirane mtDNK.

Povišena koncentracija laktata u krvi i

likvoru je nespecifičan nalaz kod MERRF-a (kao i

kod većine mitohondropatija), uz često pojavu

povećane koncentracije proteina u likvoru.

Najčešći nalaz na magnetnoj rezonanci kod

pacijenata sa MERRF-om je generalizovana

cerebralna atrofija uz kalcifikaciju bazalnih

ganglija. U literaturi je opisana je pojava

bilateralne nekroze putamena uz atrofiju

moždanog stabla i cerebeluma (26).

Histopatološki nalaz kod MERRFA-a

Histohemijski nalaz biopsije skeletnih

mišića pacijenata sa MERRF-om pokazuje

karakteristična iskrzana crvena vlakna (RRF), uz

jasno pozitivnu reakciju na sukcinat dehidrogenazu

(SDH pozitivna vlakna).

RRF, ali i neka RRF negativna mišićna

vlakna pokazuju jasnu COX negativnost, mada

aktivnost ovog enzima može imati i normalne

vrednosti (27).

Kearns-Sayreov sindrom

Kearns-Sayreov sindrom (KSS) predstavlja

multisistemsko oboljenje koje predominantno

zahvata CNS, skeletne mišiće i srce. KSS nastaje

usled delecije mtDNK i karakteriše ga pojava

pigmentne retinopatije i hronične progresivne

eksterne oftalmoplegije (CPEO) pre 20. godine

starosti (28).

Prvi simptomi kod osoba obolelih od KSS

se najčešće javljaju u detinjstvu pojavom ptoze

očnih kapaka, oftalmoplegije i oslabljenog vida

noću, uz brzo napredovanje oštećenja vida.

Najčešće su oboleli od KSS nižeg rasta.

Progresijom bolesti dolazi do pojave cerebelarne

ataksije i demencije. Za razliku od drugih

mitohondrijalnih encefalomiopatija (MELAS,

MERRF, NARP), kod KSS se veoma retko javljaju

epileptični napadi i moždani udari.

Kod pacijenata sa KSS je česta pojava

mišićne slabosti, koja se može manifestovati kao

PEO, ptoza, slabost mišića orofarinksa, slabost

proksimalne muskulature ekstremiteta uz

intoleranciju fizičkog napora. Usled simetrične

slabosti bulbarnih mišića, moguća je pojava

mutnih ili duplih slika, dok se disfagija javlja kao

posledica slabosti mišića orofarinksa (29).

U sklopu KSS se često javlja blok u

sprovoĎenju srčanog impulsa, čak u vidu

kompletnog srčanog bloka, koji zahteva hitnu

implantaciju pejsmejkera (30). Kod ovih pacijenata

najčešće dolazi do smrtnog ishoda u mlaĎem

odraslom dobu.

Nivo laktata u krvi i likvoru kod pacijenata

sa KSS je često povišen, uz povišene vrednosti

nivoa proteina u likvoru, što predstavlja

nespecifičan nalaz kod ovih pacijenata. Nalaz na

magnetnoj rezonanci često ukazuje na postojanje

leukoencefalopatije, koja je često udružena sa

cerebralnom ili cerebelarnom atrofijom ili lezijama

bazalnih ganglija (30).

Kod pacijenata sa KSS-om se najčešće

javlja smanjena aktivnost subjedinica respiratornog

lanca koje kodira mtDNK (I, III, IV, V), što zavisi

od nivoa mutacionog opterećenja. U slučaju nižeg

nivoa opterećenja, aktivnost enzima respiratornog

lanca može biti normalna.

Do sada je utvrĎeno postojanje oko 150

različitih delecija mtDNK koje su povezane sa

KSS sindromom. Delecije mogu biti različite

veličine i zastupljenosti meĎu obolelima od KSS,

ali je kod jednog pacijenta uvek prisutna ista

delecija mtDNK. U oko 90% slučajeva se radi o

obimnim delecijama mtDNK koje obuhvataju 1,1-

10kb. Najčešća se kod pacijenata sa KSS javlja

delecija od 4977 bp, odnosno

m.8470_13446del4977 (31). Usled pojave

heteroplazmije, kod pacijenata sa KSS se često ne

mogu detektovati delecije mtDNK u leukocitima

krvi, već je za definitivnu dijagnostiku neophodno

uraditi molekularnu analizu biopsije mišića, gde je

veća verovatnoća pronalaženja delecije mtDNK.

Histopatološki nalaz kod KSS-a

Biopsija skeletnih mišića pacijenata sa KSS

pokazuje postojanje RFF, kao i pozitivnu reakciju

20 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

prilikom bojenja na SDH. RRF-pozitivna i RRF

negativna mišićna vlakna su histohemijski

negativna na COX (33131)..

Dijagnostika mitohondrijalnih bolesti

Pored kliničke slike, istorije bolesti i

magnetne rezonance u dijagnostici

mitohondorapatija pored laboratorijske i genetske

analize važnu ulogu igraju metode histohemijske i

ultrastrukturne analize.

Laboratorijske analize

Prvi korak u dijagnostici, svih

mitohondropatija je odreĎivanje nivo laktata u

serumu i cerebrospinalnoj tečnosti. Iako je

povišena koncentracija laktata u krvi jedan od

karakterističnih nalaza kod mitohondropatija, reč

je o nespecifičnom markeru, jer se on javlja i kod

drugih poremećaja metabolizma različitog porekla,

kao što su hipoksično-ishemijska oštećenja tkiva,

hiperglikemija, hipoglikemija, poremećaji u

metabolizmu aminokiselina i masnih kiselina,

deficit piruvat dehidrogenaze, defekti na nivou

Krebsovog ciklusa itd. Važno je napomenuti da se

nivo laktata i piruvata značajno uvećava sa

fizičkim naporom.

Genetska analiza

Pored ekstremne fenotipske polimorfnosti,

mitohondropatije se odlikuju i postojanjem velikog

broja mutacija na mtDNK. Zbog ove činjenica kao

i zbog postojanja „preklapajućih sindroma“, gde

jedna ista mutacija dovodi do nastanka različitih

oboljenja, analiza mtDNK najčešće nije dovoljne

za postavljanje definitivne dijagnoze oboljenja.

Zbog toga morfološka ispitivanja skeletnih mišića

mogu biti ključna dijagnostička procedura u

postavljanju dijagnoze.

Biopsija mišića i histohemijske metode

Nalaz iskrzanih crvenih vlakana (RRF) na

biopsiji mišića je glavni histološki marker koji

direktno upućuje na postojanje mitohondropatije.

Iskrzana crvena vlakna predstavljaju iregularne

konture sarkoleme skeletnih mišićnih vlakana koje

nastaju zbog subsarkolemalnog grupisanja velikog

broja izmenjenih mitohondrija. Na histološkim

preparatima, bojenim modifikovanom Gomori

trihrom metodom, ove akumulacije mitohondrija

se vide kao crvenkaste mrlje koje se, uglavnom,

nalaze na periferiji skeletnog mišićnog vlakna

(slika 3).

Slika 3. Tipičan nalaz iskrzanih crvenih mišićnih

vlakna (RRF) – modifkovano Gomori trihrom

bojenje (DiMauro, Biochim Biophys Acta

2004;1658:80-88).

Akumulacije nastaju usled značajne

kompenzatorne proliferaciju mitohondrija. Zbog

disfunkcije mitohondrijalnog respiratornog lanca

dolazi do smanjenja kapaciteta mitohondrija za

stvaranje ATP-a, što ćeliju dovodi u stanje

konstantnog energetskog deficita. Kada produkcija

energije u ćeliji padne ispod kritičnog praga, dolazi

do kompenzatorne proliferacije svih mitohondrija,

uključujući i one koje sadrže mutiranu mtDNK, što

se mikroskopski odlikuje subsarkolemalnim

nagomilavanjem atipičnih mitohondrija s

kristaloidnim inkluzijama i nastanka

patohistološke slike iskrzanih crvenih vlakana

(32). Nalaz više od 2% RRF je jasan dijagnostički

indikator mitohondrijalne bolesti (33). Na

kompenzatornu proliferaciju mitohondrija ukazuje

i jako pozitivno bojenje na sukcinat dehidrogenazu

(jedini proteinski kompleks respiratornog lanca

koji je pod isključivom kontrolom nuklearne

DNK). Interesantan i donekle specifičan

histopatološki nalaz kod MELAS-a je pozitivno

bojenje na citohrom c oksidazu (COX). Najveći

broj pacijenata sa MELAS-om ima normalnu ili

povećanu aktivnost ovog enzimskog kompleksa

(34). Kod ostalih mitohondropatija (MERRF, KSS,

PEO) RRF su histohemijski negativna na aktivnost

COX. Iako razlog za ovakav nalaz nije do kraja

rasvetljen, pretpostavlja se da je kod MELAS-a, za

razliku od drugih mitohondropatija, aktivnost

respiratornog lanca relativno očuvana. Važno je

naglasiti da negativan nalaz biopsije mišića ne

isključuje dijagnozu MELAS-a, naročito kod

osoba mlaĎih od 30 godina (33).

Ultrastrukturna analiza

Već na polutankim isečcima skeletnog

mišića bojenim toluidinom jasno se mogu uočiti

21Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

iregularni nabori sarkoleme sa subsarkolemalnom

akumulacijom brojnih mitohondrija nepravilnog

oblika, koje mišićnom vlaknu daju iskrzan,

nazubljeni oblik (RRF) (slika 4).

Slika 4. Skeletno mišićno vlakno (polutanki

isečak, toluidin plavo). Karakteristične

akumulacije mitohondrije ispod sarkoleme

(strelice).

Na nivou transmisione elektronske

mikroskopije (TEM) jasno se mogu uočiti

akumulacije brojnih izmenjenih mitohondrija u

perifernom delu skeletnog mišićnog vlakna odmah

ispod sarkoleme (slika 5). Na mestima

akumulacija, sarkolema je uzdignuta i neravnih

ivica. Patološki izmenjene mitohondrije se mogu

videti i unutar skeletnog mišićnog vlakna, izmeĎu

miofibrila. Broj mitohondrija u akumulacijama je

varijabilan i kreće se od nalaza pojedinačnih

izmenjenih mitohondrija, preko manjih grupa, do

ogromnog broja mitohondrija poreĎanih u

nekoliko redova, što je i najčešći histopatološki

nalaz.

Kod pacijenata sa mitohondropatijama

ultrastrukturno se može zapaziti i ekstremna

varijabilnost u veličini, ali i obliku mitohondrija

(slika 6). Veličina mitohondrija se kreće od 1-2 μm

pa sve do 15 i više μm. Varijabilnost oblika je još

izraženija, pa su se u odreĎenim slučajevim mogu

videti mitohondrije ovoidnog, cilindričnog i

kružnog oblika sa koncentrično rasporeĎenim

kristama, kao i mitohondrije nepravilnog i

bizarnog oblika. Pored ovih karakteristika u

matriksu odreĎenih mitohondrija može se uočiti i

prisustvo elektronski gustih parakristalnih

inkluzija.

Na kraju, treba istaći da je ultrastrukturna

analiza skeletnih mišićni vlakana od velikog

značaja, posebno u situacijama kada su morfološke

promene na nivou svetlosne mikroskopije, ranije

opisanim metodama, nejasne ili u toj meri

diskretne da se dijagnoza ne može sa sigurnošću

postaviti (35).

Slika 5. Subsarkolemalna akumulacija

mitohondrija (TEM). 1. jedro, 2. sarkolema, 3.

brojne mitohondrije, 4. miofibrili.

Slika 6. Pleomorfne mitohondrije različitih

veličina (zvezdice) izmeĎu miofibrila (TEM).

LITERATURA

1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M,

Roberts K, Walter P. Molecular Biology of

the Cell, 5th

ed. New York: Garland

Science; 2007.

2. McBride HM, Neuspiel M, Wasiak S.

Mitochondria: more than just a

powerhouse. Curr Biol 2006; 16(14):R551-

560.

3. Anderson S, Bankier AT, et al. Sequence

and organization of the human

mitochondrial genome. Nature 1981;

290:457-465.

4. Rosenberg, R., S. Prusiner, S. et al. The

Molecular and Genetic Basis of Neurologic

and Psychiatric Disease, 3rd ed.

22 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Butterworth-Heinemann. Philadelphia, PA;

2003.

5. Schon EA. The mitochondrial genom. In:

Rosenberg R, Prusiner S, DiMauro S,

Barchi R, Nestler E, editors. The molecular

and genetic basis of neurologic and

psychiatric disease. Philadelphia:

Butterworth-Heinemann; 2003. p.179-188.

6. Horai S. Mitochondrial genetics. In:

Nonaka I, Goto Y, editors. Mitochondrial

disease. Igakushoin: Tokyo, 1997, 52-57.

7. Bogenhagen D, Clayton DA. The number

of mitochondrial deoxyribonucleic acid

genomes in mouse L and human HeLa

cells. Quantitative isolation of

mitochondrial deoxyribonucleic acid. J.

Biol. Chem 1974; 249(24):7991-7995.

8. Mambo E, Gao X, Cohen Y, Guo Z,

Talalay P, Sidransky D. Electrophile and

oxidant damage of mitochondrial DNA

leading to rapid evolution of homoplasmic

mutations. Proc Natl Acad Sci USA 2003;

100(4):1838-1843.

9. DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial

disorders in the nervous system. Annu.

Rev. Neurosci 2008;31:

10. Sproule DM, Kaufmann P. Mitochondrial

encephalopathy, lactic acidosis, and

strokelike episodes: basic concepts, clinical

phenotype, and therapeutic management of

MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci

2008; 1142: 133-58.

11. Majamaa K, Moilanen JS, Uimonen S, et

al. Epidemiology of A3243G, the Mutation

for Mitochondrial Encephalomyopathy,

Lactic Acidosis, and Strokelike Episodes:

Prevalence of the Mutation in an Adult

Population. American Journal of

HumanGenetics 1998; 63.no.2: 447.

12. Pavlakis SG, Phillips PC, DiMauro S, De

Vivo DC, Rowland LP. Mitochondrial

myopathy, encephalopathy, lactic acidosis,

and strokelike episodes: a distinctive

clinical syndrome. Ann Neurol

1984;16(4):481–8.

13. Hirano M, Pavlakis SG. Mitochondrial

myopathy, encephalopathy, lactic acidosis

and strokelike episodes (MELAS): current

concepts. J. Child. Neurol. 1994; 9 4-13.

14. Wong L.J. Pathogenic mitochondrial DNA

mutations in protein-coding genes. Muscle

Nerve 2007; 36: 279-293.

15. Hirano M, Ricci E, Koenigsberger MR,

Defendini R, Pavlakis SG, DeVivo DC, et

al. Melas: an original case and clinical

criteria for diagnosis. Neuromuscul Disord

1992;2(2):125–35.

16. Shy GM, Gonatas NK. Two childhood

myopathies with abnormal mitochondria: I.

Megaconial myopathy; II. Pleoconial

myopathy. Brain 1966;89:133-58.

17. Bonilla E, Sciacco M, Tanji K, Sparaco M,

Petruzzella V, Moraes CT. New

morphological approaches to the study of

mitochondrial encephalomyopathies. Brain

Pathol 1992;2(2):113-9.

18. Naini A, Kaufmann P, Shanske S,

Engelstad K, De Vivo DC, Schon EA.

Hypocitrullinemia in patients with

MELAS: an insight into the “MELAS

paradox”. J Neurol Sci 2005;229-230:187–

93.

19. Sakuta R, Nonaka I. Vascular involvement

in mitochondrial myopathy. Ann Neurol

1989;25(6):594–601.

20. Remes AM, Majamaa-Voltti K, Kärppä M,

Moilanen JS, Uimonen S, Helander H, et

al. Prevalence of large-scale mitochondrial

DNA deletions in n adult Finnish

population. Neurology 2005;64(6):976–81.

21. DiMauro S, Davidzon G. Mitochondrial

DNA and disease. Ann Med

2005;37(3):222–32.

22. Melone MAB, Tessa A, Petrini S, Lus G,

Sampaolo S, Di Fede G, et al. Revelation

of a new mitochondrial DNA mutation

(G12147A) in a MELAS/MERFF

phenotype. Arch Neurol 2004;61(2):269–

72.

23. Van de Glind G, De Vries M, Rodenburg

R, Hol F, Smeitink J, Morava E. Resting

muscle pain as the first clinical symptom in

children carrying the MTTK A8344G

mutation. Eur J Paediatr Neurol

2007;11(4):243–6.

24. Mancuso M, Petrozzi L, Filosto M, Nesti

C, Rocchi A, Choub A, et al. MERRF

syndrome without ragged-red fibers: the

need for molecular diagnosis. Biochem

Biophys Res Commun 2007;354(4):1058–

60.

25. Horvath R, Kley RA, Lochmüller H,

Vorgerd M. Parkinson syndrome,

neuropathy, and myopathy caused by the

23Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

mutation A8344G (MERRF) in tRNALys.

Neurology 2007;68(1):56–8.

26. Ito S, Shirai W, Asahina M, Hattori T.

Clinical and brain MR imaging features

focusing on the brain stem and cerebellum

in patients with myoclonic epilepsy with

ragged-red fibers due to mitochondrial

A8344G mutation. AJNR Am J

Neuroradiol 2008;29(2):392–5.

27. DiMauro S, Hirano M. MERRF. In Pagon

RARA, Bird TDTD, Dolan CRCR,

Stephens KK, Adam MPMP, editors.

GeneReviewsTM. Seattle (WA):

University of Washington, Seattle; 1993.

Initial Posting: June 3, 2003; Last update:

August 18, 2009.

28. Kearns TP, Sayre GP. Retinitis

pigmentosa, external ophthalmophegia, and

complete heart block: unusual syndrome

with histologic study in one of two cases.

AMA Arch Ophthalmol 1958;60:280–9.

29. Maceluch JA, Niedziela M. The clinical

diagnosis and molecular genetics of

Kearns-Sayre syndrome: a complex

mitochondrial encephalomyopathy. Pediatr

Endocrinol Rev 2007;4(2):117-37.

30. Auré K, Ogier de Baulny H, Laforêt P,

Jardel C, Eymard B, Lombès A. Chronic

progressive ophthalmoplegia with large-

scale mtDNA rearrangement: can we

predict progression? Brain 2007;130(Pt

6):1516–24

31. Mirabella M, Di Giovanni S, Silvestri G,

Tonali P, Servidei S. Apoptosis in

mitochondrial encephalomyopathies with

mitochondrial DNA mutations: a potential

pathogenic mechanism. Brain

2000;123:93-104.

32. Scaglia F, Northrop JL. The mitochondrial

myopathy encephalopathy, lactic acidosis

with stroke-like episodes (MELAS)

syndrome: a review of treatment options.

CNS Drugs 2006; 20(6): 443-64.

33. Bernier FP, Boneh A, Dennett X, Chow

CW, Cleary MA, Thorburn DR. Diagnostic

criteria for respiratory chain disorders in

adults and children. Neurology 2002;

59:1406-1411.

34. Petruzzella V, Moraes CT, Sano MC,

Bonilla E, DiMauro S, Schon EA.

Extremely high levels of mutant mtDNA

co-localize with cytochrome c oxidase-

negative ragged-red fibers in patients

harboring a point mutation at nt 3243. Hum

Mol Genet1994; 3:449-454.

35. Bajčetić M.. Značaj ultrastrukturnih

istraživanja dermisa, mišića i suralnog

nerva u diferencijalnoj dijagnozi bolesti

malih i srednjih krvnih sudova nervnog

sistema, doktorska disertacija, Medicinski

fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd,

2010

24 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

ANTIOKSIDANTNI VITAMINI

Slobodni radikali imaju veoma veliki značaj

u humanoj patologiji, jer je pokazana njihova

uloga u patogenezi mnogih oboljenja (1). Najčešće

nastaju kao produkti nepotpune redukcije

kiseonika i odlikuju se ekstremnom reaktivnošću.

Učestvuju u brojnim fiziološkim i biohemijskim

procesima u organizmu, ali i u oštećenju ćelija i

tkiva. Naime, slobodni radikali reaguju sa

važnim biološkim molekulima- enzimima,

strukturnim i receptorskim proteinima, lipidima i

nukleinskim kiselinama. U ovim reakcijama

moguća je produkcija sekundarnih i tercijarnih

slobodnih radikala. Kumulativni efekti navedenih

reakcija mogu dovesti do oštećenja ili smrti ćelije.

Stoga su ćelije, u toku adaptacije na aerobni

metabolizam, razvile snažne enzimske i

neenzimske sisteme antioksidativne zaštite.

Vitamini A, E i C, spadaju u neenzimske

antioksidante. Svoje antioksidativno delovanje

ispoljavaju u uslovima normalnog i pojačanog

stvaranja slobodnih radikala, i predstavljaju važan

nivo odbrane u zaštiti od slobodnih radikala (2).

Vitamin A

Aktivne forme i funkcija

Postoji više aktivih formi vitamina A u

prirodi. U biljkama se nalaze karotenoidi, dok su

drugi oblici aktivnih formi vitamina A poput

retinola, retinaldehida (retinala) i retinoične

kiseline prisutni samo u hrani životinjskog porekla.

Sve aktivne forme u osnovi imaju β-jononski

prsten, povezan s bočnim lancem koji sadrži dva

ostatka izoprena i alkoholnu grupu (Slika 1). Beta-

karoten i drugi karotenoidi uneti hranom se cepaju

u crevnoj mukozi delovanjem karoten

dioksigenaze, dajući retinal, koji se zatim redukuje

u retinol, esterifikuje i pakuje u hilomikronske

čestice zajedno sa estrima retinola iz hrane.

Preuzimanje ostataka hilomikrona u jetri dovodi

do dopremanja retinola u jetru radi skladištenja u

obliku lipidnog estra, retinil palmitata. Rezerve u

jetri su dovoljne za 1-2 godine. Transport retinola

iz jetre do ekstrahepatičnih tkiva se odvija

vezivanjem hidrolizovanog retinola za retinol

vezujući protein (engl. retinol binding protein,

RBP) (2,3).

Slika 1. Aktivne forme vitamina A. * Pokazuje

mesto cepanja β-karotena u 2 molekula

retinaldehida delovanjem karoten dioksigenaze

Različiti oblici vitamin A imaju različite

funkcije u organizmu (Slika 2).

Slika 2. Funkcije različitih oblika vitamina A

Vitamin A ima posebno bitnu ulogu u

fiziologiji vida. U mrežnjači oka se nalaze dve

vrste fotosenzitivnih ćelija, čepići i štapići. Oba

tipa ćelija u svojim membranama sadrže protein

osetljiv na svetlost, opsin. U pigmentisanom

epitelu mrežnjače all-trans-retinol je izomerizovan

do 11-cis-retinola i oksidovan do 11-cis-

Autor: doc. Dr Marija Matić 1

1 Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

25Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

retinaldehida. Ovaj oblik vitamina A reaguje sa

ostatkom lizina u opsinu, formirajući holoprotein u

fotosenzitivnim ćelijama, skotopsin u štapićima i

rodopsin u čepićima. Kao što je pokazano na Slici

3, apsorbcija svetla od strane rodopsina dovodi do

izomerizacije retinaldehida iz 11-cis u all-trans

oblik, što dovodi do brojnih konformacionih

promena u molekulu opsina. Ovo rezultuje

odvajanjem retinaldehida od opsina što pokreće

nastanak nervnog impulsa. Ekscitirana forma

rodopsina, batorodopsin, nastaje u samo nekoliko

pikosekundi od izlaganja svetlu. Zatim dolazi do

serije konformacionih promena opsina koje

dovode do formiranja metarodopsina II, koji

započinje guanin nukleotidnu amplifikacionu

kaskadu. Pad koncentracije cikličnog guanin

monofosfata (cGMP) dovodi do potpunog

zatvaranja Na+ kanala. Zatvaranje kanala dovodi

do hiperpolarizacije čepića, nastaje nervni impuls

sa sledstvenom propagacijom u mozak (2,3).

Slika 3. Uloga vitamina A u vidu

Retinoična kiselina, jedan od oblika vitamina

A, ima veoma važnu ulogu u kontroli ćelijske

diferencijacije. Retinoična kiselina nastaje u dve

povezane reakcije oksidacije, pri čemu se retinol

oksiduje u retinal, a zatim retinal u retinoičnu

kiselinu (4). Kad je jednom proizvedena,

retinoična kiselina ne može biti redukovana nazad

do retinola. Enzimi koji učestvuju u nastanku

retinoične kiseline su retinol dehidrogenaza koja

prevodi retinol u retinaldehid i retinaldehid

dehidrogenaza koja prevodi retinaldehid u

retinoičnu kiselinu (4). All-trans-retinoična

kiselina i 9-cis-retinoična kiselina regulišu rast,

razvoj i tkivnu diferencijaciju; one imaju različite

uloge u različitim tkivima. Na primer, vitamin A je

neophodan za održavanje zdravog epitelnog tkiva.

Retinol i retinočna kiselina su ključni u

sprečavanju nastanka keratina velike molekulske

mase, dok je retinil fosfat važan za sintezu

glikoproteina (važne komponente mukusa

sekretovanog od strane mnogih epitelnih ćelija).

Retinil fosfat nastaje ATP-zavisnom fosforilacijom

retinola. Izgleda da retinil fosfat služi kao glikozil

donor u sintezi nekih glikoproteina i

mukopolisaharida u istoj meri kao i dolihol fosfat

(2,3). Takođe je pokazano da su retinol i/ili

retinoična kiselina neophodni u sintezi transferina

(2,3).

Poput steroidnih hormona i vitamina D,

retinoična kiselina se vezuje za receptore u jedru

koji potom prepoznaju određene elemente DNK

molekula koji odgovaraju na stimulaciju

hormonom (engl. response element). Na ovaj način

vitamin A reguliše transkripciju specifičnih gena

koji kodiraju sintezu proteina uključenih u rast i

diferencijaciju ćelija. Postoje 2 familije nuklearnih

retinoidnih receptora-receptori retinoične kiseline

(RAR) koji vezuju all-trans-retinoičnu kiselinu ili

9-cis-retinoičnu i retinoid X receptore (RXR) koji

vezuju 9-cis-retinoičnu kiselinu (Slika 4) (2).

26 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Slika 4. Nuklearni receptori vitamina A. RAR-

receptor retinoične kiseline, trans RA-trans

retinoična kiselina, 9-cis RA-9-cis-retinoična

kiselina, RXR-retinoid X receptor, RARE- element

DNK molekula koji odgovaraja na stimulaciju

hormonom (engl. retinoc acid response element)

Poznato je da β-karoten (CAR) i neki drugi

karotenoidi imaju važnu antioksidantnu ulogu (5).

U uslovima niskog parcijalnog pritiska kiseonika

(kakva je u ljudskom organizmu), β-karoten je vrlo

jak antioksidant i može neutralisati slobodne

radikale (ROO) na jedan od tri navedena načina:

CAR + ROO CAR+ + ROO

- (prenos elektrona)

CAR + ROO CAR + ROOH (oksido-redukcija)

CAR + ROO ROOCAR (adicija)

Nedostatak vitamina A

Obzirom da se vitamin A skladišti u jetri,

nedostatak ovog vitamina je redak u opštoj

populaciji. Međutim, nedostatak može nastati kao

posledica teškog oštećenja jetre, poremećaja u

apsorpciji masti ili tokom produženog perioda

neadekvatnog unošenja ovog vitamina. Manji

nedostatak vitamina A se manifestuje folikularnom

hiperkeratozom (gruba keratinizirana koža) koja se

javlja zbog smanjene sekrecije mukusa od strane

epitelnih ćelija istovremeno sa viškom sinteze

keratina. Pored toga, javlja se i anemija

(biohemijski jednaka sideropenijskoj samo sa

adekvatnim unosom gvožđa) zbog otežane

mobilizacije gvožđa iz jetre uzrokovanog

smanjenjom sintezom transferina. S obzirom da

vitamin A ima značajnu ulogu u diferencijaciji

imunskih ćelija, i manji nedostatak ovog vitamina

može dovesti do povećane podložnosti za

nastanak infekcija. Pored toga, sinteza RBP

(protein negativne faze) u odgovoru na infekciju je

smanjena, samim tim se smanjuje i količina

cirkulišućeg vitamina. Noćno slepilo

(hemeralopia) je jedan od ranih znakova

deficijencije ovog vitamina, a uzrokovano je

smanjenim stvaranjem vidnog pigmenta

(rodopsina). Veći nedostatak vitamina A dovodi do

progresivne keratinizacije rožnjače oka poznate

kao kserooftalmija (2,3).

Višak vitamina A

Unošenje velike količine vitamina A tokom

dužeg perioda može biti toksično zato što su

kapaciteti za metabolisanje vitamina A ograničeni.

Naime, povećano unošenje dovodi do njegove

akulmulacije jer se prevazilaze kapaciteti RBP i

stoga nevezani oblik vitamina A oštećuje tkiva.

Toksični efekat ovog vitamina ispoljava se na

centralni nervni sistem (glavobolja, mučnina i

ataksija, svi simptomi su povezani sa povećanim

interkranijalnim pritiskom), jetru (hepatomegalija

sa histološkim promenama), homeostazu kalcijuma

(istanjivanje dugih kostiju, bolovi u kostima,

hiperkalcemija i kalcifikacija mekih tkiva) i kožu

(izrazita suvoća, deskvamacija i alopecija).

Preporučena dnevna doza za odraslu zdravu osobu

iznosi 700-900 µg, toksičnost se javlja kod doza

većih od 3000 µg (2,3).

Suplementacija vitaminom A

Zbog mogućeg toksičnog efekta visokih

doza vitamina A, trebalo bi izbegavati suplemente

ovog vitamina. Suplementacija vitaminom A se

pokazala korisnom u prevenciji displazije želuca

(6). Međutim, uzimanje visokih doza može dovesti

do povećanog rizika za nastanak karcinoma pluća

(7).

Vitamin E

Aktivne forme i funkcija

Vitamin E je generčki naziv 2 familije

jedinjenja, tokoferola i tokotrienola (Slika 5).

Vitamin E se nalazi u ishrani kao mešavina

nekoliko blisko povezanih jedinjenja, nazvanih

tokoferoli. D-α-tokoferol je najpotentnija forma

ovog vitamina (2,3).

27Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

Slika 5. Oblici vitamina E. Kod α-tokoferola i

tokotrienola R1, R2 i R3 su CH3 grupe; kod β-

oblika vitamina R2 je H; kod ϒ-oblika vitamina R1

je H; kod δ oblika vitamina R1 i R2 su H

Daleko najvažnija uloga vitamina E je

antioksidantna. S obzirom da je vitamin E

liposolubilan, akumulira se u cirkulišućim

lipoproteinima, ćelijskim membranama i depoima

masti, gde veoma brzo reaguje sa kiseonikom i

kiseoničnim slobodnim radikalima. Vitamin E se

ponaša kao čuvar ovih struktura, štiteći nezasićene

masne kiseline (pogotovo one u membranama

ćelija) od peroksidacije. Vitamin E ostvaruje svoju

zaštitnu ulogu tako što zaustavlja proces lipidne

peroksidacije. Alfa-tokoferol (-TocH) predaje

pojedinačne elektrone lipidnim peroksil radikalima

(LOO), nastalim peroksidacijom nezasićenih

masnih kiselina, što rezultuje formiranjem

stabilnih lipidnih peroksida, LOOH. Na ovaj način

vitamin E dovodi do neutralizacije lipidnih

peroksil radikala pre nego što započnu lančanu

reakciju i oštete biološki važne makromolekule

(2,3).

-TocH + LOO -Toc + LO2H

LOO + -Toc

-TocOOL

Tokoferil radikali (-Toc) su relativno

neraktivni i formiraju neradikalska jedinjenja.

Tokoferil radikali se redukuju nazad do tokoferola

reakcijom sa vitaminom C iz plazme. Međutim,

tokoferil slobodni radikali mogu slobodno ulaziti u

ćelije, i potencijalno, započeti lančanu reakciju

peroksidacije. Stoga, vitamin E može, poput

drugih antioksidanata, imati i prooksidantni efekat

pogotovo u visokim koncentracijama. S druge

strane, jedna od formi vitamina E, ϒ-tokoferol,

inaktivira lipofilne elektrofilne mutagene. Na taj

način se ponaša slično glutationu koji inaktivira

elektrofilne mutagene u vodenoj sredini ćelija

(2,3).

Nedostatak vitamina E

Smatra se da je unos vitamina E u

balansiranoj ishrani dovoljan, zato što, do sada,

nisu opisana stanja uzrovana nedostatkom ovog

vitamina. Kod eksperimentalnih životinja,

nedostatak vitamina E dovodi do reasorpcije fetusa

kod ženki i atrofije testisa kod mužjaka. Mada

nedostatak vitamina E kod ljudi nije opisan,

pacijenti sa ozbiljnom malapsorpcijom masti,

cističnom fibrozom i nekim oblicima hronične

bolesti jetre razvijaju nedostatak ovog vitamina jer

nemaju mogućnost adekvantne absorpcije ili

transporta vitamina E, što dovodi do oštećenja

membrana nervnih i mišićnih ćelija (2,3).

S druge strane, prevremeno rođena deca

nemaju dovoljne zalihe vitamina E stoga su

podložnija hemolitičkoj anemiji, jer je njihova

eritrocitna membrana fragilna zbog procesa

peroksidacije. Takođe, prevremeno rođena deca

koja se hrane mlečnim formulama siromašnim u

vitaminom E mogu razviti formu hemolitičke

anemije koja se popravlja suplementacijom ovim

vitaminom (2).

Interesantno je da je prirodna forma vitamina

E efektivnija nego sintetska. Naime, α-tokoferol

transfer protein u jetri specifično vezuje prirodni

D-α-tokoferol i zadržava D formu α-tokoferola u

organizmu 6 puta duže nego sintetsku all rac ili

d,l, formu ovog vitamina. Vitamin E je najmanje

toksičan od svih liposolubilnih vitamina.

Preporučena dnevna doza za odraslu zdravu osobu

iznosi 10 mg (15 IU) (2,3).

Suplementacija vitaminom E

Vitamin E može, poput drugih

antioksidanata, imati i prooksidantni efekat

pogotovo u visokim koncentracijama. Stoga bi

trebalo biti obazriv u primeni suplementa ovog

vitamina. Studije na velikom broju ispitanika su

pokazale da je unos preko 400 IU vitamina E

udružen sa većim mortalitetom različitih hroničnih

bolesti (8). U naučnoj zajednici postoje velike

kontrverze o primeni vitamina E, samostalno ili u

kombinaciji sa drugim antioksidantima, u

prevenciji kardiovaskularnih bolesti. Nove kliničke

studije koje su u toku trebalo bi da daju konačni

odgovor na ovo pitanje.

28 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Vitamin C

Aktivne forme i funkcija

Vitamin C se može sintetisati u putu uronske

kiseline metabolizma glukoze. Međutim, ljudi,

primati, zamorci i nekoliko drugih životinjskih

vrsta ne mogu sintetisati askorbinsku kiselinu jer u

jetri nemaju enzim gulonolakon oksidazu koja

katališe pretvaranje L- gulonolaktona u

askorbinsku kiselinu. Askorbinska kiselina je

ketolakton sa šest ugljenikovih atoma pa je po

strukturi jako slična glukozi (2,3). Askorbinska,

monohidroaskorbinska i dehidroaskorbinska

kiselina poseduju aktivnost vitamina (Slika 6).

Slika 6. Forme vitamina C

Vitamin C ima ima brojne neenzimske uloge

u organizmu jer se ponaša kao redukujući agent -

sakuplja slobodne radikale. Glavna uloga vitamina

C u zaštiti od slobodnih radikala je regeneracija

vitamina E. Monodehidroaskorbil slobodni radikal

koji nastaje u toj reakciji zatim podleže ezimskoj

ili neenzimskoj reakciji u kojoj nastaje askorbat i

dehidroaskorbat, koji nisu slobodni radikali (Slika

7). Međutim, askorbinska kiselina može direktno

reagovati i sa superoksidom, vodonik peroksidom,

hipohloritom, hidroksil i peroksil radikalima, kao i

NO2 (2,3).

Slika 7. L-Askorbat (redukovana forma) predaje

pojedinačne elektrone slobodnim radikalima ili

disulfidima u dva koraka-preko askorbil radikala

do oksidovane forme dehidro-L-askorbinske

kiseline.

Pored toga, askorbinska kiselina ima

specifične uloge u hidroksilazama koje sadrže

bakar i α-ketoglutarat dekarboksilazama koje

sadrže gvožđe (Tabela 1) (3). Dopamin β-

hidroksilaza sadrži bakar i uključena je u sintezu

kateholamina iz tirozina u srži nadbubrega i

centralnog nervnog sistema. Tokom hidroksilacije,

Cu+ se oksiduje do Cu

2+, a redukcija nazad u Cu

+

zahteva prisustvo askorbata, koji se oksiduje do

monodehidroaskorbata. Sličnu aktivnost askorbat

ima u degradaciji tirozina u reakciji katalisanom p-

hidroksifenilpiruvat hidroksilazom i homogenizat

dioksigenazom, enzimima koji sadrže Fe2+

. Veliki

broj peptidnih hormona ima karboksi terminalni

amid koji potiče iz glicina. Ovaj glicin je

hidroksilisan na α-ugljeniku enzimom koji sadrži

bakar, peptidilglicin hidroksilazom, za koji je

neophodno prisustvo askorbata zbog redukcije

Cu2+

. Mnogi od ovih enzima su uključeni u

modifikacije prekursora proteina. Prolin i lizin

hidroksilaza su neophodne za postsintetsku

modifikaciju prokolagena u kolagen. Stoga je

vitamin C jako važan za održavanje normalnog

vezivnog tkiva, kao i za zarastanje rana. Pored

toga, prolin hidroksilaza je takođe neophodna u

nastanku osteokalcina (organski matriks u kostima

koji sadrži kolagen) i C1q komponente

komplementa. Aspartat β-hidroksilaza je

neophodna za postsintetsku modifikaciju

prekursora proteina C i vitamin K-zavisne proteaze

koja hidrolizuje aktivirani faktor V u

koagulacionoj kaskadi. Trimetilizin i γ-

butirobetain hidroksilaza su enzimi neophodni za

sintezu karnitina.

Osim toga, vitamin C pomaže apsorpciju

gvožđa redukujući ga u fero oblik u želucu. Štiti

vitamine A, E i neke vitamine B grupe od

oksidacije. Takođe poboljšava korišćenje folne

kiseline, pomažući konverziju folata u

tetrahidrofolat ili formiranje derivata poliglutamata

tetrahidrofolata. Obzirom da se vitamin C

koncentruje u adrenalnoj žlezdi, može biti važan u

reakcijama hidroksilacije uključenih u sintezu

nekih steroidnih hormona, pogotovu u periodu

stresa (2,3).

Tabela 1. Enzimi koji zahtevaju prisustvo vitamina

C kao kofaktora

Enzim Metabolički put Redukcija

metalnog jona

Dopamin β-hidroksilaza Sinteza kateholamina Cu2+

→ Cu+

p-hidroksifenilpiruvat hidroksilaza

Homogenizat dioksigenaza Degradacija tirozina Fe

3+→Fe

2+

Peptidilglicin hidroksilaza Hidroksilacija glicina Cu2+

→ Cu+

Lizin hidroksilaza Hidroksilacija protokolagena Fe3+

→Fe2+

Prolin hidroksilaza

Hidroksilacija protokolagena

Sinteza osteokalcina

Sinteza C1q komponenta komplementa

Fe3+

→Fe2+

Aspartat β-hidroksilaza Modifikacija vit. K zavisnih-proteaza Cu2+

→ Cu+

Trimetilizin hidroksilaza

ϒ-butirobetain hidroksilaza Sinteza karnitina Fe

3+→Fe

2+

29Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

Nedostatak vitamina C

Vitamin C se brzo apsorbuje i njegov

nedostatak se javlja uvek u slučajevima loše

ishrane ili povećanih potreba organizma. Znaci

nedostatka vitamina C uključuju promene na koži,

povećanu fragilnost krvnih sudova, krvarenje

desnih, gubitak zuba i frakture kostiju. Većina

simptoma je uslovljena deficitom u sintezi i

strukturi kolagena. Manji nedostatak ovog

vitamina manifestuje se petehijama na koži i lakim

nastankom modrica zbog povećne fragilnosti

krvnih sudova. Skorbut je teži oblik nedostatka

vitamina C i povezan je sa otežanim zarastanjem

rana, osteoporozom, krvarenjem i anemijom.

Osteoporoza nastaje zbog nemogućnosti

održavanja organskog kolagenog matriksa kostiju

praćenog demineralizacijom. Krvarenje nastaje

zbog deficita u strukturi kolagena, koji čini okolno

tkivo kapilarnih zidova, što dovodi do povećane

fragilnosti zida krvnih sudova. Anemija se javlja

zbog produženog i dugotrajnog krvarenja

komplikovanog lošom apsorpcijom gvožđa i folata

iz digestivnog trakta (2,3).

Vrlo su kontraverzna mišljena u vezi

primene visokih doza vitamina C u prevenciji i

lečenju prehlade. Od kada je primena ovog

vitamina popularizovana, 70-ih godina prošlog

veka, datiraju i različita mišljenja. Neubedljivi su

dokazi da visoke doze vitamina C sprečavaju

prehladu i smanjuju dužinu njenog trajanja. S

druge strane, neke dvostruko slepe studije su

pokazale da suplementacija vitaminom C ne

sprečava razvoj prehlade, ali može biti korisna u

ublažavanju simptoma bolesti i skratiti dužinu

trajanja. Razlog tome je, verovatno, zato što je

vitamin C neophodan za funkciju leukocita ili

otpuštanje histamina tokom stresnih situacija.

Preporučena dnevna doza za odraslu zdravu osobu

iznosi 75-90 mg. Sa unosom otprilike 100 mg

dnevno kapacitet organizma da metaboliše vitamin

C je saturisan, i višak se ekskretuje urinom (2,3).

Mada velike doze vitamina C, verovatno,

nisu ništa štetnije u odnosu na druge široko

korišćene medikamente za prehladu, mogući štetni

efekti se moraju razmotriti. Na primer, oksalat je

glavni metabolit askorbinske kiseline. Stoga

primena visokih doza ovog vitamina, teoretski,

može dovesti do nastanka oksalatnog kamenja u

bubrezima kod predisponiranih osoba (2).

Međutim, podaci iz literature o povećanom riziku

za nastanak kamena u bubregu kod osoba koje

koriste suplemente vitamina C su kontradiktorni

(9).

Suplementacija vitaminom C

Pušači imaju niži nivo askorbinske kiseline u

plazmi. Smatra se da su dnevne potrebe pušača za

vitaminom C dvostruko veće (110-125mg) nego

kod nepušača. Pored toga, izgleda da aspirin

blokira preuzimanje vitamina C od strane

leukocita. Takođe, i oralni kontraceptivi i

kortikosteroidi snižavaju vrednosti vitamina C u

plazmi. Stoga bi osobe koje su duže vreme na

ovim lekovima, a pored toga nemaju adekvatan

unos hranom, trebalo da budu na suplementaciji

ovim vitaminom (2).

Pojedini istraživači, 90-tih godina prošlog

veka, su sugerisali da bi primena visokih doza

(˃500mg) vitamina C mogla imati za posledicu

potpuno suprotnu, prooksidantnu ulogu, ovog

vitamina (10). Naime, pokazano je da vitamin C, u

višku, u prisustvu Fe3+

ili Cu2+

može ubrzati

stvaranje slobodnih radikala. Takođe može

indukovati apoptozu i pojačati unutarćelijski

potencijal za oksidaciju. Sve navedeno može

dovesti do pojačanog oksidativnog ošećenja DNK

molekula i mutacija. S druge strane, prooksidantno

delovanje vitamina C može imati hemopreventivni

efekat i sprečiti proliferaciju i napredovanje

premalignih i malignih lezija. Primena vitamina C

kao antioksidanta preporučuje se u prevenciji

karcinoma cerviksa (11), dok se primena vitamina

C kao prooksidanta koristi kod terapije karcinoma

usne duplje, jednjaka, želuca (12).

Literatura:

1. Halliwell B. Free radicals and antioxidants:

updating a personal view. Nutr Rev. 2012; 70

(5):257-65.

2. Delvin MT. Textbook of biochemistry with

clinical correlations. New York:Wiley−Liss;

2002. p. 1139−48.

3. Murray KR, Granner KD, Mayer AP, Rodwell

WV. Harper’s Illustrated Biochemistry. Lange

Medical Books/McGraw-Hill; 2003. p. 481-

98.

4. Duester G. Retinoic Acid Synthesis and

Signaling during Early Organogenesis. Cell

2008; 134 (6):921–31.

5. Young JA, Lowe MG. Antioxidant and

Prooxidant Properties of Carotenoids.

30 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Archives of Biochemistry and Biophysics

2001; 385 (1):20–27.

6. Correa P, Fonthan ETH et al.

Chemoprevention of gastric dysplasia:

randomized trial of antioxidant supplements

and anti-helicobactar pylori therapy. J. Natl.

Cancer Inst. 2000; 92:1881-1888.

7. Järvinen R, Knekt P et al. Antioxidant

vitamins in the diet: relationships with other

personal characteristics in Finland. J

Epidemiol Community Health. 1994;

48(6):549-54.

8. Miller ER, Pastor-Barriuso R, Dalal D,

Riemersma RA, Appel LJ, Guallar E. Meta-

analysis: High-dosage Vitamin E

supplementation may increase all-cause

mortality. Ann. Intern. Med. 2005; 142:37–46.

9. Traxer O, Pearle MS, Gattegno B, Thibault P.

Vitamin C and stone risk. Review of the

literature. Prog Urol. 2003; 13(6):1290-4.

10. Carr A., Frei B. Does Vitamin C act as a pro-

oxidant under physiological conditions?

FASEB J 1999; 13:1007–1024.

11. Myung SK, Ju W, Kim SC, Kim H. Vitamin or

antioxidant intake (or serum level) and risk of

cervical neoplasm: a meta-analysis. Meta-

analysis (KORMA) Study Group. BJOG.

2011; 118(11):1285-91.

12. Terry P, Lagergren J, Ye W, Nyrén O, Wolk

A. Antioxidants and cancers of the esophagus

and gastric cardia. Int J Cancer. 2000;

87(5):750-4.

31Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

NEUROLOŠKI PREGLED DETETA

Prof. dr Nebojša J. Jović 1,2

Doc.dr Jasna B. Jančić 1,2

1Klinika za neurologiju i psihijatriju za decu i omladinu, Beograd, Srbija

2Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Srbija

A. UVOD

Neurološkim pregledom deteta

procenjuju se razvoj i celovitost nervnog sistema,

nalaze se mogući ispadi i disfunkcije i određuju se

lateralizacija i lokalizacija pretpostavljenog

uzročnog oštečenja. Tokom proteklih nekoliko

decenija razvijeno je nekoliko metoda neurološkog

pregleda ročne i preterminske novorođenčadi i

male dece do 12 meseci. U zavisnosti od škole

kojoj pripadaju, različiti dečji neurolozi su

naglasili pregled posebnih neuroloških funkcija ili

položaja, tonusa i primitivnih refleksa ili

bihejvioralnih aspekata. Neurološki pregled

novorođenčeta koji su standardizovali Dubowitz i

saradnici (1998) sastoji se od: procene položaja i

tonusa, različitih obrazaca tonusa, refleksa,

pokreta, patoloških znakova i ponašanja (1).

Izostavljanje pojedinih delova pregleda i

jednostavniji način skorovanja, skratili su vreme

potrebno za njegovo izvođenje na 10-15 minuta(2).

Ako je nalaz patološki, često je potrebno je da se

pregled više puta ponovi. Rezultati neurološkog

pregleda imaju prediktivnu vrednost u prognozi

neurobihejvioralnog razvoja deteta (2,3,4).

A.1. Gestacijsko doba

Poznavanje gestacijskog doba deteta važno je

iz više razloga: 1. različiti pokazatelji neurološkog

razvoja menjaju se sa sazrevanjem nervnog

sistema i prepoznavanje tih promena ključno je za

procenu opservacijskih nalaza. 2. određeni

poremećaji karakteristični su za prevremeno

rođenu decu koja su prosečne telesne mase za

gestacijsko doba ili za ročnu decu koja su manje

mase od očekivane za gestacijsko doba (small for

date), 3. različiti patološki događaji kao što je

hipoksija-ishemija, različito deluju na određene

moždane structure u zavisnosti od gestacijskog

doba deteta (5).

Novorođenče iz trudnoće koja je trajala kraće

od 36+6/7 nedelja je preterminsko ili

prevremeno rođeno dete. Deca rođena blizu

termina („near term“) ili predterminska

novorođenčad su rođena 34,0–36+6/7 nedelje.

Novorođenčad rođena posle 294. dana trudnoće

(42,0 gestacijskih nedelja) su postterminska (6).

U proceni gestacijskog doba uz brojna

ograničenja, mogu se koristiti antropometrijski

podaci o masi, dužini i obimu glave na rođenju,

kliničke karakteristike (koža, lanugo, plantarna

površina, veličina tkiva dojke, oči/uši, genitalije)

neurološki nalaz, EEG zapis i ultrazvučni pregled

mozga. (5,6).

A.2. Senzorimotorni period u kognitivnom

razvoju

Švajcarski psiholog Jean Piaget (1929)

opisao je senzorimotorni period koji se odvija od

rođenja do 18-24 meseca.. Za to vreme bebe

ispituju svet oko sebe pomoću čula i akcija i plaše

se stranih osoba. Jednostavni i kruti motorni

obrasci koje dete donosi na svet rođenjem (refleks

sisanja, hvatanja) uvežbavanjem postaju

precizniji, raznolikiji i složeniji. Dete uviđa da

svojim ponašanjem može da utiče na okolinu, što

vodi pojavi namernog i svrsishodnog ponašanja.

Ono počinje da razlikuje sebe od okolnog sveta, da

bi krajem prve godine uvidelo da okolni predmeti

nastavljaju da postoje i onda kada se izgube iz

vidnog polja (stalnost objekta) (7).

Pregled ranog psihomotornog razvoja

zahteva dobijanje podataka o pre-, perinatalnom i

postnatalnom razvoju deteta. U odnosu na

karakteristike neuroloških funkcija razlikujemo

32 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

sledeće razvojne periode: novorođenački (0-28

dana); rani period odojčeta (6 nedelja- 4 meseca);

period odojčeta (5-12 m.). Razvoj motornih, i

manipulativnih sposobnosti, vida i sluha,

socijalnog kontakta i govora sažeto je prikazan u

odnosu na navedene periode (Tabela).

(1,5,8)

Tabela br. 1: Neurološke funkcije novorođenčeta i odojčeta

Novorođenče (0-28 dana)

Ponašanje Mirno, razdražljivo, plače, budno, spava

Senzorne funkcije Vid: optički refleks treptanja

Sluh: akustički refleks treptanja

Motoričke funkcije Spontana motorika (leđni, potrbušni položaj) obrazac potpune fleksije,

asimetrija, nestabilnost, nepostojanje oslonca i antigravitacijskih

pokreta

Spontani pokreti "uvijanja"

Položajne reakcije, "inertna" fleksija glave, trupa i ekstremiteta

Postojanje primitivnih refleksa (neonatalni automatizmi)

Fiziološki hipertonus mišića

Odojče (6 nedelja – 4,5 meseci) rano infantilno doba

Senzorne funkcije preovlađuju "vizuelna orijentacija"u fiksiranju i praćenju predmeta i

likova i reakcija na zvuk uz obostranu lokalizaciju

Motoričke funkcije Nestanak većine primitivnih refleksa

Spontani pokreti se menjaju od "uvijanja" do "vrpoljenja"

Reakcije uspravljanja.U leđnom položaju razvija se antigravitacijski

položaj ruku i nogu. Uspostavlja se kontakt šaka-šaka, šaka-usta, noge

su savijene u zglobovima i odignute od podloge(3-4 meseca).

Motorički fleksioni obrazac zamjenjuje se ekstenzijom.

Položajne reakcije: uspostavlja se kontrola položaja glave i razvija se

aktivna fleksija ruku i nogu.

Spontana motorika - priprema za funkciju hvatanja šake, masovni-

distonički pokreti trupa i ekstremiteta

Psihosocijalne

funkcije

Pojava emocionalnih reakcija, vokalizacija, gukanje, radosno cičanje

Razvijaju se socijalni kontakt, interakcija s bliskom osobom i osmeh

Odojče (5-12 meseci)

Razvoj funkcije šake Ciljano, voljno hvatanje šakom: medio-palmarni hvat, radio-

palmarni hvat, "pincetni", hvat, prebacivanje predmeta iz ruke u

ruku.

Razvoj mehanizama

uspravljanja i

mijenjanja položaja

Oslonac na ispružene ruke i otvorene dlanove, sedeći i klečeći

stav, puzanje, klečeći iskorak, stojanje, okretanje

Komunikacija, razvoj

govora

Prvi smisleni slogovi, imitacija poznatih slogova, raspoznavanje i

razlikovanje poznatih od nepoznatih osoba, ispunjavanje

jednostavnih govornih naloga

33Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

B. PREGLED DETETA MLAĐEG OD 12

MESECI

Specifičnosti pregleda dece do 12. meseci

najčešće su vezane za ograničenu saradnju i brze

promene fizioloških stanja . Deca više vole da se

igraju nego da budu pregledana i najčešće se plaše

ispitivača. Ispitivač nastoji da prevaziđe ili umanji

strah deteta tako što posmatra dete tokom igre ili

kada sedi u majčinom naručju. Pritom nastoji da

najpre primeni delove pregleda koji izazivaju

najmanje otpora od strane deteta. Poželjno je imati

u ordinaciji igračke kako bi se pregled detetu

učinio zanimljivijim, ali i učinili vidljivijim

poremećaji npr. pokreta očnih jabučica, intencioni

tremor i drugo. Zbog moguće neprijatnosti

ispitivanje senzibiliteta je najbolje ostaviti za kraj

pregleda. Toplina i blizina majke tokom pregleda

važni su jer dete u njenom naručju oseća sigurnost.

Ukoliko je uznemireno, kada oseti blizinu njenog

tela i čuje njen glas, ukoliko je sito, umiriće se. Pre

zaključivanja, često je potrebno ponavljanje

neurološkog pregleda uz mnogo strpljenja,

nežnosti i elastičnosti u odnosu na standardni način

pregleda većeg deteta.

B.1. Opservacioni deo pregleda

Formalni neurološki pregled novorođenčeta i

malog deteta treba početi procenom nivoa

budnosti. To je verovatno najosetljiviji deo

pregleda i zavisi od stanja i različitih nivoa

centralnog nervog sistema (CNS). Nivo budnosti

normalnog deteta menja se u zavisnosti od

vremena poslednjeg hranjenja, spoljnih stimulusa,

skorih senzornih iskustava i gestacijskog doba

(2,5,8). Opservacija spontanog otvaranja očiju,

pokreta lica i ekstremiteta i odgovor na

stimulaciju, ključni su u proceni mentalnog stanja

novorođenčeta. Budnost se određuje na osnovu

trajanja vremena tokom koga dete drži otvorene

oči i navedenih spontanih pokreta (9).

Pre 28. n.g. teško je utvrditi periode

budnosti. Dotle, samo dovoljna stimulacija dovodi

do otvaranja očiju. Tada nastaju značajne promene

jer i laka stimulacija rezultuje u buđenju i budnosti

koja traje nekoliko minuta. Sa 32 n.g. periodi

budnosti i spavanja se jasnije razlikuju. Sa 36 n.g.

budnost se lako zapaža, dete često tada snažno

plače.(5) Sa rastom i razvojem deteta, period

budnosti postaje duži i stabilniji.

Položaj u miru odgovara gestacijskom dobu i

aktivnom tonusu novorođenčeta.

Spontana motorna aktivnost novorođenog

deteta je masivna, stereotipna i odlikuje se

naizmeničnim pokretima savijanja i opružanja

ekstremiteta. Pre 36.-38. n.g. spontani pokreti

imaju izrazitu varijabilnost brzine i amplitude.

Spontani pokreti na kraju 2. meseca liče na

vrpoljenje i predstavljaju fine pokrete koji

ravnomjerno zahvataju telo. Ovi pokreti nestaju u

dobu od 3-4 meseca posle rođenja, kada dobijaju

karakteristike voljne motoričke akcije.

Plač je veoma važna aktivnosti

novorođenog deteta. Procenjuju se visina, jačina,

učestalost i trajanja plača. Plač zdravog

novorođenog deteta je snažan, krepak, srednjeg

intenziteta i trajanja, motivisan glađu, bolom ili

diskomforom i postepeno prestaje. Oko sedmog

meseca čest uzrok bebinog plača su bes, ljutnja i

nezadovoljstvo. „Strah od stranih lica“, koji se

javlja oko osmog meseca, takođe može uzrokovati

plač (2,3). Prevremeno rođeno dete plače kratko i

slabo. Piskav, ljutito bolan, razdražljiv, jako

produžen, monoton plač ili jecanje, kao i

povremeni krik, mogu predstavljati patološki nalaz

(10).

B.2. Neurološki pregled deteta mlađeg od 12

meseci

B 2.1. Merenje obima glave

Merenje obima glave predstavlja izuzetno

značajan i pouzdan parametar veličine

intrakranijumskog volumena, intrakranijumskog

pritiska i stanja CNS novorođenčeta i malog

deteta. Obim glave treba meriti mekanim

santimetrom postavljenim 0,5 cm iznad gornje

ivice obrva i ušnih školjki i preko najšireg dela

okcipitalne kosti. Obim glave kod dece rođene u

34 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

terminu iznosi prosečno 35 cm+2 cm i veći je za 2

cm od obima grudnog koša. Velika fontanela se

nalazi između frontalnih i parijetalnih kostiju,

romboidnog je oblika, dimenzija (mereno na

sredini dve naspramne ivice) od 1x1 do 4x4 cm.

Mala fontanela se nalazi između parijetalnih i

okcipitalnih kostiju i ima veličinu oko 1x1 cm (6).

Dobijena vrednost se poredi sa vrednostima

koje se očekuju za gestaciono doba deteta. Pored

merenja obima glave na rođenju, meri se prirast

obima glave tokom vremena. Posmatra se oblik

glave, palpiraju se fontanele i suture i registruju se

patološka odstupanja (prerano srastanje šavova,

napetost velike fontanele, kefalhematom i dr.).

Oblik lobanje utiče na obim glave. Tako deca sa

relativno velikim potiljačno-čeonim dijametrom

imaće veći obim glave od dece sa velikim

biparijetalnim prečnikom. Stopa rasta obima glave

prema standardnim krivama kreće se od srednje

vrednosti i 1 SD ispod proseka za većinu dece

(1,4). Makrokranija ili mikrocefalija mogu ukazati

na osnovni metabolički, genetički ili infektivni

poremećaj (1,9,11)

B 2.2 Procena položaja, mišićnog tonusa i

pokrteta

Mišićni tonus ispituje se posmatranjem

položaja koji dete bez odeće zauzima u miru i

pasivnim pokretanjem vrata, trupa i ekstremiteta

deteta u opuštenom stanju. Poremećen tonus može

da bude povišen, snižen ili promenljiv. Budno

novorođenče je aktivno i reaguje na spoljne draži

pokretima vrata i ekstremiteta - u vidu

naizmeničnog savijanja i opružanja. Pokreti su

promenljivi po intenzitetu i obimu. Voljni i

svrsishodni pokreti se ne javljaju kod

novorođenčeta.

Sa maturacijom nervnog sistema, uočava se

porast tonusa fleksora u kaudo-kranijalnom

pravcu. Kod terminskog novorođenčeta, postoji

prevaga tonusa fleksora nad ekstenzorima. Tokom

prvih par meseci postoji fiziološka mišićna

hipertoniju ekstremiteta. Povišeni tonus fleksora

značajno opada tokom 3. meseca života, najpre na

rukama, zatim i na nogama. U isto vreme raste

tonus mišića vrata i trupa. Između 8-12 meseca

ponovo opada tonus fleksora ekstremiteta uz

istovremeni porast tonusa ekstenzora (10).

Procena pasivnog tonusa vrši se

određivanjem otpora na pasivne pokrete u raznim

zglobovima dok je dete budno i ne plače. Obzirom

da je tonus ekstremiteta pod uticajem toničkih

refleksa vrata, važno je da dete drži glavu pravo, u

središnjem položaju tokom ovog dela pregleda.

Pasivni tonus se ispituje: 1. procenom

konzistencije mišića pri palpaciji; 2. pregledom

obima pokreta u pojedinim zglobovima i 3.

reakcijom na pasivno istezanje.

Dete sa 28 n.g. ležaće sa minimalno

savijenim ekstremitetima i činiće minimalan otpor

pasivnim pokretima ekstremiteta. Sa 32 n.g.

međutim, novorođenče razvija tonus fleksora u

nivou kuka i kolena što rezultuje u pojavi otpora

na pokretanje nogu. Ova promena koreliše sa

porastom mijelinacije subkortikalnih motornih

puteva u nivou moždanog stabla. Sa 36 n.g. dete

razvija fleksiju u lakatnom zglobu tako da

terminsko dete može da savija sve ekstremitete.

Kvalitet pokreta prati ovo sazrevanje tonusa (9).

Posmatraju se veličina ugla koji se obrazuje

pri maksimalnoj dorzalnoj fleksiji stopala prema

potkolenici, potkolenice prema butu ili, kao i širina

pasivnog okretanja glave pri približavanju brade

vrhu ramena. Znak „šala, marame ili ešarpe“ se

izvodi dok je dete u poluležećem položaju.

Ispitivač uzima ruku deteta, povlaći šaku preko

grudi u pravcu suprotnog ramena. Posmatra se

položaj lakta u odnosu na srednju liniju.

Hipotonija kod terminskog novorođenčeta postoji

ako lakat pređe srednju liniju. Tada se procenjuje

mogućnost deteta da stopalom dodirne svoju bradu

ili uvo (proba peta-uvo). Što je dete gestaciono

mlađe, stopalo je bliže uvu. Pasivni pokreti u

sklopu reakcije na pasivno istezanje (povratak u

poziciju fleksije posle pasivnog istezanja i obim

pokreta pri «klaćenju» ekstremiteta) jednostavan

su način za procenu tonusa (1,2,8).

Aktivni tonus se ispituje: posmatranjem

položaja koji novorođeno dete zauzuma u miru i

opservacijom spontane i izazvane motorne

35Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

aktivnosti. Pritom se procenjuje i snaga aktivnih

pokreta.

Hipotonični ekstremiteti su ispruženi i

oslonjeni na bočne strane. Pokreti su oskudni. U

izrazitoj mlitavosti prisutan je tzv. žablji položaj.

Kod hipertonije, ruke i noge su ukrštene. Rukama

ispitivača, ekstremiteti se teško pomeraju iz

osnovnog položaja. Ekstremna hipertonija

manifestuje se tzv. izgledom "lutke od kaučuka"

(na pr. kod neonatalnog tetanusa). Svako

asimetrično držanje, upadljiva mlitavost

nesrazmerna gestacijskoj zrelosti ili izvijanje vrata

i leđa unazad (opistotonus)- patološki su znaci.

Ispružene noge sa ispruženim ili zgrčenim rukama

se viđaju kod oštećenja nervnog sistema.

.

Mišićni refleksi se lako mogu izazvati.

Ukršteni odgovor adduktora i neiscrpljujući klonus

nisu retki kod novorođenog deteta. Plantarni

odgovor nije od većeg značaja jer su brojni faktori

koji mogu izazvati fleksorni ili ekstenzorni

odgovor, što može voditi pogrešnom zaključivanju

(5,12,13).

B 3. Pregled primarnih (primitivnih ili

automatskih) reakcija novorođenog deteta i

odojčeta

Primarne, specifične reakcije karakteristične

su za nezreli mozak u novorođenačkom i ranom

odojačkom uzrastu i postepeno nestaju sa razvojem

kontrole iz viših moždanih centara. Novorođenče

reaguje na jake svetlosne i zvučne nadražaje

refleksnim pokretima ekstremiteta. Normalno je da

se reakcije s vremenom menjaju i postupno slabe.

B 3.1. Morov refleks predstavlja reakciju na

iznenadnu draž. Dete se plaši iznenadnog

unutrašnjeg ili spoljašnjeg nadražaja i leži u

nestabilnom položaju koji Vojta označava kao

„holokinetička faza“. Na iznenadni stimulus (npr.

naglo spuštanje glave prema trupu) dolazi do

savijanja i opružanja ruku, šake se otvaraju, prsti

se lako šire, ili delom ostaju savijeni. Ovu fazu

smenjuje stavljanje ruku u zagrljaj i plač deteta.

Otvaranje šaka nastaje oko 28 n.g. a opružanje i

savijanje ruku se javlja sa 32. n.g, a prednja

fleksija sa 37 n.g. Moroov refleks u prvih šest

nedelja ima dve faze (abdukciju, ekstenziju,

adukciju), a posle samo prvu fazu (abdukciju,

ekstenziju) (12). Ovaj refleks nestaje sa 6 meseci

života kod zdravog deteta (2,5,13). (Slika 1)

Održavanje ove reakcije posle tog doba ili

odsustvo u prvim nedeljama pokazatelji su

neurološkog poremećaja.

Slika 1: Morov refleks

B 3.2. Refleksi sisanja i traženja usnama

(«rooting»)

Refleks sisanja se ispituje stavljanjem prsta

(ili bradavice dojke) u usta bebe, pri čemu dolazi

do otvaranja usta i ritmičnih pokreta sisanja.

Prisutan je od 24 g.n., dobro je izražen u 32. n. g. i

održava se do kraja prve godine života. Refleks

traženja usnama se izaziva taktilnom

stimulacijom 4 tačke: gornje, donje usne ili

spoljašnjih uglova usana. Na stimulaciju dolazi do

usmerenog okretanja glave i jezika prema toj

strani. Sa ovim refleksom traženja, dete brzo nalazi

bradavicu i uzima je u usta. (Slika 2).

B.3.3. Kohleo-palpebralni refleks

Već krajem prvog meseca možemo pomoću

refleksa ispitati sluh deteta. Na iznenadan i jak

slušni nadražaj kraj uva deteta (može i pljesak

šakama) dete će refleksno trepnuti očima (kohleo-

palpebralni, akutično-facijalni refleks). To treba

uraditi sa obe strane. Ovaj refleks se zadržava.

36 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Slika 2: Refleks sisanja

B.3.4. Fenomen „lutkinih očiju“ vidi se

ako glavu odojčeta okrenemo od sredine u stranu.

Tada oči na kratko ostanu u središnjem položaju.

Sa zakašnjenjem oči se potom pokreću u stranu i

ponovo zauzimaju središnji položaj. Oči zatim

slede novi položaj (Slika 3).

B.3.5. Refleksi hvatanja

Refleks hvatanja na rukama izaziva se

stavljanjem prsta ispitivača u obe šake. Kada

prstom dodirnemo površinu šake bebe, prsti i palac

se zatvaraju oko našeg prsta (Slika 4). Refleksi su

jasno prisutni sa 28. n.g., snažni su sa 32 ng, a

udruženi su sa opružanjem mišića ruku dovoljnim

da se dete podigne u krevetu sa 37 g.n.. Palmarni

refleks hvatanja postaje manje jasan u 2. mesecu

kada počinje da se razvija voljno hvatanje (2,8,11).

Pri izvođenju refleksa hvatanja stopalom noga

treba da bude savijena u kuku i kolenu. Na nogama

se refleks hvatanja najbolje izaziva pritiskom

vrhovima oba palca ispitivača na tabane deteta

neposredno ispod prstiju stopala. Odgovor je

simetrična fleksija prstiju oba stopala. Ovo

refleksno savijanje prstiju na nozi može se videti

do kraja prve godine (Slika 5).

Slika 3: Lutkine oči

Slika 4: Hvatanje sakom

Slika 5: Refleks hvatanja stopalom

B.3.6. Asimetrični tonični refleks vrata

izvodi se u položaju supinacije (odojče leži na

leđima) pasivnim okretanjem glave na jednu

stranu. Budno, dete posmatra zbivanja u okolini i

spontano okreće glavu u stranu. Telo reaguje u

skladu sa okretanjem glave i dete zauzima „stav

mačevaovca“(Magnusov refleks). Dolazi do

opružanja ekstremiteta na strani ka kojoj se glava

okreće i savijanja ruke i noge suprotne strane.

Prisutan je od 35. g.n., snažan sa 2 meseca, a

iščezava do 6. ili 7. meseca života. (Slika 6)

37Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

Simetrični vratni refleks izaziva se

savijanjem glave deteta prema grudnom košu, kada

dolazi do fleksije nogu.

Poremećena dinamika pojedinih refleksa,

pojačavanje umesto slabljenja, ili njihovo dugo

trajanje imaju prognostičko značenje (5,12,13). U

dijagnostičkom pogledu, odsustvo refleksa koji

odgovaraju određenom uzrastu, njihovo

održavanje posle doba u kome treba da nestanu,

njihova ponovna pojava ili asimetričnost nalaza

ukazuju na moguće oštećenje i poremećaj

maturacije CNS.

Slika 6: Stav mačevaoca (Magnusov refleks)

B. 4. Položajne reakcije

Položajne reakcije predstavljaju refleksni

motorički odgovor na promenu položaja tela, posle

izlaganja tela nestabilnom antigravitacijskom

položaju

B. 4. 1. Odgovor na trakciju je dobar način

za procenu aktivnog tonusa.

Trakcijska reakcija, izvodi se povlačenjem

deteta za ruke iz leđnog u sedeći položaj, pri čemu

se procenjuje položaj glave, trupa i nogu pri

nagibu trupa prema podlozi od 45º. Ispitivač koji

sedi licem okrenut detetu, stavlja svoje palčeve u

dečje dlanove a svoje prste oko ručnog zgloba i

lagano podiže dete iz supinacionog položaja.

Normalno dete do 2-3. meseca, ima palmarni

refleks hvatanja, nastoji da savije ruke u

laktovima, fleksori vrata su stimulisani da podignu

glavu tako da su, i kod terminskog deteta, fleksorni

i ekstenzorni mišići uravnoteženi i glava će biti na

kratko zadržana u osovini trupa. Test je patološki

ako je glava pasivno spuštena i pada unazad pri

trakciji ili ako se glava održava u položaju unazad.

U prvom slučaju radi se o abnormalnoj hipotoniji

mišića vrata i trupa, a u drugom o abnormalnoj

hipertoniji mišića ektenzora vrata (10,11,12)

(Slika 7).

Slika 7: Odgovor (reakcija) na trakciju

B. 4.2. Aksilarna (vertikalna) suspenzija,

izvodi se držanjem deteta u vertikalanom položaju

ispod pazuha, pri čemu se procenjuje položaj

glave, trupa ruku i nogu. Odbrambena reakcija

na pad poznata je pod nazivom «padobranski

odgovor» (»parashut reaction»). Izvodi se

dovođenjem deteta u položaj ventralne suspenzije

(obuhvati se oko grudnog koša dok leži u položaju

pronacije i odigne od podloge) i naglim

spuštanjem prema podlozi sa glavom napred. Pri

tome zdravo dete pruža ruke napred da bi zaštitilo

glavu. Ova reakcija je prisutna od 6.-9. meseca i

održava se.

B. 4.3. Landauova reakcija ili ventralna

suspenzija, izvodi se obuhvatanjem deteta oko

trbuha u horizontalnom položaju, pri čemu se

procenjuje položaj glave, trupa i nogu. U sklopu

Landauove reakcija dete ispruži glavu, trup i

ekstremitete formirajući luk od glave do nožnih

prstiju sa konkavitetom na gore. Normalno je

prisutna od 6.-9. meseca života, a posle navršene

godine života je nepodesna za izvođenje.

B. 4.4. Automatski hod može se izazvati sa

37 n.g. Dete se obuhvati sa obe šake ispitivača

ispod pazuha i dovede u uspravan položaj. Kada se

osloni na podlogu i lako nagne napred izazivaju se

38 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

pokreti koračanja (normalno je da dete napravi

nekoliko koraka). Značaj ove refleksne reakcije

nije sasvim jasan.

Krajem osmog meseca dete pri okretanju oko

sopstvenog tela otkriva bočni položaj. Na boku se

drži kao „otpala grana koja leži u vrtu“ (14). U

ovom položaju dete se oslanja na lakat ruke koja

leži dole a slobodnom rukom se igra. Noga ispod

tela je opružena a drugom, savijenom nogom dete

se opire. Trup je na boku i iz tog položaja se diže i

sedi.

Položajne reakcije menjaju se u zavisnosti

od nivoa funkcionalnog sazrevanja CNS.

Motorički odgovor položajnih reakcija i njihova

dinamika korelišu s miljokazima razvoja spontane

motorike.

Pregled novorođenčeta primenom

Neonatalne neurološke procene za terminsku decu

koju je sačinio par Dubowitz (1,2), prilagođen je i

za preterminsku (prevremno rođenu decu). Ova

procena može se lako izvršiti za kratko vreme

ukoliko se neki od parametara procene izostave,

koriste se isti pokazatelji neurorizika i ukoliko se

pojednostavi sistem skorovanja. (15)

C. PREGLED DETETA STARIJEG OD 12

MESECI

Saradnja deteta pri pregledu zavisi od

uzrasta. Zbog njegove nekooperativnosti,

standardni neurološki pregled ustaljenim

redosledom je gotovo nemoguće sprovesti. Stoga

pribegavamo pregledu deteta kroz igru, koji je

zasnovan pre svega na opservaciji, uz usmeravanje

aktivnosti u željenom pravcu. U zavisnosti od

razvojnog doba i temperamenta deteta pregled

prilagođavamo individualnim sposobnostima

ispitanika. Da bi prevazišli dečju stidljivost i

anksioznost koju izaziva pojava ispitivača, najbolje

je da dete pregledamo u krilu roditelja koji daje

sigurnost, verbalno ga ohrabruje i podstiče pregled,

a zatim pomoću igračaka pridobijemo pažnju i

poverenje ispitanika.

Najznačajnije neurološke informacije

možemo prikupiti tokom prvog dela pregleda koji

se zasniva na posmatranju i koji nazivamo «stani,

gledaj i slušaj». Na ovaj način se može uočiti

spontana aktivnost, dobrim delom proceniti

mentalni status, deo kranijumskih živaca,

koordinacija i motorne sposobnosti. U drugom

delu pregleda ispitivač uzima aktivno učešće.

Koristeći detetovu radoznalost i maštovitost, kroz

igru usmerava njegova interesovanja u željenom

pravcu pregleda, a predmete neophodne za

neurološki pregled pretvara u zanimljive igračke

(neurološki čekić kao zamišljeni konjić) ili koristi

same igračke za izvođenje neuroloških testova

(lutkin prst ili nos za probu koordinacije).

Za kraj pregleda ostavljamo neprijatna i

uznemirujuća ispitivanja kao što su merenje obima

glave, refleks zenica na svetlost, refleks povraćanja

i sl. Kada se mali ispitanik pri tome rasplače i

brani, izvlačimo korist iz nepoželjnih reakcija

posmatrajući simetričnost mimične muskulature

pri plaču, simetričnost pokreta i snagu pri pružanju

otpora.

Pregled deteta uzrasta preko 12 meseci

obuhvata:

1. Opšti, fizikalni pregled

2. Ispitivanje stanja svesti i mentalnog

statusa

3. Pregled kranijalnih nerava

4. Pregled motornog sistema

5. Isptivanje senzibiliteta

6. Pregled cerebeluma

7. Ispitivanje sedenja, stajanja i hoda

C.1. Opšti fizikalni pregled

Fizikalni pregled malog deteta je od

izuzetnog kliničkog značaja. On podrazumeva

pregled oblika lobanje i perkusiju koju vršimo

blagim udarima vrhom srednjeg prsta po kostima

krova lobanje u svrhu ispitivanja «zvuka naprslog

lonca» koji može ukazivati na postojanje

hidrocefalusa.

Posmatranjem glave u celini i lica možemo

uočiti različita dismorfička obeležja: nisko

39Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

postavljene ušne školjke, nisku liniju rasta kose,

mongoloidni ili antimongoloidni položaj očiju,

hipertelorizam, sastavljene obrve, širok koren

nosa, rascep usne i sl, koji mogu biti deo kliničke

slike određenih sindroma.

Obim lobanje u razvoju je odraz veličine

mozga, koji dostiže 80% svoje adultne zapremine

tokom druge godine života. Stoga, mnoge

neurološke bolesti ranog uzrasta utiču na obim

glave. Merenje obima glave se vrši uz pomoć

običnog santimetra, tako da se izmeri najširi obim

koji treba da obuhvati okcipitalna i frontalna

tubera. Dobijene vrednosti se upoređuju sa

standardnim tabelarnim vrednostima za

odgovarajući uzrast. S obzirom na uznemirenje

koje ovaj deo pregleda izaziva kod deteta, merenje

ostavljamo za kraj. Poželjno je da postupak

ponovimo dva puta i da pri tome dete sedi u

roditeljskom krilu. Ukoliko je potrebno, roditelj

može pridržavati i lako fiksirati detetovu glavu.

Obim glave ispod dve standardne devijacije od

uzrasnog opsega se naziva mikrokranija, a iznad

dve standardne devijacije od gornje fiziološke

granice – makrokranija.

Pregledom kičmenog stuba otkrivamo

postojanje morfoloških izmena (skolioze, lumbalne

hiperlordoze kod Dišenove mišićne distrofije i dr.),

dok na koži trupa, naročito u srednjoj liniji se

mogu opservirati hiperpigmentovani nevusi,

rupice, hipertrihoza, koji mogu ukazivati na

postojanje značajne patologije ispod ovih promena

(npr. spina bifida occulta), naročito u lumbo-

sakralnom predelu.

Od izuzetnog značaja je pregled čitave kože

koji ispitivača može uputiti na postojanje

neurokutanog oboljenja: mrlje boje bele kafe,

hipopigmentacije, nevusi boje portnog vina i sl.

Palpacija abdomena, pre svega jetre i slezine,

može ukazivati na postojanje bolesti skladištenja

(visceromegalija).

C.2 Ispitivanje stanja svesti i mentalnog statusa

Ovaj deo pregleda je izuzetno važan i

istovremeno delikatan u dečjem uzrastu, jer

promena nivoa stanja svesti može biti jedna od

prvih manifestacija akutne bolesti. Najpre treba

opisati aktivnost pacijenta u trenutku našeg ulaska

u sobu. Primena odgovarajućeg stimulusa,

pozivanje po imenu ili štipkanje, treba da probudi

ispitanika. Korisno je opisati ponašanje pacijenta

kada je najaktivniji: neverbalno ili verbalno

komunicira sa okruženjem, pokazuje interesovanje

za igračke, nova lica, prati događaje. Utisak

roditelja o dečjem ponašanju je jedan od

najvažnijih parametara na osnovu kojih

procenjujemo stanje svesti i mentalni status. Zbog

toga je neophodno pitati roditelje da li se dete

ponaša kao obično.

Kod dece starijeg uzrasta, koja imaju formiran

govor, tražimo da kratku reč izgovaraju unazad,

slovo po slovo.

Na kraju koristimo test od četiri komande:

«kada ti kažem, ti hodaj», «zatvori oči», «isplazi

jezik» i «stavi svoju levu ruku na desno uvo».

Mnoga deca, naročito pre desete godine života,

imaju problem sa levo-desno orijentacijom o čemu

treba voditi računa. Kratkoročno pamćenje

testiramo pitanjima vezanim za skorašnji obrok

(šta je doručkovao ili ručao), a dugoročno

pitanjima o ranijim iskustvima (ime učitelja,

vaspitačice).

C.3. Pregled kranijalnih nerava

Pri ispitivanju kranijumskih živaca kod

dece je veoma značajna opservacija.

Prvi, mirisni kranijalni živac se ne ispituje

rutinski u ranom dečjem uzrastu.

Vizus se grubo procenjuje posmatranjem

deteta pri kretanju u prostoru, između predmeta,

kao i prepoznavanjem slika ili igračaka na

adekvatnoj udaljenosti.

Okulopokretači se ispituju praćenjem

interesantnih svetlećih igračaka ili izvora svetlosti

u svim pravcima pogleda. Usmerenost bulbusa

naniže, «znak zalazećeg sunca», je klinički

pokazatelj povišenog intrakranijumskog pritiska.

Ispitivanje reakcije zenica na svestlost ne odstupa

bitno od pregleda kod odraslih ispitanika, ali se

izvodi pri samom kraju, zbog neprijatnosti koju

izaziva kod deteta.

40 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

Pregled trigeminalnog nerva u dečjem dobu

se svodi na motornu funkciju, posmatranje

žvakanja, jer se pouzdani podaci o senzibilitetu

mogu dobiti samo u starijem uzrastu.

Ispitivanje facijalisa, kod dece koja ne

razumeju zadate naloge, se vrši posmatranjem

voljne inervacije mimične muskulature pri

smejanju i plaču.

Kod najmlađih, sluh se procenjuje primenom

kohleo-palpebralnog refleksa, naglim pljeskom

šakama ispred aurikule jedne, a zatim druge strane.

Pozitivan, normalan odgovor podrazumeva treptaj

kao reakciju na iznenadni jak zvuk. Odsustvo

odgovora pobuđuje sumnju na postojanje oštećenja

sluha.

Posmatranje položaja mekog nepca i

eventualno izazivanje refleksa na povraćanje se

sprovode kod ispitivanja devetog i desetog

kranijumskog živca.

Posmatranjem položaja glave (inklinacija u

levo ili desno) i okretanjem glave u levu i desnu

stranu ispitujemo funkciju akcesornog živca.

Prinudni položaj glave, tortikolis kod dece se može

videti kod visokih cervikalnih intrapartusnih

povreda, procesa u nivou kraniocervikalnog

prelaza, kao i kod tumora zadnje lobanjske jame

kada se dete zatvaranjem oka i prinudnim

položajem glave brani od dvoslika.

Ukoliko je moguće, hipoglosus ispitujemo

posmatranjem jezika u usnoj duplji i pri spontanoj

protruziji ili na nalog, ako mali pacijent može da

sarađuje.

C.4. Pregled motornog sistema

Pažljivo posmatranje aktivnosti deteta nam

daje pouzdane informacije o stanju motornog

sistema. Pri tome, u zavisnoti od uzrasta deteta,

koristimo igračke i pratimo kako predmete

prihvata i spušta, da li simetrično koristi obe ruke,

kako baca ili šutira loptu. Finu motornu

koordinaciju sa korišćenjem olovke možemo

ispitati na uzrastu od dve do 2,5 godine; zdravo

trogodišnje dete je sposobno da nacrta krug, a sa

četiri godine kopira nacrtani krst.

Kod starije dece koja ostvaruju saradnju sa

ispitivačem, za ispitivanje lezije centralnog

motornog neurona na gornjim ekstremitetima se

izvodi pronatorni test. Tražimo od deteta da

ispruži ruke napred sa dlanovima okrenutim

naniže, zatim zatvori oči i okrene dlanove naviše.

Tokom ove supinacije, dete sa lezijom centralnog

motornog neurona spušta lakat paretične ruke

naniže i put unutra. Pored toga, mogu se zapaziti i

asimetrična supinacija, «plutanje» šake na

zahvaćenoj strani ili fleksija prstiju, koji na zahtev

mogu biti provocirani pokretima glave levo-desno

u smislu «ne». Za otkrivanje oštećenja na donjim

ekstremitetima se naloži pacijentu da stopala i

palčeve podigne od podloge praveći pri tom

rotatorne pokrete unazad kao kada lovi ribu uz

pomoć štapa za pecanje.

Pojedinačno testiranje mišićne snage se može

primeniti tek oko pete godine života.

Funkcionalni motorni testovi: puzanje,

ustajanje iz čučnja, ustajanje iz sedećeg položaja

na podu, penjanje uz stepenice i testiranje hoda

imaju više namena. Sa jedne strane, mogu ukazati

na postojanje proksimalne motorne slabosti -

«Gowers-ov manevar» pri ustajanju iz čučnja kada

se dete penje uz sosptvene noge (miopatije), a sa

druge, mogu biti jedini način za ispitivanje slabosti

kod mlađe dece i/ili omogućiti procenu motornog

razvoja deteta. Na uzrastu od 18 meseci dete ustaje

sa poda preko položaja pronacije, odupirući se

šakama o pod. Kasnije, sa 2,5 godine starosti,

zdravo dete ustaje sa poda iz sedećeg položaja bez

pomoći ruku i sa lakoćom trči.

Za ispitivanje mišićnih refleksa je

neophodno da dete bude relaksirano. Zbog toga je

potrebno perkusioni čekić postaviti u vodoravni

položaj i pokretima gore-dole imitirati konja, uz

odgovarajuće prateće zvuke, da ispitanika

oslobodimo straha od predmeta koji može da mu

nanese bol. Pored toga, pre izvođenja svakog

refleksa ponaosob, možemo isti izazvati na

roditelju koji dete drži u krilu ili malom pacijentu

dati da sam opipa čekić ili imitira pokret ispitivača.

Poželjno je da refleks brahioradijalisa ne izvodimo

direktnom perkusijom, već preko našeg palca ili

kažiprsta koji postavljamo na tetivu mišića.

41Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

Znak Babinskog predstavlja normalan plantarni

odgovor na uzrastu do godinu dana. U dečjem

uzrastu, asimetrija plantarnog odgovora ima

najveći klinički značaj.

C.5 Ispitivanje senzibiliteta

Najčešći, a često i jedini modalitet

senzibiliteta koji možemo da ispitamo kod dece je

dodir. Testiranje senzibiliteta i kod odraslih

predstavlja zametan posao sa nesigurnim ishodom,

što u dečjem uzrastu postaje još izraženije s

obzirom na hipervigilnost njihove pažnje. Zbog

toga, nalaze ovog ispitivanja treba sa oprezom

interpretirati.

C.6. Pregled cerebeluma

U zavisnosti od toga u kojoj meri možemo

da ostvarimo saradnju sa malim ispitanikom,

sprovodićemo odgovarajuće cerebelarne probe

koje se primenjuju u odraslom dobu. Najčešće se

procena cerebelarnog integriteta sprovodi

opservacijom deteta kroz igru. Pre svega u

pokušaju da vrhom svog prsta dodirne lutkin nos, a

zatim svoj nos ili tokom hvatanja, premeštanja

igračaka ili stavljanja - uzimanja sitnih delova

igračaka u posudu ili iz nje. Slaganje kockica je

jedan od najboljih pokazatelja spretnosti i

koordinisanosti pokreta.

C.7. Ispitivanje sedenja, stajanja i hoda

Ovi testovi su korisni kao pokazatelj

cerebelarne disfunkcije u srednjoj liniji i kao

odličan skrining za otkrivanje mišićnih slabosti.

Pri stajanju i hodu treba posmatrati širinu osnove

na kojoj ispitanik stoji, položaj i pokrete ruku,

položaj karlice, odnos butina, položaj stopala.

Najbolju saradnju pri ispitivanju hoda

ostvarujemo kada pustimo dete da hoda prema

majci koja ga dočekuje raširenih ruku, pri čemu

ono obično pruža svoje ruke u susret, spontano

izvodeći test tonjenja.Ukoliko je izvodljivo, hod na

petama najbolje ispitujemo gledajući ispitanika

dok ide prema nama, a hod na prstima, dok se

leđima okrenut udaljava. Najbolji test je

posmatranje deteta dok trči, uz poziv koji će

iziskivati nagli okret.

Neposredno nakon samostalnog

prohodavanja, hod je na širokoj osnovi, nestabilan,

gegav, sa rukama podignutim do nivoa ramena

(«visoki gard»), što detetu obezbeđuje zaštitu i

pomaže u održavanju ravnoteže. Sa sazrevanjem,

oko 18. meseca života, ruke se polako spuštaju

(«niski gard»), a zatim hod dobija karakteristike

adultnog, sa sinkinetskim pokretima ruku.

Literatura

1. Dubowitz L, Mercuri E, Dubowitz V. An

optimality score for the neurologic examinati-

on of the term newborn. J Paediatr 1998; 133

(3): 406-16.

2. Dubowitz L, Ricci D, Mercuri E. The

Dubowitz neurological examination

of the full-term newborn.Ment Retard Dev

Disabil Res Rev 2005; 11(1): 52-60.

3. Griffiths R. The abilities of babies: a study in

mental measurement. Amersham: Association

for Research in Infant and Child Development,

1986.

4. Woodward LJ, Mogridge N, Wells SW, Inder

TE. Can neurobehavioral examination predict

the presence of cerebral injury in the very low

birth weight infant? J Dev Behav

Pediatr 2004; 25(5):326-34.

5. Volpe J.J. The Neurological Examination:

Normal and Abnormal Features. In:

Neurology of the Newborn. 4th ed. WB

Saunders Co, Philadelphia, 2001: 95-124.

6. Бранковић Д. Преглед

новорођенчета;Процена гестацијске

зрелости новорођенчади. У: Јанковић

Б.(уредник).Водич за основно и

специјализовано збрињавање

новорођенчета - Институт за здравствену

заштиту мајке и детета Србије “Др Вукан

Чупић” , Београд : 2011; 30-49, 55-60.

42 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakEditorijali

7. Piaget J, Inhalder B. Intelektualni razvoj

deteta. Izabrani radovi. Zavod za udzbenike i

nastavna sredstva. Beograd 1982.

8. Vojta V. Die zerebralen Bewegungen im Säu-

glingsalter, Frühdiagnose und Frühtherapie,

Enke Velag. Stuttgart, 1988.

9. Yang M. Newborn neurologic examination.

Neurology 2004;62;E15-E17. DOI

10.1212/WNL.62.7.E15

10. Grupa autora. Osnovi neurološkog pregleda.

Kostić VS (urednik). Medicinski fakultet,

Libri Medicorum, Beograd, 2011.

11. Painter MJ. Neurological evaluation of

newborns, infants, and older children. In:

Albright AL, Pollack IF, Adelson PD.

Principles and practice of pediatric

neurosurgery. New York: Thieme, 1999; 3–

19.

12. Mejaški-Bošnjak V. Rani neurološki razvoj

djeteta. Paediatr Croat 2008; 52 (Supl 1): 36-

42.

13. Vojta V. Di posturale Ontogenese als Basis

der Entwicklungsdiagnostik. Der Kinderartzt

1989; 20:S.669-764.

14. Zukunft-Huber B. Neometan razvoj odojčeta.

Prva i presudna godina života. Dečje novine,

Gornji Milanovac, 1998.

15. Romeo DM, Ricci D, van Haastert IC, et al.

Neurologic Assessment Tool for Screening

Preterm Infants at Term Age.J Pediatr

2012;161:1166-8

43Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Editorijali

LIPIDNI STATUS I INDEKS TELESNE MASE KAO PROGNOSTIČKI FAKTORI U

PACIJENATA SA AMIOTROFIČNOM LATERALNOM SKLEROZOM

Autori: Nemanja Belić1, Mihail Baša

1

Mentor: prof. dr Zorica Stević2

1 Medicinki fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Klinika za neurologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak

Uvod: Amiotrofična lateralna skleroza (ALS)

najozbiljniji je oblik degenerativne bolesti

motornih neurona kod odraslih, čiji nezaustavljivi

tok vodi ka smrti za dve do pet godina, najčešće

zbog respiratorne insuficijencije. Osim starosti i

mesta početka bolesti, nijedan drugi činilac nije

dokazan kao pouzdan pokazatelj toka i ishoda

bolesti, odnosno vremena preživljavanja.

Cilj: Procena uticaja serumskih vrednosti

holesterola, triglicerida i indeksa telesne mase na

početku praćenja bolesti, na preživljavanje

obolelih od ALS.

Materijal i metode: Ispitivanje je obuhvatilo 234

pacijenta Klinike za neurologiju Kliničkog centra

Srbije sa ALS koji su dijagnostikovani i praćeni u

periodu od 8 godina (2004-2011). Kompletan

lipidni status (nivo holesterola i triglicerida) i

indeks telesne mase imalo je 59 pacijenata kod

kojih je ispitivan uticaj ovih parametara na

preživljavanje. Kaplan-Majerovom metodom,

odnosno Mantel-Koksovim testom je procenjeno

trajanje bolesti, odnosno srednje preživljavanje.

Rezultati: U ovoj studiji 19 (32,2%) pacijenata

imalo je fiziološke vrednosti lipida a 40 (67,8%)

hiperlipidemiju. Srednje preživljavanje pacijenata

sa normalnim lipidima od pojave simptoma

iznosilo je 3,21 ± 1,44 godine, a sa

hiperlipidemijom 3,3 ± 1,59 godine ( p = 0,71). U

odnosu na pol, životno doba i formu bolesti na

početku nije uočena značajna razlika u

preživljavanju pacijenata. Takođe, nije pokazano

da indeks telesne mase značajno utiče na

preživljavanje.

Zaključak: Rezultati dobijeni ovom studijom

pokazuju da se hiperlipidemija i veće vrednosti

indeksa telesne mase ne mogu dovesti u vezu sa

dužim preživljavanjem pacijenata obolelih od ALS,

te da nisu pouzdan prognostički faktor.

Ključne reči: amiotrofična lateralna skleroza,

hiperlipidemija, preživljavanje, indeks telesne

mase.

Abstract

Introduction: Amyotrophic lateral sclerosis

(ALS) is the most serious degenerative motor

neuron disease in adults whose relentless course

leads to death within 2 to 5 years, generally due to

respiratory failure. Besides age and site of onset,

no other factors have been consistently

demonstrated to be related to the ALS outcome.

The aim: The aim of this study was to

investigate the influence of serum lipid levels

(cholesterol and triglyceride) and body mass index

at the time of diagnosis on survival rates in ALS

patients.

Material and methods: The study included

234 patients with ALS who have been diagnosed

and followed over the period of 8 years (from 2004

to 2011) at the Neurological Clinic of the Clinical

Centre of Serbia, and 59 of these had a complete

lipid status which was analysed. Survival was

assessed by the Kaplan-Meier and Mantel-Cox

methods.

Results: In this study 19 (32.2%) patients

had normal values of lipids and 40 (67.8%) had

hyperlipidaemia. The mean survival time from the

onset of symptoms for patients with normal

lipidaemia was 3.21 ± 1.44 years, while in patients

with hyperlipidaemia 3.3 ± 1.59 years (p = 0.71).

A significant difference in survival rates according

to different site and age of onset, as well as gender

was not proved. Furthermore, our study couldn’t

confirm that BMI had a significant influence on

patients’ life expectancy.

Conclusion: Results acquired in this study

show that hyperlipidaemia and higher values of

BMI cannot be related with better survival rates of

patients with ALS.

Keywords: amyotrophic lateral sclerosis,

hyperlipidaemia, survival, body mass index.

44 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Uvod

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je

najteža progresivna neurodegenerativna bolest kod

koje postoji lezija i centralnog i perifernog

motoneurona. Oštećenje motornih neurona se

najčešće povezuje sa patološkim nakupljanjem

ubikvitina, RNK-vezujućeg proteina FUS, kao i

TARDBP proteina (TDP-43) u citoplazmi tela

nervnih ćelija. Obično počinje u šestoj ili sedmoj

deceniji života, a smrt kod oko 50% pacijenata

nastupa u periodu od 2,5 do 3 godine od pojave

simptoma, usled paralize respiratornih mišića [1-5].

Oko 25% pacijenata preživi pet godina, a samo 5-

10% živi duže od deset godina [6]. Incidencija ove

bolesti je 1,5 - 3 novoobolela na 100.000 stanovnika,

što je slično kao kod multiple skleroze, s tim što je

prevalenca ALS znatno manja usled lošije prognoze

[7]. S obzirom na to da većina obolelih ima vrlo lošu

prognozu, u poslednje vreme se posvećuje veća

pažnja pravcu otkrivanja prognostičkih faktora koji

bi ukazali na duže preživljavanje.

Iako se ALS tradicionalno smatra za bolest

motoneurona, sve je veći broj dokaza da je ovo, u

stvari, multisistemska bolest sa dodatnim

neurološkim manifestacijama, pored motornih. Izvan

nervong sistema, primećene su zanimljive

metaboličke promene u vezi sa ovom bolešću [8].

Preciznije, novije studije pokazuju da dve trećine

obolelih od ALS pokazuju stabilni

hipermetabolizam, koji je u korelaciji sa srednjim

preživljavanjem [9-11].

Nakon što je pokazano da oboleli od ALS i

neuhranjenosti imaju kraće srednje preživljavanje

[12], u poslednjih deset godina obavljena su brojna

istraživanja u cilju procene značaja poremećaja

metabolizma lipida kao prognostičkog faktora kod

ALS. Uprkos činjenici da je postojanje poremećaja

metabolizma u ALS dokazano, objavljeni su oprečni

rezultati o ulozi dislipidemije i indeksa telesne mase

(ITM) kao prognostičkih faktora dužeg

preživljavanja. Neki autori označavaju

hiperlipidemiju kao značajan faktor prognoze dužeg

preživljavanja [12-17], dok drugi tvrde da kod

obelilih od ALS to nije značajan činilac [2, 18].

Slično ovome, oprečni su i rezultati istraživanja

uticaja različitih stepena uhranjenosti na početku

bolesti, odnosno ITM na vreme preživljavanja [19-

25].

Cilj ovog istraživanja je da ispita uticaj

koncentracije lipida (holesterola i triglicerida) u krvi

i indeksa telesne mase na vreme preživljavanja

pacijenata obolelih od amiotrofične lateralne

skleroze.

Materijal i metode

Ispitanici

Ovom studijom obuhvaćeno je 234

pacijenta obolelih od ALS koji su dijagnostikovani i

lečeni na Klinici za neurologiju Kliničkog centra

Srbije u period od 2004. do 2011. godine. Kod svih

pacijenata dijagnoza verovatne i sigurne ALS

postavljena je upotrebom El Escorial kriterijuma

[26]. Pacijenti sa nepotpunom dokumentacijom,

mogućom ALS (po El Escorial kriterijumima),

familijarnim oblikom ALS, oboleli od drugih

bolesti motoneurona osim ALS, pacijenti kod kojih

nije tačno utvrđen datum smrtnog ishoda, te

pacijenti sa perkutanom endoskopskom

gastrostomom (PEG) isključeni su iz istraživanja,

tako da je konačna analiza uključila 59 pacijenata.

Klinički podaci obuhvatili su starost pacijenata u

momentu početka bolesti, formu bolesti na početku

(bulbarni ili spinalni početak), procenu

funkcionalnog stanja izraženu kroz ALSFRS zbir,

kao i trajanje bolesti do smrtnog ishoda. Ni jedan od

pacijenata nije uzimao lekove za snižavanje

lipidemije.

Laboratorijski i klinički parametri

Laboratorijski testovi podrazumevali su

određivanje serumske koncentracije ukupnog

holesterola (HOL) i triglicerida (TGL) dobijenih od

pacijenata jutarnjom venepunkcijom nakon perioda

od 8-10 časova neuzimanja hrane. U skladu sa

parametrima laboratorijskih postupaka koje koristi

centralna laboratorija Kliničkog centra Srbije, za

referentne vrednosti lipidemije i hiperlipidemije

uzeto je: HOL [0-5,2 mmol/L], TGL [0-1,7

mmol/L]. Svim pacijentima je izmerena telesna

visina i masa, a na osnovu ovih podataka izračunat

indeks telesne mase, kao količnik mase pacijenta i

kvadrata njegove visine [kg/m2]. Zatim su pacijenti

razvrstani u kategorije uhranjenosti na osnovu

kriterijuma Svetske zdravstvene organizacije za

područje Evrope: pothranjeni (ITM < 18,5),

normalne uhranjenosti (18,5–24,9), predgojazni

(25,0–29,9), gojazni I klase (30,0–34,9), II klase

(35,0–39,9), i gojazni III klase (ITM > 40). Svi

pacijenti redovno su praćeni tokom trajanja bolesti.

Datum smrti je dobijen na osnovu dokumentacije

regionalnih opštinskih registara matičara ili

direktnim kontatktom sa članovima porodice i

uvidom u postojeću dokumentaciju.

Statistička analiza

Period preživljavanja predstavljen je kao

broj godina od pojave simptoma i znaka bolesti do

smrti pacijenta. Uticaj navedenih parametara na

45Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

preživljavanje pacijenata ispitivan je Kaplanovim i

Majerovim postupkom, a značajnost razlike između

pojedinih grupa Mantelovim i Koksovim testom

(„logrank test”). Stepen korelacije dužine trajanja

bolesti sa pojedinim merenim parametrima

određena je Spirmanovim testom. Prihvaćeno je da

se vrednost p < 0,05 smatra kao statistički značajna.

Rezultati

Spinalni početak bolesti ustanovljen je kod

40 (67,8%) pacijenata, 22 (81,48%) muškaraca i

18 (56,25%) žena, a bulbarni kod 19 pacijenata

(32,2%), 5 (18,52%) muškaraca i 14 (43,75%)

žena. Srednje životno doba na početku bolesti bilo

je 57,66 ± 8,68 godina ( x̅ ± SD ), dok se kod 5

(8,47%) pacijenata bolest javila pre 45. godine.

Srednje trajanje bolesti do postavljanja dijagnoze,

tj. dijagnostičko kašnjenje iznosilo je 1,07 ± 1,05

godina, a prosečno vreme preživljavanja 3,27 ±

1,52 godine. U tabeli 1 prikazani su demografski i

klinički podaci kao i rezultati laboratorijskih

ispitivanja posmatranih pacijenata.

Tabela 1. Osnovne kliničke karakteristike

pacijenata sa ALS. Sve vrednosti su predstavljene

u obliku procentne zastupljenosti ili x̅ ± SD.

Demografske karakteristike

ukupan broj pacijenata 59

muškarci 27 (45,76%)

žene 32 (54,24%)

mlaĎi od 45 godina 5 (8,47%)

stariji od 45 godina 54 (91,52%)

srednje životno doba

početka bolesti

57,66 ± 8,68

godina

dijagnostičko kašnjenje 1,07 ± 1,05

godina

srednje vreme trajanja

bolesti

3,27 ± 1,52

godine

spinalni početak 40 (67,8%)

bulbarni početak 19 (32,2%)

prosečni indeks telesne

mase

23,12 ± 3,6

kg/m2

Laboratorijske analize

ukupni serumski holesterol 5,89 ± 1,38

mmol/L

serumski trigliceridi 1,81 ± 1,19

mmol/L

Srednja vrednost ukupnog serumskog

holesterola iznosila je 5,89 ± 1,38 mmol/L, a

serumskih triglicerida 1,81 ± 1,19 mmol/L.

Normalne vrednosti lipida imalo je 19 (32,2%),

dok je hiperlipidemija zabeležena kod 40 (67,8%)

pacijenata. Srednje preživljavanje u grupi

bolesnika sa normalnim vrednostima lipida bilo je

kraće, 3,21 ± 1,44 godine, u odnosu na grupu sa

povišenim vrednostima gde je iznosilo 3,3 ± 1,59

godine, ali bez statistički značajne razlike u

preživljavanju (logrank test, p = 0,71), prikazano u

grafiku I. U odnosu na polne razlike, srednje

preživljavanje muškaraca sa normalnom

lipidemijom iznosilo je 3,6 ± 1,35 godina, a sa

hiperlipidemijom 3,65 ± 1,84 godine. Kod žena sa

normalnim serumskim lipidima prosečno

preživljavanje iznosilo je 2,78 ± 1,48 godina, a sa

hiperlipidemijom 3,08 ± 1,36 godina, kao što se

može videti u tabeli 2. Ni u ovom slučaju nije

pokazana značajna statistička razlika (logrank test,

p = 0,57).

Tabela 2. Različiti pokazatelji preživljavanja ALS

pacijenata, u odnosu na vrednosti lipida. Sve

vrednosti su predstavljene u obliku x̅ ± SD , gde je

x̅ srednje trajanje bolesti u godinama.

demografske

odlike

normalne

vrednosti

lipida

povišene

vrednosti

srednje

preživljavanje 3,21 ± 1,44 3,3 ± 1,59

muškarci 3,6 ± 1,35 3,65 ± 1,84

žene 2,78 ± 1,48 3,08 ± 1,36

mlaĎi od 45

godina 3 * 4,25 ± 0,5

stariji od 45

godina 3,22 ± 1,51 3,19 ± 1,64

bulbarni

početak bolesti 3,57 ± 1,62 2,75 ± 1,14

spinalni početak 3,0 ± 1,41 3,54 ± 1,71 * jedan pacijent

46 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Posmatrajući starosne grupe pacijenata,

srednje trajanje bolesti kod pacijenata mlađih od

45 godina sa hiperlipidemijom iznosilo je 4,25 ±

0,5 godine, dok je samo jedan pacijent imao

normalne vrednosti lipida, i živeo je tri godine od

pojave simptoma. U grupi starijih od 45 godina, sa

normalnom lipidemijom prosečno preživljavanje je

iznosilo 3,22 ± 1,51 godine, a sa povišenim

lipidima 3,19 ± 1,64 godine; ni u ovom slučaju nije

registrovana značajna razlika (logrank test, p =

0,68). U pogledu na formu bolesti, kod pacijenata

sa spinalnim početkom i normalnom lipidemijom

prosečno preživljavanje iznosilo je 3,0 ± 1,41

godine, a sa hiperlipidemijom 3,54 ± 1,71 godine.

Pacijenti sa bulbarnim početkom i normalnim

vrednostima lipida prosečno su živeli 3,57 ± 1,62

godine, a sa hiperlipidemijom 2,75 ± 1,14 godine;

bez statistički značajne razlike (logrank test, p =

0,897).

Grafik 1. Kriva preživljavanja ALS pacijenata u

donosu na vrednosti lipida u krvi.

U statističkoj obradi ispitan je stepen

korelacije između dužine trajanja bolesti i

vrednosti ukupnog serumskog holesterola (R = 0,2;

p = 0,129); triglicerida (R = 0,195; p = 0,139);

vrednosti indeksa telesne mase (R = -0,22; p =

0,87); ALSFRS zbira (R = 0,142; p = 0,283).

Ispitivanjem svih ovih parametara nije dokazana

značajna korelacija, što je i grafički prikazano

(grafici 1-5).

Grafik 2. Stepen korelacije između dužine

trajanja bolesti i serumske koncentracije ukupnog

holesterola (HOL). Trajanje bolesti izraženo je u

godinama, a koncentracije holesterola u mmol/L.

Grafik 3. Stepen korelacije između dužine

trajanja bolesti i serumske koncentracije

triglicerida (TGL). Trajanje bolesti izraženo je u

godinama, a koncentracija trigilicerida u mmol/L.

Grafik 4. Stepen korelacije između dužine trajanja

bolesti i serumske koncentracije triglicerida

(TGL). Trajanje bolesti izraženo je u godinama, a

koncentracija trigilicerida u mmol/L.

47Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Grafik 5. Stepen korelacije između dužine

trajanja bolesti sa zbirom skale funkcionalne

procene bolesnika sa ALS (ALSFRS). Trajanje

bolesti izraženo je u godinama.

Merenjem indeksa telesne mase u vreme

dijagnoze, 3 (5,08%) pacijenta su bila pothranjena,

normalne vrednosti indeksa imalo je 37 (62,71%),

predgojaznih je bilo 18 (30,5%), i jedan pacijent je

bio u tzv. I klasi gojaznih (ITM = 32,27). U prvoj

grupi, srednje preživljavanje je bilo 4,67 ± 1,53

godine, u drugoj 3,08 ± 1,34, u trećoj 3,39 ± 1,85

godine, dok je pacijent I klase gojaznosti živeo

četiri godine. Analizom podataka nije ustanovljena

statistički značajna razlika u preživljavanju

pacijenata u odnosu na stepen uhranjenosti

(logrank test, p = 0,94).

Diskusija Rezultati ovog istraživanja pokazuju da

67,8% pacijenata sa ALS ima i pridruženu

hiperlipidemiju, što je dvostruko više od

prevalence hiperlipidemije u Srbiji koju pokazuju

epidemiološki pokazatelji [27]. S obzirom na to da

u ovoj studiji nije postojala kontrolna grupa

zdravih pacijenata sa hiperlipidemijom, radi

poređenja, u skladu sa polom i starošću

posmatranih pacijenata, treba biti pažljiv u

interpretaciji nalaza. Ipak, radovi drugih autora,

čije su studije uključivale kontrolnu grupu,

pokazuju slične rezultate, tačnije da je nivo

holesterola i triglicerida, dvostruko veći u

pacijenata sa ALS u odnosu na kontrole [14, 15].

Analiza je pokazala da ne postoje značajne

razlike u trajanju bolesti između pacijenata sa

normalnim lipidnim statusom i hiperlipidemijom.

Uzevši u obzir studije koje su pokazale da je kod

pacijenata sa ALS, iz za sada nerazjašnjenih

razloga, metabolizam dvostruko povećan, što vodi

ka povećanju intenziteta bazalnog metabolizma, ne

možemo da budemo sigurni da li je hiperlipidemija

kod ALS posledica specifičnih potreba organizma

za lipidima, ili nespecifično povećanje obima

metaboličkih potreba u hipermetabolizmu [8, 16,

28]. Takođe, ne treba da zanemarimo činjenicu da

je nešto više od dve trećine pacijenata u

posmatranoj grupi imalo hiperlipidemiju, te da

disproporcija u odnosu na broj bolesnika sa

normalnim vrednostima lipida, može da utiče na

valjanost statističkog zaključka u međusobnom

poređenju. Studija na transgenim miševima

pokazala je da se u presimptomatskoj fazi ALS

javlja hipolipidemija uz normalne vrednosti drugih

izvora energije, odlika koja se javlja u odsustvu

znaka pothranjenosti, značajnije degeneracije

motoneurona i pojave respiratornih tegoba. Ova

pojava je pripisana mogućnosti da se u sklopu

patofiziološkog mehanizma ALS javlja i specifični

poremećaj metabolizma lipida, a ne samo da je

posledica energetskog disbalansa i postojanja

prethodno nabrojanih tegoba [28].

Po rezultatima ove studije, pacijenti sa

hiperlipidemijom živeli su oko 36 dana duže nego

pacijenti sa normalnim lipidima, ali ova razlika

nije od značaja. Takođe, nije uočena statistički

značajna razlika u preživljavanju ni u odnosu na

pol, formu bolesti na početku, niti starosti

pacijenata na početku bolesti, mada može da se

primeti da je pacijent mlađi od 45 godina sa

normalnim vrednostima lipida živeo oko godinu

dana duže nego oni sa povišenim lipidima, a i svih

pacijenata starijih od 45. Treba uzeti u obzir da je

odnost starijih i mlađih od 45 bio 54:5, što je

velika razlika koja otežava poređenje i donošenje

pouzadnog zaključka. Ova primećena pojava

dužeg preživljavanja pacijenata mlađih od 45

godina trebalo bi, u daljem ispitivanju, da se

prouči povećanjem broja pacijenata iz ove grupe, i

dostizanja adekvatnijeg brojnog odnosa sa grupom

starijih.

Ispitivanje procene dužine trajanja bolesti u

odnosu na ALSFRS zbir nije pokazalo značajan

stepen korelacije. Ovo je u skladu sa najnovijim

rezultatima studija gde je pokazano da

funkcionalna sposobnost pacijentata sa ALS

određena ALSFRS skalom nije dobar pokazatelj

preživljavanja. Pomenute studije preporučuju

kombinovanu skalu procene funkcije i

preživljavanja (CAFS) kao bolji pokazatelj za

predviđanje trajanja bolesti [29-31], te bi ovu skalu

trebalo ispitati u daljem istraživanju.

48 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Značajna korelacija nije dokazana ni

između serumske koncentracije holesterola i

triglicerida sa periodom preživljavanja. Ovi

rezultati su u skladu sa novijom studijom sa

kontrolama gde je pokazano da hiperlipidemija

nije povezana sa dužim preživljavanjem, mada u

ovoj studiji nije pokazana značajna razlika u

koncentracijama lipida između obolelih od ALS i

kontrola, dok je u našoj studiji dva puta veća

učestalost hiperlipidemije nego u populaciji Srbije

prema epidemiološkim podacima [18]. U drugoj

studiji, suprotno, pokazano je da pacijenti sa

hiperlipidemijom preživljavaju oko 14 meseci

duže nego pacijenti sa normalnim lipidima, te joj

se pripisuje značaj kao prognostičkom faktoru

[14].

Naša studija nije pokazala statistički

značajan uticaj indeksa telesne mase u vreme

dijagnoze na period preživljavanja. Paradoksalno,

pacijenti sa ITM ispod 18,5 (pothranjeni), kao i

gojazni (ITM > 30) živeli su u proseku 18 meseci

duže nego normalno uhranjeni i predgojazni. Ove

rezultate bi trebalo proveriti na većem uzorku

pacijenata. Studije dostupne u literature, takođe su

pokazale da ITM na početku bolesti ne utiče na

dalji tok i prognozu, ali je primećeno da je (u

skladu sa činjenicom o postojanju

hipermetabolizma u ALS) brzina opadanja

vrednosti ITM tokom praćenja bolesti dobar

pokazatelj prognoze [32-34].

U sagledavanju rezultata dobijenih ovim

istraživanjem možemo da zaključimo da

hiperlipidemija i indeks telesne mase ne pokazuju

značajan uticaj na trajanje bolesti. Ove nalaze bi

trebalo da proverimo u budućim istraživanjima na

većem broju ispitanika, poređenjem sa kontrolnom

grupom zdravih pacijenata, i uz praćenje promena

biohemijskih parametara i ITM tokom progresije

bolesti, proširenih serumskim vrednostima

lipoproteina male i velike gustine (LDL i HDL),

što su bili u više prilika pomenuti, glavni nedostaci

ove studije.

Literatura

1. Lee JR, Annegers JF, Appel SH. Prognosis of

amyotrophic lateral sclerosis and the effect of

referral selection. J Neurol Sci 1995; 132:207–15.

2. Preux PM, Couratier P, Boutros-Toni F, Salle

JY, Tabaraud F,.et al. Survival prediction in

sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Age and

clinical form at onset are independent risk factors.

Neuroepidemiology 1996; 15:153–60.

3. Traynor BJ, Codd MB, Forde C, Frost E,

Hardiman O. Clinical features of amyotrophic

lateral sclerosis according to the El Escorial and

Airlie House diagnostic criteria. Arch Neurol

2000; 57:1171–6.

4. Deng HX, Zhai H, Bigio EH, et al. FUS-

immunoreactive inclusions are a common feature

in sporadic and non-SOD1 familial amyotrophic

lateral sclerosis. Ann Neurol 2010; 67:739–48.

5. Mackenzie IR, Bigio EH, Ince PG, et al.

Pathological TDP-43 distinguishes sporadic

amyotrophic lateral sclerosis from amyotrophic

lateral sclerosis with SOD1 mutations. Ann Neurol

2007; 61:427–34.

6. Haverkamp J, Appel V, Appel H. Natural

history of amyotrophic lateral sclerosis in a

database population: Validation of a scoring

system and a model for survival prediction. Brain

1995; 118:707.

7. Corcia P, Pradat PF, Salachas F, et al. Causes of

death in a post-mortem series of ALS patients.

Amyotroph Lateral Scler 2008; 9:59–62.

8. Gonzalez de Aguilar JL, Dupuis L, Oudart H,

Loeffler JP. The metabolic hypothesis in

amyotrophic lateral sclerosis: insights from mutant

Cu/Zn-superoxide dismutase mice. Biomed

Pharmacother 2005; 59:190–196.

9. Kasarskis EJ, Berryman S, Vanderleest JG,

Shneider AR, McClain CJ. Nutritional status of

patients with amyotrophic lateral sclerosis: relation

to the proximity of death. Am J Clin Nutr 1996;

63:130–137.

10. Desprot JC, Preux PM, Magy l, et al. Factors

correlated with hypermetabolism in patients with

amyotrophic lateral sclerosis. Am J Clin Nutr

2001; 74:328–334.

11. Desport JC, Torny F, Lacoste M, preux PM,

Couratier P. Hypermetabolism in ALS:

correlations with clinical and paraclinical

parameters. Neurodegenerative Dis 2005; 2:202–

207.

12. Desport JC, Preux PM, Truong TC, Vallat JM,

Sautereau D. et al. Nutritional status is a

prognostic factor for survival in ALS patients.

Neurology 1999; 53 (5):1059–1063.

13. Tysnes OB, Vollset SE, Aarli JA.

Epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis in

Hardaland county, western Norway. Acta Neurol

Scand 1991; 83:280–5.

14. Dorst J, Ludolph AC, Hendrich C,Kuehnlein P,

Sperfeld AD. Nutritional prognostic factors in

49Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

amyotrophic lateral sclerosis, Amyotrophic Lateral

Sclerosis 2009 (Suppl. 1); 10:180–190, P243.

15. Dupuis L, Corcia P, Fergani A, Gonzalez de

Aguilar JL, Bonnefont-Rousselot D. et al.

Dyslipidaemia is a protective factor in

amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 2008;

70:1004–9.

16. Dupuis L, Oudart H, Rene F, Gonzalez de

Aguilar JL, Loeffler JP. Evidence for defective

energy homeostasis in amyotrophic lateral

sclerosis: benefit of a high-energy diet in a

transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S

A 2004; 101:11159–64.

17. Fergani A, Oudart H, Gonzalez de Aguilar JL,

Fricker B, Rene F.et al. Increased peripheral lipid

clearance in an animal model of amyotrophic

lateral sclerosis. J Lipid Res 2007; 48:1571–80.

18. Chiò A, Calvo A, Ilardi A, Cavallo E, Moglia

C. et al. Lower serum lipid levels are related to

respiratory impairment in patients with ALS.

Neurology 2009; 73:1681–1685.

19. Brooks BR. Natural history of ALS:

symptoms, strength, pulmonary function, and

disability. Neurology 1996; 47:S71–81.

20. Okamoto K, Kihira T, Kondo T, Kobashi G,

Washio M, Sasaki S, et al. Nutritional status and

risk of amyotrophic lateral sclerosis in Japan.

Amyotroph Lateral Scler 2007; 8:300–4.

21. Abel EL. Football increases the risk for Lou

Gehrig' sdisease, amyotrophic lateral sclerosis.

Percept Mot Skills 2007; 104:1251–4.

22. Chiò A, Benzi G, Dossena M, Mutani R, Mora

G. Severely increased risk of amyotrophic lateral

sclerosis among Italian professional football

players. Brain 2005; 128:472–6.

23. Scarmeas N, Shih T, Stern Y, Ottman R,

Rowland LP. Premorbid weight, body mass, and

university athletics in ALS. Neurology 2002;

59:773–5.

24. Longstreth WT, McGuire V, Koepsell TD,

Wang Y, van Belle G. Risk of amyotrophic lateral

sclerosis and history of physical activity: a

population based case-control study. Arch Neurol

1998; 55:201–6.

25. Veldink JH, Kalmijn S, Groeneveld GJ,

Titulaer MJ, Wokke JH, van den Berg LH.

Physical activity and the association with sporadic

ALS. Neurology 2005; 64:241–5.

26. Brooks BR, Miller RG, Swash M, Munsat TL.

El Escorial revisited: revised criteria for the

diagnosis of ALS. Amyotroph Lateral Scler Other

Motor Neuron Disord 2000; 1(5):293-299.

27. Konstantinović D, Žigić D. Multicentrična

studija prevalence faktora rizika i hroničnih

oboljenja (MCS studija). Opšta medicina 1996; 2

(2-3):83–127.

28. Kim SM, Kim H, Kim JE. Amyotrophic

Lateral Sclerosis Is Associated with

Hypolipidemia at the Presymptomatic Stage in

Mice. PLoS One 2011; 6(3):e17985

29. Berry JD, Miller R, Moore DH, Cudkowicz

ME, et al. The Combined Assessment of Function

and Survival (CAFS): A new endpoint for ALS

clinical trials. Amyotroph Lateral Scler

Frontotemporal Degener 2013 Jan 17. [Epub ahead

of print]

30. Berry JD, Cudkowicz ME. New considerations

in the design of clinical trials for amyotrophic

lateral sclerosis. Clin Investig 2011; 1:1375–89.

31. Gordon PH, Corcia P, Lacomblez L,

Pochigaeva K, Abitbol JL, Cudkowicz M, et al.

Defining survival as an outcome measure in

amyotrophic lateral sclerosis. Arch Neurol 2009;

66:758–61.

32. Shimizu T, Nagaoka U, Nakayama Y, et al.

Reduction rate of body mass index predicts

prognosis for survival in amyotrophic lateral

sclerosis: a multicenter study in Japan. Amyotroph

Lateral Scler 2012 Jun; 13(4):363–6.

33. Paganoni S, Deng J, Jaffa M, Cudkowicz ME,

Wills AM. Body mass index, not dyslipidemia, is

an independent predictor of survival in

amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve 2011

Jul; 44(1):20–4.

34. Jawad A, Murthy SB, Wilson AM, et al. A

decrease in bodz mass index is associated with

faster progression of motor symptoms and shorter

survival in ALS. Amyotrph Lateral Scler 2010;

11:542–548.

50 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

EFEKTI METIONIN-HOLIN DEFICIJENTNE DIJETE NA AKTIVNOST

ACETILHOLINESTERAZE U MOZGU I JETRI C57BL6 MIŠEVA

Autori: Ivana Cerović1, Nenad Kokošar

1, Stefan Krstić

1

Mentor: Prof. dr Tatjana Radosavljević2

1 Medicinki fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Institut za patološku fiziologiju ”Ljubodrag Buba Mihailović”, Medicinski fakultet, Univerzitet u

Beogradu

Sažetak Uvod: Holin je esencijalni nutrijent koji je

prekursor za sintezu acetilholina, čiju katalizu

hidrolizuje acetilholinesteraza (AChE). Metionin

je esencijalna aminokiselina i prekursor za

endogenu sintezu holina. S obzirom na mogućnost

postojanja njihovog udruženog deficita, cilj rada

bio je da se ispita dinamika promena aktivnosti

AChE u jetri i različitim regionima mozga kod

miševa koji su hranjeni dijetom deficijentnom u

metionu i holinu

Cilj: Ispitati dinamiku promena aktivnosti

AChE u jetri i različitim regionima mozga kod

miševa koji su hranjeni dijetom deficijentnom u

metionu i holinu, s obzirom na mogućnost

postojanja njihovog udruženog deficita.

Materijal i metode: Životinje (n=28) su

podeljene u grupe i hranjene metionin-holin

deficijentnom (MCD) dijetom 2, 4, odnosno 6

(MCD2, MCD4, MCD6) nedelja. Aktivnost AChE

određivana je spektrofotometrijski. Za statističku

analizu korišćena je analiza varijanse (ANOVA) za

ponovljena merenja.

Rezultati: U jetri je zabeležen visoko

statistički značajan porast aktivnosti AChE u

MCD2, MCD4 i MCD6 u odnosu na kontrolu

(p<0,01). Aktivnost AChE u hipotalamusu

pokazuje statistički značajan porast u MCD4

(p<0,05) i MCD 6 (p<0,01) u odnosu na kontrolnu

grupu, kao i visoko statistički značajan porast u

MCD6 u odnosu na MCD4 (p<0,01). U

hipokampusu je pokazan visoko statistički

značajan porast aktivnosti AChE u MCD6 u

odnosu na kontrolu (p<0,01). U korteksu i

strijatumu aktivnost ovog enzima statistički je

značajno veća (p<0,05) u MCD6 u poređenju sa

kontrolnim vrednostima.

Zaključak: Naši rezultati pokazuju da usled

nutritivnog deficita holina i metionina aktivnost

AChE u jetri, hipotalamusu, hipokampusu,

korteksu i strijatumu ostaje ista ili raste, u

zavisnosti od dužine primene MCD dijete. Naredna

istraživanja trebalo bi da se fokusiraju na

utvrđivanje preciznih mehanizama nastanka

razlike aktivnosti AChE u zavisnosti od vremena i

lokalizacije, kao i funkcionalnih promena koje

nastaju kao posledica.

Ključne reči: metionin-holin deficijentna (MCD)

dijeta, acetilholinesteraza (AChE), jetra, mozak.

Abstract

Introduction: Choline is an essential

nutrient and the precursor for acetylcholine

synthesis, whose hydrolysis is catalysed by

acetylcholinesterase (AChE). Methionine is an

essential amino acid and the precursor for choline

endogenous synthesis. Considering the possibility

of their common deficiency, the aim of this study

was to examine the dynamics of AChE activity

alterations in the liver and different brain regions

in mice fed on a methionine-choline deficient

(MCD) diet.

The aim: To examine the dynamics of

AChE activity alterations in liver and different

brain regions in mice fed with methionine-choline

deficient (MCD) diet, considering the possibility of

their common deficiency.

Material and methods: Animals (n=28)

were divided in groups and fed on MCD diet for 2,

4 and 6 (MCD2, MCD4, MCD6) weeks. AChE

activity was determined spectrophotometrically.

Repeated measures analysis of variance

(rANOVA) was used for statistical analysis.

Results: Highly statistically significant

increase of AChE activity was detected in the liver

in MCD2, MCD4 and MCD6 in comparison with

the control group (p<0.01). AChE activity in

hypothalamus recorded a statistically significant

increase in MCD4 (p<0.05) and MCD6 (p<0.01)

compared to the control group, as well as a highly

statistically significant increase in MCD6

compared to MCD4 (p<0.01). A highly

statistically significant increase of AChE activity

was shown in hippocampus in MCD6 in

51Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

comparison with the control group (p<0.01). In

the cortex and striatum, AChE activity was

statistically significantly higher (p<0.05) in MCD6

compared to the control values.

Conclusion: Our results have shown that

due to methionine and choline nutritional

deficiency, AChE activity in the liver,

hypothalamus, hippocampus, cortex and striatum

remains the same or increases, depending on the

duration of the treatment. Further studies should

focus on the precise mechanisms of these time-

depending region-specific differences, as well as

on the functional consequences of the enzymatic

changes.

Keywords: methionine-choline deficient (MCD)

diet, acetylcholinesterase (AChE), the liver, the

brain.

Uvod

Holin je esencijalni nutrijent [1], koji ima

značajnu ulogu u procesima holinergičke

transmisije (sinteza acetilholina), sinteze

fosfolipida ćelijske membrane i transmembranske

signalizacije, lipidnog transporta (sinteza

lipoproteina) i reakcijama metilacije [2]. Dnevne

potrebe holina jasno su definisane u zavisnosti od

uzrasta, a namirnice posebno bogate holinom su

mleko, jetra, jaja i kikiriki [1]. Deficit holina javlja

se u kliničkoj praksi kao posledica različitih

patoloških (alkoholizam, malnutricija) ili

fizioloških stanja (trudnoća, laktacija) [3].

Metionin je esencijalna aminokiselina, koja

u obliku S-adenozilmetionina (SAM) predstavlja

glavni izvor metil-grupa u organizmu, a reakcije

metilacije učestvuju u biosintezi lipida, regulaciji

metaboličkih puteva i u procesima detoksikacije

[4]. Između ostalog, omogućavaju endogeni put de

novo biosinteze holina iz metionina višestrukom

metilacijom fosfatidiletanolamina koji, međutim,

nije adekvatan da zadovolji nutritivne potrebe

organizma za holinom [4]. Metionin u organizmu

nastaje na dva načina, procesom remetilacije

homocisteina ili degradacijom endogenih proteina

ili proteina hrane [5]. Konverziju homocisteina u

metionin, koja se odvija u svim ćelijama sisara,

katalizuje enzim metionin sintaza, u prisustvu

folne kiseline kao metil-donora i vitamina B12 kao

kofaktora [5]. Alternativni put je reakcija

homocisteina i betaina, proizvoda oksidacije

holina, koja se odvija samo u jetri, bubregu i

očnom sočivu [6]. Stoga, sinteza metionina je

reakcija na nivou koje se sustiču metabolizmi

holina, metionina i folne kiseline [1]. Deficit folne

kiseline i vitamina B12 dovodi do sniženja

koncentracije metionina u organizmu [5]. Dnevne

potrebe ovih vitamina definisane su u zavisnosti od

uzrasta, a osnovni izvori među namirnicama su

žitarice, zeleno povrće i jetra za folate, a hrana

životinjskog porekla za vitamin B12 [1].

Mnogobrojna stanja dovode do deficita ili

povećane potrebe za folatima (alkoholizam,

primena određenih lekova, trudnoća, laktacija) i

vitaminom B12 (atrofični gastritis, bakterijske

infekcije creva, primena nekih lekova i dr) [1].

Holin je prekursor acetilholina (ACh),

neurotransmitera koji se nalazi kako u perifernom,

tako i u centralnom nervnom sistemu (CNS) [7]. U

CNS, ACh je nespecifično prisutan u svim

regionima u tzv. „globalnim“ neuronima, gde ima

prvenstveno inhibitorno dejstvo stimulisanjem

GABAergičkog sistema [8]. Njegov uticaj dokazan

je u procesima pamćenja, učenja i ponašanja [9].

Sa druge strane, potvrđeno je prisustvo ACh,

receptora i enzima koji učestvuju u njegovom

metabolizmu u mnogim drugim tkivima (ćelijama

imunog sistema, hematopoeznom tkivu i drugim)

[10].

Acetilholinesteraza (AChE; EC 3.1.1.7) je

specifična holin esteraza koja katalizuje hidrolizu

estara holina; prisutna je u mozgu, neuromišićnoj

spojnici, eritrocitima, limfocitima, kao i u jetri,

serumu i drugim tkivima, obavljajući svoju

osnovnu ulogu inaktivacije Ach [11]. Novije

studije ukazuju na postojanje nehidrolitičke

aktivnosti AChE, koja se ogleda u trofičkom ili

toksičnom dejstvu na neurone, u zavisnosti od

stepena i trajanja njene aktivnosti, kao i od starosti

samih neurona [12]. Pored toga, AChE ima izražen

efekat na stimulaciju ćelijske adhezije i

postsinaptičku diferencijaciju [12].

Aktivnost AChE značajno se menja u

zavisnosti od različitih nutritivnih i metaboličkih

promena u organizmu [3]. S obzirom na činjenicu

da u različitim stanjima (malnutricija,

vegetarijanizam, sindrom malapsorpcije, Kronova

bolest, primena određenih lekova, trudnoća,

laktacija) može doći do istovremenog deficita

metionina i holina, cilj ovog rada bio je da se ispita

dinamika promena aktivnosti AChE u jetri i

različitim regionima mozga (hipotalamusu,

hipokampusu, kori velikog mozga i strijatumu)

kod miševa koji su hranjeni dijetom deficijentnom

u metioninu i holinu.

52 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Materijal i metode

Životinje

Istraživanje je sprovedeno na uzorku

odraslih mužjaka C57BL6 miševa (Vivarijum

Vojnomedicinske akademije, Beograd, Srbija),

starosti 6-8 nedelja, prosečne težine 23 ± 3g.

Životinje su čuvane u kontrolisanim

laboratorijskim uslovima (ambijentalna

temperatura 22 ± 2ºC, relativna vlažnost vazduha

50±10%, 12:12č ciklus svetlost:tama sa početkom

svetlog perioda u 9:00č), uz dostupnost

standardne dijete za miševe i vode ad libitum

nedelju dana pre eksperimenta (period

aklimatizacije). Sve procedure na životinjama

izvedene su u skladu sa Direktivom Evropskog

parlamenta i Saveta (2010/63EU) i odobrene od

strane Etičkog komiteta Univerziteta u Beogradu

(No. 1094/2).

Dizajn studije i dijetetski režim

Životinje (n=28) su nasumično raspoređene

u četiri grupe: jednu kontrolnu (n=7) i tri grupe

hranjene metionin-holin deficijentnom (MCD)

dijetom 2, 4, odnosno 6 nedelja (MCD2, MCD4,

MCD6, n=7 po grupi). Kontrolna grupa hranjena je

svih 6 nedelja eksperimenta standardnom hranom

za miševe, koja sadrži 2g/kg holin-hlorida i 3g/kg

metionina. MCD dijeta (MP Biomedicals,

California, USA) bila je istog sastava kao

kontrolna, sa nedostatkom metionina i holina i

dodatkom saharoze (22,76%). Svim grupama voda

i hrana su bile dostupne ad libitum tokom celog

eksperimenta.

Priprema uzoraka tkiva

24 časa nakon poslednjeg konzumiranja hrane, životinje su žrtvovane u anesteziji ketaminom (100 mg/kg i.p.). Uzorci jetre i četiri regiona mozga – hipotalamusa, hipokampusa, kore velikog mozga i striatuma uzeti za ispitivanje aktivnosti acetilholinesteraze, homogenizovani su na ledu, u hladnom puferizovanom 0.25M

saharoznom medijumu (Serva, Feinbiochemica,

Heidelberg, New York), kome su dodati 10M

fosfatnog pufera (pH=7,0) i 1mM

etilendiaminotetrasirćetne kiseline (EDTA; Sigma

Chem.Co.St.Louis, USA). Homogenati su

centrifugirani na 2000xg, 15 minuta na 4ºC.

Preostali talog rastvoren je u saharoznom

medijumu i ponovo centrifugiran. Supernatant je

prebačen u epruvetu i centrifugiran na 3200xg, 30

minuta na 4ºC. Preostali sediment rastvoren je u

dejonizovanoj vodi. Nakon 1 časa inkubacije,

uzorci su centrifugirani na 3000xg, 15 minuta na

4ºC, a dobijeni supernatanti su zamrznuti na -70ºC.

Određivanje aktivnosti

acetilholinesteraze

Određivanje aktivnosti acetilholinesteraze

zasniva se na reakciji u kojoj od acetil-tioholin

jodida, pod dejstvom acetilholinesteraze, nastaje

proizvod koji vezuje 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoičnu

kiselinu (DTNB), dajući žutu boju [13]. Kinetika

enzimske reakcije praćena je spektrofotometrijski

tokom 3-5 minuta na 412 nm. Aktivnost

acetilholinesteraze izračunata je na osnovu

linearnog dela krive reakcije i izražena u mol

acetiltioholina/min/g proteina.

Statistička analiza

Vrednosti varijabli izražene su

aritmetickom sredinom ± standardna devijacija

(SD). Nakon potvrde normalne raspodele vrednosti

datog parametra u osnovnom skupu, za testiranje

hipoteza o postojanju uticaja vremena i lokalizacije

na promenu aktivnosti acetilholinesteraze

korišćena je analiza varijanse (ANOVA) za

ponovljena merenja, uz post hoc testiranje t-

testom. Vrednost p<0,05 smatrana je značajnom,

p<0,01 visoko značajnom (rezultat Pillai’s Trace i

Wilks’Lambda statistike).

Rezultati

U tabeli 1 prikazane su srednje vrednosti

nivoa aktivnosti acetilholinesteraze u jetri i četiri

regiona mozga: hipotalamusu, hipokampusu, kori

velikog mozga i strijatumu nakon dve, četiri i šest

nedelja primene MCD dijete.

Tabela 1. Uticaj metionin-holin deficijentne dijete

(MCD) na aktivnost acetilholinesteraze (AChE)

nakon dve (MCD2), četiri (MCD4) i šest (MCD6)

nedelja u jetri i mozgu (hipotalamus, hipokampus,

korteks i strijatum).Vrednosti su izražene kao

srednja vrednost ± standardna devijacija

(SD)[mol acetiltioholina/min/g proteina].

53Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

kontrolna grupa

(n=7)

MCD2

(n=7)

MCD4

(n=7)

MCD6

(n=7)

Jetra 43,9±21,0 200,7±82,6** 209,2±70,6** 334,7±112,8**,##,┼┼

Hipotalamus 217,2±47,5 245,6±50,4 287,0±45,4* 597,3±166,3**,┼┼

Hipokampus 222,4±60,9 237,5±42,3 278,9±153,0 651,7±146,4**

Korteks 217,0±81,4 318,8±73,9 190,9±50,3 363,2±82,9*

Strijatum 322,9±101,0 358,1±39,0 239,7±146,4 446,8±79,1* Značajnost razlike izračunata korišćenjem analize varijanse (ANOVA) za ponovljena merenja, uz post hoc testiranje t-testom

(*p<0,05, **p<0,01 u odnosu na kontrolnu grupu; ##

p<0,01 u odnosu na MCD2; ┼┼

p<0,01 u odnosu na MCD4).

U jetri je zabeležen visoko statistički

značajan porast aktivnosti AChE u MCD2, MCD4

i MCD6 u odnosu na kontrolne vrednosti (p<0,01)

(grafikon 1). Najizraženiji porast aktivnosti ovog

enzima u jetri uočen je kod životinja nakon 6

nedelja primene MCD dijete.

Značajnost razlike izračunata korišćenjem analize varijanse (ANOVA) za ponovljena merenja, uz post hoc testiranje t-testom

(**p<0,01 u odnosu na kontrolnu grupu; ##

p<0,01 u odnosu na MCD2; ┼┼

p<0,01 u odnosu na MCD4).

Grafikon 1. Uticaj metionin-holin deficijentne dijete (MCD) na aktivnost acetilholinesteraze (AChE) u

jetri nakon dve (MCD2), četiri (MCD4) i šest (MCD6) nedelja.

Aktivnost AChE u hipotalamusu beleži

statistički značajan porast u MCD4 (p<0,05) i

MCD6 (p<0,01) u odnosu na kontrolnu grupu

(grafikon 2). Takođe, uočen je porast aktivnosti

ovog enzima u MCD6 u odnosu na MCD4

(p<0,01). U hipokampusu je pokazan visoko

statistički značajan porast aktivnosti AChE u

MCD6 u odnosu na kontrolne vrednosti (p<0,01)

(grafikon 2).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

kontrola MCD2 MCD4 MCD6

Akti

vn

ost

AC

hE

[

mo

l

acet

ilti

oh

oli

na/

min

/g p

rote

ina]

*

*

**##┼

┼

**

│ │ │ │

54 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Značajnost razlike izračunata korišćenjem analize varijanse (ANOVA) za ponovljena merenja, uz post hoc testiranje t-testom

(*p<0,05, **p<0,01 u odnosu na kontrolnu grupu; ┼┼

p<0,01 u odnosu na MCD4).

Grafikon 2. Uticaj metionin-holin deficijentne dijete (MCD) na aktivnost acetilholinesteraze (AChE) u

hipotalamusu i hipokampusu nakon dve (MCD2), četiri (MCD4) i šest (MCD6) nedelja.

Iako aktivnost AChE u korteksu i

strijatumu pokazuje tendenciju rasta u MCD2 i

tendenciju pada u MCD4, nije uočena značajna

razlika između ovih grupa i kontrole. Nasuprot

tome, aktivnost ovog enzima je statistički značajno

veća (p<0,05) u MCD6 u poređenju sa kontrolnim

vrednostima (grafikon 3).

Značajnost razlike izračunata korišćenjem analize varijanse (ANOVA) za ponovljena merenja, uz post hoc testiranje t-testom

(*p<0,05 u odnosu na kontrolnu grupu).

Grafikon 3. Uticaj metionin-holin deficijentne dijete (MCD) na aktivnost acetilholinesteraze (AchE) u

korteksu i strijatumu nakon dve (MCD2), četiri (MCD4) i šest (MCD6) nedelja.

0

200

400

600

800

kontrola MCD2 MCD4 MCD6

Akti

vn

ost

AC

hE

[

mo

l ac

etil

tio

ho

lin

a/m

in/g

pro

tein

a]

hipotalamus

hipokampus

0

200

400

600

800

kontrola MCD2 MCD4 MCD6

Akti

vn

ost

AC

hE

[

mol

acet

ilti

oh

oli

na/

min

/g p

rote

ina]

korteks

strijatum

│ │

*

│

│

**

**┼┼

│ │ │ │

*

*

│

55Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Diskusija

U ovoj studiji ispitivana je dinamika

promena aktivnosti AChE u jetri i različitim

regionima mozga koje nastaju kao posledica

nedostatka metionina i holina u ishrani, s obzirom

na mogućnost postojanja udruženog deficita ovih

nutrijenata u stanjima kao što su malnutricija,

vegetarijanizam, sindrom malapsorpcije, Kronova

bolest, primena određenih lekova, trudnoća,

laktacija [1].

Naši rezultati pokazuju da je aktivnost

AChE u jetri povećana već u drugoj nedelji i

nastavlja da raste, sa značajnim porastom nakon

četvrte i dostizanjem maksimalne aktivnosti u

šestoj nedelji. MCD dijeta predstavlja animalni

model nealkoholnog steatohepatitisa (NASH) koji

se razvija već nakon dve nedelje primene [14].

Povećana aktivnost AChE u našoj studiji zajedno

sa patohistološkom potvrdom NASH (neobjavljeni

rezultati), u skladu je sa pretpostavkom da je

AChE pokazatelj inflamacije u jetri [11]. Naime,

pokazano je da ACh ima antiinflamatorno dejstvo

na tkivne makrofage time što smanjuje aktivaciju

nuklearnog faktora kapa B (NF-κB) i produkciju

proinflamatornih citokina [11], dok povećana

aktivnost AChE, kao inhibitora ACh, smanjuje

njegov antiinflamatorni efekat. Takođe, deprivacija

metionina stimuliše sintezu i oslobađanje faktora

tumorske nekroze α (TNFα) i drugih citokina [15].

S obzirom na to da fiziološka uloga AChE u jetri

još uvek nije u potpunosti razjašnjena, različite

studije ukazuju na njene potencijalne funkcije:

inaktivacija cirkulišućeg ACh [16], učestvovanje u

intercelularnim i intracelularnim regulatornim

mehanizmima [16]; svojom nehidrolitičkom

aktivnošću, AChE utiče na ćelijski rast i adheziju

[16] ili stimuliše različite tipove apoptoze [17].

Rezultati naše studije pokazuju da

nutritivna restrikcija metionina i holina dovodi do

porasta aktivnosti AChE u svim ispitivanim

regionima mozga (hipotalamus, hipokampus,

cerebralni korteks i strijatum), s tim što postoji

razlika u vremenskim intervalima do nastanka

promena, kao i u stepenu aktivnosti ovog enzima.

Tako, u hipotalamusu dolazi do porasta aktivnosti

već u četvrtoj nedelji, dok u ostalim strukturama

aktivnost raste tek u šestoj nedelji. Uzimajući u

obzir dokazanu činjenicu da usled primene holina

raste nivo ACh u mozgu (zahvaljujući indukciji

biosinteze ACh povišenom koncentracijom

prekursora ili zbog centralnog muskarinskog

odgovora) [18], deprivacija holina bi očekivano

trebalo da dovede do smanjenja aktivnosti AChE.

Međutim, slično našim rezultatima, i druge studije

ukazuju na porast aktivnosti ovog enzima, posebno

u stanjima prolongirane primene holin deficijentne

dijete [19,20]. Moguće objašnjenje porasta

aktivnosti AChE zasniva se na uticaju metionina.

Deprivacija metionina može smanjiti sintezu

glutationa [21], čime se smanjuje efikasnost

antioksidativne zaštite, dok povišen nivo

reaktivnih kiseoničnih i nitrozativnih radikala

dovodi do porasta aktivnosti AChE [22]. Sa druge

strane, mogući uzrok porasta aktivnosti AChE

tokom MCD dijete je postojanje različitih

molekulskih formi AChE, koje se međusobno

razlikuju na subcelularnom nivou, po

rastvorljivosti i vezanosti za ćelijsku membranu,

kao i u njihovoj distribuciji u tkivima [23].

Takođe, u izolovanim kulturama različitih linija

nervnih ćelija pokazana je heterogenost u stepenu

aktivnosti AChE [24]. U prilog tome govori studija

koja pokazuje različit stepen porasta aktivnosti

AChE u cerebelumu, hipokampusu, frontalnom

korteksu, hipotalamusu i ponsu [24]. Pored toga,

promena aktivnosti AChE specifična za region

mozga u nekom metaboličkom stanju organizma

može biti posledica interakcije sa drugim

neurotransmiterima koji utiču na aktivnost ovog

holinergičkog enzima samo u određenom regionu

mozga, sa ciljem da se dostigne homeostaza i održi

osnovna funkcija najvažnijih neuronskih mreža

[25].

Brojne studije pokazuju da nutritivna

restrikcija holina menja stanje holinergičkog

sistema mozga, prvenstveno u hipokampusu i time

dovodi do promena ponašanja, učenja i pamćenja

[26-27]. Povećanje aktivnosti AchE u mozgu može

se dovesti u vezu sa Alchajmerovom bolešću, s

obzirom na to da je ova bolest praćena sniženjem

koncentracije više transmitera, uključujući i ACh

[28]. Patognomonični znaci Alchajmerove bolesti

su plakovi amiloid β peptida (Aβ) i spletovi

nervnih vlakana povezanih tau proteinom [29].

Prisustvo AChE i butirilholinesteraze (BChE)

dokazano je u Aβ plakovima, što sugeriše da ovi

enzimi mogu stimulisati agregaciju Aβ i stimulisati

neurotoksičnost vlakana izazvanu amiloidom [29].

Poseban značaj ima hipokampalna holinergička

disfunkcija, s obzirom na kliničku sliku

Alchajmerove bolesti kojom dominiraju

poremećaji pamćenja i učenja, kao i dokazan

izraziti gubitak holinergičkih neurona

hipokampusa u ovoj bolesti [30].

56 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Na osnovu rezultata dobijenih u našoj

studiji, može se zaključiti da usled nutritivnog

deficita holina i metionina aktivnost AChE u jetri,

hipotalamusu, hipokampusu, cerebralnom korteksu

i strijatumu ostaje ista ili raste, u zavisnosti od

dužine primene MCD dijete. Naredna istraživanja

trebalo bi da se fokusiraju na utvrđivanje preciznih

mehanizama nastanka razlike aktivnosti AChE u

zavisnosti od vremena i lokalizacije, kao i

funkcionalnih promena koje nastaju kao posledica

tih razlika.

Literatura

1. Food and Nutrition Board, Institute of

Medicine. Dietary Reference Intakes:

Thiamin, Riboflavin, Niacin, Vitamin B-6,

Vitamin B12, Pantothenic Acid, Biotin,

and Choline. Washington DC: National

Academy of Sciences; 1998. p. 390-422.

2. Penry J, Manore M. Choline: an important

micronutrient for maximal endurance-

exercise performance? Int J Sport Nutr

Exerc Metab 2008; 18:191–203.

3. Li Z, Vance D. Phosphatidylcholine and

choline homeostasis. J Lipid Res 2008;

49:1187–1194.

4. Zeisel SH, Da Costa KA, Franklin PD et al.

Choline, an essential nutrient for humans.

FASEB J1991; 5(7):2093-8.

5. Guéant JL, Caillerez-Fofou M, Battaglia-

Hsu S et al. Molecular and cellular effects

of vitamin B12 in brain, myocardium and

liver through its role as co-factor of

methionine synthase. Biochimie 2013– u

štampi

6. Finkelstein JD. Methionine metabolism in

mammals. J Nutr Biochem 1990; 1:228–37.

7. Parson SM, Prior C, Marshall IG.

Acetylcholine transport, storage and

release. Int Rev Neurobiol 1993; 35:279-

390.

8. Woolf NJ. Global and serial neurons form

a hierarchically arranged interface

proposed to underlie memory and

cognition. Neuroscience 1996; 74:625–651.

9. Hironaka N, Tanaka K, Izaki Y, Hori K,

Nomura M. Memory-related acetylcholine

efflux from rat prefrontal and

hippocampus: A microdialysis study. Brain

Res 2001; 901:143–150.

10. Reardon C, Duncan GS, Brüstle A et al.

Lymphocyte-derived ACh regulates local

innate but not adaptive immunity. Proc

Natl Acad Sci USA 2013; 110(4):1410-5.

11. Das UN. Acetylcholinesterase and

butyrylcholinesterase as markers of low-

grade systemic inflammation. Annals of

Hepatology 2012; 11(3):409-411.

12. Greenfield SA, Zimmermann M, Bond CE.

Non-hydrolytic functions of

acetylcholinesterase. The significance of C-

terminal peptides. FEBS J2008;

275(4):604-11.

13. Micic DV, Petronijevic ND.

Acetylcholinesterase activity in the

Mongolian gerbil brain after acute

poisoning with aluminium. J Alzh Dis

2000; 2: 1-6.

14. Marcolin E, Forgiarini LF, Tieppo J, Dias

AS, Freitas LA, Marroni NP. Methionine-

and choline deficient diet induces hepatic

changes characteristic of non-alcoholic

steatohepatitis. Arq Gastroenterol 2011; 48:

72-79.

15. McClain CJ, Hill DB, Song Z, et al. S-

Adenosylmethionine, cytokines, and

alcoholic liver disease. Alcohol 2002;

27:185–92.

16. Soreq H, Seidman S. Acetylcholinesterase -

new roles for an old actor. Nat Rev

Neurosci 2001; 2:294-302.

17. Zhang XJ, Greenberg DS.

Acetylcholinesterase involvement in

apoptosis. Front Mol Neurosci 2012; 5:40.

18. Kilbinger H, Kruel MR. Choline inhibits

acetylcholine release via presynaptic

muscarinic receptors. Naunyn-

Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 1981;

316:131–134.

19. Liapi C, Kyriakaki A, Zarros A. Choline-

deprivation alters crucial brain enzyme

activities in a rat model of diabetic

encephalopathy. Metab Brain Dis 2010;

25(3):269-76.

20. Liapi C, Feskou I, Zarros A, Carageorgiou

H, Galanopoulou P, Tsakiris S.

Equilibrated diet restores the effects of

early age choline-deficient feeding on rat

brain antioxidant status and enzyme

activities: the role of homocysteine, L-

phenylalanine and L-alanine. Metab Brain

Dis 2008; 23:289–301.

21. Bianchi G, Brizi M, Rossi B, Ronchi M,

Grossi G, Marchesini G. Synthesis of

glutathione in response to methionine load

57Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

in control subjects and in patients with

cirrhosis. Metabolism 2000; 11:1434–9.

22. Xia Y, Cheng S, He J. Effects of

subchronic exposure to benzo[a]pyrene

(B[a]P) on learning and memory, and

neurotransmitters in male Sprague-Dawley

rat. Neurotoxicology 2011; 32(2):188-98.

23. Hicks DA, Makova NZ, Nalivaeva NN,

Turner AJ. Characterisation of

acetylcholinesterase release from neuronal

cells. Chem Biol Interact 2012 – u štampi

24. Liapi C, Kyriakaki A, Zarros A et al.

Effects of adult-onset choline deprivation

on the activities of acetylcholinesterase,

(Na+, K+)- and Mg2+-ATPase in crucial

rat brain regions. Food Chem Toxicol

2009; 47:82–85.

25. Carageorgiou H, Pantos C, Zarros A et al.

Changes in acetylcholinesterase, Na+, K+-

ATPase, and Mg2+-ATPase activities in

the frontal cortex and the hippocampus of

hyper- and hypothyroid adult rats.

Metabolism 2007; 56(8):1104-10.

26. Bartus RT, Dean RL, Goas JA, Lippa AS.

Aged-related changes in passive avoidance

retention: Modulation with dietary choline.

Science 1980; 209:301–303.

27. Sasaki H, Matsuzaki Y, Meguro K,

Ikarashi Y, Yamaguchi S, Sekizawa K.

Vitamin B12 improves cognitive

disturbance in rodents fed a choline-

deficient diet. Pharmacol Biochem Behav

1992; 43:635–639.

28. Querfurth HW, La Ferla FM. Alzheimer’s

disease. N Engl J Med 2010; 362:329–344.

29. Inestrosa NC, AlvarezA, PerezCA et al.

Acetylcholinesterase accelerates assembly

of amyloid-beta-peptides into Alzheimer’s

fibrils: possible role of the peripheral site

of the enzyme. Neuron 1996; 16:881–891.

30. Probst A, Cortes R, Ulrich J, Palacios JM.

Differential modification of muscarinic

cholinergic receptors in the hippocampus

of patients with Alzheimer’s disease: An

autoradiographic study. Brain Res1988;

450:190–201.

58 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

POSLEDICE BAKTERIJSKOG MENINGITISA KOD DECE

Autori: Ivana Dajić1, Miloš Babić

1

Mentor: Doc. dr Dimitrije Nikolić2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2Univerzitetska dečja klinika, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak:

Uvod: Akutni bakterjiski meningitis

predstavlja jedno od najčešćih oboljenja u

pedijatrijskoj populaciji, a 70% svih bakterijskih

meningitisa pripada dečjem uzrastu. Iako je stopa

smrtnosti među obolelom decom u poslednjih

nekoliko decenija drastično opala, pojava

neuroloških sekvela i dalje je značajan pratilac

bolesti. Zbog toga bakterijski meningitis predstavlja

jedno od najurgentnijih stanja u pedijatriji i zahteva

brzu dijagnostiku i efikasno lečenje.

Ciljevi rada: Određivanje učestalosti

najčešćih sekvela uzrokovanih bakterijskim

meningitisomkod dece i njihovu zastupljenost po

uzrasnim grupama.

Materijal i metode: Analizirani su podaci

191 pacijenta koji su lečeni pod kliničkom slikom

bakterijskog meningitisa na Univerzitetskoj dečjoj

klinici (UDK) u periodu 1997-2012. Podela

pacijenata rađena je, prema uzrastu, na tri grupe:

A- do godinu dana, B- 1-5 godina, C- preko 5

godina, i postojanju sekvela: grupa I- bez sekvela, II-

postojanje jedne, III- dve ili više sekvela.

Rezultati: Odojčad su pod najvećim rizikom

od pojave sekvela te je kod 17,07% je zabeležena

pojava jedne, a kod 13,41% dve ili više sekvela. U

uzrastu 1-5 godine 9,85% je imalo jednu, a 7,04%

dve ili više sekvela. U uzrasnoj grupi preko 5 godina

2,63% je imao jednu, a 5,26% je imalo dve ili više

sekvela. Analizom podataka pokazano je da je

najčešća sekvela oštećenje sluha (7,81%), zatim

pojava epilepsije (7,29%), oštećenje motorike

(6,77%), potom strukturne lezije i kognitivni

poremećaji (po 5,72%).

Zaključak: Utvrđena je nedvosmislena

povezanost pojave sekvela i uzrasta pacijenata, pri

čemu su sekvele najčešće u uzrastu do pet godina, a

najintenzivnije u periodu odojčeta.

Ključne reči: bakterijski meningitis, uzrast, sekvele.

Abstract:

Introduction: Acute bacterial meningitis is

one of the most common diseases in the pediatric

population, and 70% of all bacterial meningitis

cases belong to childhood. Although the mortality

rate among these infants has decreased dramatically

in recent decades, the occurrence of neurological

sequelae is still an important companion to the

disease.

Aim: Determining the frequency of the most

common sequelae caused by bacterial meningitis in

children and their distribution among age groups.

Material and methods: We analyzed data for

191 patients with clinical sings of bacterial

meningitis which were treated at the University

Children's Hospital between 1997 and 2012. The

classification of patients was made according to age

into three groups: A- patients under 1 year old, B-

patients between the age of 1 and the age of 5, C-

patients aged 5 and older; the presence of sequelae:

I- without sequelae, II- one sequela, III- two or more.

Results: Infants are at the greatest risk of

sequelae and our results show that in 17.07% of

cases the presence of one sequela was noted,

whereas there were two or more in 13.41% of cases.

In the group of 1 to 5 year-olds, 9.85% of patients

had one sequela, whereas 7.04% had two or more.

In the group of children aged 5 or older, 2.63% of

patients had one sequela and 5.26% had two or

more. The analysis of data showed that the most

common sequela is the loss of hearing (7.81%),

followed by (7.29%) seizure disorders and

spasticity/paresis (6.77%).

Conclusion: Unequivocal association was

determined between the patients’ age and the

occurrence of sequelae, with the highest incidence of

sequelae in those under 5 years old, and most intense

in the infant period.

Key words: Bacterial meningitis, age, sequelae.

Uvod

Bakterijski meningitis je teško infektivno

oboljenje, sa stvaranjem gnojnog eksudata u

subarahnoidnom prostoru. Učestalost bakterijskog

meningitisa je 30-70/100.000 stanovnika, 80%

59Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

obolelih su uzrasta ispod 15 godina (1). Bolest je

najčešće sporadična, mada su moguće i epidemije,

što se posebno odnosi na meningokokni meningitis.

U dečjem uzrastu tri najčešća uzročnika su:

H. influenzae tip b, N. meningitidis i S. pneumonia

(1,3). Ove bakterije su izazivači 75-80% bakterijiskih

meningitisa, pre svega zahvaljujući moćnim

faktorima virulencije. Kod novorođenčadi najčešći

uzročnik je Streptococcus grupe B, kod dece uzrasta

do 5 godina H. influenzae tip b, a kod osoba starosti

5-29 godina to je N.meningitidis.

Glavni faktor rizika za nastanak bolesti je

povećanje broja kliconoša u populaciji. Pored toga,

značajni faktori rizika su i nedostatak specifičnih

antitela na mestu ulaska bakterija, kao i neadekvatan

odgovor imunološkog sistema na iste. Ovo je

najizraženije u uzrastu novorođenčeta i malog deteta.

Najčešči put prenosa je kapljični.

Patogeneza bolesti protiče kroz nekoliko

stadijuma: kolinizacija nazofarinksa,prolazak

mukozne barijere, preživljavanje u krvi, njihova

diseminacija, prolazak kroz hematoencefalnu

barijeru i na kraju izazivanje zapaljenja u

subarahnoidalnom prostoru.

Patoanatomski promene su hiperemija i edem

moždanih opni kao i stvaranje eksudata sastavljenog

od polimorfonukleara u subarahnoidalnom prostoru.

Kliničku sliku bakterijskog meningitisa

karakteriše pojava meningealnih simptoma i

znakova. Meningealni simptomi su kombinacija

sistemskih pojava kao što su temperatura,

malaksalost i povraćanje, i simptomi od strane

centralnog nervnog sistema kao što su glavobolja,

fotofobija, poremećaj svesti. Meningealni znaci su:

ukočen vrat, Kernigov znak, gornji i donji

Brudzinski, Vujićev znak. Napeta fontanela kod

odojčeta ima istu dijagnostičku vrednost kao svi

meningealni znaci zajedno. Konvulzije se javljaju u

30-40% dece i to obično u prva tri dana od početka

bolesti. Kod novorođenčadi, meningealni znaci su

najčešće odsutni, što znatno otežava postavljanje

dijgnoze .

Zbog svog brzog progresivnog toka, bolest

zahteva što raniju dijagnozu i što raniji početak

adekvatne antimikrobne terapije kako bi se spasao

život obolelog i sprečio nastanak sekvela koje mogu

značajno skratiti ili otežati život obolelog.

Dijagnoza bakterijskog menngitisa postavlja

se relativno lako, lumbalnom punkcijom i analizom

cerebrospinalne tečnosti. Likvor ima karakterističan,

zamućen izgled koji je posledica prisustva velikog

broja ćelijskih elemenata, a čiji najveći broj čine

polimorfonukleari. Pored ćelijskih elemenata, od

značaja su i povećana proteinorahija kao i snižena

glikorahija. Ovi nalazi se razlikuju u odnosu na

tuberkulozni meningitis i na meningitis izazvan

virusima. Bakteriološkom analizom likvora postavlja

se definitivna etiološka dijagnoza, a određivanje

antibiograma pomaže u odabiru pravilne

antimikrobne terapije.

U toku bakterijskog meningitisa mogu nastati

različite komplikacije, koje mogu otežati i produžiti

bolest ili ostaviti sekvele, zbog toga je važno na

vreme ih prepoznati i lečiti. Neurološke komplikacije

su: konvulzije, oštećenja kranijalnih nerava,

cerebritis i apsces, subduralne efuzije, ventrikulitis.

Posebno je značajno oštećenje VIII kranijalnog

nerva, koje kod 10% obolelih dovodi do trajnog

oštećenja sluha.

Komplikacije na ostalim organskim

sistemima su posledica hematogene diseminacije

bakterija (artritis, pneumonija, perikarditis,

endokarditis). Među najteže komplikacije spada

nastanak šoka sa razvojem diseminovane

intravaskularne koagulacije, obično u toku

meningokokne sepse ili pneumokoknog meningitisa

kod osoba bez slezine (2).

Sekvele se javljaju najčešće u uzrastu do 5

godina, najintezivnije su u periodu odojčeta. Dele se

na minor i major sekvele. U grupu minor sekvela

spadaju: jednostrano oštećenje sluha, poremećaj vida

(diplopije), hipotonija, poremećaj ponašanja, dok su

u major grupi sledeće: glavobolja, epilepsija,

gluvoća, hidrocefalus, mentalna zaostalost, slepilo,

snižene kognitivne sposobnosti,

hemiplegija/kvadriplegija (4).

Incidenca sekvela značajno je smanjena

primenom efektivne antibiotske i antiinflamatorne

terapije, kao i merama intenzivne nege. Zbog toga

lečenje treba započeti pre dobijanja svih analiza,a

posle odrađenje lumbalne punkcije. Obično se

primenjuje kombinacija dva ili tri antibiotika, koja se

po dobijanju antibiograma može korigovati. Rano

započeta, adekvatna antimikrobna terapija smanjuje

rizik za nastanak sekvela, odnosno, povećava šanse

za izlečenje bez posledica (2).

Cilj našeg istraživanja bio je da procenimo

rizik od pojave sekvela i njihovu učestalost kod dece

obolele od bakterijskog meningitisa.Takođe, želeli

smo da ispitamo zastupljenost sekvela po uzrasnim

grupama.

Materijal i metode

Rađena je studija deskriptivnog tipa, u okviru

koje su obrađivani podaci uzimani iz istorija bolesti

60 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

pacijenata hospitalizovanih u UDK u periodu

1.1997-12.2012. sa kliničkom slikom meningitisa.

Ukupno je obrađeno 227 istorija bolesti, a potpuni

podaci sa dijagnozom meningitisa nađeni su kod 191

pacijenata. Pacijenti su upućivani na bolničko lečenje

zbog temperature, malaksalosti, povraćanja,

glavobolje, fotofobije, poremećaja svesti, ukočenog

vrata, napete fontanele. Definitivna dijagnoza

bakterijskog meningitisa postavljana je na osnovu

pozitivnih laboratorijskih nalaza u likvoru:

pleocitoza, hipoglikorahija, hiperproteinorahija, a

etiološka dijagnoza je postavljana na osnovu

izolovanja bakterija iz likvora.

Pacijenti su prilikom obrade podataka

podeljeni u tri uzrasne grupe. Prvu grupu činili su

pacijenti uzrasta do godinu dana (grupa A), drugu

grupu pacijenti uzrasta između 1 i 5 godina (grupa

B), a treću preko 5 godina (grupa C). Druga podela

pacijenata rađena je na osnovu postojanja sekvela,

pri čemu su prvu grupu činili pacijenti bez sekvela

(grupa I), drugu pacijenti sa jednom sekvelom (grupa

II), treću pacijenti sa dve ili više sekvela (grupa III).

Ishod koji je praćen bila je pojava sekvela kao sto su:

oštećenje sluha, vida, motorike, kognitivni

poremećaji, strukturne lezije, pojava epilepsije i

potpuni oporavak bez sekvela, njihova učestalost i

uzrasna distribucija.

Statistička analiza dobijenih rezultata

izvedena je korišćenjem kompjuterskog programa

SPSS. Statistička analiza sastojala se iz primene χ2

testa za procenu značajnosti razlike određenih

podataka među upoređivanim grupama.

Razlika je je smatrana kao statistički

značajna kada je p<0,05.

Rezultati

Od ukupno 191 pacijenta, dečaka je bilo 110

(58%), a devojčica 81 (42%). Najmlađi pacijent

imao je mesec dana, a najstariji 17 godina. Prosečan

uzrast bio je 35 meseci. U prvoj uzrasnoj grupi bilo

je 82 (42,83%) pacijenta, u drugoj 71 (37,17%), a u

trećoj 38 (20%) pacijenata.

Tabela 1: Uzrasne grupe pacijenata

Uzrasne grupe Broj pacijenata %

Do godinu dana

82 42,83

Od 1-5 godina 71 37,17

Preko 5 godina 38 20,00

Ukupno 191 100,00

Pojava konvulzija zabeležena je kod 22,5%

pacijenata obolelih od bakterijskog meningitisa, dok

je kod 77,5% klinički tok protekao bez njih. Najveća

učestalost konvulzija u našem uzorku bila je u grupi

do godinu dana (33,33%), dok je bila manja u grupi

dece od 1-5 godina (15,71%), odnosno, još manja u

grupi dece uzrasta preko 5 godina (12,12%). Ova

razlika pokazala se kao statistički značajna (p<0,05).

Kod 151 (79%) pacijenta oporavak je bio

potpun, bez sekvela, 22 (11,55%) je imalo jednu

sekvelu, 18 (9,45%) dve ili više sekvela. Analizom

podataka o učestalosti sekvela nakon preležanog

bakterijskog meningitisa dobijeni su sledeći rezultati:

od ukupno 40 pacijenata kod kojih je nastala jedna ili

više sekvela, oštećenje sluha, kao najčešća,

zabeležena je kod 15 (7,81%) pacijenata, pojava

epilepsije kod 14 (7,29%), a poremećaj motorike

imalo je 13 (6,77%), strukturne lezije 11 (5,72%),

kognitivne poremećaje 11 (5,72%), oštećenje vida

svega 2 (1,04%) pacijenta, dok su sve ostale sekvele

javile kod 4 (2,08%) pacijenta.

Grafikon 1: Učestalost sekvela baketrijskog meningitisa kod dece

7.81%7.29%

6.77%5.72% 5.72%

2.08%1.04%

Učestalost sekvela

61Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

U uzrasnoj grupi do jedne godine, od 82 pacijenta

kod 57 (69,51%) nije zabeležena pojava sekvela,

14 (17,07%) pacijenata je imalo jednu, a 11

(13,42%) dve ili više sekvela. U drugoj uzrasnoj

grupi ( 1-5 godina), od 71 pacijenta 59 (83,1%) je

izlečeno bez sekvela, 7 (9,85%) sa jednom

sekvelom, a 5 (7,05%) sa dve ili više sekvela. U

uzrasnoj grupi preko 5 godina, od 38 pacijenata

kod 35 (92%) je izlečenje bez sekvela, 1 (2,64%)

sa jednom sekvelom, 2 (5,26%) sa dve ili više

sekvela. Ova razlika pokazala se kao statistički

značajna (p<0,05).

Grafikon 2: Uzrasno-specifična distribucija sekvela bakterijskog meningitisa kod dece

Diskusija

Sekvele bakterijskog meningitisa su česte,

mogu značajno kompromitovati rast i razvoj i

povećati troškove lečenja (4). U našem istraživanju

potpuni oporavak imalo je 79% bolesnika, a

sekvele je imalo oko 21%, što je u skladu sa

rezultatima dobijenim u slično dizajniranim

studijama. Pomeroy i sar. u svojoj studiji navode

da je 14% bolesnika imalo makar jednu sekvelu

(5), dok su Weightman i sar. naveli postajanje

sekvela kod 28% bolesnika (6). Takođe,

distribucijom sekvela po uzrasnim grupama,

ustanovili smo značajnu povezanost. Najčešću

pojavu sekvela imali su najmlađi pacijenti uzrasta

do 1 godine, oko jedna trećina njih, zatim su sledili

pacijnti uzrasta 1-5 godina, a najređu pojavu

sekvela imali su bolesnici uzrasta preko 5 godina.

Time su potvrđena ranija iskustva da je pojava

sekvela povezana sa uzrastom pacijenata, a da su

odojčad pod najvećim rizikom (4).

U našoj studiji ispoljio se uobičajeni

spektar sekvela. Najučestalija sekvela bila je

oštećenje sluha koju je ispoljilo 7,81% svih

bolesnika. To je nešto niži procenat u odnosu na

podatke iz sličnih studija. Pikis i sar. u svojoj

studiji navode da je oštećenje sluha imalo 17%

njihovih pacijenata (7), dok Pomeroy i saradnici

navode oštećenje sluha kod 10% bolesnika (5).

Pojava epilepsije, kao druge sekvele po učestalosti,

zabeležena je kod 7,29% bolesnika. Slične podatke

navode i drugi autori, pa tako Pikis i sar. navode

da se epilepsija javila kod 15% bolesnika u

njihovoj studiji. Takođe, i ostale sekvele koje su

zabeležene među našim bolesnicima, kao što su

poremećaj motorike, strukturne lezije, kognitivni

poremećaji, oštećenje motorike i ošećenje vida, u

skladu su sa dosadašnjim iskustvima (8).

Sekvele utiču na kasniji kvalitet života,

česti su različiti poremećaji ponašanja, pohađanje

škole je otežano, izraženi su poremećaji

emocionalnog i psihičkog funkcionisanja.

Naša studija pokazuje nedvosmislenu

povezanost pojave sekvela i uzrasta pacijenata, pri

čemu su sekvele najčešće u uzrastu do pet godina,

a najintenzivnije u odojačkom periodu.

Nelečen, nepravilno lečen ili kasno

prepoznat meningitis vrlo često rezultuje

izlečenjem ali sa postojanjem trajnih sekvela. Zbog

toga su rana i pravilna dijagnoza od ključnog

značaja u prevenciji i smanjenju broja trajnih

sekvela.

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

90.00%

100.00%

Do godinu dana 1-5 godina Preko 5 godina

Bez sekvela

Postojanje 1 sekvele

Uzrasne grupe

Sekvele

62 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Literatura

1. Dimitrijević N. U: Perišić V, Janković B,

(urednici): Pedijatrija. Udžbenik za studente

medicine. Medicinski fakultet Univerziteta u

Beogradu, CIBID, Beograd 2010. s. 564-567

2. Dulović O. Infekcije nervnog sistema. U:

Božić M, Dokić Lj, Nikolić S, Pavlović M,

Šašić M, urednici. Infektivne bolesti. Udžbenik

za studente medicine. Medicinski fakultet

Univerziteta u Beogradu, CIBID, Beograd

2009. s. 71-92.

3. Agrawal S, Nadel S. Acute bacterial meningitis

in infants and children: epidemiology and

management. Paediatr Drugs 2011; 13(6):385-

400.

4. Edmond K. i sar. Global and regional risk of

disabling sequelae from bacterial meningitis: a

systematic review and meta-analysis. Lancet

Infect Dis 2010;10:317-28

5. Pomeroy SL, Holmes SJ, Dodge PR, Feigin

RD. Seizures and other neurologic sequelae of

bacterial meningitis in children.N Engl J Med

1990; 323: 1651–57.

6. Weightman NCS, Sajith J. Incidence and

outcome of pneumococcal meningitis in

northern England. Eur J Clin Microbiol Infect

Dis 2005;24:542e4.

7. Pikis A, Kavaliotis J, Tsikoulas J,

Andrianopoulos P, Venzon D, Manios S.

Long-term sequelae of pneumococcal

meningitis in children. Clin Pediatr (Phila)

1996; 35: 72–78.

8. Jit M. The risk of sequelae due to

pneumococcal meningitis in high-income

countries: A systematic review and meta-

analysis. Journal of Infection 2010; 61(2):114-

24

63Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

UTICAJ POLIMORFIZMA NEUROTROFIČKOG FAKTORA BDNF NA KLINIČKO

ISPOLJAVANJE PARKINSONOVE BOLESTI

Autori: Maja Đorđević1, Aleksandra Šljivar

1

Mentor: Asist. dr Igor Petrović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2Klinika za neurologiju KCS, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak

Uvod: Parkinsonova bolest (PB) je

neurodegenerativno oboljenje koje se karakteriše

gubitkom dopaminergičkih neurona u pars

compacta substancije nigre (SNpC). Klinička

ekspresija bolesti je heterogena u pogledu

motornih i nemotornih simptoma bolesti, brzine

progresije i učestalosti i težine komplikacija

dopaminergičke terapije. Neurotrofički faktor

BDNF (brain-derived neurotrophic factor) široko

je rasprostranjen u centralnom nervnom sistemu

(CNS), i utiče na diferencijaciju, migraciju,

preživljavanje i mogućnost prilagođavanja

neurona u fiziološkim i patološkim stanjima.

Skorija istraživanja ukazuju na mogućnost uticaja

polimorfizma u genu koji kodira za BDNF na

poziciji 166 na kliničko ispoljavanje Parkinsonove

bolesti, ali i drugih neurodegenerativnih bolesti.

Cilj: Ispitivanje uloge Val66Met polimorfizma u

genu za BDNF na kliničke karakteristike PB i

pojavu komplikacija dopaminergičke terapije.

Materijal i metode: Studija je obuhvatila

177 pacijenata obolelih od PB. Kliničke

karakteristike bolesti definisane su preporučenim

kliničkim testovima i skalama za procenu težine

bolesti. Kontrolnu grupu ispitanika (n=366)

ekspresije polimorfizma BDNF-a činili su studenti

beogradskog univerziteta. BDNF genotip

determinisan je metodom pojedinačnih

nukleotidnih polimorfizama (SNP) (rs6265),

upotrebom komercijalnih (TaqMan) testova.

Rezultati: Kod obe grupe, distribucija

učestalosti genotipova i alela bila je slična.

Polimorfizam BDNF-a i prisutvno metionina na

poziciji 166 nije pokazalo uticaj na težinu

motornih simptoma, depresiju, anksioznost kao i

pojavu komplikacija motornog odgovora obolelih

od PB.

Zaključak: Prema našim rezultatima,

polimorfizam u genu za BDNF ne utiče na motorne

i nemotorne kliničke karakteristike i komplikacije

terapije kod obolelih od PB.

Ključne reči: Parkinsonova bolest (PB),

BDNF, G196A polimorfizam.

Abstract

Introduction: Parkinson’s disease (PD) is a

neurodegenerative disease characterised by the

loss of dopaminergic neurons in the pars compacta

of substantia nigra (SNpC) and the presence of

Lewy bodies. The brain derives neurotrophic

factor (BDNF) which is widely present in the

central nervous system (CNS) and important for

growth, survival and neuronal cells differentiation

in the CNS. Val66Met polymorphism may be

associated with the clinical expression of PD and

cognitive impairment, levodopa - induced

dyskinesia and planning abilities in PD.

The Aim: To investigate the association of

the Val66Met polymorphism in the brain - derived

neurotrophic factor (BDNF) gene with clinical

features in Serbian patients with Parkinson’s

disease (PD).

Material and Methods: The study

comprised 177 consecutive PD patients. A

comprehensive set of clinical scales was applied to

all the patients. The controls (n=366) were

recruited among students. Single nucleotide

polymorphisms (SNP) (rs6265) were analysed

using TaqMan assays.

Results: PD patients and controls had a

similar distribution of genotypes and allele

frequencies. The presence of the Met allele did not

influence clinical characteristics of PD patients.

Conclusion: The Val66Met polymorphism

did not modify clinical features in PD patients.

Keywords: Parkinson’s disease (PB),

BDNF, G196A polymorphism.

Uvod

Parkinsonova bolest (PB) je

neurodegenerativno oboljenje koje se karakteriše

gubitkom dopaminergičkih neurona u pars

64 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

compacta substancije nigre (SNpC), sa

posledičnim deficitom dopamina u strijatumu.

Mehanizam smrti neurona nije poznat, ali je

pretpostavljena uloga genetskih i faktora spoljašnje

sredine. Kardinalni simptomi bolesti su hipo i

bradikinezija, rigor i tremor u miru, ali se

poslednjih godina sve više ističe značaj i

nemotornih simptoma kakvi su depresija,

anksioznost i demencija na ukupnu

onesposobljenost obolelih od PB. Heterogenost

kliničkog ispoljavanja PB ogleda se u uzrastu u

kojem bolest počinje, stepenu motorne i nemotorne

onespobljenosti i brzini progresije bolesti.

Dosadašnja ispitivanja nisu definisala uzroke koji

utiču na pleomorfnost kliničkog ispoljavanja i

heterogenost progresije bolesti [1].

Neurotrofički faktor BDNF (brain-derived

neurotrophic factor) pripada grupi neurotrofičkih

faktora koji je široko rasprostranjen u centralnom

nervnom sistemu (CNS), i utiče na rast,

sposobnost adaptacije, preživljavanje i

diferencijaciju neurona u CNS-u [2]. Na

eksperimentalnim modelima pokazano je da

BDNF sprečava spontano odumiranje

dopaminergičkih neurona mezencefalona kod

pacova [2], kao i da ispoljava protektivni uticaj na

toksični efekat neurotoksina MPTP (1-methyl-4-

phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) u jednom od

klasičnih animalnih modela parkinsonizma kod

primata [3].

U genu koji kodira za BDNF identifikovan

je polimorfizam pojedinačnog nukleotida koji

dovodi do zamene guanina (G) za adenin (A) na

poziciji 166, sa posledičnom supstitucijom

aminokiseline valin (Val) na ovoj poziciji

metioninom (Met). Dosadašnja istraživanja

pokazala su na uglavnom ujednačenu zastupljenost

različitih polimorfizama na poziciji 166 u genu za

BDNF u svetskoj populaciji. Procenjuje se da 60

do 75% svetske populacije nosi kombinaciju

Val/Val, 25-30% kombinaciju Val/Met, dok 5-

10% ima retku homozigotnu kombinaciju Met/Met

[4]. Zamena valina sa metioninom (c.196G>A)

rezultira manjom bioraspoloživošću kao i

abnormalnoj intracelularnoj distribuciji proteina

[5,6], dok je kod obolelih od PB pokazana

smanjena ekspresija BDNF mRNK u substanciji

nigri i posledično nizak nivo BDNF u nigralnim

dopaminergičkim neuronima u poređenju sa

kontrolnom grupom [7,8].

Dosadašnja istraživanja pokazala su

inkonzistentne rezultate u pogledu uticaja

Val66Met polimorfizma sa kliničkom ekspresijom

PB [9], levodopa-izazvanim diskinezijama [10] i

kognitivnim sposobnostima obolelih [11,12,13].

Cilj našeg istraživanja je ispitivanje uloge

Val66Met polimorfizma na kliničku ekspresiju PB,

posebno utvrđivanje povezanosti sa motornim i

nemotornim karakteristikama bolesti, kao i sa

komplikacijama bolesti izazvanih lečenjem

levodopom.

Materijal i metode

Studija obuhvata 177 sukcesivnih

pacijenata obolelih od PB ambulantno i hospitalno

lečenih na Odeljenju za bolesti nevoljnih pokreta,

Klinike za neurologiju, Kliničkog centra Srbije

(Beograd). Dijagnoza PB postavljena je na osnovu

kriterijuma Britanskog udruženja za Parkinsonovu

bolest [14]. Mentalni status bolesnika procenjivan

je primenom testa procene mentalnog stanja

(MMSE) [15], a motorni simptomi bolesti

skorovani su pomoću Unifikovane skale za

ocenjivanje Parkinsonove bolesti (UPDRS) [16].

Težina depresije i anskioznosti ustanovljena je

primenom Hamiltonove skala za procenu depresije

(HDRS) [17] i Hamiltonova skala za procenu

anksioznosti (HARS) [18]. Nemotorni simptomi

skorovani su pomoću skale nemotorih simptoma

za PB [19], a uticaj bolesti na svakodnevne

aktivnosti procenjivan je pomoću Schwab-England

ADL skale [20]. Kontrolnu grupu ispitanika

(n=366) činili su studenti beogradskog univerziteta

koji nisu bolovali od neuroloških oboljenja, što je

utvrđeno anamnezom i kliničkim pregledom. Iako

su kontrolnu grupu činili ispitanici mlađe životne

dobi od grupe sa PB, prema sugestijama Owen i

saradnika [21] nije bilo potrebno ispitati kontrolnu

grupu na retke poremećaje sa doživotnim rizikom

1% , s obzirom na to da je njihov uticaj na

statističke rezultate beznačajan.

Genomska DNK izdvojena je iz venske

krvi u epruvetu koja sadrži EDTA, dok je DNK

izdvojena na osnovu standardnih protokola u

Genetskoj laboratoriji Klinike za neurologiju. U

cilju determinisanja BDNF genotipa, analizirani su

pojedinačni nukleotidni polimorfizmi (SNP)

(rs6265), pomoću komercijalnih TaqMan testova

(Applied Biosystems [ABI], Foster City, CA).

Distribucija genotipova kontrolne i ispitivane

grupe testirana je Hardy- Weinberg

ekvilibrijumom pomoću hi kvadrat testa [22].

Koristeći hi kvadrat test (ili po potrebi Fisherov

test egzaktne verovatnoće), odvojeno je analizirana

65Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

povezanost rizika za nastanak PB i genotipa

(Val/Val, Val/ Met, Met/Met). Razlike u početku

bolesti između grupa pacijenata sa različitim

genotipovima i alelima procenjene su pomoću

jednosmerne ANOVA metode. Izračunate su

korigovane kvote razmera (KR) sa intervalom

pouzdanosti od 95% (95%IP). U svim analizama

određena je statistička značajnost od 0.05.

Rezultati

Studija je obuhvatila 177 bolesnika sa PB

(118 muškarci), prosečne starosti 58,9 ±10.9

godina (raspon: 28-82 godine), prosečna starost na

početku bolesti iznosila je 49.0±11.2 godina

(raspon: 20-72 godine), a trajanja bolesti u

momentu ispitivanja iznosilo 9.7±6.2 godina

(raspon: 0.6-37 godina). U grupi obolelih, 121 od

177 ispitanika bilo je mlađe od 45 godina na

početku bolesti, od kojih je 33 (18.6%) imalo

pozitivnu porodičnu anamnezu za PB.

Raspored učestalosti alela kod obolelih od

PB i kontrolne grupe je u skladu sa Hardy–

Weinberg ekvilibrijumom (p>0.05). Kod obe

grupe, distribucija učestalosti genotipova i alela je

bila slična (Tabela 1).

Tabela 1. Učestalost GG, AA i AG varijanti

BDNF gena kod pacijenata sa Parkinsonovom

bolesti (PB) i zdrave kontrolne grupe

A/A G/A G/G

Hardy–

Weinberg

ekvilibrijum

Pacijenti

sa PB 4 52 121

X2=0.34,

p>0.05

Zdrava

kontrolna

grupa

8 106 252 X2=0.66,

p>0.05

Zbog male veličine uzorka sa A/A

genotipom, slučajevi sa G/A i A/A spojeni su u

cilju određivanja veze između kliničkih

ispoljavanja i G196A polimorfizma. Nije bilo

značajne razlike u prisustvu Met alela (G) kod

pacijenata sa PB i zdravih iz kontrolne grupe

(OR=0.98, 95%CI 0.65-1.47, p=0.907).

Prisustvo Met alela nije uticalo na kliničke

karakteristike pacijenata sa PB (godine na početku

bolesti, porodična anamneza, pol, dužina trajanja

bolesti, forma bolesti, inicijalni simptomi,

kognitivne sposobnosti, depresija, anksioznost,

težina bolesti, težina motornih i učestalost

nemotornih simptoma) (Tabele 2, 3, 4).

Tabela 2. Demografske karakteristike kod

pacijenata sa Parkinsonovom bolesti sa različitim

BDNF genotipovima

G/G G/A, A/A P

Broj

pacijenata 121 56 0.816

Godine

pacijenta

(godine)*

58,7±11.1

(28-82)

59.2±10.9

(3178) 0.772

Početak

bolesti

(godine) *

48.7±11.2

(20-72)

49.6±11.1

(29-72) 0.624

Pozitivna

porod.

anamneza#

22

(18.2%)

11

(19.6%) 0.816

Odnos

muškarci:

žene#

84

(69.4%):3

7 (30.6%)

32

(57.1%):2

4 (42.9%)

0.110

Trajanje

bolesti

(godine) *

9.8±6.2

(0.5-37)

9.3±6.1

(0-25) 0.630

Tabela 3. Opšte kliničke karakteristike kod

pacijenata sa Parkinsonovom bolesti sa različitim

BDNF genotipovima

G/G G/A,

A/A P

Forma bolesti#

Tremor-

predominacija

Akinetička

rigidnost

Posturalna

nestabilnost

63

(52.1%)

32

(26.4%)

10 (8.3%)

24

(42.9%)

12

(21.4%)

4 (7.1%)

0.888

Inicijalni

simptomi #

Tremor

Bradikinezija

Rigiditet

Bol

Poteškoće u

pisanju

Smetnje pri

hodu

63

(52.1%)

32

(26.4%)

13

(10.7%)

6 (5.0%)

1 (0.8%)

3 (2.5%)

24

(42.9%)

12

(21.4%)

10

(17.9%)

5 (8.9%)

1 (1.8%)

1 (1.8%)

0.254

0.473

0.191

0.167

0.574

0.773

Inicijalno:

ruka:noga#

110

(90.9%):1

1 (9.1%)

52

(92.9%):

4 (7.1%)

0.665

66 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Tabela 4. Specifične karakteristike motornog i

nemotornog statusa pacijenata sa Parkinsonovom

bolesti sa različitim genotipovima

G/G G/A, A/A P

MMSE* 27.9±3

(14-30)

28.5±1.9

(23-30) 0.164

HDRS* 11.6±9 (0-

39)

9.7± 7.7

(0-30) 0.137

HARS* 7.5±6.1 (0-

22)

6.9±5.5

(0-19) 0.631

H-Y on* 2.3±0.7 (1-

4)

2.2±0.5

(1-4) 0.240

UPDRS I* 3.5±2.9 (0-

13)

2.7±2.1

(0-10) 0.048

UPDRS II* 15.4±8.3

(1-294)

15±6.6 (2-

40) 0.744

UPDRS III* 36.5±14.3

(5-72)

34.5±11.2

(11-58) 0.366

UPDRS IV* 4.8±3.9 (0-

16)

4.5±3.6

(0-12) 0.677

UPDRS

total*

60.1±26.3

(7-125)

56.7±19.5

(15-93) 0.396

SE on* 76.7±15.7

(40-100)

76.6±14.4

(3-100) 0.912

Broj

nemotornih

simptoma*

8.1±6.3(0-

22)

6.5±4.9

(0-17) 0.122

MMSE: test procene mentalnog stanja; HARS:

Hamiltonova skala za procenu anksioznosti;

HDRS: Hamiltonova skala za procenu depresije;

H-Y: Hoehn-Yahr sistem skala, UPDRS:

Unifikovana skala za ocenjivanje Parkinsonove

bolesti, SE: Schwab-England skala svakodnevnih

životnih aktivnosti;

*

vrednosti čine srednju vrednost ± SD sa

rasponom u zagradama; # vrednosti čine broj

pacijenata sa posebnim karakteristikama sa

procentima u zagradama

Diskusija

U ovom istraživanju, Met/Met homogenost

bila je podjednako raspoređena kod pacijenata sa

PB i zdravih iz kontrolne grupe. Iako su Momose i

saradnici utvrdili da je Met/Met homogenost češća

kod obolelih od PB nego kod kontrolne grupe [23],

dalja istraživanja nisu potvrdila ove rezultate

[24,25]. Takođe, prema našim podacima, G196A

polimorfizam nije imao uticaja na izmenu

motornih i nemotornih kliničkih karakteristika.

Polimorfizam BDNF-a nije uticao na godine

početka bolesti i bio je podjednako raspoređen

među sporadičnim i porodičnim slučajevima, što je

kontradiktorno sa rezultatima Karamohamed i

saradnika koji su pokazali da je G196A

polimorfizam povezan sa kasnim početkom bolesti

[26]. Slično našim rezultatima i skorija meta

analiza do sada objavljenih istraživanja nije

podržala hipotezu da je polimorfizam u genu za

BDNF faktor rizika za idiopatsku PB [12].

Egan i saradnici ukazali su na udruženost

BDNF polimorfizma i abnormalne hipokampalne

funkcije, pre svega lošijim postignućima na

testovima epizodične memorije [27]. U našoj

grupi ispitanika postignuća na MMSE testu nisu

pokazala značajnu razliku između obolelih sa

različitim kombinacijama Val66Met polimorfizma

BDNF gena na kognitivno funkcionisanje

pacijenata sa PB.

U različito dizajniranim studijama

pokazano je da je BDNF važan u regulaciji

raspoloženja i ponašanja [11,27,28,29]. Međutim,

naša studija nije dokazala bilo kakvu vezu između

BDNF polimorfizma psihijatrijskih simptoma u

Parkinsonovoj bolesti, naročito depresije i

anksioznosti.

Moguće nekonzistentne, a često i

kontradiktorne podatke o uticaju BDNF na

kliničku ekspresiju PB Hong i saradnici tumače:

(a) neuniformnošću ispitivanih grupa u različitim

studijama, (b) minornim efektima pojedinačnog

gena, (c) mogućnošću da kontrolna grupa nije

ispitana na PB, kao i (d) mogućnošću da su drugi

BDNF polimorfni lokusi odgovorni za uočene

razlike [25].

U zaključku napominjemo da prema našim

rezultatima, G196A polimorfizam nije uticao na

motorne i nemotorne kliničke karakteristike i

komplikacije lečenja bolesnika sa PB. UPDRS I,

statističke značajnosti od 0.048, predstavlja

graničnu vrednost, tako da nije bilo potrebno

komentarisati.

Literatura

1. Kostić VS. Parkinsonova bolest i

parkinsonizam. Medicinski fakultet

Univerziteta u Beogradu - CIBIF, 1998

2. Hyman C, Hofer M, Barde YA, Juhasz M,

Yancopulous GD, Squinto SP, Lindsay

RM. BDNF is a neurotrophic factor for

dopaminergic neurons of the substantia

nigra. Nature 1993;350:230–232

67Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

3. Tsukahara T, Takeda M, Shimohama S,

Ohara O, Hashimoto N. Effects of brain-

derived neurotrophic factor on 1-methyl-4-

phenyl-1,2,3,6-tetrahydripyridine-induced

parkinsonism in monkeys. Neurosurgery

1995;37: 733-739

4. Seidah, N.G., Benjannet, S., Pareek, S.,

Chretien, M., and Murphy, R.A. Cellular

processing of the neurotrophin precursors

of NT3 and BDNF by the mammalian

proprotein convertases. FEBS Lett.

1996;379, 247–250

5. Egan MF, Kojima M, Callicott JH,

Goldberg TE, Kolachana BS, Bertolino A,

Zaitsev E, Gold B, Goldman D, Dean M,

Lu B, Weinberger DR. The BDNF

val66met polymorphism affects activity-

dependent secretion of BDNF and human

memory and hippocampal function. Cell.

2003 Jan 24;112(2):257-69

6. Chen ZY, Patel PD, Sant G, Meng CX,

Teng KK, Hempstead BL, Lee FS. Variant

brain-derived neurotrophic factor (BDNF)

(Met66) alters the intracellular trafficking

and activity-dependent secretion of wild-

type BDNF in neurosecretory cells and

cortical neurons. J Neurosci. 2004;

5;24(18):4401-11

7. Mogi M, Togari A, Kondo T, Mizuno Y,

Komure O, Kuno S, Ichinose H, Nagatsu T.

Brain-derived growth factor concentrations

are decreased in the supstantia nigra in

Parkinson s disease. Neurosci Lett 1999;

270: 45-48

8. Parain K, Murer MG, Yan Q, Faucheux B,

Agid Y, Hirsch E, Raisman-Vozari R.

Reduced expression of brain-derived

neurotrophic factor protein in Parkinson s

disease substantia nigra. Neuroreport 1999;

10:577-561

9. Guerini FR, Beghi E, Riboldazzi G,

Zangaglia R, Pianezzola C, Bono G, Casali

C, Di Lorenzo C, Agliardi C, Nappi G,

Clerici M, Martignoni E. BDNF Val66Met

polymorphism is associated with cognitive

impairment in Italian patients with

Parkinson's disease. Eur J Neurol.

2009;16(11):1240-5

10. Foltynie T, Cheeran B, Williams-Gray CH,

Edwards MJ, Schneider SA, Weinberger D,

Rothwell JC, Barker RA, Bhatia KP.

BDNF val66met influences time to onset of

levodopa induced dyskinesia in Parkinson's

disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry.

2009;80(2):141-4

11. Foltyne T, Lewis S, Goldberg T, Blackwell

AD, Kolachana BS, Weinberger DR,

Robbins TW, Barker RA. The BDNF

Val66Met polymorphism has a gender

specific influence on planning ability in

Parkinson s disease. J Neurol 2005; 252:

833-838

12. Zintzaras E, Hadjigeorgiou GM. The role

of G196A polymorphism in the brain-

derived neurotrophic factor gene in the

cause of Parkinson's disease: a meta-

analysis. J Hum Genet. 2005;50(11):560-6

13. Gao L, Díaz-Corrales FJ, Carrillo F, Díaz-

Martín J, Caceres-Redondo MT, Carballo

M, Palomino A, López-Barneo J, Mir P.

Brain-derived neurotrophic factor G196A

polymorphism and clinical features in

Parkinson's disease. Acta Neurol Scand.

2010;122(1):41-5

14. Hughes A, Ben-Shlomo Y, Daniel SE, Lees

AJ. What features improve the accuracy of

clinical diagnosis in Parkinson s disease? A

clinicopathological study. Neurology 1992;

42: 1142-1146

15. Marshal F. Folstein M F, Folstein S E,

McHugh P R. “Mini-mental state”: A

practical method for grading the cognitive

state of patients for the clinician. Journal of

Psychiatric Research 12 (3): 189 – 198

(1975)

16. Fahn S, Elton RL. Unified Parkinson’s

Disease Rating Scale. In: Fahn S, Marsden

CD, Calne D, Goldstein M editors. Recent

developments in Parkinson’s disease.

Florham Park (NJ): Macmillan Health Care

Information; 1987. pp. 153–63.

17. Hamilton, M (1960) A rating scale for

depression. Journal of Neurology,

Neurosurgery and Psychiatry. 23: 56-62

18. Hamilton M. 1969. Diagnosis and rating of

anxiety. Br J Psychiatry Special Pub 3:76–

79.

19. Chaudhuri KR, Martinez-Martin P,

Schapira AH, Stocchi F, Sethi K, Odin P,

Brown RG, Koller W, Barone P, MacPhee

G, Kelly L, Rabey M, MacMahon D,

Thomas S, Ondo W, Rye D, Forbes A,

Tluk S, Dhawan V, Bowron A, Williams

AJ, Olanow CW. International multicenter

pilot study of the first comprehensive self-

68 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

completed nonmotor symptoms

questionnaire for Parkinson’s disease: the

NMSQuest study. Mov Disord 2006; 21

(7): 916–923

20. Schwabe R, England A. Projection

technique for evaluating surgery in

Parkinsons disease. 3rd Symposium of

Parkinson's disease. In: Gillingham F,

Donaldson I, editors. Edinburgh

Livingstone; 1969. p. 152-7.

21. Owen MJ, Holmans P, McGuffin P.

Association studies in psychiatric genetics.

Mol. Psychiatry 1997; 2:270-273

22. Rodriguez S, Gaunt TR, Day NM. Hardy-

Weinberg Equilibrium Testing of

Biological Ascertainment for Mendelian

Randomization Studies. Am J Epidemiol

2009;169(4):505-514.

23. Momose Y, Murata M, Kobayashi K,

Tachikawa M, Nakabayashi Y, Kanazawa

I, Toda T. Association study of the brain-

derived neurotrophic factor (BDNF) gene

with bipolar disorder. Neurosci Lett 2003;

337: 17-20.

24. Hakansson A, Melke J, Westberg L,

Shahabi HN, Buervenich S, Carmine A,

Klingborg K, Grundell MB, Schulhof B,

Holmberg B, Ahlberg J, Eriksson E, Sydow

O, Olson L, Johnels B, Nissbrandt H. Lack

of association between the BDNF

Val66Met polymorphism and Parkinson s

disease in a Swedish population. Ann

Neurol 2003; 53:823.

25. Hong CJ, Liu HC, Liu TY, Lin CH, Cheng

CY, Tsai SH. Brain derived neurotrophic

factor (BDNF) Val66Met polymorphism in

Parkinson s disease and age of onset.

Neurosi Lett 2003; 353: 75-77.

26. Karamohamed S. Latourelli J. Racete B.

Perlmutter JS, Wooten GF, Lew M, Klein

C, Shill H, Golbe LI, Mark MH, Guttman

M, Nicholson G, Wilk JB, Saint-Hilaire M,

DeStefano AL, Prakash R, Tobin S,

Williamson J, Suchowersky O, Labell N,

Growdon BN, Singer C, Watts R,

Goldwurm S, Pezzoli G, Baker KB, Giroux

ML, Pramstaller PP, Burn DJ, Chinnery P,

Sherman S, Vieregge P, Litvan I, Gusella

JF, Myers RH, Parsian A. BDNF genetic

variant are associated with onset age od

familial Parkinson's disease. GenePD

study. Neurology 2005; 65:1823-1825.

27. Egan MF, Kojima M, Callicott JH,

Goldberg TE, Kolachana BS, Bertolino A,

Zaitsev E, Gold B, Goldman D, Dean M,

Lu B, Weinberger DR. The BDNF

val66met polymorphism affects activity-

dependent secretion of BDNF and human

memory and hippocampal function. Cell.

2003; 112(2):257-69.

28. Zaitsev E, Gold B, Goldman D, Dean M,

Lu B, Weinberger DR. The BDNF

val66met polymorphism affects activity-

dependent secretion of BDNF and human

memory and hippocampal function. Cell

2003; 112(2):257–269.

29. Samadi P, Morissette M, Levesque D, Di

Paolo T. BDNF levels are not related with

levodopa-induced dyskinesia in MPTP

monkeys. Mov Disord 2010;25:116-121.

69Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

ZNAČAJ KRIOGLOBULINEMIJE U HRONIČNOJ INFEKCIJI VIRUSOM HEPATITISA C

Autor: Jovan Grujić1

Mentor: Asist. dr SlaĎana Andrejević2

1 Medicinki fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Klinika za alergologiju i imunologiju, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u

Beogradu

Sažetak

Uvod: Hronična infekcija virusom

hepatitisa C (HCV) je često povezana sa brojnim

ekstrahepatičkim manifestacijama.Cirkulišući

mešoviti krioglobulini se otkrivaju u 40-60%

pacijenata inficiranih HCV-om, dok se

krioglobulinemijski vaskulitis javlja u 5-10%

slučajeva. Prema našem saznanju, za našu

populaciju nema pouzdanih podataka o

prevalenci krioglobulinemije u hroničnoj HCV

infekciji.

Cilj: Utvrditi učestalost krioglobulinemije

u hroničnoj HCV infekciji i ispitati njen klinički

značaj.

Pacijenti i metode: Ispitivanjem je

obuhvaćeno 45 pacijenata (24 žene, 21 muškarac),

srednje starosti 51,4 god. (rang 22-67) sa

hroničnom HCV infekcijom srednjeg trajanja

bolesti od 8,8 god. (rang 1-24). Utrvrđivani su i

analizirani svi važni klinički nalazi i podaci.

Krioglobulini su određivani standardnom

procedurom. Prisustvo autoantitela određivano je

standardnom tehnikom indirektne

imunofluorescence. Koncentracije C3 i C4

komponente komplementa i reumatoidnog faktora

određivane su nefelometrijski.

Rezultati: Kod 15 pacijenata (33%)

utvrđeno je prisustvo krioglobulina i većina njih je

bila bez simptoma. Utvrdili smo da pacijenti sa

krioglobulinemijom značajno češće imaju izraženu

malaksalost, purpuru, ulceracije na koži (p<0,01) i

perifernu neuropatiju (p<0,05) u odnosu na

pacijente koji nemaju krioglobuline. Takođe, ova

grupa pacijenata ima niže (p<0,01) koncentracije

C4 od pacijenata bez krioglobulinemije.

Zaključak: Krioglobulini imaju značajnu

ulogu u patogenezi ekstrahepatičkih manifestacija

u HCV infekciji. Blagovremeno otkrivanje

prisustva krioglobulina može poboljšati lečenje i

prognozu pacijenata sa hroničnom HCV

infekcijom.

Ključne reči: krioglobulini, HCV, vaskulitis.

Abstract

Introduction: Chronic hepatitis C virus

(HCV) infection is commonly associated with a

number of extrahepatic complications. Circulating

mixed cryoglobulins are detected in 40 - 60% of

HCV infected patients, whereas cryoglobulinaemic

vasculitis develops in 5 - 10% of cases. To the best

of our knowledge, there are no confident data

concerning the prevalence of cryoglobulinaemia in

HCV infection for our population.

Aim: To establish the frequency of

cryoglobulinemia in chronic HCV infection and to

assess its clinical relevance.

Patients and Methods: We have studied 45

patients (24 women and 21 men), median age 51,4

years (range 22 - 67), suffering from chronic HCV

infection with the medium duration of disease of

8,8 years (range 1 - 24). All important clinical

findings and data were recorded and analysed.

Cryoglobulins were detected by the standard

procedure. The presence of autoantibodies was

detected by the standard indirect

immunofluorescence technique. Concentrations of

C3, C4 component complement and rheumatoid

factor were determined by nephelometry.

Results: Fifteen patients (33%) had

detectable cryoglobulins and most of them were

asymtomatic. We found that patients with

cryoglobulinemia had significantly higher

frequency of weakness, palpable purpura, skin

ulcers (p<0,01) and peripheral neuropathy

(p<0,05) comparing to cryoglobulin negative

patients. Also, patients from this group had lower

(p<0,01) concentrations of C4 than patients

without cryoglobulinaemia.

Conclusion: Cryoglobulins in HCV

infection have the important role in the

ethiopathogenesis of extrahepatic manifestations.

An early detection of their presence could improve

the treatment and prognosis of patients with

chronic HCV infection.

Key words: cryoglobulins, HCV, vasulitis

70 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Uvod

Hepatitis C virus (HCV) je RNK virus iz

familije flavivirida. Infekcija HCV-om je u svetu

druga po učestalosti hronična virusna infekcija koja

u 80% inficiranih prelazi u hronicitet sa razvojem

ciroze jetre i hepatocelularnog karcinoma u 20%

slučajeva (1). Osim zahvatanja jetre, HCV infekciju

odlikuju brojne ekstrahepatične komplikacije koje

su imunski posredovane i često ispoljene kao

autoimunske manifestacije. Mnoge od njih su

etiološki uzrokovane krioglobulinima koji se

laboratorijski mogu dokazati kod 40-60%

pacijenata, dok se jasan krioglobulinemijski

vaskulitis razvija u 5-10% slučajeva (2).

Krioglobulini su abnormalni imunoglobulini

koji reverzibilno precipitiraju kada se serum

inkubira na temperaturi niţoj od 370C. Osim

udruţeni sa HCV infekcijom mogu se javiti u

limfoproliferativnim i autoimunskim bolestima,

kao i u idiopatskoj formi. Mešovita

krioglobulinemija u HCV infekciji nastaje kao

proizvod interakcije virusa i domaćina (3). Na

prisustvo krioglobulina upućuju i sniţene vrednosti

C4 komponente komplementa i prisustvo

reumatoidnog faktora (RF).

Krioglobulinski sindrom karakteriše

klinička „trijada“ koja se sastoji od purpure,

malaksalosti i bolova u zglobovima (4). Osim toga,

često postoji periferna neuropatija,

glomerulonefritis i brojni fenomeni koji se sreću u

sistemskim bolestima vezivnog tkiva. Mogu biti

zahvaćeni i drugi organski sistemi,

gastrointestinalni, respiratorni, kardiovaskularni i

endokrini. Patološki supstrat je leukocitoklastični

vaskulitis malih i srednjih krvnih sudova nastao

usled taloţenja imunskih kompleksa i aktivacije

komplementa, odgovornih za oštećenja koţe i

visceralnih organa. (5).

Prema našem saznanju, podaci o prevalenci

krioglobulinemije u HCV infekciji za našu

populaciju su oskudni ili nedostaju. Cilj ovog rada

bio je da se utvrdi učestalost krioglobulinemije u

hroničnoj HCV infekciji i utvrdi njena veza sa

imunoserološkim parametrima i pojavom

ekstrahepatičnih manifestacija bolesti.

Materijal i metode

Pacijenti

Ispitivanjem je obuhvaćeno 45 pacijenata

(24 ţena i 21 muškarac), starosti od 22 do 67

godina. U periodu od oktobra 2012. do februara

2013. godine u studiju je uključen 41 pacijent

Klinike za infektivne i tropske bolesti i 4 pacijenta

Klinike za alergologiju i imunologiju Kliničkog

centra Srbije. Ispitivani su pacijenti koji su dolazili

na redovne ambulantne kontrole i pacijenti koji su

lečeni stacionarno zbog pogoršanja bolesti, radi

detaljne dijagnostike, izvoĎenja aspiracione biopsije

jetre, ili radi otpočinjanja antivirusne terapije.

Kriterijum za uključivanje u studiju bio je

dokazana hronična HCV infekcija. Nisu uključeni

pacijenti koji su imali dokazanu koinfekciju drugim

virusima. Svi pacijenti su obavešteni o ispitivanju i

dobrovoljno su pristali da u njemu učestvuju.

Pacijenti su anketirani, a pitanja su se sem opštih

podataka ticala njihove bolesti, dosadašnje terapije,

i pojave simptoma karakterističnih za

krioglobulinemijski vaskulitis.

Svakom od pacijenata uzimana su dva

uzorka venske krvi bez antiokoagulansa. Uzorak

krvi za odreĎivanje krioglobulina uziman je u

prethodno zagrejanu epruvetu koja je

transportovana do laboratorije zaronjena u vodu

zagrejanu na oko 37° C. Drugi uzorak je standardno

transportovan.

Utvrđivanje prisustva krioglobulina

Uzorci krvi su inkubirani na 37°C u

vodenom kupatilu do koagulacije. Serum je odvojen

nakon centrifugiranja na 2500 obrtaja/minuti tokom

10 minuta u toploj centrifugi (Hettich Rotanta AP,

Nemačka). Dobijen serum je ostavljen na

temperaturi od +40C tokom 7 dana. Na prisustvo

krioglobulina upućuje prisustvo belog precipitata.

Ukoliko on postoji, odliva se supernatant i dodaje

hladni fosfatni pufer i kriprecipitat se ispira kako bi

se oslobodio nespecifično vezanih proteina.

Priustvo krioglobulina se potvrĎuje ukoliko se

precipitat potpuno rastvara u toplom fosfatnom

puferu. Koncentracija proteina odreĎuje se

merenjem optičke gustine na 280 nm pomoću

spektrofotometra (Jenway 6405 UV/VIS, Velika

Britanija) i izraţava semikvantitativno prema

utvrĎenoj skali od 1+ do 4+.

Udređivanje autoantitela i komponenti

komplementa

Prisustvo RF u krioprecipitatu i

koncentracije RF, C3 i C4 komponente

komplementa u serumina je odreĎivane su

nefelometrijski (Minineph, The Binding Site,

Birmingem, Velika Britanija).

OdreĎivano je prisustvo i titar

antinuklearnih, antimitohondrijskih,

antiglatkomišićnih i antitela protiv LKM1 na

kriostatskim isečcima jetre, bubrega i ţeluca

71Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

glodara (Euroimmun, Libek, Nemačka)

standardnom tehnikom indirektne

imunofluorescence. Početno razblaţenje seruma u

fosfatnom puferu bilo je 1:40. Pozitivan uzorak

dalje je titriran dvostrukim razblaţenjima do

poslednjeg koje daje pozitivnu reakciju. Preparati su

posmatrani pod fluorescentnim mikroskopom

(Eurostar III Plus, Euroimmun, Libek, Nemačka).

Statistička analiza

Pacijenti su podeljeni u dve grupe na osnovu

prisustva krioglobuilina.

U statističkoj obradi podataka o učestalosti

korišćeni su Hi-kvadrat test i Fišerov egzaktni test.

Za testiranje značajnosti razlika u koncentracijama

komponenti komplementa korišćen je Studentov t-

test. Kao granica statističke značajnosti uzeta je

vrednost p<0,05.

Rezultati

Podaci o pacijentima prikazani su na tabeli

1. Kao što se vidi iz tabele, zastupljenost polova je

gotovo ravnomerna. Trajanje bolesti od postavljanja

dijagnoze varira od jedne do čak 24 godine.

Nije utvrĎena veza izmeĎu trajanja bolesti i

prisustva krioglobulina. Nešto više od polovine

pacijenata bilo je lečeno antivirusnom terapijom.

Prisustvo krioglobulina nije bilo češće kod

nelečenih pacijenata. Biopsija jetre sa

patohistološkim ispitivanjem obavljena je kod 22

pacijenta i rezultati su prikazani na tabeli 1.

Tabela 1. Ispitivane karakteristike pacijenata sa

hroničnom infekcijom virusom hepatitisa C (HCV)

Pacijenti n = 45

Starost (godine ± SD) 51,4±11,2

Pol: Ţ/M 24/21

Vreme od postavljanja dijagnoze (godine) 8,8±6,3

Primenjena antivirusna terapija (%) 26 (57,8)

Kliničke manifestacije:

Malaksalost (%) 19 (42,2)

Purpura (%) 5 (11,1)

Periferna neuropatija (%) 5 (11,1)

Ulceracije na koţi (%) 5 (11,1)

Raynaud-ov fenomen (%) 15 (33,3)

Artralgije (%) 15 (33,3)

Mijalgije (%) 6 (13,3)

Limfadenopatija (%) 3 (6,7)

Sindrom suvih očiju i usta (%) 10 (22,2)

Bubreţna bolest (%) 3 (6,7)

Gastrointestinalni simptomi (%) 12 (26,7)

Srčana oboljenja (%) 5 (11,1)

Bolesti pluća (%) 1 (2,2)

Tromboze (%) 1 (2,2)

Oboljenja centralnog nervnog

sistema (%)

9 (20)

Šećerna bolest (%) 9 (20)

Bolesti štitaste ţlezde (%) 4 (8,9)

Autoimunske bolesti (%) 3 (6,7)

Neoplazme (%) 10 (22,2)

Patohistološki nalaz biopsije jetre:

Bez fibroze (%) 5/22 (22,7)

Laka fibroza (%) 6/22 (27,2)

Fibroza (%) 5/22 (22,7)

Ciroza (%) 6/22 (27,2)

Imunološke karakteristike:

Prisustvo krioglobulina (%) 15 (33,3)

RF u krioprecipitatu (%) 7/12 (58,3)

Prisustvo

autoantitela

ANA (%) 8 (17,8)

AGMA (%) 7 (15,6)

ANCA (%) 2 (4,4)

LKM1 (%) 0 (0)

Sniţena koncentracija komponenti

komplementa

C3 (%) 3 (6,7)

C4 (%) 8 (17,8)

Krioglobulini su izolovani kod 15 pacijenata

sa hroničnom HCV infekcijom. Kod sedam od 12

ispitivanih krioprecipitata utvrĎeno je prisustvo

72 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

krioprecitabilnog RF, pa za ove krioglobulinemije

moţemo tvrditi da pripadaju pravim mešovitim

krioglobulinemijama prema vaţećoj klasifikaciji (6).

Kao najčešći simptom HCV infekcije

navedena je malaksalost, koju je imalo čak 42%

pacijenata. Trećina pacijenata imala je izraţene

artralgije i Raynaud-ov fenomen. Nespecifične

gastrointestinalne simptome imalo je 12 pacijenata.

Oboljenje bubrega ustanovljeno je kod tri pacijenta,

ali ni jedan od njih nije imao izraţenu kliničku sliku

glomerulonefritisa.

Većina pacijenata sa krioglobulinemijom nije imala

izraţene kliničke simptome krioglobulinemijskog

vaskulitisa.

PoreĎena je učestalosti ekstrahepatičnih

manifestacija izmeĎu dve grupe HCV pozitivnih

pacijenata sa krioglobulinemijom i bez

krioglobulinemije. UtvrĎena je značajno češća

pojava prvenstveno palpabilne purpure i ulceracija

na koţi, zatim malaksalosti, pa periferne neuropatije

u grupi pacijenata sa krioglobulinemijom (Tabela 2).

Za ostale kliničke manifestacije nije utvrĎena

statistički značajna razlika.

Tabela 2. PoreĎenje kliničkih odlika pacijenata sa

HCV infekcijom prema prisustvu

krioglobulinemije

Pacijenti

sa

krioglobul

inemijom

(n=15)

Pacijenti

bez

krioglobul

inemije

(n=30)

P

Malaksalost 11 8 0,004

Palpabilna

purpura

5 0 0,002

Ulceracije na

koţi

5 0 0,002

Periferna

neuropatija

4 1 0,036

U serumima relativno malog broja

pacijenata sa HCV infekcijom utvrĎeno je prisustvo

autoantitela u niskom titru (1:40-1:80) protiv

jedarnih antigena, antigena glatkih mišića i

citoplazme neutrofilnih leukocita. Niko od

ispitivanih pacijenata nije imao antitela protiv

LKM1 antigena, koja se opisuju kod pacijenata sa

hroničnom HCV infekcijom. Nisu utvrĎene

značajne razlike izmeĎu dve ispitivane grupe u

učestalosti priustva autoantitela, kao ni povezanost

trajanja HCV infekcije i primenjene terapije i

prisustva autoantitela.

PoreĎenjem koncentracija C4 komponente

komplementa u serumima pacijenata sa hroničnom

HCV infekcijom uočeno je da su pacijenti sa

krioglobulinemijom imali značajno niţe

koncentracije C4 od pacijenata koji nisu imali

krioglobulinemiju (Grafikon 1).

Grafikon 1. Koncentracije C4 komponente

komplementa u serumima dve grupe pacijenata sa

hroničnom HCV infekcijom

Diskusija

U našoj populaciji, u relativno malom

uzorku pacijenata sa hroničnom HCV infekcijom

različitog trajanja utvrĎeno je da trećina pacijenata

ima krioglobulinemiju. Prema podacima iz

literature krioglobulini su utvrĎeni kod 20-60%

pacijenata sa HCV infekcijom (7, 8). Ograničenja

ove studije leţe u tome što je delom

retrospektivna, pa samim tim postoji mogućnost da

su pojedini podaci ostali nedostupni. Radi

utvrĎivanja prevalence i značaja krioglobulinemije

u našoj populaciji neophodno je ispitivanje i

analiziranje većeg broja pacijenata sa hroničnom

HCV infekcijom.

Rezultati našeg ispitivanja dokazuju

povezanost krioglobulinemije i pojave

malaksalosti, purpure, periferne neuropatije i

ulkusa Koţa je najčešće zahvaćen organ u

krioglobulinemijskom vaskulitisu. Glavni znak je

palpabilna purpura koja se javlja kod 70-90%

pacijenata sa vaskulitisom (2). Promene mogu

evoluirati ka ulceracijama, što je potvrĎeno i kod

naših pacijenata. Artralgije su prisutne kod oko 40-

80% pacijenata. Iako se u HCV infekciji često

utvrĎuje prisustvo RF ono ne korelira sa razvojem

1530N =

Krioglobulini

PozitivniNegativni

Ko

nce

ntr

acija

C4

(g

/L)

,6

,5

,4

,3

,2

,1

0,0

-,1

p<0,01

73Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

artritisa. Cacoub i saradnici (8) navode da je

periferni nervni sistem zahvaćen čak kod 55%

pacijenata sa krioglobulinemijom u okviru HCV

infekcije. Najčešća manifestacija je distalna

senzorna ili senzomotorna neuropatija.

U našoj grupi pacijenata sa

krioglobulinemijom nije utvrĎena češća pojava

drugih autoimunskih fenomena kao što su

glomerulonefritis, Rayaud-ov sindrom, sindrom

suvih očiju i usta, mijalgije, limfadenopatija i dr.

Verovatni razlog je mali uzorak u odnosu na

objavljene studije koje su analizirale izmeĎu 100 i

250 pacijenata, u kojima se ove pojave registruju

kod 5-30% ispitanika (2). Moguće objašnjenje

ovakvog rezultata moţe biti i u tome da je

tumačenje artralgija i sindroma suvih očiju i usta

oteţano kod pacijenata koji su primali antivirusnu

terapiju, jer ovi simptomi spadaju u neţeljena

dejstva lekova. Što se urinarnog sistema tiče, iako

se bubreţni simptomi navode kao relativno česte

manifestacije, kod anketiranih pacijenata mali broj

je imao bubreţne bolesti od značaja, već su

uglavnom u pitanju bile bolesti kao što su

kalkuloza, urinarne infekcije, tumori ili uroĎene

anomalije urotrakta. Pojava dijabetesa nije bila

statistički značajna, pogotovo imajući u vidu

pozitivnu porodičnu anamnezu kod većine

oboleleih. Česte su bile pojave hipertenzije,

aritmija i povremenih tahikardija, angine pektoris,

bronhitisa, pneumonia, plućnih bolesti povezanih

sa dugogodišnjim pušenjem, kao i benignih

gastrointestinalnih tegoba čestih u opštoj

populaciji. Sve ovo nije od značaja za kliničku

sliku krioglobulinemijskog sindroma. Bolesti

štitaste ţlezde, autoimunske bolesti, tromboze i

neoplazije, takoĎe, nisu imale statističku

povezanost.

Sniţena koncentracija C4 komponente

komplementa karakteristična je za postojanje

mešovite krioglobulinemije i nastaje aktivacijom

komplementa klasičnim putem. Potencijalni

aktivatori su IgM RF, IgG ili njihovi kompleksi. U

našoj grupi pacijenata sa krioglobulinemijom

utvrĎene su značajno niţe koncentracije C4 u

odnosu na pacijente sa HCV infekcijom bez

prisutne krioglobulinemije što odgovara

rezultatima prethodno objavljenih istraţivanja (9).

Mora se imati u vidu da pacijenti sa

hroničnom HCV infekcijom i

krioglobulinemijskim sindromom predstavljaju

veliki terapijski problem. Osim antivirusne

terapije, pacijentima moţe biti potrebno

uključivanje steroidne ili citostatske terapije da bi

se vaskulitis uveo u remisiju i došlo do kliničkog

poboljšanja. Zato je neophodno na vreme

prepoznati i lečiti kako HCV infekciju tako i

prateću krioglobulinemiju koja predstavlja rizik za

razvoj limfoproliferativnog oboljenja (2, 8).

Literatura

1. Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus

infection. N Eng J Med 2001; 345:41-52.

2. Saadoun D, Landau DA, Calabrese LH,

Cacoub PP. Hepatitis C-associated mixed

cryoglobulinaemia: a crossroad between

autoimmunity and lymphoproliferation.

Rheumatology 2007; 46:1234-1242.

3. Sansonno D, Carbone A, De Re V,

Dammacco F. Hepatitis C virus infection,

cryoglobulinemia , and beyond.

Rheumatology 2007; 46:572-578.

4. Meltzer M, Franklin EC, Elias K,

McCluskez RT, Cooper N.

Cryoglobulinemia –a clinical snd laboratory

study. II. Cryoglobulins with rheumatoid

factor activity. Am J Med 1966; 40:837-856.

5. Ferri C, Mascia MT. Cryoglobulinemic

vasculitis. Curr Op Rheum 2006; 18:54-63.

6. Brouet JC, Clauvel JP; Danon F, Klein M,

Seligmann M. Biology and clinical

significance of cryoglobulins. A report of 86

cases. Am J Med 1974; 57:775-788.

7. Wong VS, Egner W, Elsey T, Brown D,

Alexander GJM. Incidence, character and

clinical relevance of mixed

cryoglobulinaemia in patients with chronic

hepatitis C virus infection. Clin Exp

Immunol 1996; 104:25-31.

8. Sansanno D, Dammacco F. Hepatitis C

virus, cryoglobulinemia, and vasculitis:

immune complex relations. Lancet Infect Dis

2005; 5:227-236.

9. Cacoub P, Saadoun D, Limal N, Leger JM;

Mainsonobe T. Hepatitis C virus infection

and mixed cryoglobulinemia vasculitis: a

review of neurological complications. AIDS

2005; 19:128-34.

10. Gorevic PD. Rheumatoid factor, complement

, and mixed cryoglobulinemia. Clin Develop

Immunol 2012 (u štampi).

74 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

FAKTORI RIZIKA I ETIOLOGIJA ISHEMIJSKOG MOŢDANOG UDARA KOD OSOBA

MLAĐIH OD 45 GODINA: ANALIZA PETOGODIŠNJEG PERIODA 2008-2012

Autori: Mirjana Kneţević1, Milan Radovanović

1

Mentor: Asist. dr Aleksandra Pavlović2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Klinika za neurologiju Kliničkog centra Srbije

Sažetak

Uvod: Iako se ishemijski moždani udar

(IMU) samo u 5-10% slučajeva viđa kod osoba

mlađih od 45 godina, ovaj fenomen ima veliki

socio-ekonomski značaj jer pogađa radno aktivne

osobe. Etiologija IMU ima svoje posebnosti u

odnosu na uzroke koji se viđaju kod starijih osoba.

Cilj: Da se analiziraju uzroci IMU kod

mlađih bolesnika u poslednjih 5 godina.

Materijal i metode: Analizirali smo

vaskularne faktore rizika (FR) i etiologiju IMU

prema TOAST klasifikaciji kod bolesnika mlađih

od 45 godina, koji su u periodu 01.01.2008-

01.01.2013.godine hospitalno lečeni na Klinici za

neurologiju Kliničkog centra Srbije. Svi bolesnici

ispitani su prema odgovarajućem dijagnostičkom

protokolu.

Rezultati: U studiju je uključeno 70

ispitanika, uzrasta od 22-45 godina, prosečno

36,7±6,4 godina, sa ravnomernom distribucijom

polova (50% žena). Prosečna težina IMU

procenjena skorom na NIHSS skali za celu grupu

bila je 4 (3,9±2,8) i nije bitno varirala u

petogodišnjem periodu (p=0,324). U 41,4%

slučajeva, uzrok IMU ostao je neutvrđen uprkos

sprovedenim ispitivanjima. Analiza petogodišnjeg

perioda pokazala je trend opadanja učestalosti

kardioembolizma tokom godina (p=0,071).

Najčešći FR bili su pušenje (58,6%), hipertenzija

(47,1%) i hiperlipidemija (38,6 %). Analiza po

godinama nije ukazala na značajne promene u

učestalosti klasičnih vaskularnih FR.

Zaključak: Osim izvesnog pada prevalence

kardioembolizma, petogodišnja analiza ukazala je

na stabilnu učestalost vaskularnih FR i etiologije

IMU kod bolesnika mlađih od 45 godina. Visoka

učestalost promenljivih FR kod mladih ukazuje na

potrebu za većom edukacijom javnosti o

mogućnostima prevencije IMU.

Ključne reči: ishemijski moždani udar,

faktori rizika, etiologija IMU.

Abstract

Introduction: Although ischemic stroke is

detected in patients younger than 45 in only 5-10%

of cases, this phenomenon is of great socio -

economic importance since it affects professionally

active people. Stroke etiology differs in younger

patients compared to older ones.

Aim: To analyse the causes of stroke in

young patients in the past 5 years.

Material and Methods: We analysed

vascular risk factors (RF) and stroke etiology

defined by TOAST classification in patients < 45

years of age, who were treated as in - patients at

the Neurology Clinic, the Clinical Centre of Serbia

in the period from 01.01.2008. to 01.01.2013. All

the patients were examined according to the

standard diagnostic protocol.

Results: We enrolled 70 patients, aged 22 -

45, mean age 36.7±6.4 years, with equal gender

distribution (50% females). Stroke severity was

assessed with the use of NIHSS score, which on

average was 4 (3.9±2.8) and did not show a

significant variation in the five - year period

(p=0.324). In 41.4% of cases the cause of stroke

remained undetermined in spite of the

investigations. When the five - year period was

analysed, there was a trend of declining frequency

of cardioembolism (p=0.071). The most frequent

RF were smoking (58.6%), hypertension (47.1%)

and hyperlipidaemia (38.6%). The five - year

period analysis did not show significant changes in

the frequency of common vascular RF.

Conclusion: Except for the declining trend

of the frequency of cardioembolism, the five - year

analysis showed a stable frequency of vascular RF

and stroke etiology in young patients. High

frequency of preventable RF in the young indicates

the need for more intense public education

concerning stroke prevention.

Key words: ischemic stroke, risk factors,

stroke etiology.

75Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Uvod

Ishemijski moţdani udar (IMU) kod mladih

definiše se kao IMU kod osoba uzrasta 18-45

godina (1). Radi se o relativno retkom fenomenu,

sa prevalencom od 2-12% svih IMU (2). Međutim,

ovaj problem je od velikog značaja ne samo zato

što su pogođene osobe na vrhuncu svojih ličnih i

profesionalnih sposobnosti i aktivnosti, već i zato

što noviji podaci govore o porastu učestalosti IMU

u ovoj populaciji (3,4). Faktori rizika (FR) i

etiologija IMU kod mladih u značajnoj meri

razlikuju se u odnosu na stariju populaciju (1).

Najšire korišćena etiološka klasifikacija

uzroka IMU uopšte je TOAST klasifikacija, prema

kojoj postoji pet osnovnih grupa uzroka IMU:

ateroskleroza velikih arterija (AVA),

kardioembolizam (KE), okluzija malih arterija

(OMA), retki uzroci (RU) i neutvrđeni uzroci (NU)

(4, 5). Smatra se da su glavni uzroci IMU kod

mladih KE usled strukturnih anomalija srca i RU,

gde po učestalosti vode arterijske disekcije, druge

ne-aterosklerotske arteriopatije, tromboza venskih

sinusa mozga i razna prokoagulantna stanja (2, 7).

Ipak, studije ukazuju da ateroskleroza u zemljama

u razvoju i dalje predstavlja značajan uzrok IMU

kod mlađe populacije (2, 6, 7).

U našoj sredini obrađena je velika serija

mlađih bolesnika sa IMU koji su hospitalno lečeni

na odeljenju Urgentne neurologije u periodu od

1999-2005. godine (7). Autori Jovanović i

saradnici konstatovali su da je posle neutvrđene

etiologije, najčešći uzrok IMU bio KE usled

reumatske bolesti srca i veštačnih valvula (7).

Međutim, epidemiološke studije koje su analizirale

uzroke IMU kod mladih tokom dugoročnog

perioda ukazuju na to da se etiološka dijagnoza

IMU menja tokom vremena u raznim sredinama,

najpre zahvaljujući većim mogućnostima

dijagnostičke obrade obolelih (6, 8). Iz ovog

razloga, ciljevi naše studije bili su:

1. Analiza vaskularnih FR kod bolesnika

mlađih od 45 godina koji su hospitalno lečeni i

ispitivani na Klinici za neurologiju Kliničkog

centra Srbije zbog IMU u poslednjih 5 godina;

2. Analiza etiološke klasifikacije IMU

prema TOAST kriterijumima u ovako definisanoj

grupi bolesnika.

Materijal i metode

Grupa ispitanika

U studiju smo regrutovali bolesnike uzrasta

18 - 45 godina sa IMU, koji su hospitalno lečeni u

periodu 01.01.2008 - 01.01.2013. godine. U

studiju smo uključili samo one bolesnike kod kojih

je u potpunosti sprovedeno ispitivanje uzroka IMU

prema standardnom Protokolu za ispitivanje IMU

kod mladih osoba, koji se primenjuje na ovom

odeljenju (1).

Dijagnostički protokol

Prokotol je zasnovan na savremenoj

literaturi i preporukama i prikazan u Tabeli 1 (1, 2,

6, 7, 9). Kod svih bolesnika analizirali smo

osnovne demografske podatke (uzrast u vreme

IMU, pol), vaskularne FR i teţinu IMU koja je

izraţena skorom na Skali za Moţdani Udar

Nacionalnih Instituta za Zdravlje (National

Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS) na

prijemu i skorom na modifikovanoj Rankinovoj

skali (mRS) na otpustu iz bolnice. Etiologija IMU

određena je na osnovu anamneze, rezultata

ispitivanja uključujući laboratorijske, ultrazvučne i

nalaze na snimcima mozga magnetnom

rezonancom (MR) mozga, a prema kriterijumima

za TOAST klasifikaciju (5).

76 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Tabela 1. Protokol za ispitivanje mladih bolesnika sa IMU.

Anamnestički i demografski podaci

Uzrast

Pol

Postojanje vaskularnih FR: hipertenzija, dijabetes melitus, hiperlipidemija, bolest zalistaka,

apsolutna aritmija, koronarna bolest, prethodni IMU, aktivno pušenje, alkoholizam, korišćenje droga i

stimulativnih sredstava, upotreba oralnih kontraceptiva, migrena

Porodična anamneza o IMU u srodnika 1. stepena

Laboratorijske analize krvi

Glikemija našte, ukoliko je povišena OGTT i HbA1c

Lipidogram: ukupan holesterol, LDL- i HDL holesterol, trigliceridi

Imunološki status: antinuklearna antitela, neutrofilna citoplazmatska anitetela, LE ćelije, CRP

Antikardiolipinska antitela, lupus antikoagulans

HIV

Anti-HCV i HBV antitela, hepatitis B površinski antigen

Koagulacioni status: D-dimer, PTT, aPTT, faktori koagulacije

Antitrombin, protein C i S i rezistencija na aktivirani protein C

Radiografija srca i pluća

Kardiološki pregled sa EKG i transtorakalnom i transezofagealnom ehokardiografijom

Ultrazvučna evaluacija

Ekstrakranijalni Kolor Dopler, transkranijalni Dopler, test na desno-levi šant i test detekcije

mirkoembolijskih signala

Specijalni testovi ako je indikovano

Laktati u krvi pre i posle zamora

Lumbalna punkcija sa pregledom citobiohemijskog statusa, izoelektričnim fokusiranjem,

antitelima na virusne, bakterijske i druge infekcije

Genetske analize (na trombofilije, CADASIL, i dr)

Biopsija koţe, perifernih mišića i nerava

Neuroradiološke analize

MSKT mozga

MR moţdanog parenhima

MSKT angiografija krnih sudova mozga i vrata

MR angiografija krvnih sudova mozga i vrata

Digitalna suptrakciona angiograifija mozga i vrata

Konsultativni pregledi prema indikacijama: oftalmologa, neurohirurga, endokrinologa i dr.

IMU – ishemijski moţdani udar

OGTT – oralni glukoza tolerans test

CADASIL – cerebralna autozomno dominantna arteriopatija sa supkortikalnim infarktima i leukoencefalopatijom

MSCT – multislajsna kompjuterizovana tomografija

MR – magnetna rezonanca

Statistička Analiza

U radu je korišćena osnovna deskriptivna

statistika. Statistička analiza obuhvatala je analizu

varijanse za nekontinuirane promenljive i χ2

odnosno Fišerov test za kontinuirane promenljive.

P-vrednost <0,05 je smatrana statistički

značajnom.

Rezultati

U studiju je uključeno 70 ispitanika,

uzrasta od 23 do 44 godine, prosečno 37 godina.

Podjednako su bili zastupljeni bolesnici oba pola

(50%). Nije postojala statistički značajna razlika u

toku petogodišnjeg perioda u godišnjoj distribuciji

uzrasta (p=0,136), kao ni pola (p=0,294) obolelih.

Detalji demografskih osobina grupe prikazani su u

Tabeli 2.

77Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Tabela 2. Demografski podaci, teţina IMU i etiološka klasifikacija IMU (TOAST kriterijumi) kod

bolesnika mlađih od 45 godina u periodu od 5 godina (2008-2012).

Parametar 2008

(n=8)

2009

(n=13)

2010

(n=17)

2011

(n=23)

2012

(n=9)

Ukupno

(N=70)

p-

vrednost

Godine, x±SD 39,5±4,9 39,5±4,6 36,7±6,4 35,5±7,

1

33,4±6,

7

36,7±6,4 0,136

Broj (%)

muškaraca

2 (25,0) 6 (46,2) 11 (64,7) 13

(56,5)

3 (33,3) 35 (50,0) 0,294

NIHSS, x±SD 4,8±4,1 4,5±1,5 2,9±1,7 4,4±3,0 3,1±3,8 3,9±2,8 0,324

mRS na otpustu,

x±SD

1,4±0,9 1,8±0,9 0,9±0,9 1,3±1,0 1,0±0,7 1,3±0,9 0,148

TOAST

klasifikacija

AVA, n (%)

KE, n (%)

OMA, n (%)

RU, n (%)

NU, n (%)

1 (12,5)

0 ()

3 (37,5)

3 (37,5)

1 (12,5)

0 ()

3 (23,1)*

4 (30,8)

0

6 (46,1)

4 (23,5)

0

2 (11,8)

5 (29,4)

6 (35,3)

3 (13,0)

0

1 (4,3)

7 (30,5)

12

(52,2)

0

1 (11,1)

2 (22,2)

2 (22,2)

4 (44,5)

8 (11,4)

4 (5,8)

12 (17,1)

17 (24,3)

29 (41,4)

0,0357*

Kriptogeni IMU, n

(%)

1 (12,5) 4 (30,8) 6 (35,3) 12

(52,2)

4 (44,4) 27 (38,6) 0,327

*statistička značajnost

NIHSS - National Institutes of Health Stroke Scale

IMU - ishemijski moţdani udar

mRS - modifikovana Rankinova skala

AVA - ateroskleroza velikih arterija

KE – kardioembolizam

OMA - okluzija malih arterija

RU - retki uzroci

NU - neutvrđeni uzroci

Prosečni NIHSS skor cele grupe iznosio je

4 (raspon 1-14) i nije se statistički značajno

menjao u toku analiziranog petogodišnjeg perioda

(p=0,324). Takođe, nije registrovana značajna

razlika u skoru funkcionalne onesobljenosti (mRS)

između pojedinih godina u toku analiziranog

petogodišnjeg perioda (p=0,148); prosečni mRS za

celu grupu iznosio je 1,3 (raspon 1-4).

Distribucija učestalosti različitih uzroka

IMU prema TOAST klasifikaciji za ceo

petogodišnji period prikazana je na Grafikonu 1.

Uprkos detaljnim ispitivanjima, uzrok IMU

klasifikovan je kao neutvrđen kod najvećeg broja

bolesnika (41,4%) (Grafikon 1). Ukupno 27/29

bolesnika iz grupe NU imao je kriptogeni IMU,

dok su dvojica bolesnika klasifikovani u grupu NU

jer su imali istovremeno dva uzroka IMU (AVA i

OMA) uz klasične vaskularne FR (Tabela 2).

78 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Grafikon 1. Distribucija uzroka IMU prema

TOAST klasifikaciji (vrednosti prikazane u

procentima).

AVA - ateroskleroza velikih arterija

KE - kardioembolizam

OMA - okluzija malih arterija

RU - retki uzroci

NU - neutvrđeni uzroci

Druga po učestalosti je grupa RU u kojoj je

kod petoro bolesnika dokazana disekcija arterija,

kod petoro neaterosklerotska arteriopatija tipa

moya-moya bolesti, kod četvoro tromboza venskih

sinusa mozga; po jedan bolesnik imao je

fibromuskularnu displaziju, antifosfolipidni

sindrom i paroksizmalnu noćnu hemoglobinuiju.

Analiza petogodišnjeg perioda pokazala je

tendenciju pada učestalosti KE sa p=0,031 dok je

učestalost ostalih mehanizama nastanka IMU bila

ista u toku celog petogodišnjeg perioda (Tabela 2).

Na Slici 1 prikazani su ilustrativni KT i

MR snimci bolesnika iz ispitivane grupe.

Slika 1. Ilustrativni snimci mozga prikazuju

različitu etiologiju IMU kod ispitivane grupe

bolesnika sa IMU <45 godina.

Legenda slike:

Slika A. Kompjuterizovana tomografija (KT)

mozga 28-godišnje bolesnice sa krioptogenim

uzrokom IMU u slivu leve srednje velikomoţdane

arterije (SVMA) (tanka crna strelica).

Slika B. KT angiografija krvnih sudova mozga

pokazuje visokostepenu stenozu leve SVMA kod

iste bolesnice (tanka bela strelica).

Slika C. Magnetna rezonancna (MR) mozga 44-

godišnjeg bolesnika takođe sa IMU nepoznatog

uzroka, T2 sekvenca, velika ishemijska lezija u

slivu desne SVMA (puna crna strelica).

Slika D. Tromboza levog transverzalnog sinusa

kod 24-godišnje bolesnice sa antifosfolipidnim

sindromom (puna bela strelica).

Učestalost vaskularnih FR prikazana je u

Tabeli 3. Najčešće prisutni FR bili su pušenje

(58,6%), hipertenzija (47,1%), hiperlipidemija

(38,6%) i porodična anamneza za IMU kod

srodnika prvog stepena (21,4%). Ni jedan bolesnik

nije imao atrijalnu fibrilaciju, koronarnu bolest niti

veštački srčani zalistak. Dva bolesnika imala su

udruţenu pojavu prolaznog foramena ovale sa

aneurizmom atrijalnog septuma. Kroz petogodišnji

period, učestalost FR bila je stabilna i nije se

značajno menjala, osim ređeg prisustva anamneze

o migreni bez aure (p=0,003).

79Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Tabela 3. Vaskularni faktori rizika po godinama za period 2008-2012.

Parametar 2008

(n=8)

2009

(n=13)

2010

(n=17)

2011

(n=23)

2012

(n=9)

Ukupno

(N=70)

p-

vrednos

t

Hipertenzija, n (%) 4 (50) 8 (61,5) 10

(58,8)

8 (34,8) 3 (33,3) 33

(47,1)

0,387

Dijabetes, n (%) 0 1 (7,7) 3 (17,6) 2 (8,7) 0 (0) 6 (8,6) 0,495

Prethodni IMU, n

(%)

1 (12,5) 1 (7,7) 2 (11,8) 0 (0) 2 (22,2) 6 (8,6) 0,321

Hiperlipidemija, n

(%)

4 (50,0) 8 (61,5) 6 (35,3) 6 (26,1) 3 (33,3) 27

(38,6)

0,284

Bolest zalistaka, n

(%)

1(12,5) 0 0 0 0 1 (1,4) 0,097

Atrijalna fibrilacija,

n (%)

0 0 0 0 0 0 /

Koronarna bolest

(infarkt miokarda), n

(%)

0 0 0 0 0 0 /

PFO, n (%) 0 2 (15,4) 1 (5,9) 0 1 (11,1) 4 (5,7) 0,329

ASA, n (%) 0 2 (15,4) 0 1 (4,4) 1 (11,1) 4 (5,7) 0,362

Kardiomiopatija, n

(%)

1 (12,5) 0 1 (5,9) 1 (4,4) 0 3 (4,3) 0,661

Bolest perifernih

arterija, n (%)

1 (12,5) 0 0 00 0 1 (1,4) 0,097

Aktivno pušenje, n

(%)

4 (50,0) 6 (46,2) 13

(76,5)

15 (65,2) 3 (33,3) 41

(58,6)

0,193

Alkoholizam, n (%) 0 1 (7,7) 3 (17,6) 3 (13,0) 0 7 (10,0) 0,507

Oralni kontraceptivi,

n (%)

0 0 1 (5,9) 1 (4,4) 0 2 (2,9) 0,803

Migrena bez aure, n

(%)

2 (25,0) 0 0 0 0 2 (2,9) 0,003*

Migrena sa aurom, n

(%)

0 0 1 (5,9) 1 (4,4) 1 (11,1) 3 (4,3) 0,723

IMU u srodnika 1.

stepena, n (%)

3 (37,5) 2 (15,4) 3 (17,6) 4 (17,4) 3 (33,3) 15

(21,4)

0,622

*statistička značajnost

IMU - ishemijski moţdani udar

PFO - prolazni foramen ovale

ASA - aneurizma atrijalnog septuma

80 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Diskusija

Rezultati našeg istraţivanja ukazuju da su

vaskularni FR i etiologija IMU prema TOAST

kalsifikaciji u periodu od poslednjih 5 godina bili

stabilni i bez bitne promene kod bolesnika mlađih

od 45 godina. Najčešći uzroci IMU u našoj grupi

odgovaraju iskustvima drugih autora iz raznih

populacija (2, 6, 8). U oko 40% bolesnika uprkos

detaljno sprovedenim ispitivanjima uzrok IMU

ostao je nepoznat, to jest radilo se o kriptogenom

uzroku IMU. Ovaj nalaz odgovara literaturnim

podacima i kod nas i u svetu gde se u ovoj grupi

nalazi 30-40% mlađih bolesnika sa IMU (2, 6 ,7,

10, 11). Zabeleţeni pad KE kao uzroka IMU teško

je tumačiti budući da se radi o relativno kratkom

praćenju (5 godina) te nije moguće generalizovati

ovaj nalaz.

Arterijske disekcije, prevashodno

ekstrakranijalnih arterija i druge ne-aterosklerotske

arteriopatije, kao i cerebralna venska tromboza,

pokazale su se u našoj grupi ispitanika kao i prema

iskustvima drugih autora, kao najčešći etiološki

faktori IMU kod mladih (2, 8, 10, 12). Sa razvojem

i većom pristupačnošću neurovizualizacionih

metoda, posebno upotrebe raznih angiografskih

tehnika, značajno su se povećale i mogućnosti

dijagnostikovanja retkih oboljenja. Ovo je i

verovatni uzrok zašto u našoj studiji beleţimo veću

učestalost nekih oboljenja u odnosu na rezultate

ranije studije u našoj populaciji (7). Tako, na

primer, u našoj grupi ispitanika postoji 29,4%

bolesnika sa disekcijom arterija, dok je samo njih

8,1% opisano u grupi RU u studiji Jovanović i

saradnika (7). Slični podaci i razlike postoje i za

dijagnozu ne-aterosklerotske arteriopatije tipa

moya-moya bolesti kao i cerebralne venske

tromboze.

Pušenje, hipertenzija i hiperlipidemija su i

dalje dominantni FR u našoj sredini, kao što je

registrovano i u radu Jovanovića i saradnika (7).

Zanimljivo je da se ovakvi podaci saopštavaju i u

drugim sredinama (6, 8, 13). Značaj ovih rezultata

je veliki, jer se radi o preventabilnim FR za IMU,

na koji se uspešno moţe delovati lekovima i

promenom stila ţivota (1). Relativno je česta bila i

pojava IMU kod srodnika prvog stepena, što bi

moglo ukazivati na nasledne bolesti krvnih sudova

mozga kao uzrok IMU (14). Iako su ovakve

porodice opisivane u našoj sredini, ni jedan ovakav

slučaj nije detektovan u analiziranoj grupi

bolesnika (15).

Glavno pitanje kod pojave IMU kod

mladih je prognoza oporavka posle iktusa i rizik

rekurentnog događaja. Kao i u starijoj populaciji,

podtip IMU utiče na ishod (16). Tako je pokazano

da bolesnici sa AVA i KE imaju najveći rizik

ponavljanog cerebrovaskualrnog događaja, što nije

slučaj sa OMA (16, 17). Rezultati više studija

svedoče da je dugoročna prognoza ishoda IMU

kod mladih bolesnika koji pripadaju grupi

kriptogenih IMU povoljna, jer je rizik za

rekurentni IMU nizak (17, 18).

Iako je broj bolesnika u našoj studiji

relativno mali u odnosu na druge radove, radi se o

relativno retkom fenomenu o kome je malo pisano

u domaćoj literaturi. Prednost našeg rada je u

dobro definisanoj i obrađenoj grupi ispitanika, jer

su u analizu uključeni samo bolesnici kod kojih je

u potpunosti sprovedeno potrebno ispitivanje

etiologije IMU.

U zaključku, nisu detektovane značajne

varijacije u učestalosti uzroka i FR za IMU kod

osoba mlađih od 45 godina u toku ispitivanog

petogodišnjeg perioda. Visoka učestalost

promenjivih FR kod mladih ukazuje na potrebu za

većom edukacijom javnosti o vaţnosti i

mogućnostima prevencije IMU.

Literatura

1. Ţivković M, Šternić N, Kostić V. Ishemijska

bolest mozga. Beograd: Zavod za udţbenike i

nastavna sredstva, 2000.

2. Chatzikonstantinou A, Wolf ME, Hennerici

MG. Ischemic stroke in young adults:

classification and risk factors. J Neurol

2012;259:653–9.

3. Naess H, Waje-Andreassen U, Thomassen L,

Nyland H, Myhr KM. Health-related quality

of life among young adults with ischemic

stroke on long-term follow-up. Stroke

2006;37:1232-6.

4. Sultan S, Elkind MSV. Stroke in young adults.

On the rise? Neurology 2012;79:1752-3.

5. Adams HP Jr, Bendixen BH, Kappelle LJ et

al. 3rd. Classification of subtype of acute

ischemic stroke. Definitions for use in a

multicenter clinical trial. TOAST. Trial of Org

10172 in Acute Stroke Treatment. Stroke

1993;24:35-41.

6. Varona JF, Guerra JM, Bermejo F, Molina JA,

Gomez de la Cámara A. Causes of ischemic

stroke in young adults, and evolution of the

etiological diagnosis over the long term. Eur

Neurol 2007;57:212-8.

81Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

7. Jovanović DR, Beslać-Bumbasirević L,

Raicević, Zidverc-Trajković J, Ercegovac

MD. Etiology of ischemic stroke among

young adults of Serbia. Vojnosanitetski

Pregled 2008;65:803-9.

8. Putaala J, Metso AJ, Metso TM, et al.

Analysis of 1008 consecutive patients aged 15

to 49 with first-ever ischemic stroke: the

Helsinki young stroke registry. Stroke

2009;40:1195-203.

9. Furie KL, Kasner SE, Adams RJ, et al;

American Heart Association Stroke Council,

Council on Cardiovascular Nursing, Council

on Clinical Cardiology, and Interdisciplinary

Council on Quality of Care and Outcomes

Research. Guidelines for the prevention of

stroke in patients with stroke or transient

ischemic attack: a guideline for healthcare

professionals from the american heart

association/american stroke association.

Stroke 2011;42:227-76.

10. Leys D, Bandu L, Hénon H, et al. Clinical

outcome in 287 consecutive young adults (15

to 45 years) with ischemic stroke. Neurology

2002;59:26-33.

11. Waje-Andreassen U, Thomassen L, Jusufovic

M, et al. Ischaemic stroke at a young age is a

serious event – final results of a population-

based long-term follow-up in Western

Norway. Eur J Neurol 2013;

doi:10.1111/ene.12073

12. Metso TM, Metso AJ, Salonen O, et al. Adult

cervicocerebral artery dissection: a single-

center study of 301 Finnish patients. Eur J

Neurol 2009;16:656-61.

13. Ferro JM, Massaro AR, Mas JL. Aetiological

diagnosis of ischaemic stroke in young adults.

Lancet Neurol 2010;9:1085-96.

14. Dichgans M. Genetics of ischaemic stroke.

Lancet Neurol. 2007 Feb;6(2):149-61.

15. Pavlovic AM, Dobricic V, Semnic R, et al. А

novel Notch3 Gly89Cys mutation in a Serbian

CADASIL family. Acta Neurol Belg 2013.

DOI : 10.1007/s13760-012-0174-2.

16. Paci M, Nannetti L, D'Ippolito P. Lombardi B.

Outcomes from ischemic stroke subtypes

classified by the Oxfordshire Community

Stroke Project: a systematic review. Eur J

Phys Rehabil Med 2011;47:19-23.

17. Redfors P, Jood K, Holmegaard L, Rosengren

A, Blomstrand C, Jern C. Stroke subtype

predicts outcome in young and middle-aged

stroke sufferers. Acta Neurol Scand

2012;126:329-35.

18. Arauz A, Murillo L, Márquez JM, et al. Long-

term risk of recurrent stroke in young

cryptogenic stroke patients with and without

patent foramen ovale. Int J Stroke 2012;7:631-

4.

82 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

UTICAJ RISPERIDONA NA KONCENTRACIJU I METABOLIZAM GLUTATIONA U

MOZGU PACOVA PERINATALNO TRETIRANIH FENILCIKLIDINOM

Autor: Matić Dušan1

Mentor: Prof. dr Nataša Petronijević2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak

Uvod: Risperidon, atipični antipsihotik

koristi se u lečenju shizofrenije. Perinatalno

tretiranje pacova fenciklidinom (PCP),

nekompetitivnim antagonistom NMDA receptora,

predstavlja jedan od najubedljivijih animalnih

modela shizofrenije. Pokazano je da ovakva

primena fenciklidina dovodi do smanjenja nivoa

glutationa (GSH) i posledičnog povećanja

oksidativnog stresa u centralnom nervnom sistemu

koji učestvuje u patofiziologiji shizofrenije.

Cilj: Ispitivanje uticaja risperidona na

koncentraciju i metabolizam glutationa kod

pacova, perinatalno tretiranih fenciklidinom.

Materijal i metode: Wistar pacovi, mužjaci,

podeljeni su u četiri grupe.Sve četiri grupe

životinja tretirane su perinatalno 2, 6, 9. i 12.og

postnatalnog (PN) dana i to dve sa 0,9%NaCl i

dve sa PCP-om (10 mg/kgTT). Prva grupa (NaCl

grupa) je perinatalno dobila NaCl, a druga (PCP

grupa) fenciklidin. Treća grupa (NaCl-RSP grupa)

je perinatalno primila NaCl, a 35.og PN dana je

započeta terapija risperidonom

(0,84mg/kg/TT/dan), koja je trajala 9 nedelja.

Četvrta grupa (PCP-RSP grupa) je perinatalno

primila PCP i ,takoĎe, 35.og PN dana započela

terapiju risperidonom na isti način kao i NaCl-

RSP grupa. Životinje su žrtvovane 100. PN dana.

U korteksu i hipokampusu odreĎivane su

koncentracije GSH i aktivnost glutation reduktaze

(GR), gama-glutamil-cistein ligaze (γ–GCL) i

glutation peroksidaze (GPx) spektofotometrijskim

metodama.

Rezultati: Dobijeni rezultati pokazali su da

PCP dovodi do značajnog smanjenja koncentracije

GSH i smanjenja aktivnosti enzima uključenih u

njegov metabolizam, dok primena risperidona

dovodi do normalizacije praćenih parametara.

Zaključak: Primena risperidona dovodi do

reverzije promena u metabolizmu GSH koje se

zapažaju posle perinatalnog tretmana PCP-om.

Ključne reči: Risperidon, GSH, GR, GPx, γ –GCL.

Abstract

Introduction: Risperidone, an atypical

antipsychotic, is used in treating schizophrenia.

Perinatal administration of phencyclidine (PCP),

a non-competitive antagonist of NMDA receptors,

is one of the most convincing animal models of

schizophrenia. It has been demonstrated that PCP

administration leads to the reduction of

glutathione levels and a subsequent increase in

oxidative stress in the central nervous system

which participates in the pathophysiology of

schizophrenia.

Aim of the study: Evaluating the influence

of risperidone on concentration and metabolism of

glutathione in rats perinataly treated with PCP.

Material and methods: Wistar male rats

were divided in four groups. All groups were

treated perinataly 2, 6, 9 and 12 postnatal (PN)

days, two of them with 0.9% NaCl and two with

PCP (10mg/kgTT). The first group (NaCl group)

perinataly received NaCl, and the second (PCP

group) received phencyclidine. The third group

(NaCl - RSP group) perinataly received NaCl

(s.c.) and on the 35th PN day started with perioral

risperidone (0,84mg/kg/day) treatment which

lasted for the following 9 weeks. PCP - RSP group

perinataly received phencyclidine (s.c.) and also

on the 35th PN day the perioral risperidone

treatment started in the same manner as in NaCl -

RSP group. Animals were sacrificed on the 100th

PN day. In the cortex and hippocampus GSH

concentrations, activities of GPx, GR and γ-

GCLwere determined using spectrophotometry

methods.

Results: The results show that PCP

significantly leads to the reduction of GSH level

and the reduction of activities of enzymes involved

in its metabolism, whereas the use of risperidone

leads to normalization of the parameters.

Conclusion: Risperidone treatment leads to

the reversion of disturbances in the glutathione

metabolism observed after perinatal phencyclidine

administration.

Key words: risperidone, GSH, GR, GPx, γ-GCL.

83Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Uvod

Shizofrenija, ozbiljna psihijatrijska bolest,

kompleksan je moždani poremećaj u kome se

abnormalnosti ispoljavaju u ranom odraslom

životnom dobu. Biohemijska priroda shizofrenije

još uvek nije potpuno razjašnjena. Brojni rezultati

ukazuju na prisustvo oksidativnog stresa i

oštećenje antioksidativnog odbrambenog sistema

kod obolelih od shizofrenije (1).

Fenciklidin (1-1-fenilcikloheksil piperidin,

phencyclidine, PCP) je sintetisan dvadesetih

godina XX veka. U upotrebu ulazi 1963. godine

kao nenarkotični, nebarbituratni anestetik (2).

Ubrzo je povučen iz humane upotrebe zbog

neželjenih dejstava i postao je poznat po

negativnim postoperativnim reakcijama poznatim

kao iznenadni fenomen (emergence phenomenon)

(3). Ovaj fenomen se karakterisao dezorjentacijom,

halucinacijama i paranojom, što je uslovilo

klasifikaciju fenciklidina u disocijativne

anestetike. Danas se PCP koristi u veterinarskoj

anesteziji i ilegalno kao narkotičko sredstvo

poznato pod imenom angel dust, hog (4).

Glavno dejstvo fenciklidin ostvaruje preko

glutamatskog NMDA receptora čiji je

nekompetitivni antagonista, a pored toga deluje i

na dopaminske, serotoninske, opioidne,

acetilholinske i GABA receptore (5). NMDA

receptorska hipofunkcija se smatra odgovornom za

nastanak shizofrenije i objašnjava pojavu

dijapazona simptoma (pozitivni, negativni i

neorganizovani), pojavu simptoma u ranoj

mladosti, strukturne promene u mozgu i

poremećaje kognicije (6). Rana perinatalna

primena fenciklidina prihvaćena je kao

eksperimentalni model shizofrenije (7,8), TakoĎe,

brojni literaturni podaci ukazuju da je oksidativni

stres uključen u patogenezu shizofrenije.

Oksidativni stres je stanje u kome postoji

disbalans izmeĎu produkcije reaktivnih slobodnih

radikala i antioksidativnog kapaciteta organizma.

Brojni dokazi upućuju na to da kod obolelih od

shizofrenije postoji povećana produkcija slobodnih

radikala i/ili smanjenje antioksidativne zaštite (9).

Risperidon se koristi za lečenje

shizofrenije, bipolarnog poremećaja i

bihejviolarnih poremećaja, kao i kod ljudi sa

autizmom ("Respiridone". The American Society

of Health-System Pharmacists. Retrieved 3 April

2011.). Odobren je od strane „United States Food

and Drug Administration (FDA)” 1993. godine

kao lek za lečenje shizofrenije. Klasifikovan je kao

antipsihotik sa relativno malom incidencom

ekstrapiramidalnih neželjenih efekata. Risperidon

je jedinstven po tome što ima visok afinitet za D2

receptore, a takoĎe, utiče i na serotoninske (5-HT)

receptore. Glavni neželjeni efekti su ataksija,

sedacija, insomnije, snižen krvni pritisak i dr. U

dve male studije pokazano je da se risperidon

može uspešno koristiti za lečenje simptoma

izazvanih fenciklidinom kod akutnih (10) i

hroničnih intoksikacija (11).

Glutation (γ-glutamincisteinglicin, GSH)

predstavlja glavni endogeni antioksidans koji

reguliše redukcioni status u živim tkivima delujući

na slobodne radikale i neutrališući ih. Smanjenje

nivoa glutationa prisutno je u cerebrospinalnoj

tečnosti i u prefrontalnom korteksu kod obolelih

od shizofrenije. Prethodna istraživanja pokazala su

da perinatalna primena fenciklidina dovodi do

značajnog smanjenja sadržaja GSH i promena u

aktivnosti enzima uključenih u njegov

metabolizam u mozgu mladih adultnih pacova

(12).

Glutation peroksidaza (GSH-Px) prisutna

je u gotovo svim ćelijama kičmenjaka i ima

funkciju da redukuje H2O2, hidroperoksidaze

masnih kiselina i druge peorkside u prisustvu

glutationa (GSH), pri čemu se glutation oksidiše

do oksidovanog glutationa (GSSG). Glutation

peroksidaza je selen-zavisan enzim i zastupljen je

u mnogim tkivima. Na aktivnost glutation

peroksidaze utiče sadržaj glutationa, aktivnost

glutation reduktaze i nivo NADPH (13).

Glutation reduktaza (GR) katališe redukciju

oksidovanog glutationa uz učešće NADPH, kao

koenzima. Glutation reduktaza je flavoprotein,

sastavljen od dve podjedinice. Ovaj enzim katališe

i redukciju drugih disulfida, koji nastaju reakcijom

glutationa i jedinjenja koja sadrže tiolne-SH grupe.

Glutation reduktaza, slično drugim reduktazama,

se inaktivira redukcijom sopstvenog elektron

donora (NADPH). Ova autoinaktivacija (od strane

NADPH) i reaktivacija sa GSSG imaju važnu

regulatornu ulogu. Aktivnost glutation reduktaze

odražava fiziološke potrebe ćelije. Značaj GR

ogleda se u održavanju visokog odnosa

GSH/GSSG, čime se obezbeĎuje neophodna

količina GSH za delovanje GSH-Px i glutation S-

transferaze (13).

84 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

γ -Glutamilcistein sintetaza (γ -GCS) je

ključni enzim biosinteze glutationa, zajedno sa

glutation reduktazom održava koncentraciju

glutationa u ćelijama. γ -Glutamilcistein sintetaza

katalizuje nastanak γ -glutamilcisteina iz

glutaminske kiseline i cisteina, a potom drugi

enzim, glutation sintetaza, katalizuje vezivanje

glicina sa postojećim dipeptidom. Opisani

mehanizam sinteze glutationa ima karakteristiku

da je nezavisan od iRNK, koji inače učestvuje u

sintezi drugih proteina. TakoĎe, specifična je i

veza glutaminske kiseline preko γ-C-atoma za

cistein, koja štiti glutation od inhibitora (14).

Cilj ovog istraživanja bio je da se ispita

uticaj peroralnog davanja atipičnog antipsihotika

risperidona na koncentraciju GSH i aktivnost GPx,

GR i y-GCL u mozgu pacova perinatalno tretiranih

fenciklidinom.

Materijal i metode

Životinje

Četiri skotne ženke Wistar pacova uzete su

u isto vreme, u 14-om danu trudnoće. Životinje su

smeštane individualno, u posebnim žičanim

kavezima smeštenim u životinjskom vivarijumu sa

kontrolisanom temperaturom, i ciklusima 12:12h

svetlo/mrak. Hrana i voda su bile dostupne ad

libium tokom kompletnog eksperimenta. Dvanaest

časova nakon roĎenja, mladunci iz različitih legla

su pomešani, a onda nasumično rasporeĎeni

ženkama na dojenje. Dan roĎenja je uzet kao

postnatalni (PN) dan 0. Životinje su tretirane 2, 6,

9 i 12-og PN dana, sa fenciklidinom (PCP, dve

grupe) ili fiziološkim rastvorom (NaCl 0,9%, dve

grupe). PCP (Sigma, Sent Luis, MO) je rastvoren u

0,9% fiziološkom rastvoru (0,001 g/ml) i

ubrizgavan je subkutano (s.c.) u interskapularni

region (10 mg/kg TT). Doza i vreme primene

tretmana usvojeni su iz objavljenih studija

(5,15,12). Kod kontrolnih grupa fiziološki rastvor

je ubrizgan s.c. u istoj zapremini kao i PCP.

Mladunci su zadržani u istim leglima i dojenje je

prekinuto 30-og PN dana, kada su odvojeni od

ženki i razdvojeni prema polu. U ovu strudiju

uključeni su samo mužjaci.

U studiju su uključene četiri grupe mužjaka

pacova:

1) NaCl grupa – kontrola – perinatalna

primena NaCl (n=9); sirćetna kiselina je

dodata pijaćoj vodi u istoj koncentraciji

koja je korišćenja za rastvaranje

risperidona.

2) PCP grupa – pacovi perinatalno

tretirani PCP-om primena (n=6);

sirćetna kiselina je dodata pijaćoj vodi

kao kod grupe 1.

3) NaCl-RSP grupa – perinatalna primena

NaCl (n=7); Ova grupa je 35-og PN

dana počela da dobija risperidon (RSP)

(Alkaloid, Skoplje) u dozi 0,84

mg/kg/dan (17,18,19). Lek je unošen

oralno, kroz vodu za piće tokom devet

nedelja. Antipsihotik je rastvoren u 0,1

M sirćetnoj kiselini i nakon toga

razblažen (u razmeri 1:100) za dnevni

unos kroz vodu za piće (20). Doziranje

lekova zasnovano je na prosečnom

dnevnom unosu tečnosti i na osnovu

težine životinja.

4) PCP-RSP grupa – prenatalna primena

PCP (n=7). nakon koje je sledila

terapija respiridonom opisana u okviru

tretmana prethodne eksperimentalne

grupe

Pacovi su žrtvovani 100. PN dana

cervikalnom dislokacijom i dekapitacijom, a glave

su odmah nakon toga uranjane u tečni azot, a zatim

čuvane na temperaturi od -85 o

C. Izdvajani su

korteks i hipokampus. Nakon izolacije uzorci su

homogenizovani u saharoznom medijumu i zatim

centrifugirani 15min. na 3000 rmp. Supernatant je

izdvojen dok je talog resuspendovan u 0,5ml

saharoznog medijuma i centrifugiran 15min. na

3000 rpm. Nakon toga supernatanti su spojeni, a

talog je odbačen. Spojeni supernatanti su

centrifugirani 30min. na 14000 rpm. Izdvojen

supernatant je korišćen za odreĎivanje

koncentracije GSH i aktivnosti enzima GR, GPx i

γGCL.

Sardržaj redukovanog glutationa (GSH)

odreĎivan je spektofotometrijski upotrebom 5,5-

ditiobis-2-nitrobenzoeve kiseline (DTNB)

takozvani Ellman-ov reagens (21). DTNB reaguje

sa alifatičnim tiol jedinjenjima pri pH 8.0

stvarajući p-nitrofenol anjon žute boje. Intezitet

nastale boje koristi se za odreĎivanje koncentracije

GSH očitavanjem ekstinkcije na spektofotometru

na 412nm. Postupak odredjivanja sadržaja

redukovanog glutationa je da se deproteiniziran

uzorak sa 10% sulfosalicilnom kiselinom u odnosu

2:1 se snažno promeša i centrifugira 20 min na

6000 rmp. Dobijeni supernatant koristi se u daljem

85Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

postupku. U epruvetu se sipa 400μL 0,4M TRIS-

HCl pufer (pH 8.9), 800μL vode, 90μL uzorka i

10μL DTNB. Slepa proba sadrži sve komponente

kao i proba, zamenjujući uzorak sa dodatnih 90μL

0,4M TRIS-HCl puferom (pH 8.9). Sadržaj

epruveta promeša se i nakon 20min. očita se

ekstinkcija na 412nm (ekstinkcioni koeficijent

ε=13,600). Sadržaj GSH izračunava se po formuli:

sadržaj GSH/mg proteina = (Eprobe-Esl.probe)/

ε*1/Cp*1,5. Oznaka Cp u formuli označava

koncentraciju proteina u analiziranom uzorku

(mg/mL).

OdreĎivanje aktivnosti glutation reduktaze

vršeno je po metodi Carlberg and Mannervik

(1985). Metoda se zasniva na reakciji oksidovanog

glutationa sa NADPH u prisustvu GR iz uzorka.

Potrošnja NADPH se prati spektrofotometrijski na

340nm (ekstinkcioni koeficijent ε=0,0062) i

proporcionalna je aktivnosti GR. Reakciona smeša

bez uzorka se preinkubira 30min na 30oC, po

dodatku uzorka se inkubira 3min i nakon toga se

prati ekstinkcija na 340nm u toku 3min. Dok proba

(880μL 0,2M K-fosfatni pufer + 2nM EDTA pH

7.0, 50μL 2mM NADPH, 50μL 20mM oksidovani

glutation, 20μL uzorka) i slepa proba (930μL 0,2M

K-fosfatni pufer + 2nM EDTA pH 7.0, 50nL 2mM

NADPH, 20nL uzorka) sadrže uzorak, slepa proba

(900μL 0,2M K-fosfatni pufer + 2nM EDTA pH

7.0, 50μL 2mM NADPH, 50μL 20mM oksidovani

glutation) ne sadrži. Aktivnost enzima se

izračunava po formuli: GR/mg proteina = ∆E/ε

*Vsmeše/Vuzorka*1/Cp; ∆E = Eprobe-Esl.probe.

OdreĎivanje aktivnosti glutation

peroksidaze metoda zasniva se na oksidaciji

redukovanog glutationa (GSH) sa iskorišćavanjem

NADPH u reakciji koju katalizuje enzim glutation

reduktaza. Promena ekstinkcije (smanjenje) pri

340nm (ekstinkcioni koeficijent ε=0,0062) kao

posledica potrošnje NADPH+H+

(22) predstavlja

meru aktivnosti glutation peroksidaze u vezanoj

reakciji u kojoj učestvuje glutation reduktaza. Pri

340nm i temperaturi 37Co prati se promena

ekstinkcije po dodatku terc-butilhidroperoksida (t-

BOOH) za probu (50μL uzorka, 820μL 0,2M

HEPES-a + 2mM EDGA pH7,4, 20μL100mM

GSH, 20μL 8mM NADPH, 100μL 20U/mL

glutation reduktaze, 20μL t-BOOH) i slepa proba

(870μL 0,2M HEPES-a + 2mM EDGA pH7,4,

20μL100mM GSH, 20μL 8mM NADPH, 100μL

20U/mL glutation reduktaze, 20 μL t-BOOH)

nakon 2min od pripreme u toku 4-6min kada se

postigne najbolja linearnost. Postupak je identičan

i za slepu probu (50μL uzorka, 840μL 0,2M

HEPES-a + 2mM EDGA pH7,4, 20μL100mM

GSH, 20μL 8mM NADPH, 100μL 20U/mL

glutation reduktaze) i slepu probu (890μL 0,2M

HEPES-a + 2mM EDGA pH7,4, 20nL100mM

GSH, 20nL 8mM NADPH, 100μL 20U/mL

glutation reduktaze) samo kod njih se meri po

dodatku 8mM NADPH(15). Aktivnost enzima se

izračunava po formuli: GSH-Px/mg = ∆E/ε

*Vsmeše/Vuzorka*1/Cp; ∆E = Eprobe-Esl.probe.

OdreĎivanje aktivnosti γ -glutamil-cistein

sintetaze odreĎuje se u reakcionoj smeši koja

sadrži L-glutamat, L-α-aminobutirat i ATP,

pomoću kuplovane enzimske reakcije u kojoj se

brzina formiranja ADP-a u prisustvu piruvat

kinaze, laktat dehidrogenaze, fosfoenol piruvata i

NADH meri kao smanjenje ekstinkcije na 340nm

kao posledica potrošnje NADH. L-α-aminobutirat

se koristi umesto L-cisteina (23). Za jedan uzorak

uzeli smo 550nL reagensa 1 (0,2M TRIS + 4mM

EDTA, pH8.0) i po 50μL reagensa 2-7 (0,3M KCl,

0,4M MgCl2, 100mM ATP, 40mM

fosfoenolpiruvat, 200mM l-glutamat, 200mM , L-

α-aminobutirat) i po 25μL reagensa 8 i 9 (4nM

NADH, 10U/mL piruvat kinaze) i dodali 50μL

uzorka. Posle postizanja reakcione temperature

prati se brzina oksidacije NADH kao pad

apsorpcije na 340nm, tokom 3 minuta. Slepa proba

sadrži sve reakcione komponente izuzev enzima,

umesto koga je dodat reagens 1. Aktivnost enzima

se izračunava po formuli: γ-GCS /mg proteina =

∆E/ε *Vsmeše/Vuzorka*1/Cp; ∆E = Eprobe-

Esl.probe.

Rezultati

Risperidon, atipični antipsihotik, kod

pacova tretiranih fenciklidinom uticao je na

koncentraciju redukovanog glutationa, aktivnost

glutation reduktaze, glutation peroksidaze i γ -

glutamil-cistein sintetaze. Koncentracija

redukovanog glutationa u korteksu i hipokampusu

kod sve četiri grupe prikazana je u prilogu I i II.

Zapaža se da i u korteksu i hipokampusu pacova

koji su tretirani fenciklidinom dolazi do statistički

značajnog smanjenja u koncentraciji GSH u

odnosu na grupu koja je tretirana sa NaCl. Tretman

risperidonom dovodi do normalizacije sadržaja

GSH u mozgu životinja.

86 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Grafikon 1. Prikazani rezultati koncentracije

redukovanog glutationa u korteksu kod sve četiri

grupe pacova; * statistički značaja razlika

koncentrecije GSH kod PCP grupe (n=6) u odnosu

na NaCl grupu (n=9), p<0.05; ζ statistički značajna

razlika koncentracije GSH kod PCP-Rsp grupe

(n=7) u odnosu na PCP grupu (n=6), p<0.05.

Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ±

standardna greška.

Grafikon 2. Prikazani rezultati koncentracije

redukovanog glutationa u hipokampusu kod sve

četiri grupe pacova. * statistički značaja razlika

koncentrecije GSH kod PCP grupe (n=6) u odnosu

na NaCl grupu (n=9), p<0.05; ζ statistički značajna

razlika koncentracije GSH kod PCP-Rsp grupe

(n=7) u odnosu na PCP grupu (n=6), p<0.05;

Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ±

standardna greška.

Aktivnost glutation reduktaze kod sve četiri

grupe pacova prikazana je u prilogu III i IV. U

korteksu i hipokampusu pacova perinatalno

tretiranih PCP-om zapaža se statistički značajno

smanjenje aktivnosti enzima, dok primena

risperidona dovodi do vraćanja aktivnosti GR na

vrednost u kontrolnoj grupi.

Grafikon 3.Prikazani rezultati aktivnosti glutation

reduktaze u korteksu kod sve četiri grupe pacova.

* statistički značaja razlika aktivnosti GR kod PCP

grupe (n=6) u odnosu na NaCl grupu (n=9),

p<0.05; ζ statistički značajna razlika aktivnosti GR

kod PCP-Rsp grupe (n=7) u odnosu na PCP grupu

(n=6), p<0.05; Vrednosti su izražene kao srednja

vrednost ± standardna greška.

Grafikon 4. Prikazani rezultati aktivnosti glutation

reduktaze u hipokampusu kod sve četiri grupe

pacova. * statistički značaja razlika aktivnosti GR

kod PCP grupe (n=6) u odnosu na NaCl grupu

(n=9), p<0.05; ζ statistički značajna razlika

aktivnosti GR kod PCP-Rsp grupe (n=7) u odnosu

na PCP grupu (n=6), p<0.05; Vrednosti su izražene

kao srednja vrednost ± standardna greška.

Aktivnost γ -glutamil-cistein sintetaze u

korteksu i hipokampusu kod sve četiri grupe

87Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

pacova prikazana je u prilogu V i VI. Kod PCP

grupe u odnosu na NaCl zapaža se značajno

smanjenje u aktivnosti ovog enzima. Primena

risperidona dovela je do vraćanja aktivnosti i ovog

enzima na vrednost u kontrolnoj grupi čime je

potvrĎen pozitivan efekat ovog leka na

metabolizam glutationa kod pacova tretiranih

fenciklidinom.

Grafikon 5. Prikazani rezultati aktivnosti γ-

glutamil-cistein sintetaze u korteksu kod sve četiri

grupe pacova. * statistički značaja razlika

aktivnosti γ-GCL kod PCP grupe (n=6) u odnosu

na NaCl grupu (n=9), p<0.05; ζ statistički značajna

razlika aktivnosti γ-GCL kod PCP-Rsp grupe

(n=7) u odnosu na PCP grupu (n=6), p<0.05;

Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ±

standardna greška.

Grafikon 6. Prikazani rezultati aktivnosti γ-

glutamil-cistein sintetaze u hipokampusu kod sve

četiri grupe pacova. * statistički značaja razlika

aktivnosti γ-GCL kod PCP grupe (n=6) u odnosu

na NaCl grupu (n=9), p<0.05; ζ statistički značajna

razlika aktivnosti γ-GCL kod PCP-Rsp grupe

(n=7) u odnosu na PCP grupu (n=6), p<0.05;

Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ±

standardna greška.

Tokom istraživanja u okviru ove studije

došli smo do rezultata da ne postoji statistički

značajna razlika u aktivnosti glutation peroksidaze

u korteksu i hipokampusu pacova tretiranih

fenciklidinom perinatalno u odnosu na one koji su

nakon perinatalne primene fenciklidina primali

risperidon.

Diskusija

Oksidativni stres je posledica neravnoteže

izmeĎu prooksidantnog i antioksidantnog sistema.

Višak oksidativnih produkata, zbog povećanog

stvaranja slobodno-radikalskih vrsta i/ili

neefikasnosti antioksidativnog sistema, mogu

oštetiti polinezasićene masne kiseline u lipidnim

membranama neurona, uzrokujući oštećenje

fluidnosti i propustljivosti membrane, gubitak

membranskog integriteta, neuronsku disfunkciju i

smrti ćelije (24). Visok sadržaj masti u samom

mozgu i slaba mogućnost reparacije DNK čine

mozak veoma osetljivim na ćelijski oksidativni

stres (25).

Nivo redukovanog glutationa (GSH) može

delovati kao neuroprotektivni faktor prilikom

izlaganja oksidativnom stresu (26). Nizak nivo

GSH nije faktor koji će odrediti početak psihoza,

ali povećava rizik od pojave psihoza kod osoba

izloženih oksidativnom stresu (27). Promena

koncentracije GSH, promena aktivnosti enzima

vezanih za metabolizam glutationa (γ-GCL, GPx,

GR), kao i promene u aktivnosti SOD i nivou

lipidnih peroksida su pokazane kao dugotrajni

efekat perinatalne primene PCP-a (12). Različite

promene parametara oksidativnog stresa su

pokazane u eritrocitima i plazmi pacijenata

obolelih od shizofrenije. Povećanje aktivnosti

superoksid dizmutaze i smanjena aktivnost

glutation peroksidaze eritrocita prisutni su kod

pacijenata obolelih od shizofrenije koji nisu bili

podvrgnuti terapiji (28).

Naši rezultati su potvrdili postojanje

značajnog smanjenja sadržaja GSH u mozgu

pacova perinatalno tretiranih PCP-om i pokazali da

za taj nalaz može biti odgovorno smanjenje

aktivnosti γ-GCL, enzima ključnog za sintezu

88 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

GSH (14), kao i enzima GR koji je odgovoran za

održavanje glutationa u redukovanom obliku (13).

Dalje, naše istraživanje je prvo koje je na

fenciklidinskom animalnom modelu pokazalo da

davanje atipičnog antipsihotika risperidona dovodi

do normalizacije i nivoa GSH i aktivnosti enzima

uključenih u njegov metabolizam, osim aktivnosti

glutation peroksidaze za koju nismo uočili

značajnu razliku izmeĎu grupa. Poznato je da

antipsihotici prve generacije ispoljavaju

neurotoksičnost koja se manifestuje povećanjem

nivoa lipidnih peroksida u plazmi pacijenata

obolelih od shizofrenije, dok antipsihotici druge

generacije dovode do značajno manjih promena

nivoa lipidnih peroksida. Nedavna studija Zhang i

sar. (2012) pokazala je da dvonedeljni prekid

terapije dovodi do povećanja aktivnosti SOD i

nivoa azot monoksida (NO) u krvi obolelih od

shizofrenije, kao i da i tipični i atipični

antipsihotici posle 12 nedelja od početka ponovne

primene u terapiji, dovode do reverzije ovih

promena.

Iz svega navedenog može se zaključiti da

razumevanje uloge oksidativnog stresa u

patogenezi shizofrenije može biti od velikog

značaja za pronalaženje adekvatnih terapijskih

protokola. Pretpostavlja se da redoks disregulacija

može formirati središte gde genetski i egzogeni

faktori konvergiraju uzrokujući poremećaj

neurološkog razvoja koji može imati odlučujuću

ulogu u nekim oblicima shizofrenije (29).

Literatura

1. Raffa M, Mechri A, Othman LB, Fendri C,

Gaha L, Kerkeni A. Decreased glutathione

levels and antioxidant enzyme activities in

untreated and treated schizophrenic

patients. Prog Neuropsychopharmacol Biol

Psychiatry. 2009; 33(7):1178-83.

2. Johnson KM, Phillips M, Wang C,

Kevetter GA.,J Neurosci Chronic

phencyclidine induces behavioral

sensitization and apoptotic cell death in the

olfactory and piriform cortex Res. 1998;

52(6): 709-22.

3. Greifenstein Fe, Devault M, Yoshitake J,

Gajewski. A study of a 1-aryl cyclo hexyl

amine for anesthesia.Anesth Analg. 1958;

37(5): 283-94.

4. Morris BJ, Cochran SM, Pratt JA. PCP:

from pharmacology to modelling

schizophrenia Curr Opin Pharmacol. 2005;

5(1): 101-106.

5. Adams SM, de Rivero Vaccari JC,

Corriveau RA. Pronounced cell death in the

absence of NMDA receptors in the

developing somatosensory thalamus. J

Neurosci 2004; 24(42): 9441-50

6. Olney JW, Farber NB. NMDA antagonists

as neurotherapeutic drugs, psychotogens,

neurotoxins, and research tools for

studying schizophrenia.

Neuropsychopharmacology. 1995; 13(4):

335-45.

7. Javitt DC, Zukin SR. Recent advances in

the phencyclidine model of schizophrenia

Am J Psychiatry. 1991; 148(10): 1301-8.

8. Nagai T, Noda Y, Une T, Furukawa K,

Furukawa H, Kan QM et al. Effect of AD-

5423 on animal models of schizophrenia:

phencyclidine-induced behavioral changes

in mice. Neuroreport. 2003; 10;14(2):269-

72.

9. Pavlovic D., Tamburic V., Stojanovic et al.

Oxidative stres as marker of positive

syimtoms in schizophrenia. Medicine and

Biology 2002; 9 (2) : 157-161.

10. Giannini, GL Colapietro, DK Cook.

Risperidone therapy in phencyclidine

intoxication, Society for Neuroscience

Abstracts. 1996; 22:77.12.

11. JF Gabbert,AJ Giannini.

Dopaminergic/serotonergic actions of

phencyclidine as a model for schizophrenia

psychosis. American Journal of

Therapeutics. 4:159-164.

12. Nevena V. Radonjić, Iva D. Knežević,

Urosh Vilimanovich, Tamara Kravić-

Stevović, Ljiljana V. Marina, Tatjana

Nikolić, et al. Decreased glutathione levels

and altered antioxidant defense in an

animal model of schizophrenia: Long-term

effects of perinatal phencyclidine

administration Neuropharmacology 2010;

58: 739-745.

13. Kozić A.,Popović M., Ivetić V., Pilija V.,

praxis medica activates of glutation

peroxidase, gluthation and glutation

reductase in healthy and diabetes patients

2002; 30 (1-2): 13-20.

14. Baldi F., Vaughan M.A., Olson J.g.,

Chromium resistant yeasts isolated from a

sawage treatment plant receiving tannery

89Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

wastes. Applied and Environmental

Microbiology, 1990; 56 (4): 913-918.

15. Ikonomidou,C.,Bosch,F.,Miksa,M.,Bittaga

u,P.,Vockler,J.,Dikranian,K. et al.

Blockade of NMDA receptors and

apoptotic neurodegeneration in the

developing brain.Science 1999; 283:70-74.

16. Giannini, GL Colapietro, DK Cook.

Risperidone therapy in phencyclidine

intoxication, Society for Neuroscience

Abstracts. 1996; 22:77.12.

17. Schotte, A., Janssen, P.F., Gommeren, W.,

Luyten, W.H, Van Gompel, P., Lesage,

A.S., De Loore, K., Leysen,

J.E..Risperidone compared with new and

reference antipsychotic drugs: in vitro and

in vivo receptor binding.

Psychopharmacology 1996; 124: 57–73.

18. Kapur, S., VanderSpek, S.C, Brownlee,

B.A, Nobrega, J.N. Antipsychotic dosing in

preclinical models is often unrepresentative

of the clinical condition: a suggested

solution based on in vivo occupancy. J.

Pharmacol. Exp. Ther. 2003; 305: 625–31.

19. Choi, Y.K., Gardner M.P., Tarazi, F.I.

Effects of risperidone on glutamate

receptor subtypes in developing rat brain.

Eur. Neuropsychopharmacol. 2009; 19:

77–84.

20. Terry, A.V. Jr, Gearhart, D.A., Warner,

S., Hohnadel, E.J., Middlemore, M.L.,

Zhang, G., Bartlett, M.G., Mahadik, S.P.

Protracted effects of chronic oral

haloperidol and risperidone on nerve

growth factor, cholinergic neurons, and

spatial reference learning in rats.

Neuroscience 2007; 150:413–24.

21. Ellman, G.L. Tissue sulfhydryl groups.

Archives of Biochemistry and Biophysics

1959; 82: 70-77.

22. Günzler, W.A., Kremers, H., Flohé, L., An

improved coupled test procedure for

glutathione peroxidase (EC 1-11-1-9) in

blood. Zeitschrift für klinische Chemie und

klinische Biochemie 1974; 12: 444-448.

23. Seelig, GF., Meister, A., Glutathione

biosynthesis; gamma-glutamylcysteine

synthetase from rat kidney. Methods in

Enzymology 1985; 113: 379-390.

24. Akyol, O., Herken, H., Uz, E., Fadillioglu,

E., Unal, S., Sogut, S. The indices of

endogenous oxidative and antioxidative

processes in plasma from schizophrenic

patients. The possible role of

oxidant/antioxidant imbalance. Prog.

Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry

2002; 26 (5): 995–1005.

25. Padurariu, M., Ciobica, A., Dobrin, I.,

Stefanescu, C. Evaluation of antioxidant

enzymes activities and lipid peroxidation in

schizophrenic patients treated with typical

and atypical antipsychotics. Neurosci. Lett.

2010; 479 (3): 317–320.

26. Eack, S.M., Hogarty, G.E., Cho, R.Y.,

Prasad, K.M., Greenwald, D.P., Hogarty,

S.S. Neuroprotective effects of cognitive

enhancement therapy against gray matter

loss in early schizophrenia: results from a

2-year randomized controlled trial. Arch.

Gen. Psychiatry 2010; 67 (7): 674–682.

27. Do, K.Q., Trabesinger, A.H., Kirsten-

Krüger, M., Lauer, C.J., Dydak, U.

Schizophrenia: glutathione deficit in

cerebrospinal fluid and prefrontal cortex in

vivo. European Journal of Neuroscience

2000; 12: 3721-3728.

28. Abdalla, D.S., Monteiro, H.P., Oliveira,

J.A., Bechara, E.J.,Activities of superoxide

dismutase and glutathione peroxidase in

schizophrenic and manic-depressive

patients. Clinical Chemistry 1986; 32: 805-

807.

29. Do, K.Q., Cabungcal, J.H., Frank, A.,

Steullet, P., Cuenod, M. Redox

dysregulation, neurodevelopment, and

schizophrenia. Curr. Opin. Neurobiol.

2009; 19 (2): 220–230.

90 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

POJAVA SRČANE INSUFICIJENCIJE KOD BOLESNIKA SA AKUTNIM INFARKTOM

MIOKARDA SA ST ELEVACIJOM LEČENIH PRIMARNOM PERKUTANOM

KORONARNOM INTERVENCIJOM

Autori: Irena Oštrić1, Andrija Pavlović

1

Mentor: 2

doc. dr Milika Ašanin

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Urgentni Centar Kliničkog Centra Srbije

Sažetak

Uvod: Srčana insuficijencija (SI) je česta

komplikacija akutnog infarkta miokarda sa ST

elevacijom (STEMI).

Cilj: Testiranje prediktora za pojavu SI

tokom hospitalizacije kod bolesnika sa STEMI

lečenih primarnom perkutanom koronarnom

intervencijom (pPCI).

Materijal i metode: Ova studija obuhvata

169 bolesnika sa STEMI lečenih u Urgentnom

centru. Bolesnici su podeljeni u grupu sa srčanom

insuficijencijom (SI) (n=27) i grupu bez SI (n=142).

Grupe su poređene primenom χ2 i Studentovog t-

testa i, a prediktori za pojavu SI su analizirani

primenom univarijantne i multivarijantne logističke

regresije.

Rezultati: Bolesnici sa SI su bili stariji

(p=0,01), češće su imali prethodni infarkt miokarda

(IM) (p=0,018), više vrednosti srčane frekvence

(p=0,001), leukocita (p=0,024) i glikemije na

prijemu (p=0,043) i niže vrednosti ejekcione frakcije

leve komore (EFLK) (p<0,001). Multivarijantnom

logističkom regresionom analizom nađeno je da su

najznačajniji prediktori pojave SI niže vrednosti

EFLK (OR=0,888, 95%CI=0,840-0,940, p<0,0001),

prethodni IM (OR=6,570, 95%CI=1,119-38,567,

p=0,037) i više vrednosti glikemije na

prijemu(OR=1,140, 95%CI=1,019-1,275, p=0,022).

Zaključak: Najznačajniji nezavisni prediktori

za pojavu SI tokom hospitalizacije kod bolesnika sa

STEMI lečenih pPCI su niže vrednosti EFLK,

prethodni IM i više vrednosti glikemije na prijemu.

Ključne reči: Srčana insuficijencija, akutni infarkt

miokarda sa ST elevacijom, primarna perkutana

koronara intervencija.

Abstract

Background: Heart failure is a common

complication in patients with acute myocardial

infarction with ST elevation (STEMI).

Aim: We aimed at identifying the predictors

of heart failure (HF) during hospitalization in

patients with STEMI treated by primary

percutaneous coronary intervention (pPCI).

Materials and methods: This study includes

169 patients with STEMI treated at the Emergency

Centre. Patients have been divided into two groups:

patients with HF (n=27) and those without HF

(n=142).

Results: Patients with HF were older

(p=0,01), had previous myocardial infarction (MI)

(p=0,018), higher heart rate (p=0,001), leukocyte

(p=0,024) and glycaemia levels on admission

(p=0,043) and lower ejection fraction of the left

ventricle (EFLV) (p<0,001). Multivariant predictors

of HF during the hospitalisation were lower EFLV

(OR=0,888, 95%CI=0,840-0,940, p<0,0001), a

previous MI (OR=6,570 , 95%CI=1,119-38,567,

p=0,037) and hyperglycaemia on admission

(OR=1,140 , 95%CI=1,019-1,275, p=0,022).

Conclusions: Patients with lower EFLV, a

previous MI and hyperglycaemia on admission are

more likely to develop congestive HF during the

hospitalisation for STEMI treated by pPCI.

Key words: heart failure, acute myocardial

infarction with ST elevation, primary percutaneous

coronary intervention.

Uvod

Srčana insuficijencija (SI) je česta

komplikacija akutnog infarkta miokarda (AIM). (1)

Ishemijska bolest srca je vodeći uzrok nastanka SI,

pri čemu je veličina nekrotičnog dela miokarda usko

povezana sa funkcijom leve komore. (2)

Kongestivna srčana slabost sa disfunkcijom leve

komore može se javiti u svim kliničkim oblicima

akutnog koronarnog sindroma, ali je najčešća kod

bolesnika sa AIM sa ST elevacijom (STEMI) (2,3)

SI može natati i usled električnih (poremećaja

srčanog ritma) ili mehaničkih komplikacija AIM

91Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

poput novonastale mitralne regurgitacije ili defekta

komorskog septuma.

Studije su pokazale da pacijenti koji u sklopu

akutne faze STEMI razviju SI imaju lošiju

kratkoročnu i dugoročnu prognozu.(4) Uvođenjem

primarne perkutane koronarne intervencije (pPCI)

kao metode izbora u lečenju AIM u prvih 12 časova,

postiže se brza i kompletna reperfuzija infarktne

arterije, smanjuje se zona nekroze miokarda i

omogućava očuvanje funkcija leve komore (5), čime

se postiže bolje preživljavanje pacijenata. Studije

poput Global Registry of Acute Coronary Events

(GRACE) (3) i Olmsted County (6) registruju čestu

pojavu SI tokom hospitalizacije bolesnika sa STEMI.

Ipak, tačna incidenca, prevalenca i vreme potrebno

da se SI razvije nakon AIM nisu dovoljno poznati.

Cilj našeg istraživanja je testiranje prediktora

za pojavu SI tokom hospitalizacije kod bolesnika sa

STEMI lečenih pPCI.

Materijal i metode

Naše istraživanje je opservaciona,

retrospektivna studija koja je uključila populaciju od

169 bolesnika sa STEMI lečenih pPCI u Koronarnoj

jedinici Urgentnog centra Kliničkog centra Srbije.

Bolesnici su podeljeni u dve grupe, bolesnike koji su

razvili SI (SI grupa) (n=27) i one koje nisu imali SI

(NSI grupa) (n=142).

Dijagnoza STEMI postavljena je na osnovu

kriterijuma: prisustva anginoznih tegoba u trajanju

duže od 20 minuta, postojanja elevacije ST segmenta

više od 2mm u najmanje 2 susedna odvoda u

anteriornim odnosno 1 mm u standardnim odvodima

i povišenih kardiospecifičnih enzima.

PPCI su rađene po standardnoj metodi, a

pacijenti su pre intervencije dobijali udarne doze

aspirina 300mg i klopidogrela 600mg. Doza

održavanja bila je aspirin 100 mg i klopidogrel 75

mg.

Posmatrani su klinički i laboratorijski

parametri: starost, pol, dijabetes melitus,

hiperlipidemija, hipertenzija, pušenje, raniji infarkt

miokarda (IM), pozitivna porodična anamneza,

lokalizacija STEMI, vreme proteklo od početka

simptoma do prijema, srčana frekvenca pri prijemu,

pojava atrijalne fibrilacije i komorskih aritmija,

atrioventrikularnog bloka, vrednosti leukocita,

glikemije, kreatinina, kreatin kinaze (CKMB) i

srčanog troponina I (CTNI). Pri prijemu, procenjen

je stepen srčane insuficijencije na osnovu

klasifikacije po Killip-u. Vrednosti ejekcione frakcije

leve komore (EFLK) određene su

dvodimenzionalnom ehokardiografijom po

Simsponu. (7) Određivan je i broj suženih krvnih

sudova, tip stenta koji je pacijentu ugrađen prilikom

pPCI i pojava instent tromboze.

U obradi podataka korišćene su metode

deskriptivne statistike χ2-test i Studentov T-test, kao i

univarijantna i multivarijantna logistička regresija.

Vrednosti p<0,05 uzimane su za statistički značajne,

dok su vrednosti za p<0,01 uzimane za statistički

visoko značajne. Odabrani interval poverenja (CI)

iznosio je 95%. Testovi su izvedeni programom

SPSS 15.0 za Windows.

Rezultati

Osnovne karakteristike naših bolesnika sa

STEMI podeljenih u dve grupe: sa razvojem SI

tokom hospitalizacije i bez SI su prikazane u Tabeli

1.

Tabela 1. Osnovne karakteristike u pacijenata sa STEMI lečenih pPCI sa razvojem SI (SI grupa) i bez SI

(NSI)

GRUPA 1 (SI) (n=27) GRUPA 2 (NSI)

(n=142) P

Starost (godina) 62,27±10,10 57,00±9,30 0,010*

Muški pol (%) 74,1 67,2 0,651

Dijabetes melitus (%) 23,1 13,4 0,231

Hiperlipidemija (%) 28,0 44,0 0,183

Hipertenzija(%) 80,8 61,2 0,073

Pušenje (%) 63,6 70,3 0,618

Raniji IM (%) 19,2 4,5 0,018*

Porodična anamneza (%) 36,0 27,4 0,463

Anteriorni AIM(%) 40,7 23,7 0,093

92 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

VT+VF (%) 11,5 15,0 0,769

Aritmija absoluta(%) 3,8 1,5 0,417

AV3 blok (%) 11,5 2,3 0,056

Vreme do prijema (min) 244,04±203,98 196,62±127,98 0,124

Srčana frekvenca (1/min) 85,00±20,79 73,54±14,23 0,001*

Leu na prijemu (x109/L) 12,47±3,73 11,06±2,71 0,024*

Glikemija na prijemu (mmol/L) 10,03±4,87 8,37±3,58 0,043*

Kreatinin (mmol/L) 101,42±17,09 94,18±17,15 0,051

MDRD 65,86±12,28 71,57±13,64 0,059

CKMB 24h (U/L) 192,16±178,57 133,35±119,05 0,063

CTNI 24h (g/L) 96,88±91,02 63,27±61,03 0,058

EFLK (%) 39,67±9,46 49,10±8,40 0,000*

Mitralna regurgitacija (%) 92,0 80,2 0,252

Višesudovna koronarna bolest (%) 61,9 56,4 0,810

BMS (%) 95,2 93,5 1,000

Instent tromboza (%) 4,8 2,7 0,504

Legenda: IM= akutni infarkt miokarda, VT+VF= udruženost ventrikularne tahikardije i ventrikularne

fibrilacije, AV blok= atrioventrikularnog blok, Leu=leukociti na prijemu,

MDRD (Modification of Diet in Renal Disease): formula za izračunavanje klirensa kreatinina

eGFR = 175 x (Standardized Scr)-1.154

x (age)-0.203

x (0.742 if female) x (1.212 if African American),

CKMB= Kreatinkinaza mioglobin, CTNI= srčani troponin I, EFLK=ejekciona frakcija leve komore, BMS

=bear metal stent.

Iz studije su isključeni bolesnici koji su pri

prijemu imali SI. Tako, SI se u toku hospitalizacije

javila kod 27 (16,8%) bolesnika; i to 81%

bolesnika imalo je SI klase II, 18% klase III a

samo 1% je imalo klasu IV po Killipu.

Bolesnici sa SI bili su stariji (p=0,010),

češće su imali prethodni IM (p=0,018), više

vrednosti srčane frekvence (p=0,001), leukocita

(p=0,024) i glikemije na prijemu (p=0,043) i niže

vrednosti EFLK određene metodom po Simpsonu

(p<0,001) nego pacijenti u kontrolnoj grupi.

Rezultati univarijantne i multivarijantne

logističke regresione analize za određivanje

nezavisnih prediktora za pojavu SI tokom

hospitalizacije prikazani su u Tabeli 2.

Tabela 2: Univarijantna i multivarijantna analiza nezavisnih prediktora pojave SI tokom hospitalizacije

pacijenata sa STEMI lečenih pPCI

Univarijantna analiza Multivarijantna analiza

OR 95%CI P OR 95%CI P

Starost 1,060 1,013-1,109 0,012*

Raniji IM 5,079 1,422-18,148 0,012* 6,570 1,119-38,567 0,037*

Srčana frekvenca 1,047 1,018-1,076 0,001*

Leu na prijemu 1,172 1,018-1,349 0,028*

Glu na prijemu 1,097 0,999-1,204 0,052 1,140 1,019-1,275 0,022*

EFLK 0,888 0,839-0,940 <0,0001* 0,888 0,840-0,940 <0,0001*

Legenda:

IM= akutni infarkt miokarda, Leu= leukociti na prijemu, Glu= vrednosti glikemije na prijemu,

EFLK=ejekciona frakcija leve komore

93Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Multivarijantnom logističkom regresionom

analizom nađeno je da su najznačajniji prediktori

pojave SI niže vrednosti EFLK (OR=0,888,

95%CI=0,840-0,940, p<0,0001), prethodni IM

(OR=6,570 , 95%CI=1,119-38,567, p=0,037) i

više vrednosti glikemije na prijemu (OR=1,140 ,

95%CI=1,019-1,275, p=0,022).

Diskusija

Srčana insuficijencija javlja se kod 10-40%

svih registrovanih STEMI (8,9) U našem

istraživanju SI je komplikovala klinički tok 16,8%

bolesnika sa STEMI lečenih pPCI.

Pojava SI tokom hospitalizacije češća je

kod starijih, bolesnika sa ranije preležanim AIM i

udruženim faktorima rizika (arterijska hipertenzija,

poremećenaj metabolizama glukoze,

hiperlipoproteinemija, gojaznost, pušenje i fizička

neaktivnost) koji dovode do razvoja

aterosklerotičnog oboljenja koronarnih arterija i SI.

(10)

Među našim bolesnicima, razlika u

godinama između grupe sa SI (62,27±10,10

godina) i kontrolne grupe (57,00±9,30 godina)

bila je statistički značajna (p=0,010). Istraživanja

pokazuju da je veća učestalost SI i drugih

neželjenih dodađaja nakon STEMI kod starijih

bolesnika češće odraz postojanja komorbiditeta i

udruženih faktora rizika koji prati ovaj uzrast, nego

uticaj samih godina starosti. (11,12) Posebno se

ističe značaj pridružene arterijske hipertenzije,

koja u našem istraživanju nije pokazala statistički

značajnu razliku između grupa sa i bez SI.

Poremećaj glikoregulacije je čest pratilac

AIM a povećava i rizik za nastanak SI. Bolesnici

sa dijabetes melitusom češće obolevaju od SI. Kod

njih je veća učestalost arterijske hipertenzije i

hiperlipoproteinemije pa se i koronarna

ateroskleroza brže razvija i ima teži oblik.

Autonomna disfunkcija, koja je čest pratilac

dijabetesa, pogoršava bubrežnu, plućnu i endotelnu

funkciju što ubrzava nastanak SI. (7,13) Među

našim ispitanicima bilo je više dijabetičara u grupi

sa SI nego bez SI, a vrednosti glikemije određene

pri prijemu pacijanata sa STEMI bile su statistički

značajno više u grupi sa SI nego u kontrolnoj

grupi. Hiperglikemija na prijemu bila je nezavistan

prediktror pojave SI u multivarijantnoj logističkoj

regresionoj analizi.

Studije pokazuju da je disfunkcija leve

komore teža ukoliko postoji predhodni IM.

(14,15,16). I među našim bolesnicima koji su

tokom hospitalizacije razvili SI bilo je više onih

koji su imali prethodni IM. To se može objasniti

tesnom povezanošću veličine nekrotičnog dela

miokarda sa funkcijom leve komore (10). Veličina

infarkta zavisi od broja izmenjenih koronarnih

arterija, stepena suženja i polja koje vaskularizuju.

Kardiomiociti koji su bili zahvaćeni ranijom

ishemijom podležu procesu nekroze i njihova

kontraktilnost se gubi. Tada

se u ekstracelularnom matriksu miokarda nalazi

veća količina kolagena tipa 1. Porast nivoa

matriksnih metaloproteinaza u AIM, stimuliše

pojačanu sintezu kolagena a usporava njegovu

razgradnju čime postepeno sve veći deo miokarda

podleže procesu fibroze. Ove promene u veličini,

obliku i debljini zidova i promerima leve komore

označene su kao „remodelovanje leve komore“.

One se mogu otkriti i pratiti primenom

ehokardiografije i magnetne rezonance. Za

procenu funkcije leve komore se najčešće koristi

ehokardiografija, i to metoda po Simsponu kao

najpreciznija metoda za ishemijsku bolest srca. (7)

Više od 50% pacijenata u razvijenim zemljama sa

SI nakon AIM ima pad EFLK. (16) I naši pacijenti

sa SI su imali značajno nižu EFLK u odnosu na

pacijente bez SI. Progresiju bolesti podstiče pojava

novih ishemičnih događaja sa aktivacijom

neurohumoralnih mehanizama (sistem renin-

andiotenzin-aldosteron i aktivnost simpatikusa),

koji pokušavaju da održe funkciju miokarda. (18)

Primena pPCI u AIM, kao terapija izbora,

postiže brzu reperfuziju infarktne arterije, smanjuje

zonu nekroze miokarda i oštećenje funkcije leve

komore. (5). Uprkos tome, pPCI ne sprečava

pojavu srčane insuficijencije. Studije su pokazale

da postoje različiti pokazatelji neželjenog ishoda

bolesnika nakon pPCI.(19) Prema rezultatima

Zeymer i saradnika (20), nezavisni prediktori

bolničkog mortaliteta kod bolesnika sa STEMI

lečenih pPCI bili su: srčana insuficijencija i razvoj

kardiogenog šoka, duži vremenski interval od

početka bolova do pPCI i visoke vrednosti

glikemije.

Najznačajniji nezavisni prediktori za

pojavu SI tokom hospitalizacije kod naših

bolesnika sa STEMI lečenih pPCI su bile niže

vrednosti EFLK, prethodni IM i više vrednosti

glikemije na prijemu. Njihovo blagovremeno

otkrivanje obezbediće bolji klinički tok i ishod

pacijenata sa STEMI lečenih pPCI.

94 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Literatura:

1. Iraqi W, Rossignol P, Angioi M, Fay R,

Nuée J, Marie J: Extracellular Cardiac

Matrix Biomarkers in Patients With Acute

Myocardial Infarction Complicated by Left

Ventricular Dysfunction and Heart Failure :

Insights From the Eplerenone Post−Acute

Myocardial Infarction Heart Failure

Efficacy and Survival Study (EPHESUS)

Study. Circulation 2009; 119: 2471-2479.

2. Hellermann JP, Jacobsen SJ, Gersh BJ et

al. Heart failure after myocardial

infarction:a review. American Journal of

medicine 2002; 113: 324-330.

Steg PG, Dabbous OH, Feldman LJ,

Cohen-Solal A, Aumont MC, López-

Sendón J et al.; for the Global Registry of

Acute Coronary Events (GRACE)

Investigators:Determinants and Prognostic

Impact of Heart Failure Complicating

Acute Coronary Syndromes Observations

From the Global Registry of Acute

Coronary Events (GRACE), Circulation

2004; 109: 494-499.

3. Van de Wer F, Bax J, Betriu A,

Blomstrom-Lundqvist C, Crea F, Falk V

et al. The Task Force on the management

of ST-segment elevation acute myocardial

infarction of the European Society of

Cardiology: ESC GUIDELINES:

Management of acute myocardial infarction

in patients presenting with persistent ST-

segment elevation European Heart Journal

2008; 29: 2909–2945.

4. Keeley CE, Hillis LD. Primary PCI for

Myocardial Infarction with STSegment

Elevation. N Engl J Med 2007; 356:47-54

5. Senni M, Tribouilloy CM, Rodeheffer RJ,

Jacobsen SJ, Evans JM, Bailey KR et al.

Congestive Heart Failure in the

CommunityA Study of All Incident Cases

in Olmsted County, Minnesota, in 1991:

Circulation 1998; 98: 2282-2289

6. Stamm RB, Carabello BA, Mayers DL,

Martin RP: Two-dimensional

echocardiographic measurement of left

ventricular ejection fraction: Prospective

analysis of what constitutes an adequate

determination

7. Weir RA, McMurray JJ, Velazquez EJ.

Epidemiology of heart failure andleft

ventricular systolic dysfunction after acute

myocardial infarction: prevalence, clinical

characteristics, and prognostic importance.

Am J Cardiol. 2006;97:13F–25F.

8. Velagaleti RS, Pencina MJ, Murabito JM,

Wang TJ, Parikh NI, D'Agostino RB et al.

Long-Term Trends in the Incidence of

Heart Failure After Myocardial Infarction,

Circulation 2008;118:2057-2062;

9. Borlaug BA, Paulus WJ: Heart failure with

perserved ejection fraction:

pathophysiology, diagnosis and treatment;

European Heart Journal 2011;32,670-679.

10. Gaw A, Healthy ageing: addressing acute

coronary syndrome? European Heart

Journal 2001, N11- N15

11. Mehta RH, Granger CB, Alexander KP,

Bossone E, White HD, Sketch MH:

Reperfusion Strategies for Acute

Myocardial Infarction in the

Elderly:Benefits and Risks Journal of the

American College of Cardiology Vol. 45,

No. 4, 2005 ISSN 0735-1097/05.

12. Bartnika M, Ryde L, Ferraric R,

Malmberga K et al. The prevalence of

abnormal glucose regulation in patients

with coronary artery disease across Europe

The Euro Heart Survey on diabetes and the

heart, European Heart Journal (2004) 25,

1880–1890.

13. Stewart S, MacIntyre K, Hole DJ,

Capewell S, McMurray JJ. More

'malignant' than cancer? Five-year survival

following a first admission for heart failure.

J Heart Fail 2001;3:315-322

14. Chen J, Normand SL, Wang Y, Krumholz

HM. National and regional trends in heart

failure hospitalizationand mortality rates

for Medicare beneficiaries, 1998-2008.

JAMA 2011;306:1669-1678.

15. Mosterd A, Hoes AW. Clinical

epidemiology of heart failure. Heart 2007;

93:1137-1146.

16. Jhund PS, McMurray JJ. Heart Failure

After Acute Myocardial Infarction-A Lost

Battle in the War on Heart Failure?

Circulation 2008;118: 2019-2021

17. Seferović P, Ristić A, Vasiljević Z,

Deljanin Ilić M, Lapčević M, Dodić S et al.

Nacionalni vodič dobre kliničke prakse za

dijagnostikovanje i lečenje srčane

insuficijencije, 2012.

18. French JK, Armstrong PW, Cohen E,

Kleiman NS, O'Connor CM, Hellkamp

95Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

AS, et al. Cardiogenic shock and heart

failure post-percutaneous coronary

intervention in ST-elevation myocardial

infarction: observations from "Assessment

of Pexelizumab in Acute Myocardial

Infarction".Am Heart J. 2011

Jul;162(1):89-97. doi:

10.1016/j.ahj.2011.04.009.

19. Zeymer U, Vog A, Zahn R, et al. Predictors

of in-hospital mortality in 1333 patients

with acute myocardial infarction

complicated by cardiogenic shock treated

with primary percutaneous coronary

intervention (PCI). Eur Heart J 2002;

25:322-328

96 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

UTICAJ VITAMINA D3 I DEHIDROASKORBINSKE KISELINE NA POKAZATELJE OKSIDATIVNOG STRESA U

KORTEKSU I HIPOKAMPUSU PUSTINJSKIH MIŠEVA IZLOŽENIH PROLAZNOJ GLOBALNOJ ISHEMIJI MOZGA

Autori: Zlatko Pravdić1, Đurđa Jovanović

1

Mentor: Asist. dr Tatjana Nikolić, dr Milica Velimirović2

1 Medicinki fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak: Uvod: Vitamin D3 je prohormon, koji u

CNS-u ostvaruje neuroprotektivnu,

imunomodulatornu i antiinflamatornu ulogu.

Protektivnu ulogu u CNS-u ispoljava i oksidovana

forma vitamina C – dehidroaskorbinska kiselina

(DHA). Cilj: Cilj ovog istraživanjabio je ispitivanje

uticaja vitamina D i dehidroaskorbinske kiseline

na sadržaj malondialdehida (MDA), aktivnost

enzima superoksid dizmutaze (SOD) i katalaze

(CAT), u mozgu pustinjskih miševa izloženih

prolaznoj globalnoj ishemiji mozga.

Materijal i metode: Pustinjski miševi,

starosti 8 nedelja, bili su podeljeni u 5 grupa: I grupa – kontrolna; II grupa - ishemija

reperfuzija (I/R); III grupa – I/R+vit D3; IV grupa

–I/R+DHA; V grupa – I/R+vit D3+DHA. Aktivna

forma vitamina D (1,25(OH)2D3) aplikovana je

(1μg/kg na dan, i.p.) tokom 8 dana pre izlaganja

ishemiji. DHA je aplikovana jednokratno 30 min

pre ishemije (50 mg/kg, i.p.). Ishemija je izvedena

podvezivanjem obe zajedničke karotidne arterije

tokom 10 minuta. Reperfuzija je trajala 24 časa, a

zatim su životinje žrtvovane. U uzorcima

moždanog tkiva navedeni parametri određivani su

spektrofotometrijskim metodama.

Rezultati: Pokazano je visoko statistički

značajno povećanje sadržaja MDA u korteksu i

hipokampusu u grupama I/R, I/R+DHA i I/R+vit

D3+DHA. Uočena je visoko, statistički značajna

razlika u aktivnosti SOD, među eksperimentalnim

grupama u korteksu i hipokampusu . Postoji

visoko, statistički značajno smanjenje aktivnosti

CAT u korteksu u grupama I/R+DHA i I/R+vit

D3+DHA u odnosu na kontrolnu i I/R. Statistički

visoko, značajno smanjenje aktivnosti CAT

prisutno je u hipokampusu u svim grupama u

odnosu na kontrolnu grupu. Zaključak: Primena aktivnog oblika

vitamina D3 vrši zaštitu u I/R oštećenju dok DHA

pokazuje prooksidativnu aktivnost.

Ključne reči: vitamin D, dehidroaskorbinska

kiselina, ishemija mozga, oksidativni stres,

pustinjski miševi.

Abstract: Introduction: Vitamin D3 is a prohormone,

which has neuroprotective, immunomodulating

and anti - inflammatory effects on the CNS. The

oxidised form of vitamin C – dehydroascorbic acid

(DHA) also has a protective effect on the CNS.

Aim: The aim of this study was to

investigate the effects of vitamins D and

dehydroascorbic acid to the content of malonyl

dialdehyde (MDA), the activity of the enzyme

superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT),

in the brains of gerbils exposed to transient global

cerebral ischemia.

Materials and methods: Eight – week - old

gerbils were divided into 5 groups: I group –

control, II group - ischemia reperfusion (I/R); III

group - I/R+vit D3; IV group - I/R+DHA; V group

-I/R+vit D3+DHA. The active form of vitamin D

(1,25(OH)2D3) was administrated

intraperitoneally (i.p.) on a daily basis for 8 days

before ischemia at a dose of 1 μg/kg. DHA was

applied once, 30 min before ischemia (50 mg/kg,

ip). Ischemia was achieved by ligation of both

common carotid arteries for 10 minutes.

Reperfusion lasted for 24 hours, after which the

animals were sacrificed. The indicators of

oxidative stress from the samples of brain tissue

were determined by spectrophotometry.

Results: Statistically significant increase in

MDA content in the cortex and hippocampus was

demonstrated in groups I/R, I/R+DHA and I/R+vit

D3+DHA. А significant increase in SOD activity

was shown in experimental groups compared to

the control group, both in the cortex and the

hippocampus. CAT activity was decreased in the

cortex of groups I/R+DHA and I/R+vit D3+DHA

compared to the control and I/R. Also, a decrease

in CAT activity in the hippocampus was present in

all the groups compared to the control group.

97Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Conclusion: Application of vitamin D3

showed protective effect in I/R injury while DHA

acted as a prooxidant.

Key words: vitamin D, dehydroascorbic acid,

brain ischemia, oxidative stress, gerbils.

Uvod

Prema podacima Svetske zdravstvene

organizacije, moždanu udar je na drugom mestu

uzroka smrti, remeti kvalitet života i često dovodi

do trajne onesposobljenosti odrasle populacije (1).

Najčešće nastaje kao posledica ishemije moždanog

tkiva. Globalna prolazna ishemija predstavlja

kratkotrajni prekid dotoka krvi u mozak. Nagli pad

energetskih rezervi usled ishemije, u roku od

nekoliko sekundi do minuta, pokreće ishemijsku

kaskadu koja dovodi do poremećaja energetskog

metabolizma (2), ekscitotoksičnosti usled

oslobađanja glutamata (3), naglog ulaska jona

kalcijuma koji dovode do aktivacije kataboličkih

enzima (4) i oksidativnog stresa. Ishemijska

kaskada prouzrokuje oštećenja ćelijske membrane,

smrt neurona, mikrovaskularna oštećenja,

disfunkciju krvno-moždane barijere, inflamaciju

(1), acidozu i edem (5). Jednom, kada ishemija

nastupi, potrebno je u što kraćem vremenskom

periodu ponovo uspostaviti cirkulaciju da bi

ishemijska povreda bila što manja. Pri

uspostavljanju cirkulacije, u ishemičnoj zoni

dolazi do oslobađanja slobodnih radikala iz

oštećenih ćelija kao i iz nakupljenih zapaljenskih

ćelija (1, 6). Mozak je posebno osetljiv na ishemične

uslove jer zahteva velike količine kiseonika.

Poseduje velike količine nezasićenih masnih

kiselina, a pri tom ima slab antioksidativni

kapacitet (7,8). Do sada je pokazano da

antioksidanti, kao što su, vitamin E, omega-3

masne kiseline i melatonin imaju neuroprotektivan

efekat nakon izlaganja I/R oštećenju (8). Vitamin C je hidrosolubilni vitamin koji se

javlja u dva oblika kao askorbinksa kiselina (AK) i

njena oksidovana forma - dehidroaskorbinska

kiselina (DHA). Poseduje snažan redukujući

potencijal, lakše se oksiduje (predaje elektrone) od

drugih supstanci, dobar je antioksidant (9),

inaktivator je superoksidnog anjona (10),

hidroksilonog jona i različitih peroksida.

Regeneriše redukovani oblik vitamina E, koji štiti

membrane od peroksidacije (11), redukuje

glutation (GSH) (12). U mozgu, vitamin C je

najvećim delom prisutan u svom oksidovanom

obliku kao dehidroaskorbinska kiselina (DHA).

Krvno-moždanu barijeru prolazi kroz transportere

za glukozu u DHA obliku (10). Pokazano je da

DHA ima protektivnu, antioksidativnu ulogu u

eksperimentalnom modelu ishemije (8). Vitamin D3 je liposolubilni prohormon.

Nastaje u epidermalnom sloju kože pod dejstvom

UVB zračenja. Za aktivaciju, potrebna je

dvostepena reakcija hidroksilacije u jetri i

bubrezima kada se prevodi u 1,25(OH2)D3 (13,14).

Ima značajnu ulogu u održavanju koštanog,

imunog sistema i paratireoidnog hormona.

Dosadašnje studije pokazale su da su smanjene

koncentracije 25-OH-vitD povezane sa povećanim

rizikom od ishemijskog moždanog udara opštoj

populaciji (15). U centralom nervnom sistemu

1,25(OH2)D3 preko receptora za vitamin D (VDR)

eksprimiranog na neuronima i gliji ostvaruje

neuroprotektivni, imunomodulatorni i

antiinflamatorni efekat (8, 14, 13). Cilj eksperimenta bio je ispitivanje uticaja

pretretmana vitaminom D i dehidroaskorbinskom

kiselinom na pokazatelje oksidativnog stresa u

hipokampusu i korteksu pustinjskih miševa koji su

bili izloženi desetominutnoj prolaznoj ishemiji

mozga i 24-časovnom periodu reperfuzije. S ovim

ciljem su, u ispitivanim strukturama, određivani

sadržaj lipidnih peroksida (malondilaldehid-MDA)

i aktivnosti enzima superoksid-dizmutaze (SOD) i

katalaze (CAT).

Materijal i metode

Eksperimentalne životinje: Korišćeni su

pustinjski miševi (Meriones Unguiculatus),

muškog pola, prosečne težine oko 65g, starosti 8

nedelja, odgajani u standardnim laboratorijskim

uslovima, na konstantnoj temperaturi prostorije i

sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Tretiranje životinja: Životinje su podeljene

u 5 grupa: I grupa je kontrolna (n=6), životinje su

bile izložene hirurškoj proceduri, suture nisu

postavljane; II grupa bila je izložena procesu

ishemije reperfuzije (I/R) (n=5); III grupa je

tretirana vitaminom D + I/R (n=6); IV grupa je

tretirana dehidroaskorbinskom kiselinom + I/R

(n=7); V grupi su aplikovani vitamin D i

dehidroaskorbinska kiselina i I/R (n=6). Tretman

aktivnom formom vitamina D (1,25 (OH)D3) u

dozi 1μg/kg na dan (i.p.) trajao je 8 dana pre

98 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

izlaganja ishemiji (8). Dehidroaskorbinska kiselina

(DHA) aplikovana je jednokratno, 30 min pre

ishemije u dozi 50 mg/kg (i.p.) (10). Ishemija je izvodjena podvezivanjem obe

a. carrotis communis tokom 10 minuta, nakon

čega su suture uklonjene. Reperfuzija je trajala 24

časa. Životinje su zatim žrtvovane cervikalnom

dislokacijom i dekapitacijom. Glave su trenutno

zamrzavane u tečnom azotu, a zatim čuvane na -

85◦C.

Priprema uzoraka: Dorzolateralni frontalni

korteks i hipokampus su izolovani i na hladno

homogenizovani u saharoznom medijumu (2,5 ml i

2,25 ml respektivno). Homogenizovanje je vršeno

teflonskim tučkom. Odvojene i homogenizovane

strukture mozga su centrifugirane na 3000 obrtaja

tokom 15 minuta. Surepernatant (S1) je odvajan u

epruvetu za centrifugiranje i čuvan na +4ºC. Talog

je resuspendovan u 0,5 mL saharoznog medijuma i

centrifugiran na 3000 obrtaja tokom 15 minuta.

Supernatant (S2) je spajan sa supernatantom S1 i

centrifugiran na 14000 obrtaja 30 minuta. Ovako

dobijeni supernatant (S3) koji predstavlja

neprečišćenu sinaptozomalnu frakciju korišćen je

za određivanje stepena lipidne peroksidacije i

aktivnosti enzima SOD i CAT. Stepen lipidne peroksidacije određivan je

na osnovu sadržaja MDA u sinaptozomalnoj

frakciji korteksa i hipokampusa (16).

Tiobarbituratna kiselina (TBA) reaguje sa MDA

stvarajući obojeni kompleks. Količina stvorenog

MDA meri se spektrofotometrijski na 533nm.

Koncentracija proteina određivana je po metodi

Lowry-a(17). Aktivnost SOD određivana je kao procenat

inhibicije autooksidacije adrenalina u baznoj

sredini (18). Aktivnost ukupne SOD određivana je

kinetički, kao promena ekstinkcije u vremenu (10

minuta) na talasnoj dužini od 480nm.

Aktivnost CAT određivana je po metodi

Goth i sar. (19). Prati se potrošnja H2O2 koji sa

amonijum molibdatom gradi jedinjenje žute boje

čiji se intezitet meri spekrofotometrijski na 405

nm.

Statistička analiza: Dobijene vrednosti

statistički su analizirane ANOVA testom uz

korišćenje Fisherovog LSD testa za post hoc

analizu. Verovatnoća od p<0,05 smatrana je

statistički značajnom, a verovatnoća od p<0,01

smatrana je statistički visoko značajnom. Rezultati

su prikazivani grafički stubičastim dijagramima u

programu OriginPro 8.1.

Rezultati

Rezultati pokazuju da postoji statistički

značajna razlika u sadržaju MDA među

eksperimentalnim grupama u korteksu

(F4,29=3,132, p<0,05) (Grafikon 1). Takođe, postoji

statistički visoko značajna razlika u sadržaju MDA

među eksperimentalnim grupama u hipokampusu

(F4,27=5,983, p<0,01) (Grafikon 2). Primenom post

hoc analize pokazano je značajno povećanje

sadržaja MDA u korteksu u I/R grupi (p<0,05),

I/R+DHA grupi (p<0,01) i u I/R+vit D3+DHA

grupi (p<0,05) u odnosu na kontrolnu grupu.

Primenom post hoc analize pokazano je značajno

povećanje sadržaja MDA u hipokampusu u I/R

grupi (p<0,05), I/R+DHA grupi (p<0,01) i u

I/R+vit D3+DHA grupi (p<0,01) u odnosu na

kontrolnu grupu.

Postoji statistički visoko značajna razlika u

aktivnosti SOD među eksperimentalnim grupama

u korteksu (F4,26=5,838, p<0,01) (Grafokon 3).

Takođe, postoji statistički visoko značajna razlika

u aktivnosti SOD među eksperimentalnim

grupama u hipokampusu (F4,26=7,450, p<0,01)

(Grafikon 4). Primenom post hoc analize pokazano

je značajno povećanje aktivnosti SOD u korteksu u

I/R grupi (p<0,05), I/R+DHA grupi (p<0,01) i u

I/R+vit D3+DHA grupi (p<0,01) u odnosu na

kontrolnu grupu; takođe, postoji smanjenje

aktivnosti SOD u I/R+vit D3 grupi (p<0,05) u

odnosu na I/R grupu i povećanje u I/R+vit

D3+DHA grupi (p<0,05) u odnosu na I/R+vit D3

grupu. U hipokampusu je post hoc analizom

pokazano povećanje aktivnosti SOD u svim

grupama p<0,05) u odnosu na kontrolu, kao i viša

aktivnost SOD (p<0,05) u I/R+DHA grupi u

odnosu na I/R i I/R+vit D3 grupe.

99Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

100 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Postoji statistički visoko značajna razlika u

aktivnosti CAT među eksperimentalnim grupama

u korteksu (F4,24=6,270, p<0,01) (Grafikon 5).

Takođe, postoji statistički visoko značajna razlika

u aktivnosti CAT među eksperimentalnim

grupama u hipokampusu (F4,26=8,138, p<0,01)

(Grafikon 6). Primenom post hoc analize pokazano

je značajno smanjenje aktivnosti CAT u korteksu u

I/R+DHA grupi (p<0,01) i u I/R+vit D3+DHA

grupi (p<0,01) u odnosu na kontrolnu grupu, kao i

značajno smanjenje aktivnosti CAT u korteksu u

I/R+DHA grupi (p<0,05) i u I/R+vit D3+DHA

grupi (p<0,05) u odnosu na I/R grupu. Primenom post hoc analize pokazano je visoko

značajno smanjenje aktivnosti CAT u

hipokampusu u svim grupama (p<0,01) u odnosu

na kontrolnu grupu.

Diskusija

Rezultati studije pokazuju da

desetominutna globalna prolazna ishemija, nakon

perioda reperfuzije u trajanju od 24 sata, dovodi do

značajnog povećanja sadržaja MDA u obe

ispitivane strukture mozga u odnosu kotrolnu

grupu. Pretretman vitaminom D3 deluje

protektivno u odnosu na ovu promenu, dok

primena dehidroaskorbinske kiseline dovodi do još

izraženijeg povećanja sadržaja MDA. Takođe,

primena dehidroaskorbinske kiseline uzrokuje

značajno, ali manje izraženo povćanje sadržaja

MDA u ispitivanim strukturama i kod životinja

koje su pre ishemije i reperfuzije bile tretirane

vitaminom D3. Ovi rezultati ukazuju na zaštitno

delovanje pretretmana vitaminom D3 ali i na

prooksidativno delovanje jednokratne aplikacije

dehidroaskorbinske kiseline u dozi od 50 mg/kg,

na primenjenom modelu ishemije mozga. Naši

rezultati se donekle razlikuju u odnosu na rezultata

Ekici i sar. koji su ispitivali uticaj pretretmana

vitaminom D i dehidroaskorbinskom kiselinom na

oksidativni stres u korteksu i strijatumu pacova

posle devedesetominutne prolazne fokalne

ishemije mozga i 2 h reperfuzije. Ovi autori su

našli da samostalna primena dehidroaskorbinske

kiseline i vitamina D nema efekat na povećanje

lipidnih peroksida, ali da primena oba vitamina

zajedno dovodi do smanjenja sadržaja ovih

pokazatelja oksidativnog stresa. Ove razlike

verovatno su posledica različitog trajanja ishemije

i reperfuzije u našim modelima. Takođe, doza

dehidroaskorbinske kiseline (250mg/kg) koju su

primenili Ekici i saradnici, bila je veća od doze

aplikovane u našem eksperimentu. Pojedina

istraživanja pokazala su da vitamin C, u zavisnosti

od dužine tretmana i primenjene doze, može da

101Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

ima pro- i antioksidativni efekat. Vitamin C,

tokom biosintetskih ili antioksidativnih reakcija,

predaje elektron i prevodi se u askorbični radikal

(AR) koji, u interakciji sa molekularnim

kiseonikom (O2), dovodi do produkcije

kiseoničnog superanjona (O2•), vodonik peroksida

(H2O2) i dehidroaskorbinske kiseline (DHA) (20,

21). Smatra se da AR može dovesti do redukcije

Fe3+

i Cu2+

jona, koji će dalje posredovati u

produkciji hidroksilnog radikala (OH•) (22). Song i

sar. (23) dokazali su da prooksidativna aktivnost

vitamina C u tkivu mozga nije posredovana

Fentonovom reacijom. Dokazano je da vreme

trajanja tretmana sa DHA utiče na nivo

oksidativnog stresa. Naime, inkubacija kortikalnog

tkiva sa DHA u trajanju od 20 min do 2 sata

podstiče razvoj apoptoze, dok 36-časovna

inkubacija sa DHA dovodi do snažne inhibicije

ćeliske smrti. Pored zavisnosti od dužine tretmana

pokazana je i dozna zavisnost. Zapaženo je da

vitamin C u niskim koncentracijama (0,1-1mM)

deluje prooksidativno dok visoke koncentracije (3

mM) ispoljavaju antioksidativni efekat (23).

Kod miševa izloženih ishemiji i

podvrgnutih tretmanu sa DHA samostalno i u

kombinaciji sa vitaminom D, aktivnost SOD je

značajno povišena u odnosu na kontrolu grupu.

Monoterapija vitaminom D dovodi značajnog

smanjenja aktivnosti SOD u odnosu na I/R grupu.

Miševi tretirani dehidroaskorbinskom kiselinom

imaju visoko statistički značajno povišenu

aktivnost SOD u poređenju sa vitamin D tretiranim

miševima. U hipokampusu dokazano je značajno

povećanje aktivnosti SOD u odnosu na kotrolnu

grupu. Tretman dehidroaskorbinskom kiselinom

pokazuje visoko, statistički značajno povećanje

aktivnosti SOD u odnosu na I/R grupu i miševe

tretirane vitaminom D. Primećeno je visoko, statistički značajno

smanjenje aktivnosti CAT u korteksu i

hipokampusu u I/R+DHA grupi i u I/R+vit

D3+DHA grupi u odnosu na kontrolnu grupu, kao i

značajno smanjenje aktivnosti CAT u korteksu u

I/R+DHA grupi i u I/R+vit D3+DHA grupi u

odnosu na I/R grupu. Takođe, prisutno je značajno

smanjenje aktivnosti CAT u hipokampusu u svim

grupama u odnosu na kontrolnu grupu. U uslovima

stresa CAT ima ulogu antioksidansa, prevodi H2O2

do H2O i O2 i smanjuje učestalost nekroze ćelija

prouzrokovane dehidroaskorbinskom kiselinom

.(21). U našem eksperimentu aktivnost katalaze

opada u ishemiji, dok je DHA dodatno inhibira.

Moguće je da DHA interferira sa Fe2+

u aktivnom

centru CAT i tako utiče na njenu funkciju.

Na osnovu iznetih rezultata možemo

zaključiti da I/R dovodi do porasta nivoa lipidnih

peroksida u moždanom tkivu, da

dehidroaskorbinska kiselina dodatno pospešuje

lipidnu peroksidaciju, dok vitamin D3 vraća nivoe

lipidnih peroksida na kontrolni nivo. Aktivnost

SOD u uslovima I/R raste a pod uticajem

dehidroaskorbinske kiseline porast aktivnosti je još

izraženiji. Vitamin D3 normalizuje aktivnost SOD i

smanjuje efekte dehidroaskorbinske kiseline.

Aktivnost CAT značajno se snižava u uslovima

I/R i ne normalizuje se pod delovanjem vitamina

D3, dok dehidroaskorbinska kiselina još više

produbljuje promenu koju izaziva ishemija. Ovi

rezultati ukazuju da primena vitamina D3 pre

ishemije ima protektivan efekat, dok

dehidroaskorbinska kiselina u datoj dozi deluje

prooksidativno. Potrebna su dalja istraživanja u

kojima bi se analiziralo kako različite doze,

trajanje tretmana i način aplikacije DHA utiču na

stvaranje slobodnih radikala i antioksidativnu

zaštitu. Takođe, potrebno je ispitati uticaj

pretretmana vitaminom D u ishemijama sa

različitom dužinom trajanja i vremenom

reperfuzije.

Literatura

(1) Lakhan SE, Kirchgessner A, Hofer M.

Inflamatory mechanisms in ischemic stroke:

therapeutic approaches. J Transl Med. 2009; 7: 97.

(2) Xu F, Li J, Ni W, Shen YW, Zhang XP.

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ

Agonist 15d-Prostaglandin J2 Mediates Neuronal

Autophagy after Cerebral Ischemia-Reperfusion

Injury. PLoS One 2013; 8(1): e55080.

(3) Selaković V, Janac B, Radenović L. MK-801

effect on regional cerebral oxidative stress rate

induced by different duration of global ischemia in

gerbils. Mol Cell Biochem 2010;342:35-50.

(4) Harukuni I, Bhardwaj A. Mechanisms of brain

injury after global cerebral ischemia. Neurol Clin

2006; 24: 1-21.

(5) Ste-Marie L, Vachon P, Vachon L, Bemeur C,

Guertin MC, Montgomery J. Hydroxyl radical

production in the cortex and striatum in a rat

model of focal cerebral ischemia.

Can.J.Neurol.Sci. 2000; 27: 152-159.

102 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

(6) Osmanović S. Hipoksija. U: Beleslin B,

Jovanović B, Nedeljkov V i sar. Opšta patološka

fiziologija, II izdanje. Beograd: Data Status, 2007.

s. 282.

(7) Radermacher KA, Wingler K, Langhauser F,

Altenhofer S, Kleikers P, Hermans JJR, de Angelis

MH, Kleinschnitz C, Schmidt HHHW.

Neuroprotection after stroke by targeting NOX4 as

a source of oxidative stress. Antioxid Redox Signal

2013; 18(12):1418-27.

(8) Ekici F, Ozyurt B, Erdogan H. The

combination of vitamin D3 and dehydroascorbic

acid administration attenuates brain damage in

focal ischemia. Neurol Sci 2009; 30:207–212.

(9) Padayatty SJ, Katz A, Wang Y, Eck P, Kwon

O, Lee JH, Chen S, Corpe C, Dutta A, Dutta SK,

Levine M. Vitamin C as an Antioxidant:

Evaluation of Its Role in Disease Prevention. J Am

Coll Nutr. 2003; 22(1): 18-35.

(10) Bemeur C, Ste-Marie L, Desjardins P,

Vachon L, Butterworth RF, Hazell AS,

Montgomery J. Dehydroascorbic acid normalizes

several markers of oxidative stress and inflamation

in acute hyperglycemic focal cerebral ischemia in

the rat. Neurochem Int. 2005; 46: 399–407.

(11) Isaković A, Petronijević N, Simić T,

Marković I. Antioksidativni kapaciteti ćelija u

odbrani od slobodnih radikala – neenzimski i

enzimski. U: Priručnik za praktične vežbe iz

biohemije sa radnom sveskom, II izdanje.

Beograd: Medicinski fakultet Univerziteta -

Institut za Biohemiju,2011, s.101.

(12) Groff, J.L., Gropper S.S, Hunt S.M. The

Water Soluble Vitamins. In: Advanced Nutrition

and Human Metabolism. Minneapolis: West

Publishing Company, 1995, p. 222-237

(13) Zhang R, Naughton DP. Vitamin D in health

and disease : Current perspectives. Nutr J 2010; 9:

65.

(14) Buell JS, Dawson-Hughes B. Vitamin D and

Neurocognitive Dysfunction : Preventing

’’D’’ecline?. Mol Aspetcs Med. 2008; 29(6): 415-

422.

(15) Brondum-Jacobsen et al. 25-Hydroxyvitamin

D and Symptomatic Ischemic Stroke: An original

study and meta-analysis. ANNALS of Neurology

2013; 73:38-46.

(16) Renchrona, S., Smith, S.D, Akcesson, B,

Westenberg, E, Siesjo, K.B. Peroxidative changes

in brain cortical fatty acids and phospholipids as

characterized during Fe++

and ascorbic acid

stimulated lipid peroxidation in vitro. J Neurochem

1980;34: 1630-1638.

(17) Lowry, O.H, Rosebrough, N.J, Farr, A.I,

Randall, R,I. Protein measurement with the Folin

phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-75.

(18) Sun, M., Zigman, S. An improved

spectrophotometric assay for superoxide dismutase

based on epinephrine autooxidation. Anal

Biochem. 1978;90: 81-89

(19) Goth, L. A simple method for determination

of serum catalase activity and revision of reference

range. Clinica Chemica Acta. 1991; 196: 143-152

(20) Wilson, J. The physiological role of

dehydroascorbic acid. FEBS Letters 2002; 527: 5-

9.

(21) Scarpat, M et al. Superoxide Ion as Active

Intermediate in the Autoxidation of Ascobate by

Molekular Oxygen. Thw Journal of Biological

Chemmistry 1983; 258: 6695-6697.

(22) Carr, A., Frei, B. Does vitamin C acts as

prooxidant under physiologikal conditions. The

FABS Journal 1999; 13: 1007-1024.

(23) Song et al. Prooxidant Effects of Ascorbate in

Rat Brain Slices. Journal of Neuroscience

Research 1999; 58: 328-336.

103Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

ULOGA MODULACIJE PI3K/AKT SIGNALNOG PUTA U IN VITRO MODELU

PARKINSONOVE BOLESTI

Autori: Ratko Radeta1, Sašenka Vidičević

1

Mentor: Asist. dr Marija Dulović2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak

Uvod: Prekomerna akumulacija α-

sinukleina (ASYN) smatra se značajnim

patogenetskim činiocem u nastanku Parkinsonove

bolesti. Poremećaj u regulaciji aktivnosti PI3K/Akt

signalnog puta pokazan je u brojnim

neurodegenerativnim bolestima, uključujući i

Parkinsonovu bolest.

Cilj: Cilj ovog rada bio je da pokaže uticaj

modulacije PI3K/Akt signalnog puta u in vitro

modelu sporadične forme Parkinsonove bolesti.

Materijali i metode: Praćenje nivoa

ekspresije ASYN i aktivacije (fosforilacije) kinaze

Akt vršeno je imunoblot metodom u ćelijskoj liniji

humanog neuroblastoma SH-SY5Y, diferentovanoj

all trans retinoičnom kiselinom, koja prekomerno

eksprimira normalni ASYN (α-syn-) i kontrolnim

SH-SY5Y ćelijama, koje prekomerno eksprimiraju

indiferentni protein β-galaktozidazu (β-gal).

Vijabilitet ćelija ispitivan je kristal violet testom,

a ultrastrukturne promene na ćelijama analizirane

su upotrebom elektronske mikroskopije.

Rezultati: Analizom ćelijskog vijabiliteta

uočeno je da dolazi do pada vijabiliteta nakon 6

dana diferencijacije (pad vijabiliteta izraženiji kod

-syn- ćelija), što je bilo praćeno odgovarajućim

promenama na mikrografijama. Tokom

diferencijacije kod α-syn- ćelija došlo je do

smanjenja aktivacije Akt-a (pAkt forma), dok je

kod kontrolnih (β-gal) ćelija zapažen porast pAkt-

a. Analizom vijabiliteta β-gal ćelija nakon

tretmana specifičnim inhibitorima PI3K/Akt

signalnog puta (LY294002 odnosno DEBC)

pokazano je da dolazi do pada ćelijskog

vijabiliteta diferentovanih ćelija (65,6%, odnosno

49,7%), u poreĎenju sa nediferentovanim ćelijama

(vijabilitet 100%). Imunoblotom potvrĎeno je

smanjenje ekspresije pAkt-a nakon primene

pomenutih inhibitora kod diferentovanih β-gal

ćelija.

Zaključak: Činjenica da je povećana smrt

diferentovanih ćelija neuroblastoma koje

prekomerno produkuju ASYN bila praćena

smanjenjem aktivacije Akt-a, ukazuje da bi

inhibicija Akt signalnog puta mogla da bude jedan

od mehanizama neurotoksičnosti ASYN. Modulacija Akt signalnog puta mogla bi da bude

buduća terapijska strategija Parkinsonove bolesti.

Ključne reči: α-sinuklein, neurotoksičnost, Akt

Abstract

Introduction: ASYN is regarded as an

essential mediator of Parkinson’s disease

pathogenesis. Deregulation of the PI3K/Akt

signalling pathway is observed in

neurodegenerative diseases including Parkinson’s

disease.

Aim: Researching the PI3K/Akt signalling

pathway modulation in neuronal damage caused

by ASYN over -expression.

Materials and methods: All experiments

were conducted in all-trans retinoic acid

differentiated SH-SY5Y cells, conditionally over-

expressing wild type ASYN (-syn-) and the control

cells (-gal). The production of ASYN and

activation of Akt (pAkt) were monitored using

immunoblotting. The cell viability was assessed

using crystal violet assay, whereas the

morphological features of cell death were

monitored using TEM.

Results: The crystal violet assay

demonstrated a significant reduction in cell

number after 6 days of differentiation in both

ASYN over - expressing cells (-syn-) and in the

differentiating control cells (β-gal). However, in

the differentiating -syn- cells, the cell number

was significantly lower. Consistent with the cell

viability analysis, the cell death was confirmed in

-syn- cells by ultrastructural TEM analysis. The

pro - survival kinase Akt was activated in

differentiating -gal cells, while a decrease in pAkt

was observed in differentiating α-syn- cells.

Inhibition of Akt with LY294002 or DEBC

markedly decreased cell viability in differentiating

-gal cells (65.6% and 45.7%, respectively),

compared to undifferentiated cells (100%).

104 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Immunoblot analysis confirmed a decrease in pAkt

levels in differentiating -gal cells.

Conclusion: It could be concluded that the

ASYN over - production induces cell death in the

differentiated SH-SY5Y cells. ASYN over -

expression in differentiated SH-SY5Y cells

inhibited cytoprotective activation of the Akt

signaling pathway, suggesting that modulation of

Akt activity may promise a therapeutic strategy in

Parkinson’s disease.

Key words: α-synuclein, neurotoxicity, Akt.

Uvod

Parkinsonova bolest (engl. Parkinson’s

disease – PD) pripada grupi hipokinetskih

motornih poremećaja, a klinički se manifestuje

bradikinezijom, rigiditetom, tremorom i

posturalnim poremećajima (1). Bolest se

karakteriše progresivnom degeneracijom i

izumiranjem dopaminergičkih neurona u pars

compacta substantiae nigrae mesencephalon-a (2).

Uprkos porastu incidencije PD i velikim naporima

lekara i naučnika, patogeneza PD još uvek nije

pouzdano utvrđena (3). Međutim, zna se da na

pojavu bolesti utiču genetski faktori, kao i faktori

sredine. Samo mali broj slučajeva PD (5%) pripada

familijarnoj formi bolesti, dok daleko veći broj

slučajeva (95%) može da se podvede pod

sporadičnu formu. Glavni patološki supstrat PD

predstavlja akumulacija proteina alfa-sinukleina

(ASYN) u zahvaćenim neuronima, u vidu

Levijevih telašaca (engl. Lewy bodies) (4). U

familijarnoj formi bolesti dolazi do nagomilavanja

mutirane forme ASYN u Levijevim telašcima. Do

sada je otkriveno 15 genskih lokusa na kojima je

došlo do pojave mutacija u familijarnoj formi

bolesti (5, 6), od kojih su 2 lokusa na hromozomu

broj 4 odgovorna za produkciju ASYN (7, 1, 8). U

sporadičnoj formi bolesti dolazi do prekomerne

ekspresije gena za ASYN i sledstvenog

nagomilavanja normalnog, nemutiranog ASYN

(engl. wild type) u neuronima (9). Još uvek nije

poznat tačan mehanizam toksičnog dejstva ASYN

na ćelije, ali je pokazano da ASYN može formirati

pore u membrani, koje liče na jonske kanale (10)

ili može prekinuti komunikaciju između

endoplazminog retikuluma (ER) i Goldži aparata,

uzrokujući oštećenja ER (11–14). Nema sumnje da

usled nagomilavanja ASYN u neuronima

pacijenata obolelih od PD, dolazi do njihove

degeneracije i smrti. Međutim, molekularni

mehanizam neuronalne smrti je i dalje nerazjašnjen

i polje je interesovanja brojnih istraživanja (15).

Poremećaj u regulaciji aktivnosti protein

kinaze B (Akt) pokazan je u brojnim

neurodegenerativnim bolestima, uključujući

Alchajmerovu (16, 17), Parkinsonovu (18) i

Hantingtonovu bolest (19). Pretpostavka da prekid

prenosa signala preko Akt signalnog puta leži u

osnovi degeneracije neurona u PD izvedena je na

osnovu rezultata brojnih studija mehanizama

neurotoksičnosti ASYN izvedenim na kulturi tkiva

i animalnim modelima (20, 21), genetskim

modelima PD (22, 23), kao i na osnovu post-

mortem analiza mozgova obolelih od PD. Ove

studije su, naime, pokazale smanjenje nivoa

aktivne, fosforilisane, forme Akt-a (p-Akt; mesta

fosforilacije su Thr308 i Ser473) u PD (20, 24).

Fosfo-inozitol-3-kinaza (PI3K) aktivira Akt

fosforilacijom, a aktivnost PI3K/Akt (fosfo-

inozitol-3-kinaza/protein kinaza B) signalnog puta

sprečava apoptozu. (25, 26).

Imajući u vidu da aktivacija Akt-a (pAkt)

pospešuje preživljavanje neurona, kao i da

akumulacija ASYN direktno utiče na Akt signalni

put (27, 28), modulacija Akt-a bi mogla da bude

jedan od načina toksičnog delovanja ASYN na

neurone. Protektivna uloga Akt proteina pokazana

je u toksičnim modelima PD (29), dok takva uloga

nije nedvosmisleno potvrđena kod prekomernog

nagomilavanja normalnog ASYN, kao modela

sporadične forme PD.

Cilj ovog rada upravo je da pokaže uticaj

modulacije PI3K/Akt signalnog puta u in vitro

modelu sporadične forme Parkinsonove bolesti.

Materijal i metode

Kultura ćelija i reagensi Za potrebe ovog istraživanja, korišćena je

komercijalna SH-SY5Y ćelijska linija humanog

neuroblastoma nabavljena od European Collection

of Animal Cell Cultures (ECACC), Velika

Britanija. Izabrana ćelijska linija pokazuje neke

karakteristike dopaminergičkih neurona –

mogućnost sinteze dopamina i noradrenalina usled

ekspresije dopamin i tirozin-β-hidroksilaze (30) i

ekspresiju transportera dopamina (DAT) na

membrani (31). Diferencijacija ćelija do neurona

izvršena je all-trans retinoičnom kiselinom (engl.

retinoic acid), RA (štok 20 mM), u periodu od 6

dana (10 µL RA po 1mL medijuma), prema

podacima iz literature (32).

105Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Ćelije su transfektovane plazmidskom

DNK za alfa-sinuklein (ASYN) ili beta-

galaktozidazu pomoću lipofektamina 2000

(Invitrogen, SAD) (15). Beta-galaktozidaza je

“indiferentan“ (tj. netoksičan) protein za humane

ćelije, pa njegovo nagomilavanje ne bi trebalo da

bude citotoksično, stoga su ćelije koje prekomerno

produkuju beta-galaktozidazu smatrane kontrolno

transfektovanim ćelijama (kontrola). Selekcija

transfektovanih ćelija vršena je dodavanjem

antibiotika G418 (250 µg/mL) i Hygromicina B

(50 µg/mL) jednom u sedam dana (Calbiochem,

SAD). Ćelije su uzgajane u RPMI 1640 medijumu,

obogaćenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma, L-

glutaminom (2 mM), uz dodatak smeše

antibiotik/antimikotik (1%) (sve od PAA,

Austrija), na 37°C, u vlažnoj atmosferi, sa 5%

CO2. Za kontrolu ekspresije ASYN, odnosno β-

galaktozidaze u transfektovanim ćelijama korišćen

je doksiciklin (dox, 1 µg/mL). U prisustvu

doksiciklina, produkcija ASYN i beta-

galaktozidaze ostaje na bazalnom nivou, dok je u

odsustvu doksiciklina dolazi do do prekomerne

ekspresije ASYN (α-syn-

ćelije), odnosno beta-

galaktozidaze (β-gal, kontrolno transfektovane

ćelije). Ćelije su u medijumu bez doksiciklina

gajene 2, 7 i 10 dana, i nakon svakog od ovih

perioda metodom imunoblota proveravan je nivo

ekspresije ASYN. Za dalje eksperimente korišćene

su diferentovane (RA, 6 dana) SH-SY5Y

neuroblastomske ćelije koje su gajene 7 dana u

uslovima bez doksiciklina (period kada dolazi do

prekomerne ekspresije ASYN). Ćelije su prvobitno

gajene 7 dana u medijumu bez doksiciklina, a

potom su diferentovane pomoću retinoične kiseline

6 dana.

Specifični inhibitori PI3K/Akt signalnog

puta korišćeni za potrebe ovog istraživanja su 2-

morfolin-4-il-8-fenilhromen-4-jedan (LY294002)

u koncentraciji od 3 mM i 10-[4’-(N, N-

Dietilamino)butil]-2-hlorfenoksazin hidrohlorid

(DEBC), koncentracije 5 mM (Tocris Bioscience,

SAD). LY294002 je inhibitor ushodne kinaze Akt

molekula - fosfatidil-inozitol-3 kinaze (PI3K), dok

je DEBC selektivni inhibitor Akt molekula.

Transmisiona elektronska mikroskopija (TEM)

Cilj analize ćelija transmisionom

elektronskom mikroskopijom bio je da se pokažu

eventualne morfološke promene koje nastaju usled

toksičnog dejstva ASYN tj. njegovog

nagomilavanja u ćelijama sa neuronskim

fenotipom. Talog ćelija dobijen nakon

centrifugiranja (500g, 10 minuta) i ispiranja u

fosfatnom puferu (PBS) (3 puta), fiksiran je u

2,5% glutaraldehidu u 0,1M kakodilatnom puferu.

Fiksacija je obavljena na 4°C, tokom minimalnog

vremenskog perioda od 24h. Nakon ispiranja u

kakodilatnom puferu, izvršena je postfiksacija u

1%-om rastvoru osmijum-tetroksida, u trajanju od

1 sata. Dobijeni talog je zatim ponovo ispran u

kakodilatnom puferu i nakon toga kontrastiran u

0,5% vodenom rastvoru uranil-acetata, preko noći,

na 4°C. Nakon toga je vršena dehidratacija taloga

kroz seriju rastućih koncentracija alkohola (etanol

– 50%, 70%, 90%, 100%). Talozi u uzorcima su

potom prožimani smolom na sobnoj temperaturi

kroz dve različite mešavine propilen-oksida i

EPON 812 smole (1:1, 1:3). Uzorci su na taj način

dovedeni do čiste smole EPON 812. Nakon

kalupljenja u plastične kalupe, materijal je sušen

24h u sušnici na 60°C. Kalupi su isečeni na

ultramikrotomu i potom analizirani na Morgagni

268D elektronskom mikroskopu (FEI, SAD).

Tehnika imunoblota (Western blot)

Tehnika imunoblota (Western blot) je

metoda koja služi za detekciju proteina u uzorku,

zasnovana na razdvajanju proteina elektroforezom

i njihovoj detekciji zasnovanoj na antigen-antitelo

reakciji. Primenjuje se antitelo specifično za

protein tj. antigen. Ovom tehnikom ispitivane su

ćelije nakon 2, 7 i 10 dana kultivacije u

prisustvu/odsustvu doksiciklina u medijumu. Cilj

primenjene metode bio je da se potvrdi

prekomerna produkcija ASYN u odsustvu

doksiciklina i da se utvrdi vremenski period koji je

potreban da bi do toga došlo. Imunoblot tehnika je

takođe korišćena i radi potvrde delovanja

farmakološki sintetisanih inhibitora PI3K/Akt

signalnog puta (LY294002 i DEBC), tj. smanjenje

količine aktivne forme enzima protein kinaze B (p-

Akt) u tretiranim ćelijama nakon 6 dana

diferencijacije sa RA. Za potrebe ovog

eksperimenta ćelije su gajene u Petri šoljama

dijametra 10 cm (SARSTEDT, Nemačka), 106

ćelija u 10 mL medijuma po svakoj Petri šolji, i

diferentovane sa RA (10 µL/mL) tokom 6 dana.

Potom, ćelije su lizirane na ledu 30 minuta

puferom za liziranje (engl. lysis buffer) koji se

sastoji od: 30 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM

NaCl, 1% NP-40, 1 mM fenilmetilsulfonilfluorid i

koktel inhibitora proteaza (engl. proteasis inhibitor

cocktail, PIC). Ćelije su potom centrifugirane na

14000g, 15 min na 4ºC, posle čega je pokupljen

106 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

supernatant. Nakon liziranja ćelija određivana je

koncentracija proteina u svakom uzorku metodom

po Bradford-u. Princip ove metode je da proteini

reaguju sa bojom Comassie Brilliant Blue i

prevode je u anjonski oblik, tako da se boja menja

od smeđe-crvene u plavu boju. Intenzitet dobijene

plave boje proporcionalan je koncentraciji proteina

u uzorku. Koncentracije proteina u uzorcima

određene su na osnovu standardne krive, koja se

dobija u reakciji albiumina iz seruma govečeta

(engl. bovine serum albumin, BSA) u koncentraciji

od 5, 10, 15 i 20 mg/ml. Apsorbanca je očitana na

čitaču za mikrotitarske ploče (TECAN Sunrise) na

570nm. Nakon očitavanja apsorbanci pravi se

standardna kriva na osnovu koje se određuju

koncentracije proteina.

Proteini u uzorcima su razdvojeni

elektroforezom u denaturišućim uslovima (SDS-

PAGE) na 12% i 10% poliakrilamidnom gelu, a

potom su prenete na nitrocelulozne membrane

(Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Francuska). Kako

bi se sprečilo nespecifično vezivanje antitela za

membranu, membrana je inkubirana u 5% protein

mleku TBS (0,05% Tween 20, 1h na sobnoj

temperaturi). Membrane su stajale tokom noći

potopljene u rastvoru primarnog antitela za alfa-

sinuklein (ASYN, razblaženje od 1:1000), aktin (β

actin, 1:5000), fosforilisanu/aktivnu formu protein

kinaze B (pAkt, 1:1000), ukupnu količinu serin

kinaze B (Akt, 1:1000) u mleku (5% u rastvoru

TBS-T) (sve od Cell Signaling Technology, SAD).

Nakon ispiranja primarnog antitela u rastvoru

TBS-T dodato je sekundarno antitelo obeleženo

peroksidazom (engl. anti-rabbit IgG-HRP At,

1:5000, Jackson IP Laboratories, SAD).

Nalivanjem hemiluminescentnog supstrata za

peroksidazu na nitrocelulozne membrane i

vizuelizacijom signala na rendgenskom filmu,

dobijeni su kvalitativni podaci o prisustvu

određenog proteina (Amersham Pharmacia

Biotech, SAD). Kvantifikacija rezultata dobijenih

imunoblot tehnikom izvršena je uz pomoć

programa ImageJ (semi-kvantitatitativno).

Kristal violet metoda (Crystal violet)

Kristal violet metodu koristili smo za

određivanje broja živih ćelija u uslovima

prekomerne ekspresije ASYN, kao i nakon

primene specifičnih inhibitora Akt signalnog puta.

Princip metode jeste da boja (Kristal violet) vezuje

za proteine živih ćelija, tako da intenzitet dobijene

plave boje korelira sa brojem živih ćelija. Ćelije su

zasejavane u mikrotitarske ploče sa 96 bunara, (2 x

104 ćelija u 100 µl medijuma po svakom bunaru) i

tretirane u triplikatu. Po isteku tretmana, ćelije su

oprane rastvorom PBS-a, fiksirane metanolom (50

µL metanola po svakom bunaru), a nakon 10-15

minuta na sobnoj temperaturi, metanol je odliven

a, naliven je rastvor boje Kristal violet (1:10 u

PBS-u), u količini od 50 µL rastvora boje po

bunaru. Po isteku 10 minuta, ploče su isprane u

posudi sa vodom i osušene. Potom je u svaki bunar

dodato 50 µL 33%-tnog vodenog rastvora sirćetne

kiseline koja rastvara kristal violet boju. Na kraju

se apsorbanca plave boje očitavala na čitaču za

mikrotitarske ploče (TECAN Sunrise), na 570 nm.

Intenzitet plave boje direktno je proporcionalan

broju živih ćelija.

Statistička analiza

Za poređenje rezultata korišćen je

Studentov t-test za dva mala nezavisna uzorka.

Kao kriterijum značajnosti uzeto je p<0,05 (razlika

je statistički značajna) i p<0,01 (razlika je

statistički visoko značajna).

Rezultati

Transfektovane SH-SY5Y neuroblastomske ćelije

prekomerno produkuju ASYN

Tehniku imunoblota smo primenili u cilju

potvrde uspešne transfekcije gena za ASYN kod

SH-SY5Y neuroblastomskih ćelija, koje su gajene

u prisustvu i odsustvu doksiciklina, u vremenskom

periodu od 2, 7 i 10 dana. Uočava se vremenski

zavisno povećanje produkcije ASYN kod α-syn-

ćelija u odsustvu dox. Sa druge strane, kod ćelija

gajenih u prisustvu dox (α-syn+) ekspresija ASYN

ostaje na bazalnom nivou. Nakon sedmog dana

uočava se izuzetan porast produkcije ASYN u

odnosu na početnu. Nakon tog vremenskog

intervala, tj. 10 dana, uočava se trend povećanja u

produkciji ASYN. Kod kontrolno transfektovanih

β-gal ćelija ekpresija gena za ASYN je ostala na

bazalnom nivou (Slika 1).

ASYN

actin

DOX: + - + - + - + - + - + -

dani: 7 10

α-syn β-gal α-syn β-gal α-syn β-gal

2 Slika 1. Imunoblot analiza vremenske promene

ekspresije gena za ASYN (2, 7, 10 dana).

107Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Povećana produkcija ASYN u diferentovanim

neuroblastomskim SH-SY5Y ćelijama dovodi do

povećane citotoksičnosti

Broj živih ćelija u uslovima prekomerne

produkcije ASYN određivali smo kristal violet

metodom. Ćelije su prvobitno gajene 7 dana u

medijumu bez doksiciklina da bi došlo do

prekomerne produkcije ASYN, a potom su

diferentovane do neuronskog fenotipa pomoću

retinoične kiseline 6 dana. Vijabilitet diferentovanih

α-syn- ćelija koje prekomerno produkuju ASYN

iznosio je 23,2% ± 1,5, u odnosu na vijabilitet ćelija

nediferentovanih ćelija, za koje smo arbitrarno uzeli

da im je vijabilitet 100%. Vijabilitet kontrolnih β-

gal ćelija, nakon istog perioda diferencijacije,

iznosio je 69,2% ± 1,4 u odnosu na nediferentovane

β-gal ćelije (vijabilitet 100%). Nakon diferencijacije

došlo je do statistički značajnog pada vijabiliteta

kako kontrolnih β-gal ćelija (p<0,05), tako i α-syn-

ćelija koje prekomerno produkuju ASYN (p<0,01).

Međutim, pad vijabiliteta diferentovanih α-syn-

ćelija je bio statistički značajno niži u poređenju sa

vijabilitetom diferentovanih β-gal ćelija (p<0,05).

(Grafikon 1). Možemo zaključiti da usled

prekomernog nakupljanja ASYN dolazi do

statistički značajnog pada vijabiliteta diferentovanih

SH-SY5Y neuroblastomskih ćelija.

Grafikon 1. Analiza ćelijskog vijabiliteta kristal

violet metodom nakon 6 dana diferencijacije ćelija

retinoičnom kiselinom (RA) ; * označava p<0,05;

kada poredimo diferentovane i nediferentovane

ćelije; podaci su dobijeni iz 3 nezavisna uzorka; **

označava p<0,01; kada poredimo diferentovane i

nediferentovane ćelije; podaci su dobijeni iz 3

nezavisna uzorka; # označava p<0,05 kada

poredimo diferentovane β-gal ćelije u odnosu na

diferentovane α-syn- ćelije.

Kako bismo analizirali morfološke

promene koje nastaju usled toksičnog dejstva

ASYN, odnosno, njegovog nakupljanja u ćeliji,

koristili smo tehniku transmisione elektronske

mikroskopije. Analizirali smo α-syn-, kao i β-gal

ćelije, pre diferencijacije, a potom i 6 dana nakon

diferencijacije sa RA. β-gal ćelije, nakon

diferencijacije imaju brojne intracitoplazmatske

autofagocitne vakuole, izmenjen oblik i brojnost

mitohondrija u ćeliji, kao i hipertrofisan ER (slika

2A). Kod α-syn- ćelija, nakon diferencijacije sa

RA, uočava se potpuni gubitak morfologije,

kondenzacija hromatina i fragmentacija jedra, kao

i brojne vakuole (slika 2B). Ove morfološke

promene, posebno fragmentacija jedra, ukazuju da

je jedan od mogućih mehanizama citotoksičnosti

ASYN, indukcija programirane ćelijske smrti,

apoptoze. Sa druge strane, gubitak morfologije i

dezintegracija ćelijske membrane, ukazuju na

nekrozu.

A

Nediferentovane ćelije Diferentovane ćelije (RA)

B

Nediferentovane ćelije Diferentovane ćelije (RA)

Slika 2. Transmisione elektronske mikrografije

kontrolnih β-gal ćelija (A) i ćelija koje prekomerno

produkuju ASYN (α-syn-) (B), nediferentovanih i

nakon 6 dana diferencijacije retinoičnom

kiselinom (RA).

**

*#

108 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

ASYN kompromituje protektivnu aktivaciju

protein kinaze Akt

Tehnikom imunoblota pokazali smo da se

kod ćelija koje prekomerno produkuju ASYN (α-syn-

ćelije) uočava smanjenje zastupljenosti aktivne-

fosforilisane forme Akt-a (pAkt) nakon 6 dana

diferencijacije sa RA. Kod kontrolne grupe ćelija (β-

gal ćelije) pokazali smo povećanje p-Akt forme

nakon 6 dana diferencijacije. Zastupljenost ukupnog

Akt proteina je ostala nepromenjena kod obe vrste

ćelija. Protein aktin koristili smo kao kontrolu za

korektnost određivanja proteina čiji jednaki nivoi u

različitim uslovima pokazuju da je na gelove

nanošena jednaka količina proteina (slika 3).

Denzitometrijskom analizom rezultata dobijenih

imunoblot tehnikom (ImageJ program), pokazali

smo da postoji statistički značajno smanjenje

zastupljenosti aktivne-fosforilisane forme Akt-a

(pAkt) kod diferentovanih α-syn- ćelija (0,69 ± 0,03)

u odnosu na nediferentovane ćelije (ekspresija

proteina arbitrarno svedena na 1) (p<0,05). Nasuprot

tome, kod diferentovanih kontrolnih β-gal ćelija

postoji statistički značajno povećanje zastupljenosti

pAkt forme (1,76 ± 0,02) u odnosu na

nediferentovane β-gal ćelije (ekspresija proteina

arbitrarno svedena na 1) (p<0,05) (slika 3). Dobijeni

rezultati ukazuju na mogući mehanizam

neurotoksičnosti ASYN preko kompromitovanja

fosforilacije i aktivacije Akt molekula, odnosno Akt-

signalnog puta. S druge strane,

aktivacija/fosforilacija Akt-a bi mogla da ima

ključnu ulogu u boljem preživljavanju kontrolnih (β-

gal) ćelija.

β-gal

pAkt

Akt

actin

Ø RA

pAkt

Akt

actin

Ø RA α-syn

-

Slika 3. Imunoblot analiza prisustva

fosforilisane/aktivne forme Akt-a (pAkt) i ukupnog

Akt proteina (Akt) kontrolnih β-gal ćelija i ćelija

koje prekomerno produkuju ASYN (α-syn-),

nediferentovanih (Ø) i nakon 6 dana diferencijacije

retinoičnom kiselinom (RA). Prikazani su

reprezentativni imunoblotovi, dobijeni iz 3 nezavisna

eksperimenta.

0

1

2

pA

kt

RAO

*

0

1

2

pA

kt

RAO

*

β-gal

α-syn-

Grafikon 2. Denzitometrijska analiza rezultata za

fosforilisani/aktivni Akt (pAkt) dobijenih

imunoblot tehnikom, kontrolnih β-gal ćelija i ćelija

koje prekomerno produkuju ASYN (α-syn-),

nediferentovanih (Ø) i nakon 6 dana diferencijacije

retinoičnom kiselinom (RA); * označava p<0,05;

kada poredimo diferentovane (RA) i

nediferentovane ćelije (Ø); podaci su dobijeni iz 3

nezavisna eksperimenta.

Modulacija Akt signalnog puta utiče na

preživljavanje diferentovanih SH-SY5Y

neuroblastomskih ćelija in vitro

Kristal violet metodom ispitivali smo

vijabilitet ćelija nakon primene specifičnih

inhibitora Akt signalnog puta pre i 6 dana nakon

diferencijacije sa RA. Specifični farmakološki

inhibitori Akt signalnog puta (inhibitor ushodne

kinaze Akt-a fosfo-inozitol-3-kinaze, LY294002;

ihnibitor fosforilacije Akt proteina, DEBC) nisu

statistički značajno uticali na vijabilitet

nediferentovanih kontrolnih β-gal ćelija (za

netretirane nediferentovane ćelije je arbitrarno

uzeta vrednost vijabiliteta 100%). Međutim, kod

diferentovanih β-gal ćelija nakon tretmana

inhibitorima došlo je do statistički značajnog pada

vijabiliteta, kako nakon primene LY294002

(65,6% ± 0,4), tako i nakon primene DEBC

(49,7% ± 0,5) (p<0,05; u odnosu na vrednost

vijabiliteta netretiranih diferentovanih β-gal ćelija,

78,22 ± 6,6%) (Grafikon 3A). Kod α-syn- ćelija

109Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

vijabilitet se ne menja znatnije (Grafikon 3B), jer

je prekomerna produkcija ASYN već dovela do

značajnog pada vijabiliteta nakon 6 dana

diferencijacije (Grafikon 1).

A

B

Grafikon 3. Analiza ćelijskog vijabiliteta kristal

violet metodom nakon 6 dana diferencijacije i

tretmana specifičnim farmakološkim inhibitorima

Akt-a (LY294002, 3 mM; DEBC, 5 mM)

kontrolnih β-gal ćelija (A) i ćelija koje prekomerno

produkuju ASYN (α-syn-) (B); ** označava

p<0,05; posmatrajući pad vijabiliteta

diferentovanih ćelija tretiranih specifičnim

farmakološkim inhibitorima Akt-a (LY294002, 3

mM; DEBC, 5 Mm), u odnosu na netretirane

diferentovane ćelije (RA); podaci su dobijeni iz 3

nezavisna uzorka.

Imunoblot tehniku koristili smo da

potvrdimo smanjenje zastupljenosti

aktivne/fosforilisane forme (p-Akt) u kontrolnim

β-gal ćelijama, nakon primene farmakološki

sintetisanih inhibitora (LY294002 i DEBC).

Analizirali smo nediferentovane ćelije, kao i ćelije

nakon 6 dana diferencijacije retinoičnom

kiselinom (RA), pre i posle primene inhibitora (β-

gal ćelije). Promena u ukupnoj količini Akt

proteina se ne zapaža. Protein aktin smo koristili

kao kontrolu (Slika 4). Denzitometrijskom

analizom rezultata dobijenih imunoblot tehnikom

(ImageJ program), pokazali smo da postoji

statistički značajno povećanje zastupljenosti

aktivne-fosforilisane forme Akt-a (pAkt) kod

diferentovanih β-gal ćelija nakon tretmana

specifičnim inhibitorima u odnosu na

nediferentovane ćelije (za netretirane

nediferentovane ćelije ekspresija proteina

arbitrarno je svedena na 1). Nakon primene

LY294002, kod diferentovanih β-gal ćelija

vrednost za ekspresiju pAkt forme proteina

iznosila je 1,26 ± 0,1, što je statistički značajno

povećanje ekspresije u odnosu na nediferentovane

ćelije tretirane istim inhibitorom (0,95 ± 0,12).

Nakon primene drugog inhibitora, DEBC, vrednost

koja se odnosi na diferentovane ćelije iznosila je

1,11 ± 0,08, što je takođe statistički značajno

povećanje ekspresije pAkt u odnosu na

nediferentovane ćelije (0,8 ± 0,09) (p<0,05)

(Grafikon 4).

RAØ

LY294002O DEBC LY294002O DEBC

Slika 4. Imunoblot analiza prisustva

fosforilisane/aktivne forme Akt-a (pAkt) i

ukupnog Akt proteina (Akt) nakon 6 dana

diferencijacije kontrolnih β-gal ćelija (RA) i nakon

tretmana specifičnim farmakološkim inhibitorima

Akt-a (LY294002, 3 mM; DEBC, 5 mM).

Prikazan je reprezentativni imunoblot, dobijen iz 3

nezavisna eksperimenta.

0

20

40

60

80

100

120

Ø RA

bro

j ži

vih

će

lija

(% u

od

no

su

na

kon

tro

lu)

β-galØ

DEBC

LY294002

pAkt

actin

Akt

*

*

110 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

pA

kt

*

**

RA

LYO DEBC LY DEBC

O

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

O

Grafikon 4. Denzitometrijska analiza rezultata za

fosforilisanu/aktivnu formu Akt-a (pAkt) dobijenih

imunoblot tehnikom nakon 6 dana diferencijacije

kontrolnih β-gal ćelija (RA) i nakon tretmana

specifičnim farmakološkim inhibitorima Akt-a

(LY294002, 3 mM; DEBC, 5 mM); * označava

p<0,05; kada poredimo diferentovane (RA) i

nediferentovane ćelije (Ø); podaci su dobijeni iz 3

nezavisna eksperimenta.

Diskusija

Prekomerno nakupljanje ASYN u

dopaminergičkim neuronima, značajan je

patogenetski mehanizam nastanka PD (4). Za

potrebe ovog istraživanja koristili smo in vitro

model sporadične forme Parkinsonove bolesti. U

ovom modelu, neuroblastomske SH-SY5Y ćelije

diferentovane su u dopaminergičke neurone all-

trans retinoičnom kiselinom, a potom im je

uključen gen koji dovodi do prekomerne ekspresije

ASYN. Kontrolu ekspresije ASYN molekula vršili

smo doksiciklinom. U odsustvu doksiciklina,

uočava se povećana ekspresija ASYN kod α-syn-

ćelija, sa početkom povećanja ekspresije nakon 2

dana i maksimumom nakon 7 dana od

isključivanja doksiciklina. Povećana ekspresija

ASYN verifikovana je imunoblot tehnikom.

Prekomerno nakupljanje ASYN ima potencijalni

citotoksični efekat na ćelije, što smo detektovali

kristal violet metodom, a potvrdili tehnikom

transmisione elektronske mikroskopije. Pad

vijabiliteta značajniji je u grupi diferentovanih α-

syn- ćelija, u odnosu na kontrolno transfektovane

β-gal ćelije, što govori u prilog postavljenoj

hipotezi.

Poremećaj regulacije PI3K/Akt signalnog

puta pokazana je u animalnim modelima i kod

pacijenata obolelih od Parkinsonove bolesti (33).

Alfa sinuklein, kako mutirana, tako i nemutirana

forma ASYN (wt ASYN) direktno reaguju sa Akt

molekulom, blokirajući njegovu aktivaciju

sprečavanjem fosforilacije (3, 27, 28). Ovim

istraživanjem želeli smo da ispitamo efekte

modulacije Akt signalnog puta, važnog za

regulisanje procesa uključenih u preživljavanje

ćelija i ćelijsku smrt (apoptoza i autofagija), u

ćelijskoj kulturi diferentovanog neuroblastoma

SH-SY5Y u uslovima prekomerne ekspresije

ASYN. Pokazali smo da prekomerna produkcija

ASYN u diferentovanim SH-SY5Y ćelijama

neuroblastoma suprimira aktivaciju Akt-a, čime

utiče na celokupni PI3K/Akt-signalni put, koji je

značajan za zaobilaženje apoptoze i posledično

preživljavanje ćelija (34, 35). Nasuprot tome, u

kontrolno transfektovanim ćelijama, nakon istog

perioda diferencijacije, primetili smo aktivaciju

Akt-a. Ova povećana ekspresija aktivne forme

Akt-a sugeriše da Akt molekul može imati ulogu u

povećanom preživljavanju kontrolnih ćelija u

odnosu na ćelije koje prekomerno produkuju

ASYN. Ovakvi rezultati ukazuju na mogućnost da

bi izostanak aktivacije Akt-a mogao da doprinese

povećanoj toksičnosti ASYN i posledičnoj smrti

neurona, što je u skladu sa podacima iz literature

(3). Naime, Akt može da inhibira apoptozu

direktno, putem fosforilacije i inaktivacije

nekoliko pro-apoptotskih molekula, uključujući

Bad, c-Raf i kaspazu 9 (36–39), ili indirektno,

preko aktivacije NF-κB i potonje transkripcije

gena za preživljavanje ćelija (35).

Uprkos postojanju različitih ćelijskih i

životinjskih modela Parkinsonove bolesti, vrlo

malo se zna o ulozi Akt-a u uslovima prekomerne

ekspresije ASYN. Do sada je pokazano da u

neurotoksičnim modelima PD Akt ima značajnu

ulogu u patogenezi bolesti. Naime, protektivna

uloga β-sinukleina protiv rotenonom indukovane

PD u kulturi ćelija neuroblastoma posredovana je

aktivacijom Akt-a (40). Fosforilacija Akt-a može

takođe biti modulisana i nekim drugim faktorima

značajnim za patogenezu PD, kao npr. indukcija

proteina stresa RTP801 koja je dokumentovana u

in vitro modelima PD, kao i u dopaminergičkim

neuronima pacijenata obolelih od PD (41).

Povećana zastupljenost proteina RTP801 korelira

sa aktivacijom mTOR proteina i posledičnom

inhibicijom fosforilacije Akt-a (20). Prema

podacima iz literature, SH-SY5Y ćelije dvostruko

transfektovane da prekomerno produkuju ASYN i

konstitutivno aktiviran Akt pokazale su snižen

nivo poli-ADP ribozomske polimeraze (PARP),

markera apoptoze (42). U skladu sa dosadašnjim

istraživanjima, pokazali smo da specifični

111Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

inhibitori PI3K/Akt-signalnog puta (LY294002 i

DEBC) uzrokuju statistički visoko značajan pad u

broju živih diferentovanih kontrolnih ćelija (-gal),

ukazujući na to da aktivacija Akt-a ima značajnu

ulogu u preživljavanju ovih ćelija. Smanjenje p-

Akt forme kod diferentovanih kontrolnih ćelija (-

gal) nakon primene inhibitora Akt signalnog puta,

pokazano tehnikom imunoblota, potvrđuje

dobijene rezultate i naglašava ulogu koju protein

kinaza Akt može imati u ćelijskom preživljavanju.

U skladu sa dobijenim rezultatima, naše

dalje istraživanje će se bazirati na pokušaju da

aktivacijom protein kinaze B (Akt) pospešimo

preživljavanje ćelija koje prekomerno produkuju

ASYN. Ovakav pristup predstavlja potencijalan

pravac razmišljanja u budućoj terapijskoj strategiji

Parkinsonove bolesti.

Literatura

1. Thomas B, Beal MF. Parkinson’s disease.

Hum Mol Genet 2007; 16: 183–194.

2. Kostić V. (urednik). Neurologija za studente

medicine. Beograd: CIBID; 2010.

3. Chung J, Lee S. et al. Direct interaction of α-

Synuclein and AKT Regulates IGF-1

Signaling: Implication of Parkinson Disease.

Neurosignals 2011; 19: 86-96.

4. Dauer W, Przedborski S. Parkinson’s

disease: mechanisms and models. Neuron

2003; 39: 889-909.

5. Licker V, Kövari E, Hochstrasser DF,

Burkhard PR. Proteomics in human

Parkinson’s disease research. J Proteomics

2009; 73: 10-29.

6. Kumari U, Tan EK. LRRK2 in Parkinson’s

disease: genetic and clinical studies from

patients. FEBS J 2009; 276: 6455-6463.

7. Spillantini MG, Schmidt ML, Lee VM,

Trojanowski JQ, Jakes R, Goedert M. Alpha-

synuclein in Lewy bodies. Nature 1997; 388:

839-840.

8. Singleton AB, Farrer M. et al. Alpha-

synuclein locus triplication causes

Parkinson’s disease. Science 2003; 302: 841.

9. Maraganore DM, de Andrade M. et al.

Collaborative analysis of alpha-synuclein

gene promoter variability and Parkinson

disease. JAMA 2006; 296: 661–670.

10. Volles MJ, Lee SJ et al. Vesicle

permeabilization by protofibrillar alpha-

synuclein: implications for the pathogenesis

and treatment of Parkinson’s disease.

Biochemistry 2001; 40: 7812–7819.

11. Cooper AA, Gitler AD et al. Alpha-synuclein

blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues

neuron loss in Parkinson’s models. Science

2006; 21: 324–328.

12. SmithWW, Jiang H. et al. Endoplasmic

reticulum stress and mitochondrial cell death

pathways mediate A53T mutant alpha-

synuclein-induced toxicity. Hum Mol Genet

2005; 14: 3801–3811.

13. Vekrellis K, Rideout HJ, Stefanis L.

Neurobiology of alpha-synuclein. Mol

Neurobiol 2004; 30: 1–21.

14. Quist A, Doudevski I. et al. Amyloid ion

channels: a common structural link for

protein-misfolding disease. Proc Natl Acad

Sci USA 2005; 102: 10427–10432.

15. Vekerellis K, Xilouri M, Emmanouilidou E,

Stefanis L. Inducible over-expression of

wild-type α-synuclein in human neuronal

cells leads to caspase-dependent non-

apoptotic death. Journal of Neurochemistry

2009; 109: 1348-1362.

16. Rickle A, Bogdanovic N, Volkman I,

Winblad B, Ravid R, Cowburn RF. Akt

activity in Alzheimer's disease and other

neurodegenerative disorders. Neuroreport

2004; 15: 955-959.

17. Ryder J, Su Y, Ni B. Akt/GSK3beta

serine/threonine kinases: evidence for a

signalling pathway mediated by familial

Alzheimer's disease mutations. Cell signal

2004; 16: 187-200.

18. Hashimoto M, Bar-On P. et al. Beta-

synuclein regulates Akt activity in neuronal

cells. A possible mechanism for

neuroprotection in Parkinson’s disease. J

Biol Chem 2004; 279: 23622-23629.

19. Humbert S, Bryson EA et al. The IGF-1/Akt

pathway is neuroprotective in Huntington's

disease and involves Huntingtin

phosphorylation by Akt Dev Cell 2002; 2:

831-837.

20. Malagelada C, Jin ZH, Greene LA. RTP801

is induced in Parkinson's disease and

mediates neuron death by inhibiting Akt

phosphorylation/activation. J Neurosci 2008;

28: 14363–14371.

21. Malagelada C, Jin ZH, Jackson-Lewis V,

Przedborski S, Greene LA. Rapamycin

protects against neuron death in in vitro and

112 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

in vivo models of Parkinson's disease. J

Neurosci 2010; 30: 1166–1175.

22. Aleyasin H, Rousseaux MW et al. DJ-1

protects the nigrostriatal axis from the

neurotoxin MPTP by modulation of the AKT

pathway. Proc Natl Acad Sci USA 2010;

107: 3186–3191.

23. Rieker C, Engblom D. et al. Nucleolar

disruption in dopaminergic neurons leads to

oxidative damage and parkinsonism through

repression of mammalian target of rapamycin

signaling. J Neurosci 2011; 31: 453–460.

24. Timmons S, Coakley MF, Moloney AM,

O'Neill C. Akt signal transduction

dysfunction in Parkinson's disease. Neurosci

Lett 2009; 467: 30–35.

25. Besset V, Scott RP, Ibanez CF. Signaling

complexes and protein–protein interactions

involved in the activation of the Ras and

phosphatidylinositol 3-kinase pathways by

the c-Ret receptor tyrosine kinase. J Biol

Chem 2000; 275: 39159–39166.

26. Chen Z, Chai Y. et al. Glial cell line-derived

neurotrophic factor promotes survival and

induces differentiation through the

phosphatidylinositol 3-kinase and mitogen-

activated protein kinase pathway respectively

in PC12 cells. Neuroscience 2001; 104: 593–

598.

27. Hashimoto M, Rockenstein E, Mante M,

Mallory M, Masliah E. Beta-synuclein

inhibits alpha-synuclein aggregation: a

possible role as an antiparkinsonian factor.

Neuron 2001; 32: 213–223.

28. Seo JH, Rah JC et al. Alpha-synuclein

regulates neuronal survival via Bcl-2 family

expression and PI3/Akt kinase pathway.

Faseb J 2002; 16: 1826–1828.

29. Steidinger UT, Standaert GD, Yacoubian

AT. A neuroprotective role for angiogenin in

models of Parkinson’s disease. Journal of

Neurochemistry 2011; 116: 334-341.

30. Oyarce AM, Fleming PJ. Multiple forms of

human dopamine beta-hydroxylase in SH-

SY5Y neuroblastoma cells. Arch Biochem

Biophys 1991; 290: 503-510.

31. Takahashi T, Deng Y, Maruyama W, Dostert

P, Kawai M, Naoi M. Uptake of a

neurotoxin-candidate, (R)-1,2-dimethyl-6, 7-

dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline

into human dopaminergic neuroblastoma

SH-SY5Y cells by dopamine transport

system. J Neural Transm Gen Sect 1994; 98:

107-118.

32. Joshi S, Guleria R, Pan J, DiPette D, Singh

US. Retinoic acid receptors and tissue-

transglutaminase mediate short-term effect of

retinoic acid on migration and invasion of

neuroblastoma SH-SY5Y cells. Oncogene

2006; 25: 240-247.

33. Ryong Kim S, Ries V. et al. Age and α-

synuclein expression interact to reveal a

dependence of dopaminergic axons on

endogenous Akt/PKB signaling.

Neurobiology of Disease 2011; 44: 215-222.

34. Dudek H, Datta SR et al. Regulation of

neuronal survival by the serine-threonine

protein kinase Akt. Science 1997; 275: 661-

665.

35. Brunet A, Datta SR, Greenberg ME.

Transcription-dependent and -independent

control of neuronal survival by the PI3K-Akt

signaling pathway. Curr Opin Neurobiol

2001; 11: 297-305.

36. Datta SR, Dudek H. et al. Akt

phosphorylation of BAD couples survival

signals to the cell-intrinsic death machinery.

Cell 1997; 91: 231-241.

37. Brunet A, Bonni A. et al. Akt promotes cell

survival by phosphorylating and inhibiting a

Forkhead transcription factor. Cell 1999; 96:

857-868.

38. Zimmermann S, Moelling K.

Phosphorylation and regulation of Raf by

Akt (protein kinase B). Science 1999; 286:

1741-1744.

39. Cardone MH, Roy N. et al. Regulation of cell

death protease caspase-9 by phosphorylation.

Science 1998; 282: 1318-1321.

40. Hashimoto M, Rockenstein E. et al. An

antiaggregation gene therapy strategy for

Lewy body disease utilizing beta-synuclein

lentivirus in a transgenic model. Gene Ther

2004; 11: 1713-1723.

41. Malagelada C, Ryu EJ, Biswas SC, Jackson-

Lewis V. Greene LA RTP801 is elevated in

Parkinson brain substantia nigral neurons and

mediates death in cellular models of

Parkinson’s disease by a mechanism

involving mammalian target of rapamycin

inactivation. J Neurosci 2006; 26: 9996–

10005.

42. Kao SY. Rescue of α-synuclein cytotoxicity

by insulin-like growth factors. Biochem

Biophys Res Comm 2009; 385: 434-438.

113Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

MODULACIJA EFEKATA NITRINERGIČKE NEUROTRANSMISIJE IZOLOVANOG

DUODENUMA PACOVA PRIMENOM D-L-HOMOCISTEIN TIOLAKTONA

Autori: Nataša Stanković1, Milan Radovanović

1, Stefan Dugalić

1

Mentor: Prof. dr Ljiljana Šćepanović2, Asist. dr Marija Stojanović

2

1 Medicinki fakultet, Univerzitet u Beogradu

2 Institut za medicinsku fiziologiju „Rihard Burijan“, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak

Uvod: Postoji veliki broj dokaza da je NO

snažan inhibitorni neurotransmiter i da su neuroni

koji ga sintetišu široko rasprostranjeni u

enteričnom nervnom sistemu. Azot monoksid

predstavlja važan modulator vaskularnog tonusa i

pokazano je da homocistein smanjuje njegovo

stvaranje i moduliše njegove efekte.

Cilj: Ispitati efekte modulacije

nitrinergičke neurotransmisije u

gastrointestinalnom traktu, upotrebom D-L-

homocistein tiolaktona, čije patofiziološke

posledice uključuju smanjenje oslobadjanja azot

monoksida.

Materijal i metode: Eksperimenti su izvedeni na

izolovanom duodenumu Wistar albino pacova

muškog pola, telesne mase 250-300g. Kontrakcije

su registrovane pomoću izometrijskog pretvarača

na Bekmanovom pisaču. Nakon 1h adaptacionog

perioda registrovana je spontana aktivnost

segmenta duodenuma u toku perioda od 30 min,

nakon čega su ispitivani efekti D,L-homocistein

tiolaktona. Zatim je ispitivano dejstvo električne

poljne stimulacije (EFS) tokom 10 sekundi

impulsima trajanja 0,5 ms, voltažom od 50 V i

frekvencijom od 1-5 Hz.

Rezultati: D,L-homocistein tiolakton u

koncentraciji 1mmol/L dovodi do trenutnog

porasta tonusa, amplitude i frekvence spontanih

pokreta izolovanog duodenuma pacova.

Neposredno po dodavanju homocisteina u

koncentraciji 10 µmol/L u vodeno kupatilo,

izvršena je električna poljna stimulacija. Posle 5

minuta je administrirano 30 µmol/L L-NAME i

došlo je do porasta amplitude u većoj meri u

odnosu na administraciju L-NAME bez

homocisteina.

Zaključak: D-L-homocistein tiolakton

izaziva porast tonusa, amplitude i frekvencije

spontanih pokreta izolovanog duodenuma pacova.

Duodenum tretiran L-NAME i D-L-homocistein

tiolaktonom nakon EPS-a, pokazuje veći porast

svih već navedenih parametara u odnosu na

tretiranje samo L-NAME nakon električne poljne

stimulacije.

Ključne reči: homocistein, nitrinergička

neurotransmisija, električna poljna stimulacija,

izolovani duodenum, pacov

Abstract

Introduction: Numerous studies have

shown that NO is a powerful inhibitory

neurotransmitter, and that the neurons that

synthesize it are widespread in the enteric nervous

system. Nitric oxide is an important modulator of

vascular tone and it has been shown that

homocysteine reduces its creation and modulates

its effects.

Aim: To examine the effects of D-L-

homocysteine thiolactone modulation of nitrergic

neurotransmission in the gastrointestinal tract,

whose pathophysiological effects include nitric

oxide reduction.

Material and Methods: Experiments were

performed on isolated male albino rat duodenum

Wistar, body weight 250 - 300g. Contractions were

registrated using isometric transducer on

Backmann printer. After the one – hour adaptation

period, a spontaneous activity segment of the

duodenum was recorded during the period of 30

min, after which the effects of D, L-homocysteine

thiolacton were examined. Electrical field

stimulation (EFS) was performed during 10

seconds using electrical impulses with 0,5 ms

duration, voltage of 50 V and 1 - 5 Hz frequency.

Results: D, L-homocysteine concentration

thiolacton 1mmol/L leads to an immediate

increase in tone, amplitude and frequency of

spontaneous movements of isolated rat duodenum.

Shortly after the addition of homocysteine

concentration of 10 mmol/L to the bath water,

electrical field stimulation was performed. 5

minutes later, 30 µmol/L L-NAME was

administered and there was an increase in

amplitude to a greater extent compared to the

administration of L-NAME without homocysteine.

Conclusion: D,L-homocystein tiolakton

increases tone, amplitude and frequency of

spontaneous contractions of isolated rat duodenum

and decreases nitrergic activity. Duodenum

114 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

treated with L-NAME and D-L-homocysteine

thiolactone after EFS, shows a higher increase in

all these parameters compared to the treatment of

only L-NAME after EFS.

Key words: homocysteine, nitrergic

neurotransmission, EFS, isolated duodenum, rat.

Uvod

Gastrointestinalni trakt ima sopstveni

nervni sistem koji se naziva enterički nervni

sistem. Prostire se oko cele digestivne cevi i u

potpunosti prožima zid creva putem dva pleksusa

koja su izgradjena iz složene mreže neurona.

Brojni eksperimenti pokazali su da pored

holinergičke i adrenergičke inervacije u

gastrointestinalnom traktu sisara postoje i

neadrenergički neholinergički (NANC) nervi (1).

Ovi neuroni utiču na funkcionalnu relaksaciju

creva.

Purinergički neurotransmiteri, uračunavši

ATP utiču na oslobađanje NO koji je odgovoran za

NANC inhibitornu motornu inervaciju. Nervna

stimulacija i egzogena aplikacija ATP zajedno

dovode do relaksacije muskulature izolovanog

preparata duodenuma pacova, kao i fundusa i

teniae koli svinje (2-5). Pored toga, funkcija NO

formira se u perifernim nervima gde može biti

uključen u senzornu transmisiju signala kao i

modulaciju transmisije (6-9). Postoji veliki broj

dokaza da je NO snažan inhibitorni

neurotransmiter i da su neuroni koji sintetišu NO

široko rasprostranjeni u mienteričkom i

submukoznom enteričkom nervnom pleksusu

zamoraca i čoveka (9). Azot monoksid je važan

modulator vaskularnog tonusa.

Homocistein (Hcy) je semi-esencijalna

aminokiselina koja sadrži sumpor a nastaje u

metabolizmu esencijalne aminokiseline metionina

(Met). Homocistein se metaboliše procesima

transulfuracije i remetilacije. Nastaje

demetilacijom Met koji u oranizam dospeva putem

hrane. Pojam homocistein odnosi se na pul koji

čine: homocistein, homocistin i homocistein

tiolakton koji se nalazi u plazmi pacijenata sa

hiperhomocisteinemijom. Fu i sar. Pokazali su da

homocistein smanjuje stvaranje NO i njegove

efekte. Takođe, pokazali su da su značajno

smanjeni efekti donora NO kod pacijenata sa

hiperhomocisteinemijom.

Hiperhomocisteinemija je metabolički

poremećaj sličan diabetes mellitus-u. Podaci iz

literature ukazuju da je NANC relaksacija

duodenuma pacova obolelih od dijabetesa

oštećena verovatno zbog poremećaja na

nitrinergičkim neuronima (10). Oštećena

nitrinergička inervacija duodenuma pacova može

dovesti do poremećaja motiliteta creva koji se

sreće kod dijabetesa. NO služi kao primarni crevni

inhibitorni neurotransmiter u gastrointerstinalnoj

muskulaturi, a nitrinergički neuroni kontrolišu

tonus creva, amplitudu i frekvenciju bazičnih

kontrakcija i inhibitorne reflekse creva (11).

Cilj našeg rada bio je da ispita efekte

modulacije nitrinergičke neurotransmisije u

gastrointestinalnom traktu, upotrebom D-L-

homocistein tiolaktona, čije patofiziološke

posledice uključuju smanjenje oslobadjanja azot

monoksida.

Materijal i metode

Pri eksperimentalnom radu poštovan je

Pravilnik za rad sa eksperimentalnim životinjama

Medicinskog fakulteta u Beogradu u skladu sa

Direktivom Evropskog parlamenta i Etičkog

komiteta Univerziteta u Beogradu.

U eksperimentima su korišćeni odrasli

mužjaci Wistar albino pacova, težine 250-300g,

odgajani u vivarijumu Instituta za medicinsku

fiziologiju, Medicinskog fakulteta u Beogradu.

Proksimalni segmenti duodenuma (2,5cm)

izolovani su nakon žrtvovanja pacova (u

uretanskoj anesteziji urađena je cervikalna

dislokacija). Dva segmenta duodenuma od svakog

pacova pripremljena su i stavljena u kupatilo sa 50

ml modifikovanog Tirodovog rastvora sledećeg

sastava: (NaCl 136,9 mM; KCl 2,7 mM; CaCl2 1,0

mM; NaHCO3 11,9 mM; MgCl2 1,1mM; NaH2PO4

0,42 mM; glukoza 5,5 mM). Rastvor je održavan

na temperaturi od 37 °C uz prisustvo 95% O2 i 5%

CO2. Mehanička aktivnost duodenalnih segmenata

pod mirovnom tenzijom od 1g merena je pomoću

izometrijskog pretvarača povezanog sa Sensor

Medics Dynograph Recorder R511A pisačem. Da

bi se izazvala adrenergička i holinergička blokada

svi eksperimenti su izvedeni u prisustvu atropina

(10-6

mola) i gvanetidina (10-6

mola).

Izolovani segmenti longitudinalne

muskulature duodenuma bili su stimulisani tokom

10 sekundi. Električna poljna stimulacija (EFS)

omogućena je posredstvom platinskih elektroda

koje su postavljene paralelno sa izolovanim

115Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

segmentom creva (longitudinalna muskulatura)

povezane sa stimulatorom Ugo Basile. Odašiljani

su impulsi trajanja 0,5 ms, maksimalne voltaže 50

V sa frekvencom od 1 do 5 Hz. Motorni odgovori

longitudinalne muskulature duodenuma

registrovani su pomoću izometrijskog pretvarača

(ELUNIT). Amplituda i tonus su izražavani u

miligramima tenzije, a frekvencija u broju

kontrakcija u jednoj minuti.

Nakon 1 časa adaptacionog perioda

registrovana je spontana aktivnost segmenata

duodenuma u toku perida od 30 min.

Statistička analiza

Efekti homocisteina na motilitet segmenata

duodenuma izraženi su kao promene (mg) u

tonusu i srednjoj amplitudi spontanih kontrakcija.

Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM

za određeni broj pacova (n). Studentov t-test za

nesparene uzorke korišćen je za obradu rezultata a

multipla komparacija među srednjim vrednostima

vršena je korišćenjem jednofaktorske analize

varijanse (ANOVA) praćene Bonferroni testom

(GraphPad Prism software version 5.0, GraphPad

Software, Inc, Goleta, CA, USA). Uzeto je p<0,05

kao statistički značajna razlika.

Rezultati

Spontane kontrakcije izolovanog duodenuma

pacova

Nakon 1 časa perioda adaptacije isečci

duodenuma pokazuju spontani motilitet, a

amplituda se kreće od 118,10-124,60 mg sa

prosečnom vrednosti od 120,30±0,93 mg (n=10).

Frekvencija spontanih pokreta iznosi 9,17-10,33 u

minuti, i u proseku 9,81±0,17. Tonus spontanih

kontrakcija iznosi 98,33-106,70 mg, prosečno

102,90 ±1,17 mg (Slika 1).

Slika 1. Prikaz spontanih kontrakcija izolovanog segmenta duodenuma pacova tokom 5 minuta.

Efekti D,L- homocistein tiolaktona na tonus

spontanih kontrakcija izolovanog duodenuma

pacova

D,L-homocistein tiolakton u koncentraciji

10 µmol/L dovodi do trenutnog porasta tonusa i

ovaj efekat se održava i postaje maksimalan nakon

30-o minutne inkubacije (Grafikon 1). Razlika

između kontrolnih vrednosti i vrednosti u prisustvu

D,L-homocistein tiolaktona u 30-o minutnom

periodu određivana je svakih 5 min, srednje

vrednosti su testirane Studentovim t- testom.

Razlika je statistički značajna (*p<0,01).

ampli

tud

a/m

g

vreme/minuti

116 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

0 5 10 15 20 25 300

50

100

150

200

250

kontrola-tonus/mg

homocistein-tonus/mg

* ** * * *

Vreme/minuti

Tonus/

mg

Grafikon 1. Uticaj D,L-homocistein tiolaktona na tonus spontanih kontrakcija izolovanog duodenuma pacova

Efekti D,L- homocistein tiolaktona na amplitudu

spontanih kontrakcija izolovanog duodenuma

pacova

D,L-homocistein tiolakton u koncentraciji

od 10 µmol/L dovodi do trenutnog porasta

amplitude i ovaj efekat se pojačava i postaje

maksimalan nakon 30-o minutne inkubacije.

Vrednosti su određivane svakih 5 min. Određivana

je razlika između kontrolnih vrednosti i vrednosti u

prisustvu D,L-homocistein tiolaktona u 30-o

minutnom periodu i srednje vrednosti su testirane

Studentovim t- testom (Grafikon 2). Razlika je

statistički značajna (*p <0,01).

0 5 10 15 20 25 300

50

100

150

200

250kontrola-amplituda/mg

homocistein-amplitiuda/mg

* * * * * *

Vreme/minuti

Am

plitu

da/m

g

Grafikon 2. Uticaj D,L-homocistein tiolaktona na amplitudu spontanih kontrakcija izolovanog duodenuma

pacova

Efekti D,L- homocistein tiolaktona na

frekvenciju spontanih kontrakcija izolovanog

duodenuma pacova

Razlika između kontrolnih vrednosti i

vrednosti u prisustvu D,L-homocistein tiolaktona u

30-o minutnom periodu određivane su svakih 5

min (Grafikon 3). D,L-homocistein tiolakton u

koncentraciji 10 µmol/L dovodi do trenutnog

porasta frekvencije i ovaj efekat se pojačava i

postaje maksimalan nakon 30-o minutne

inkubacije. Srednje vrednosti su testirane

Studentovim t- testom. Razlika je statističi

značajna (*p<0,05).

*p<0,01

*p<0,05

117Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

0 5 10 15 20 25 300

5

10

15

20

25kontrola-frekvencija/min

homocistein-frekvencija/min* *

* * * *

Vreme/min

Fre

kven

cija

/min

Grafikon 3. Uticaj D,L-homocistein tiolaktona na frekvenciju spontanih kontrakcija izolovanog duodenuma

pacova

Efekti L-NAME i L-arginina na tonus, amplitudu

i frekvenciju spontanih kontrakcija izolovanih

segmenata duodenuma u prisustvu D,L-

homocistein tiolaktona

Preparat je inkubiran 30 min u prisustvu 10

µmol/L D,L-homocistein tiolaktona, a zatim je

dodat L-arginin. Došlo je do znatno manjeg

porasta tonusa, amplitude i frekvencije spontanih

kontrakcija longitudinalne muskulature izolovanih

segmenata duodenuma u odnosu na kontrolnu

grupu. Kada se preparat 5 minuta posle dodavanja

L-arginina inkubira u 30 μmol/L L-NAME, efekti

L-arginina su redukovani. Srednje vrednosti su

testirane Studentovim t- testom. Razlika je

statistički značajna (*p<0,05). (Grafikon 4,5,6).

Grafikon 4. Efekti L-NAME i L-arginina na tonus spontanih kontrakcija izolovanih segmenata duodenuma u

prisustvu D,L-homocistein tiolaktona

*p<0,05

*p<0,05

118 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Grafikon 5. Efekti L-NAME i L-arginina na amplitudu spontanih kontrakcija izolovanih segmenata duodenuma u

prisustvu D,L-homocistein tiolaktona

Grafikon 6. Efekti L-NAME i L-arginina na frekvenciju spontanih kontrakcija izolovanih segmenata duodenuma u

prisustvu D,L-homocistein tiolaktona

Efekti električne poljne stimulacije na spontanu

aktivnost izolovanih segmenata duodenuma

Izolovani segmenti longitudinalne

muskulature duodenuma bili su stimulisani tokom

10 sekundi. Na početku stimulacije došlo je do

relaksacije koja je trajala oko 1 sekunde (slika 2A).

Ovo je bilo praćeno frekventnim fazičkim

kontrakcijama i višim tonusom mišića tokom

stimulacije. Posle stimulacije nastao je „off

odgovor“- kontrakcija je trajala 1,5 s u svim

eksperimentima.

*p<0,05

*p<0,05

119Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

A. B.

Slika 2.

A.-Relaksacija usled električne poljne stimulacije longitudinalne muskulature izolovanog duodenuma pacova (50

V, 1Hz, 0,5 ms, 10s)

B.-Relaksacija usled električne poljne stimulacije longitudinalne muskulature izolovanog duodenuma pacova (50

V, 1Hz, 0,5 ms, 10s) u prisustvu L-NAME (30 µmol/L)

Uticaj L-NAME na efekte električne poljne

stimulacije izolovanih segmenata duodenuma

L-NAME u koncentraciji od 30 µmol/L do

60 µmol/L je inhibirao relaksaciju nastalu

elktričnom poljnom stimulacijom u svim

ispitivanim segmentima duodenuma (slika 2B).

Maksimalan efekat L-NAME mogao se videti 10

min nakon dodavanja. Inhibicija neadrenergički

neholinergički posredovane relaksacije bila je

povraćena nakon 60-90 min inkubacije u

Tirodovom rastvoru.

Uticaj L-NAME na efekte električne poljne

stimulacije izolovanih segmenata duodenuma u

prisustvu D,L-homocistein tiolaktona

Preparati duodenuma prvobitno su izloženi

homocisteinu u koncentraciji od 10 µmol/L.

Zapažen je odgovor u vidu trenutnog porasta

amplitude kontrakcija. Neposredno po dodavanju

homocisteina u vodeno kupatilo, izvršena je

električna poljna stimulacija (50 V, 1Hz, 0,5 ms,

10s). Posle 5 minuta je administrirano 30 µmol/L

L-NAME i praćeni su efekti dodavanja ove

supstance (Grafikon 7).

EFS 1 H

z

L-NA

ME+EFS

Hom

ociste

in+L-N

AM

E+EFS

0

200

400

600

800

L-NAME+EFS

EFS 1 Hz

Homocistein+L-NAME+EFS

*

*Rel

aksa

cija

/mg

*p<0,05 u odnosu na EFS 1 Hz

Grafikon 7. Uticaj L-NAME na efekte električne poljne stimulacije izolovanih segmenata duodenuma u prisustvu

D,L-homocistein tiolaktona

*p<0,05

120 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Diskusija

Azot monoksid (NO) koji se oslobađa sa

NANC inhibitornih neurona u različitim tkivima,

uključujući i glatku muskulaturu

gastrointestinalnog trakta služi kao primarni

enterički inhibitorni neurotransmiter, a

nitrinergički neuroni regulišu tonus, amplitudu

fazičnih kontrakcija, njihovu frekvenciju i

inhibitorne reflekse (11). Lokalizacija azot

monoksid sintaze (NOS) pokazana je u

mienteričkom pleksusu, kao i drugim nervnim

strukturama gastrointestinalnog trakta pacova (12-

14). Postoje dokazi o postojanju neurona koji

produkuju NO i koji su široko rasprostranjeni u

mienteričkom i submukoznom pleksusu zamoraca,

pacova i ljudi (15-18). Poremećaj na nivou NO

neurona dovodi do velikog broja poremećaja, kao

što su: ahalazija, dijabetička gastropareza,

juvenilna hipertrofična stenoza pilorusa,

hiperholesterolemija (19).

Rezultati našeg rada pokazuju da D,L-

homocistein tiolakton u koncentraciji od 10

µmol/L stimuliše motilitet izolovanog duodenuma

pacova. Dolazi do značajnog porasta tonusa,

amplitude i frekvencije spontanih pokreta

izolovanog segmenta longitudinalne muskulature.

Ovi efekti razvijaju se u toku 30 minuta. Dejstvo

D,L-homocistein tiolaktona javlja se u vidu

trenutnog porasta tonusa i amplitude spontanih

kontrakcija. Tokom 30-o minutnog praćenja u

prisustvu homocisteina uočava se da je

najizraženiji porast frekvencije i amplitude

spontanih pokreta prisutan u periodu od 20. do 30.

minuta. U prilog našim rezultatima idu rezultati

Pakra i saradnika (20) koji su pokazali da D,L-

homocistein povećava amplitudu i frekvenciju

kontrakcija longitudinalne muskulature kolona

svinje.

Kelly i Code su 1977. godine prvi put

zabeležili da električna stimulacija duodenuma

dovodi do prolongiranog gastričnog pražnjenja

(21). Električna poljna stimulacija dovodi do

oslobadjanja NO iz trakastih delova glatkog mišića

duodenuma in vitro (5). Ovi nalazi vode do logične

pretpostavke da električna poljna stimulacija

duodenuma indukuje produkciju NO, što posledično

može biti odgovorno za supresiju motiliteta i odloženo

pražnjenje creva. Takođe, pokazano je da je NANC

relaksacija duodenuma, indukovana primenom

GABA ili električne poljne stimulacije oštećena

kod streptozocinom indukovanih dijabetičnih

pacova (10).

Mada još uvek nije dokazan tačan

mehanizam dejstva homocisteina na smanjenje

oslobadjanja azot monoksida iz glatkih mišićnih

ćelija, pretpostavlja se da postoji nekoliko

odgovornih mehanizama među kojima su

oksidativni stres i inhibicija NOS enzima.

Potvrdjeno je da L-NAME predstavlja analog L-

arginina, što ga svrstava u inhibitore NOS enzima

te bi stoga, u sinergiji sa homocisteinom, trebao

dati jači inhibitorni efekat na NOS enzim.

Naši rezultati pokazuju da posle primene L-

NAME dolazi do smanjenja relaksacije izazvane

električnom poljnom stimulacijom. Ti efekti bili su

potencirani posle dodavanja D,L-homocistein

tiolaktona. Itoh i saradnici u skladu sa našim

rezultatima pokazuju da L-NAME dovodi do

parcijalne inhibicije relaksacije cirkulaturne

muskulature humanog ileuma nastale električnom

poljnom stimulacijom (22). Ovaj efekat je zatim

povraćen L-argininom. Takodje, Martins i

saradnici prikazuju u svom radu da postoji

redukovana NANC relaksacija posredovana dozno

i vremenski zavisnom električno poljnom

stimulacijom (23).

Iz priloženih rezultata možemo da

zaključimo da D-L-homocistein tiolakton izaziva

porast tonusa, amplitude i frekvencije spontanih

pokreta izolovanog duodenuma pacova. Pored

toga, može se izvesti i zaključak da duodenum

tretiran L-NAME i D-L-homocistein tiolaktonom,

nakon električne poljne stimulacije, pokazuje veći

porast svih već navedenih parametara u odnosu na

tretiranje samo L-NAME nakon električne poljne

stimulacije.

Literatura

1. Thatte HS, He XD, Goyal RK. Imaging of

nitric oxide in nitrergic neuromuscular

neurotransmission in the gut. PLoS One

2009;4:49-90.

2. Adeghate E, al-Ramadi B, Saleh AM,

Vijayarasathy C, Ponery AS, Arafat Ket

al.Increase in neuronal nitric oxide synthase

content of the gastroduodenal tract of diabetic

rats. Cell Mol Life Sci 2003;60:1172–1179.

3. Alexander B .The role of nitric oxide in

hepatic circulation. Nutrition 1998;14:376–

390.

4. Allescher HD, Lu S, Daniel EE, and Classen

M. Nitric oxide as putativenonadrenergic

noncholinergic inhibitory transmitter in the

121Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

opossum sphincter of Oddi. Can J Physiol

Pharmacol 1998;71:525–530.

5. Allescher HD, Tougas G, Vergara P, Lu S,

and Daniel EE. Nitric oxide as aputative

nonadrenergic noncholinergic inhibitory

transmitter in the canine pylorusin vivo. Am

JPhysioln 1992;262:695–702.

6. Ancha H, Ojeas H, Tedesco D, Ward A, and

Harty RF. Somatostatin-inducedgastric

protection against ethanol: involvement of

nitric oxide and effects ongastric mucosal

blood flow. RegulPept 2003;110:107–113.

7. Ayajiki K, Tanaka T, Okamura T, and Toda

N. Evidence for nitroxidergicinnervation in

monkey ophthalmic arteries in vivo and in

vitro. AmJPhysiol 2001;279:2006–2012.

8. Baccari MC, Romagnani P, and Calamai F.

Impaired nitrergic relaxations inthe gastric

fundus of dystrophic (mdx) mice. NeurosciLet

2000;282:105–108

9. Bagyanszki M, Roman V, and Fekete E.

Quantitative distribution of

NADPHdiaphorase-positive myenteric neurons

in different segments of the developingchicken

small intestine and colon. HistochemJ

2000;32:679–684.

10. Fu YF, Xiong Y, Guo Z. A reduction of

endogenous asymmetric dimethylarginine

contributes to the effect of captopril on

endothelial dysfunction induced by

homocysteine in rats. Eur J Pharmacol. 2005

Jan 31;508(1-3):167-75. Epub 2005 Jan 7.

11. Kaputlu İ, Özden S, Şadan G, Gökalp O.

Effects of diabetes on non-adrenergic,non-

cholonegic relaxation induced by GABA and

electrical stimulation in the rat isolated

duodenum.Clin Exp Pharm Physiol

1999;26:724-728.

12. Sanders KM, Ward SM. Nitric oxide as a

mediator of nonadrenergic noncholinergic

neurotransmission. Am J Physiol

1992;626:379-392.

13. Bredt DS, Hwang PM, Synder SH.

Localization of nitric oxide synthase indicating

a neuronal role for nitric oxide. Nature

1990;347:768-770.

14. Belai A, Schmidt HHHW, Hoyle CHW.

Colocalization of nitric oxide synthase and

NADPH-diaphorase in the myenteric plexus of

the rat gut. Neurosci lett 1992;143:60-64.

15. Martins SR, Bicudo R, Oliveira RB, Ballejo

G. Evidence for partipicipation of the l-

arginine-nitric oxide pathway in neurally

induced relaxation of the isolated rat

duodenum. Braz J Med Biol Res

1993;26:1325-1335.

16. Rand JM. Nitric oxide as a mediator of non-

adrenergic, non-cholinergic neuro-effector

transmission. Clin Exp pharmacol Physiol

1992;19:147-169.

17. Nichols K, Krantis A, Staines W.

Histohemical localization of nitric oxide-

synthesizing neurons and vascular sides in the

guinea-pig intestine. Neuroscience

1992;51:791-799.

18. Nichols K, staines W, Krantis A. Nitric oxide

synthase distribution in rat intestine: a

histohemical analysis. Gastroenterology

1993;105:1651-1661.

19. Nichols K, Staines W, Wu-Y JY, Krantis A.

Immunopositive GABAergic neural sides

display nitric oxide synthase-releated NADPH

diaphorase activity in the human colon. J

Auton Nerv Syst 1995;50:253-262.

20. Takahashi T. Patophysiological significance

of neuronal nitric oxide synthase in

gastrointestinal tract. J Gastroenterol

2003;38:421-430.

21. Romagnoulo J, Federak RN, Dias VC,

Bumforth F, Teltcher M. Hyperhomocysteimia

and inflamatory bowel disease:prevalence and

predictors in cross-sectional study. Am J

Gastroenterol 2001;23:2143-2140.

22. Kelly KA, Code CF. Duodenal-gastric reflux

and slowed gastric emptying by electrical

pacing of the canine duodenal pacesetter

potential. Gastroenterology72: 429–433,

1977.)

23. Itoh H, Sakai J, Imoto A, Creed KE. The

control of smooth muscle tissues by

nonadrenergic noncholinergic (NANC) nerve

fibres in the autonomic nervous system. J

Smooth Muscle Res 1995;31:67-78.

24. Martins SR, Bicudo R, Oliveira RB, et

al. Evidence for the participation of the L-

arginine-nitric oxide pathway in neurally

induced relaxation of the isolated rat

duodenum.Braz J Med Biol Res 1993;26:1325-1335.

122 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

PROFIL MASNIH KISELINA U NEALKOHOLNOJ MASNOJ BOLESTI JETRE MIŠEVA

IZAZVANOJ ISHRANOM DEFICIJENTNOM U METIONINU I HOLINU

Autor: Stoiljković Milica1, Stojanović Marija

1

Mentor: Prof. dr Radosavljević Tatjana2, Asist. dr Mladenović Dušan

2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2Institut za patološku fiziologiju „Ljubodrag Buba Mihailović“, Medicinski fakultet, Univerzitet u

Beogradu

Sažetak

Uvod: Patogenetski mehanizmi uključeni u

progresiju nealkoholne masne bolesti jetre

(NAFLD) podrazumevaju: insulinsku rezistenciju,

oksidativni stres, proinflamatorne citokine,

lipotoksičnost.

Cilj studije bio je određivanje profila

slobodnih masnih kiselina u jetri miševa na

modelu NAFLD izazvanom ishranom

deficijentnom u metioninu i holinu.

Materijal i metode: Mužjaci miševa

C57BL/6 soja podeljeni su u sledeće grupe: 1.

kontrolna, koja je bila na standarnoj ishrani i 2.

grupe koje su bile na ishrani deficijentnoj u

metioninu i holinu u trajanju od 2, 4 i 6 nedelja

(MCD2, MCD4 i MCD6 grupe redom). Relativna

zastupljenost masnih kiselina u jetri određivana je

metodom gasne hromatografije nakon završetka

ishrane.

Rezultati: Zastupljenost palmitinske

kiseline bila je značajno niža u MCD grupama

(p<0,01), dok je zastupljenost stearinske kiseline

bila viša u MCD4 i MCD6 grupi u odnosu na

kontrolu (p<0,01). MCD dijeta izazvala je

značajan porast zastupljenosti oleinske (p<0,01) i

pad izomera oleinske kiseline (p<0,01) u svim

intervalima u odnosu na kontrolu. Zastupljenost

linolne kiseline bila je značajno viša u MCD2

(p<0,01) i MCD4 grupi (p<0.05), a arahidonske

značajno niža u MCD2 grupi (p<0,01) u

poređenju sa kontrolom. Za razliku od

dokozopentaenske kiseline, čiji je nivo bio viši u

MCD2 grupi u odnosu na kontrolu (p<0,01),

zastupljenost dokozoheksaenske kiseline

progresivno je opadala tokom trajanja MCD dijete

i značajno je niža u MCD4 i MCD6 grupi u

odnosu na kontrolu (p<0,01).

Zaključak: Analiza lipidnog profila ukazuje

da bi suplementacija dokozoheksaenske kiseline

bila potencijalno korisnija u odnosu na

dokozopentaensku i mononezasićene masne

kiseline u prevenciji progresije steatoze u

ozbiljnije oblike NAFLD.

Ključne reči: Nealkoholna masna bolest jetre,

dijeta deficijentna u metioninu i holinu, masne

kiseline, miševi

Abstract

Introduction: Pathogenetic mechanisms

involved in the progression of non - alcoholic fatty

liver disease (NAFLD) include: insulin resistance,

oxidative stress, proinflammatory cytokines,

lipotoxicity.

Aim: To determine the liver fatty acid

profile in the methionine, choline - deficient diet -

induced model of NAFLD in mice.

Material and methods: Male C57BL/6 mice

were divided into following groups: 1. control, fed

on standard diet; 2. groups fed on methionine,

choline - deficient diet for 2, 4 and 6 weeks

(MCD2, MCD4 and MCD6 groups respectively).

The relative proportion of free fatty acids in the

liver was determined after the end of the diet by

gas chromatography.

Results: The proportion of palmitic acid

was significantly lower in MCD groups (p<0.01),

while the proportion of stearic acid was higher in

MCD4 and MCD6 groups compared to the control

group (p<0.01). MCD diet caused a significant

increase in oleic acid (p<0.01) and a decrease in

oleic acid isomer (p<0.01) at all time points when

compared with the control group. Linolic acid

proportion was significantly higher in MCD2

(p<0.01) and MCD4 groups (p<0.05), while the

123Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

arachidonic acid proportion was lower in MCD2

group (p<0.01) compared to the control one. In

contrast to docosopentaenoic acid, which was

higher in MCD2 group compared to the control

one (p<0.01), docosohexaenoic acid proportion

showed a progressive decline and was

significantly lower in MCD4 and MCD6 groups

compared to the control group (p<0.01).

Conclusion: Lipid profile analysis indicates

that supplementation of docosohexaenoic acid may

be potentially more useful in the prevention of

steatosis progression into more severe forms of

NAFLD than docosopentaenoic and

monounsaturated fatty acids.

Key words: Non-alcoholic fatty liver disease,

methionine and choline-deficient diet, fatty acids,

mice.

Uvod

Nealkoholna masna bolest jetre (engl.

nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD), najčešća

bolest jetre u zapadnim zemljama (1,2) može se

manifestovati širokim opsegom promena, od

benigne steatoze do nealkoholnog steatohepatitisa

(engl. nonalcoholic steatohepatitis, NASH), koji se

može komplikovati fibrozom i cirozom, kao i

razvojem hepatocelularnog karcinoma (3,4).

NAFLD predstavlja hepatičnu manifestaciju

metaboličkog sindroma, a glavni faktori rizika za

njen razvoj su gojaznost (posebno centralna),

insulinska rezistencija i dijabetes tipa II (5).

Dodatne faktore rizika predstavljaju

hipertrigliceridemija, hiperurikemija, hipertenzija i

niska koncentracija lipoproteina velike gustine

(engl. high density lipoproteins, HDL)(6).

Insulinska rezistencija i hiperinsulinemija

zauzimaju centralno mesto u patogenezi NAFLD.

Smanjenje osetljivosti masnog tkiva na insulin

uzrokuje povećanje lipolize i preuzimanje

slobodnih masnih kiselina u jetru (7). Osim ovoga,

hiperinsulinemija stimuliše sintezu masnih kiselina

ushodnom regulacijom transkripcionih faktora

odgovornih za lipogenezu, kao što su PPAR gama

(engl. peroxisome proliferator activated receptor

gamma) i SREBP-1c (engl. sterol regulatory

element binding protein) (6). Masne kiseline se

esterifikuju sa glicerolom, a povećano stvaranje

triacilglicerola (TAG) vodi razvoju steatoze.

Hepatičnu akumulaciju TAG favorizuje, takođe,

redukcija aktivnosti mikrozomskog proteina za

transfer triglicerida (MTP) i sinteze Apo B100 (8).

Masna jetra postaje vulnerabilnija na sekundarne

insulte, poput adipokina, reaktivnih kiseoničnih

vrsta što dalje doprinosi hepatocelularnoj

inflamaciji ili fibrozi (1,9).

Uočeno je da masne kiseline koje se

nakupljaju u jetri u NAFLD ispoljavaju

lipotoksične efekte i nezavisno od drugih

mehanizama doprinose progresiji steatoze u

steatohepatitis (10). Iako patogenetski mehanizmi

lipotoksičnosti nisu u potpunosti razjašnjeni,

poznato je da masne kiseline stimulišu sintezu

proinflamatornih citokina, smanjuju osetljivost

hepatocita na insulin i podstiču lipoapoptozu i

autofagiju. Posredničku ulogu u proapoptotskom

dejstvu masnih kiselina imaju oksidativni stres,

oštećenje endoplazmatskog retikuluma (ER) i

mitohondrijska disfunkcija (11,12). Integritet

membrane ER narušava ugradnja viška slobodnih

masnih kiselina u membranske fosfolipide kao

posledica zaobilaženja glavnih metaboličkih

puteva (beta oksidacija i sinteza TAG). Osim

ovoga, zasićene masne kiseline remete ciklus

trikarboksilnih kiselina, stimulišu sintezu

hepatotoksičnog ceramida (13), a neke in vitro

studije pokazale su i direktan toksičan efekat

visokih koncentracija slobodnih masnih kiselina na

hepatocite (14).

Do sada nije pronađen idealan model koji

bi se mogao koristiti za proučavanje složenosti i

međusobne interakcije patogenetskih mehanizama

u NAFLD (15). Među modelima koji se koriste,

MCD model smatra se najpogodnijim za

ispitivanje patogenetskih mehanizama

hepatotoksičnosti (16,17). Poznavanje vremenskog

sleda promena profila masnih kiselina u jetri

omogućilo bi bolje sagledavanje mehanizama

lipotoksičnosti i time potencijalno doprinelo

poboljšanju terapije i prevenciji progresije steatoze

u teže oblike NAFLD. Stoga je cilj ovog

124 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

istraživanja bilo određivanje profila slobodnih

masnih kiselina u jetri miševa na modelu NAFLD

izazvanom ishranom deficijentnom u metioninu i

holinu (MCD ishrana).

Materijal i metode

Životinje

Eksperiment je izveden na mužjacima

miševa C57BL/6 soja, telesne mase 20-30 g,

uzgajanih na Vojnotehničkom institutu Beograd.

Životinje su čuvane pod standardnim

laboratorijskim uslovima (temperatura 22 ± 2 °C,

relativna vlažnost 50 ± 10%, ciklus svetlost/tama

12/12 h). Studija je sprovedena u skladu sa

Direktivom Evropskog parlamenta (2010/63EU) i

odobrena je od strane Etičke komisije za zaštitu

dobrobiti eksperimentalnih životinja Medicinskog

fakulteta Univerziteta u Beogradu (1094/2).

U prvih osam nedelja sve životinje su bile na

standarnoj ishrani za miševe, koja se sastojala od

maksimalno 7% celuloze i najmanje 19% proteina.

Nakon ovog perioda sve životinje (n=32) su

podeljene u sledeće grupe: 1. kontrolna grupa

(n=8), koja je ostala na standardnoj ishrani i 2.

grupe koje su bile na ishrani deficijentnoj u

metioninu i holinu tokom 2, 4 i 6 nedelja (MCD2,

MCD4 i MCD6 grupe redom; n=8 po grupi).

Kontrolna ishrana je sadržala 2 g/kg holin hlorida i

3 g/kg metionina (Tabela 1.), dok se MCD ishrana

(MP Biomedicals, California, USA) razlikovala od

kontrolne po odsustvu metionina i holina i

povećanom sadržaju saharoze (22,76%) (Tabela

1.). Životinjama je bila dostupna odgovarajuća

hrana i voda ad libitum ,tokom čitavog

eksperimenta. Nakon tretmana životinje su

žrtvovane dekapitacijom i uzorci jetre prikupljeni

su za određivanje profila masnih kiselina i za

patohistološku analizu.

Tabela 1. Sastav standardne i metionin holin

deficijentne ishrane (MP Biomedical, CA, USA)

Nutrijent MCD (g/kg) Standardna (g/kg)

Celulozni prah

iz prirodnih

vlakana

10

10

Dibazični

kalcijum fosfat

250

250

Kukuruzno

ulje

50

50

Kukuruzni

skrob

100

100

Bakar karbonat

1,15

1,15

Dikalcijum

fosfat

1,5

1,5

Gvožđe citrat 3 3

L-amino

kiseline

85,2

85,2

Magnezijum-

oksid

12

12

Mangan

karbonat

1,7

1,7

Mix minerala 14,45 14,45

Kalijum citrat 110 110

Kalijum sulfat 26 26

Natrijum

hlorid

37

37

Saharoza 280 275

Mix vitamina 10 10

Cink karbonat 8 8

Holin hlorid / 2

Metionin / 3

Ukupno 1000 1000

Patohistološka analiza

Isečci tkiva jetre su bili fiksirani u 10%

rastvoru formalina na sobnoj temepraturi. Posle

fiksacije, uzorci jetre obrađivani su standardnom

metodom. Isečci su pripremljeni u kalupu u

parafinu, a potom mikrotomom sečeni uzorci

debljine 5 μm i bojeni hematoksilinom i eozinom,

nakon čega su bili spremni za svetlosno

mikroskopiranje. Uzorci su pregledani od strane

patologa koji nije bio uključen u istraživanje.

Preparati su analizirani i fotografisani na

kombinovanom binokularnom svetlosnom

mikroskopu Olympus BX51 equipped Artcore 500

MI artray, Co.Ltd. Japan Camera.

125Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Biohemijske analize

Za analizu profila masnih kiselina, lipidi su

ekstrahovani metodom po Blighu i Dyeru (18). Metil

estri masnih kiselina iz lipidnog ekstrakta su

transesterifikovani sa HCl u metanolu metodom po

Ichihari i Fukubayashiju (19). Nivoi estara bili su

kvantifikovani korišćenjem gasnog hromatografa

sa plameno-jonizacionim detektorom. Odvajanje

estara vršeno je na kapilarnoj kolumni 112-88A7,

HP-88 (100 m x 0,25 mm x 0,2 μm) pomoću He kao

nosača pri brzini protoka od 105 ml/min. Uzorci su

postavljeni na početnu temperaturu kuvanja od 175˚C,

dok je temperatura injektora bila 250˚C, a

detektora 280˚C. Temperatura kuvanja se tokom

postupka povećavala sa 175˚C na 220˚C brzinom

od 5˚C/min. Masne kiseline su identifikovane na

osnovu vremena njihove retencije poređenjem sa

odgovarajućim standardima (SupelcoTM FAME

Mix, USA) a njihova zastupljenost je izražena u

procentima u odnosu na ukupnu količinu masnih

kiselina u jetri.

Statistička analiza

Rezultati su predstavljeni kao srednja

vrednost ± SEM. Kako je Kolmogorov-

Smirnovljevim testom utvrđena normalnost

raspodele podataka u ispitivanim uzorcima, za

procenu statističke značajnosti razlika između

grupa, korišćena je dvofaktorska analiza varijanse

(ANOVA) sa Takijevim (Tukey) post hoc testom.

Razlika je smatrana statistički značajnom ukoliko

je p<0,05. Za statističke analize korišćen je

program SPSS 15.0.

Rezultati

Naše istraživanje nije pokazalo

patohistološke promene u jetri u kontrolnoj grupi

(Slika 1A), dok je steatoza bila evidentna u svim

eksperimentalnim grupama. MCD dijeta je za 2

nedelje izazvala blagu steatozu sa fokalnom

mikrovezikularnom masnom promenom (Slika

1B), a za 4 nedelje difuznu masnu promenu u jetri

(Slika 1C). U MCD6 grupi zapaža se difuzna

makrovezikularna steatoza sa intralobularnim

zapaljenjskim infiltratom. Balonska degeneracija

hepatocita i ćelijsko bubrenje prisutni su kao

posledica nagomilavanja masti. U ovoj grupi

mogu se mestimično videti apoptotska telašca

(Slika 1D).

Slika 1. Patohistološke promene u jetri kontrolnih

životinja i životinja na ishrani deficijentnoj u

metioninu i holinu (MCD dijeta)

A.U kontrolnoj grupi morfologija jetre je potpuno

očuvana.

B. Fokalna mikrovezikularna steatoza nakon 2

nedelje MCD dijete.

C. Difuzna makrovezikularna steatoza nakon 4

nedelje MCD dijete.

D. MCD dijeta je za 6 nedelja izazvala difuznu

makrovezikularnu steatozu sa razvojem

zapaljenjskog infiltrata. Mestimično se mogu

uočiti apoptotska telašca (H&E bojenje; x40).

Rezultati našeg istraživanja pokazali su

da je odnos masa životinje i jetre bio značajno niži

u svim grupama na MCD dijeti u poređenju sa

kontrolnom grupom. Najniži odnos je uočen u

MCD2 i MCD4 grupi, dok u MCD6 grupi ovaj

odnos pokazuje tendenciju porasta iako ne postoji

statistički značajna razlika između MCD4 i MCD6

grupe (Grafikon 1).

0

1

2

3

4

5

6

7

kontrola MCD2 MCD4 MCD6Grupe miševa

Od

no

s m

asa ž

ivo

tin

je/m

asa j

etr

e (

%)

**

*

**

126 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Grafikon 1. Uticaj dijete deficijentne u metioninu

i holinu (MCD dijete) na odnos masa životinje i

masa jetre. Životinje su hranjene MCD dijetom 2,

4 ili 6 nedelja ad libitum (MCD2, MCD4 i MCD6

grupe redom).

Statistička značajnost razlike je procenjena

dvostrukom analizom varijanse (ANOVA) sa

Takijevim (Tukey) post hoc testom (* p<0,05 i

**p< 0,01 u odnosu na kontrolu).

Relativna zastupljenost palmitinske kiseline

(C16:0) bila je značajno niža u grupama koje su

bile na ishrani deficijentnoj u metioninu i holinu u

periodu od 2 (16,66±1,17%), 4 (15,66±0,49%) i 6

nedelja (16,74±0,68%) u odnosu na kontrolnu

grupu (21,90±0,78%)(p<0,01). S druge strane, nije

uočena značajna razlika u zastupljenosti C16:0

između MCD2, MCD4 i MCD6 grupa (p>0,05;

Grafikon 2).

Grafikon 2. Uticaj dijete deficijentne u metioninu

i holinu (MCD dijete) na zastupljenost palmitinske

i stearinske kiseline u jetri. Životinje su hranjene

MCD dijetom 2, 4 ili 6 nedelja ad libitum (MCD2,

MCD4 i MCD6 grupe redom).

Statistička značajnost razlike je procenjena

dvostrukom analizom varijanse (ANOVA) sa

Takijevim (Tukey) post hoc testom (** p<0,01 u

odnosu na kontrolu, # p<0,05 u odnosu na MCD4).

Za razliku od palmitinske, relativna

zastupljenost stearinske kiseline (C18:0) bila je

značajno viša u MCD4 (19,34 ± 1,85%) i MCD6

grupi (25,18 ± 4,32%) u poređenju sa kontrolom

(13,24 ± 0,73%) (p<0,01). U MCD6 grupi

zastupljenost stearinske kiseline bila je značajno

viša u odnosu na MCD4 grupu (p<0,05). Relativna

zastupljenost stearinske kiseline u MCD2 grupi

(12,29±0,68%) nije se razlikovala u odnosu na

kontrolu (p>0,05; Grafikon 2).

MCD dijeta je izazvala značajan porast

procentualne zastupljenosti oleinske kiseline

(C18:1 n9) nakon 2 (14,44 ± 1,94%), 4 (15,43 ±

2,22%) i 6 nedelja (13,44 ± 1,80%) u odnosu na

kontrolnu grupu (10,11 ± 0,67%) (p<0,01).

Nasuprot oleinskoj, zastupljenost izomera oleinske

kiseline (C18:1 n7) bila je značajno niža u MCD2

(0,91 ± 0,19%), MCD4 (0,89 ± 0,27%) i MCD6

(0,90 ± 0,18%) grupama u odnosu na kontrolu

(2,33 ± 0,37%)(p<0,01). Zastupljenost oleinske

kao i izomera oleinske kiseline nije se značajno

razlikovala u grupi na MCD dijeti u različitim

vremenskim intervalima (Grafikon 3).

Grafikon 3. Uticaj dijete deficijentne u metioninu

i holinu (MCD dijete) na zastupljenost oleinske i

izomera oleinske kiseline u jetri. Životinje su

hranjene MCD dijetom 2, 4 ili 6 nedelja ad libitum

(MCD2, MCD4 i MCD6 grupe redom).

Relativan nivo linolne kiseline u jetri miševa

bio je značajno veći u MCD2 (26,07 ± 2,54%)

(p<0,01), kao i u MCD4 grupi (22,86 ± 1,87%)

(p<0,05) u odnosu na kontrolu (18,47 ± 2,06%).

Procentualna zastupljenost linolne kiseline posle

šest nedelja na MCD dijeti (21,77 ± 1,20%) nije se

razlikovala u odnosu na kontrolu (Grafikon 4).

Grafikon 4. Uticaj dijete deficijentne u metioninu

i holinu (MCD dijete) na zastupljenost linolne i

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

Kontrola MCD2 MCD4 MCD6

Grupe miševa

Re

lati

vn

a z

ast

up

lje

no

st m

asn

ih k

ise

lina

(%

)Oleinska

Izomer oleinska

**

** **

**

**

**

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Kontrola MCD2 MCD4 MCD6

Grupe miševa

Rel

ativ

na

zast

up

ljen

ost

mas

nih

kis

elin

a (%

)

Linolna

Arahidonska

*

**

*

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Kontrola MCD2 MCD4 MCD6

Grupe miševa

Rel

ativ

na

zast

up

ljen

ost

mas

nih

kis

elin

a (%

)

Palmitinska

Stearinska

******

**

**#

127Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

arahidonske kiseline u jetri. Životinje su hranjene

MCD dijetom 2, 4 ili 6 nedelja ad libitum (MCD2,

MCD4 i MCD6 grupe redom).

Statistička značajnost razlike je procenjena

dvostrukom analizom varijanse (ANOVA) sa

Takijevim (Tukey) post hoc testom (*p<0,05 i **

p<0,01 u odnosu na kontrolu).

Arahidonska kiselina bila je značajno

manje zastupljena u MCD2 grupi (12,20 ± 2,21%)

u poređenju sa kontrolnom grupom (15,53 ±

0,62%) (p<0,05). U MCD4(14,51±1,9) i MCD6

(16,00±1,02) grupama relativna zastupljenost ove

kiseline nije se značajno razlikovala u odnosu na

kontrolu (Grafikon 4).

Zastupljenost dokozopentaenske

kiseline (DPA) bila je značajno veća (p<0,01) u

MCD2 (1,23 ± 0,24%), u odnosu na kontrolnu

grupu (0,54 ± 0,05%), dok se zastupljenost ove

kiseline u MCD4 (0,44 ± 0,15%) i MCD6 (0,43 ±

0,08%) grupama ne razlikuje značajno od

vrednosti u kontrolnoj grupi životinja (Grafikon 5).

Grafikon 5. Uticaj dijete deficijentne u metioninu

i holinu (MCD dijete) na zastupljenost

dokozopentaenske i dokozoheksaenske kiseline u

jetri. Životinje su hranjene MCD dijetom 2, 4 ili 6

nedelja ad libitum (MCD2, MCD4 i MCD6 grupe

redom).

Statistička značajnost razlike je procenjena

dvostrukom analizom varijanse (ANOVA) sa

Takijevim (Tukey) post hoc testom (** p<0,01 u

odnosu na kontrolu).

Za razliku od DPA, zastupljenost

dokozoheksaenske kiseline (DHA) u jetri

progresivno opada tokom trajanja MCD dijete i u

MCD4 (7,16 ± 0,95%) i MCD6 (6,46 ± 0,73%)

grupi nivo ove kiseline bio je značajno niži u

poređenju sa kontrolnom (10,09 ± 0,44%) i MCD2

grupom (9,13 ± 0,76%) (Grafikon 5).

Diskusija

Do sada ne postoji jedinstvena terapija

NAFLD, koja bi dovela do reverzije promena kod

svih pacijenata. Uglavnom je terapija usmerena na

promenu higijensko-dijetetskog režima i povećanje

fizičke aktivnosti pacijenata u cilju redukcije

telesne mase. Farmakološka terapija uglavnom je

usmerena na smanjenje insulinske rezistencije,

hiperholesterolemije ili gojaznosti (20).

Metformin, lek koji se koristi u terapiji dijebetesa

tipa II, se pokazao efikasnim i u terapiji NAFLD, s

obzirom na to da on stimuliše oksidaciju masnih

kiselina aktivacijom AMPK (21). Savremene

kliničke studije pokazale su da tiazolidindioni,

PPAR-γ agonisti, smanjuju stepen steatoze i

snižavaju aktivnost transaminaza u serumu

(22,23). Tiazolidindioni ubrzavaju diferencijaciju

preadipocita u adipocite, preusmeravaju

nakupljanje TAG iz jetre i skeletnih mišića u

masno tkivo i inhibišu lipolizu u adipocitima,

najverovatnije inhibicijom translokacije hormon-

senzitivne lipaze do lipidnih kapi (24). Dodatna

sredstva koja se mogu koristiti u terapiji NAFLD

podrazumevaju: antioksidanse (vitamin E, vitamin

C), hepatoprotektivne agense (urzodeoksiholna

kiselina), statine, fibrate, blokatore renin-

angiotenzin-aldosteron sistema, kao i modulatore

efekata inkretina (agonisti glukagonu sličnog

peptida-1, sitagliptin, vidagliptin). Novije

terapijske strategije predviđaju upotrebu resolvina,

protektina, lipoksina i drugih antiinflamatornih

autakoida u ublažavanju toka NAFLD (20).

Pokazano je da masne kiseline ispoljavaju

hepatotoksične efekte, kako u NAFLD, tako i u

alkoholnoj masnoj jetri (25), pa bi se potencijalna

terapija mogla usmeriti i na smanjenje njihove

toksičnosti. Analiza profila masnih kiselina u jetri

na MCD modelu NAFLD u našoj studiji ukazala

je na moguću efikasnost ovakvog terapijskog

pristupa.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

Kontrola MCD2 MCD4 MCD6

Grupe miševa

Re

lati

vn

a z

ast

up

lje

no

st m

asn

ih k

ise

lina

(%

)

Dokozopentaenska kiselina

Dokozaheksaenska kiselina

**

**

**

128 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Naše istraživanje je pokazalo da MCD

dijeta izaziva izraženu difuznu steatozu za četiri

(Slika 1C), a steatohepatitis za šest nedelja (Slika

1D). Dijeta deficijentna u metioninu i holinu

uzrokuje masnu promenu smanjenjem ekskrecije

VLDL usled smanjene sinteze apoproteina, kao i

smanjenjem β oksidacije masnih kiselina (26).

Nakupljanje triacilglicerola u jetri, kao i

nedovoljna sinteza telesnih proteina i transport

masnih kiselina do adipocita usled nedostatka

metionina (26), ogledaju se i kroz povećanje

odnosa mase jetre i telesne mase (Grafikon 1).

Odnos zasićenih i nezasićenih masnih kiselina u

jetri se povećao nakon primene MCD dijete.

Prethodne studije pokazale su različitu

ulogu zasićenih i nezasićenih masnih kiselina u

progresiji NAFLD. Zasićene masne kiseline imaju

štetniji efekat u odnosu na nezasićene, što se

između ostalog može objasniti i nemogućnošću

esterifikacije zasićenih masnih kiselina u neutralne

TAG (12). Dodatni mehanizmi lipotoksičnih

efekata zasićenih masnih kiselina podrazumevaju

de novo lipogenezu povećanjem ekspresije

SREBP-1c, AMPK, PGC-1α, indukciju

lipoapoptoze i stimulaciju sinteze proinflamatornih

citokina (6,8). Zasićene masne kiseline stimulišu

lipoapoptozu ushodnom regulacijom brojnih

proapoptotskih proteina, kao što su Fas-FasL, Bim

i PUMA ili inhibicijom antiapoptotskih činilaca

(27). Takođe, zasićene masne kiseline stimulišu

produkciju TNF-α u jetri koji izaziva apoptozu

hepatocita i predstavlja jedan od najvažnijih

proinflamatornih citokina u NASH (28).

Pojedine zasićene masne kiseline, takođe,

ispoljavaju različite efekte u patogenezi NAFLD.

Dok i palmitinska i stearinska kiselina indukuju

apoptozu hepatocita, in vitro studije su pokazale da

samo palmitinska kiselina povećava osetljivost

hepatocita na citotoksične efekte TNF-α (29). Naša

studija ukazuje na važniju direktnu ulogu

stearinske kiseline u odnosu na palmitinsku u

indukciji apoptoze i NASH, s obzirom na to da je

najveća zastupljenost stearinske kiseline uočena u

šestoj nedelji MCD dijete (Grafikon 2) kada se u

jetri zapaža najizraženija masna promena sa

apoptotskim telašcima i zapaljenjskim infiltratom

(Slika 1D). Istovremeno, zastupljenost palmitinske

kiseline u jetri se značajno smanjila (Grafikon 2).

Međutim, ovo smanjenje ne isključuje

patogenetsku ulogu palmitinske kiseline u

progresiji NAFLD, s obzirom na to da palmitinska

kiselina može da služi kao supstrat za sintezu

ceramida, sfingolipida sa proapoptotskim

dejstvom. Smanjenje palmitinske kiseline može

biti posledica njenog povećanog preusmeravanja u

sintezu ceramida (13).

U brojnim studijama pokazano je da za

razliku od zasićenih, mono- i polinezasićene

masne kiseline imaju protektivno dejstvo u

progresiji NAFLD (30-32). Na genetičkom

modelu, kao i na modelu NAFLD izazvanom

masnom hranom, pokazano je da suplementacija

omega-3 masnih kiselina normalizuje nivo

holesterola i TAG u serumu i smanjuje stepen

steatoze sa nakupljanjem TAG dominantno u

periportnim hepatocitima (26). Takođe, egzogene

omega-3 masne kiseline povećavaju nivo DHA i

DPA u jetri, a smanjuju nivo arahidonske kiseline.

Mehanizmi hepatoprotektivnog efekta omega-3

masnih kiselina su višestruki. In vivo i in vitro

studije su pokazale da nedovoljan sadržaj omega-3

masnih kiselina u jetri menja afinitet vezivanja

SREBP-1c i PPAR-γ za odgovarajuće sekvence

DNK, tako da stimuliše lipogenezu i pogoršava

primarni poremećaj (33). Omega-3 masne kiseline

ispoljavaju antiinflamatorni efekat stimulacijom

sinteze rezolvina i protektina i inhibicijom

fosfolipaze A2, koja izdvaja arahidonsku kiselinu

iz fosfolipida membrane i omogućava sintezu

prostaglandina i leukotrijena (34). Međutim, naša

studija ne ukazuje na potencijalnu korisnost

primene svih omega-3 kiselina kako u prevenciji

tako i u usporavanju progresije NAFLD, jer se ne

smanjuje zastupljenost svih polinezasićenih

kiselina u jetri. Tako je MCD dijeta za 2 nedelje

izazvala porast linolne kiseline i DPA u odnosu na

kontrolu (Grafikon 5). Koncentracije linolne i

arahidonske kiseline posle dve nedelje na MCD

dijeti su u obrnutoj srazmeri, što bi moglo

ukazivati na autoprotektivne mehanizme u

129Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

inicijalnoj fazi NAFLD (Grafikon 4). Posle šest

nedelja na MCD dijeti, zastupljenost linolne i

arahidonske se nije razlikovala od kontrolnih

vrednosti, što potencijalno omogućuje razvoj

NASH.

S druge strane, naša studija je pokazala

progresivan pad nivoa DHA u jetri u NAFLD

izazvanom MCD dijetom, koji prethodi razvoju

difuzne steatoze i NASH (Grafikon 5). To ukazuje

da bi se, osim u terapijske svrhe, DHA, ali ne i

DPA, mogla koristiti i u prevenciji NAFLD.

Suplementacija DHA bi potencijalno doprinela

prevenciji progresije NAFLD, ali bi to trebalo da

bude predmet daljih istraživanja.

Za razliku od DHA, zastupljenost oleinske

kiseline u jetri bila je značajno veća nakon MCD

dijete u odnosu na standardnu (Grafikon 3). Ovaj

porast bi mogao imati protektivni efekat, s

obzirom na to da je pokazano da dodatak oleata

MCD dijeti smanjuje stepen steatoze i usporava

progresiju u NASH. Oleinska kiselina povećava

sintezu ApoB100 i smanjuje ekspresiju TNF-α,

monocitnog hemoatraktantnog proteina-1 (MCP-1)

i matriks metaloproteinaze-9 (MMP-9), čime

ostvaruje antiinflamatorno dejstvo (35). Prema

nekim istraživanjima, oleat i palmitoleat svrstavaju

se u lipokine i naglašava se njihova

antiinflamatorna uloga dejstvom na ćelije

imunskog sistema (14). Iako druge studije

naglašavaju korisne efekte suplementacije oleinske

kiseline u svim stadijumima NAFLD, rezultati

našeg istraživanja upućuju da oleinska kiselina

nema toliko veliki značaj u sprečavanju progresije

NAFLD kao polinezasićene masne kiseline. S

druge strane, zastupljenost izomera oleinske

kiseline smanjuje se tokom trajanja MCD dijete,

ali značaj ovog nalaza u patogenezi NAFLD treba

da bude predmet daljih istraživanja.

Na osnovu rezultata naše studije može se

zaključiti da MCD ishrana izaziva porast

zastupljenosti stearinske i pad nivoa palmitinske

kiseline u jetri. Dok nivo linolne i oleinske kiseline

raste, zastupljenost DHA i izomera oleinske

kiseline se progresivno smanjuje u NAFLD

izazvanoj MCD ishranom. U ranoj fazi NAFLD

raste zastupljenost DPA, a opada nivo arahidonske

kiseline. Analize lipidnog profila ukazuju da bi

suplementacija DHA bila potencijalno korisnija u

odnosu na DPA i mononezasićene masne kiseline

u prevenciji progresije steatoze u ozbiljnije oblike

NAFLD.

Literatura

1. Bechman LP, Hannivort RA, Gerken G,

Hotamisligil GS, Trauner M, Canbay A. The

interaction of hepatic lipid and glucose

metabolism in liver diseases. J Hepatol

2012;56: 952-964.

2. Clouston DA, Powell EE. Nonalcoholic fatty

liver disease: is all the fat bad. Int Med J

2004;34:187-191.

3. Salt 2nd WB. Non alcoholic fatty liver

disease (NAFLD): a comprehensive review. J

Ins Med 2004;36:27-41.

4. Grattagliano I, De Bari O, Bernardo TC,

Oliveira PJ, Wang DQH, Portincasa P. Role of

mitochondria in nonalcoholic fatty liver

disease-from origin to propagation. Clin

Biochem 2012;45:610-618.

5. McCarthy EM, Rinella ME. The role of diet

and nutritient composition in nonalcoholic

fatty liver disease. J Acad Nutr Diet

2012;112:401-409.

6. Adams LA, Angulo P, Lindor KD.

Nonalcoholic fatty liver disease. CMAJ

2005;172:899-905.

7. Yilmaz Y. NAFLD in the absence of

metabolic syndrome: different epidemiology,

pathogenetic mechanisms, risk factors for

disease progression. Semin Liver Dis

2012;32:14-21.

8. Van Herpen NA, Schrauwen-Hinderling

VB. Lipid accumulation in non adipose tissue

and lipotoxicity. Phys Behav 2008;94:231-241.

9. Day CP, James OF. Steatohepatitis: a tale of

two hits? Gastroenterology 1998;114:842-845.

10. Li ZZ, Bern M, Mclntyre MT, Gores GJ,

Feldstein AE. The lysosomal-mitochondrial

130 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

axis in free fatty acid-induced hepatic

lipotoxicity. Hepatology 2008;47:1495-1505.

11. Malhi H, Bronk SF, Werneburg NW, Gores

GJ. Free fatty acids induce JNK dependent

hepatocyte lipoapotosis. J Biolog Chem

2006;281:12093-12101.

12. Leamy KA, Egnatchin RA, Young JD.

Molecular mechanisms and the role of

saturated fatty acids progression of

nonalcoholic fatty liver disease. Prog Lipid Res

2013;52:165-174.

13. Neuschwander-Tetri BA. Hepatic

lipotoxicity and the pathogenesis of

nonalcoholic steatohepatitis: the central role of

nontriglyceride fatty acid metabolites.

Hepatology 2010; 52:774-788.

14. Ibrahim SH, Kohli R, Gores GJ.

Mechanisms of lypotoxicity in NAFLD and

clinical implications. J Pediatr Gastroenterol

Nutr 2011;53:131-140.

15. Anstree QM, Goldin RD. Mouse models in

nonalcoholic fatty liver disease and

steatohepatitis research. Int J Exp Pathol

2006;87:1-16.

16. London RM, George J. Pathogenesis of

NASH: animal models. Clin Liver Dis 2007;

11:55-74.

17. Marcolin E, Forgiarini LF, Tieppo J, Dias

AS, Freitas LAR, Marroni NP. Methionine and

choline deficient diet induces hepatic changes

characteristic of non-alcoholic steatohepatitis.

Arq Gastroenterol 2011;48:72-9.

18. Bligh EC, Dyer WJ. A rapid method of

total lipid extraction and purification. Can J

Biochem Physiol 1959;37:913-917.

19. Ichihara K, Fukubayashi K. Preparation of

fatty acid methyl esters for gas-liquid

chromatography. J Lipid Research

2010;57:635-640.

20. Nakayima K. Multidisciplinary

pharmacotherapeutic options for non alcoholic

fatty liver disease. Int J Hepatol

2012;2012:950693.

21. Schimmak G, DeFronzo RA, Musi N.

AMP activated protein kinase: role in

metabolism and therapeutic implications.

Diabetes Obes Metab 2006;8:591-602.

22. Musso G, Cassader M, Rosina F, Gambino

R. Impact of current treatmets on liver disease,

glucose metabolism and cardiovascular risk in

nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD):

systematic review and meta-analysis of

randomised trials. Diabetologia 2012; 55:885-

904.

23. Spiegelman BM. Peroxisome proliferator

activated receptor gamma: a key regulator of

adipogenesis and systemic insulin sensitivity.

Eur J Med Res 1997;2:457-464.

24. Samuel VT, Peterson KF, Shulman GI.

Lipid induced insulin resistance: unravelling

the mechanism. Lancet 2010;375:2267-2277.

25. Lieber CS. Alcoholic fatty liver: its

pathogenesis and mechanism of progression to

inflammation and fibrosis. Alcohol 2004;34:9-

19.

26. Takahashi Y, Soejima Y, Fukusato T.

Animal models of nonalcoholic fatty liver

disease / nonalcoholic steatohepatitis. World J

Gastroenterol 2012;18:2300-2308.

27. Cazanave SC, Gores GJ. Mechanisms and

clinical implications of hepatocyte

lipoapoptosis. Clin Lipidol. 2010;5:71-85.

28. Yamaguchi K, Hoh Y, Yokomizo C et al.

Blocade of interleukine-6 signalling pathway

enhances hepatic steatosis but improves liver

injury in methionine choline deficient diet fed

mice. Lab Invest 2010;90:1169-1178.

29. Oh JM, Choi JM, Lee YJ et al. Effects of

palmitic acid on TNFα induced citotoxicity in

SK-Hep1 cells. Toxicol in Vitro 2012;26:783-

790.

30. Gillingham LG, Haris-Janz S, Jones PJ.

Dietary monounsaturated fatty acids are

protective against metabolic syndrome and

cardiovascular disease risk factors. Lipids

2011;46:209-228.

31. Capanni M, Calella F, Biagini MR, et al.

Prolonged n-3 polyunsaturated fatty acid

supplementation ameliorates hepatic steatosis

in patients with non-alcoholic fatty liver

131Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

disease: A pilot study. Aliment Pharmacol

Ther 2006;23:1143-1151.

32. Spadaro L, Magliocco O, Spampinato D, et

al. Effects of n-3 polyunsaturated fatty acids in

subjects with non-alcoholic fatty liver disease.

Dig Liver Dis 2008;40:194-199.

33. Lamaziere A, Wolf C, Barbe U, Bausero P,

Visioli F. Lipidomics of hepatic lipogenesis

inhibition by omega 3 fatty acids.

Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids

2013;88:149-154.

34. Rius B, Lopez-Vicario C, Gonzalez-Periz

A, et al. Resolution of inflammation in obesity-

induced fatty liver disease. Front Immunol

2012;3:257-263.

35. Lee JY, Moon HJ, Park JS, et al.Dietary

oleate has beneficial effects on every step of

nonalcoholc fatty liver disease progression in a

methionine-and choline-deficient diet fed

animal model. Diabetes Metab J 2011;35:489-

496.

132 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

SOCIOEKONOMSKI PROFIL I KLINIČKE KARAKTERISTIKE PACIJENATA SA

MIJASTENIJOM GRAVIS KASNOG POČETKA

Autori: Aleksandra Šljivar1, Maja Đorđević

1

Mentor: Prof. dr Dragana Lavrnić2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2Klinika za neurologiju KCS, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Sažetak Uvod: Stečena autoimuna mijastenija

gravis (MG) je organ-specifična autoimuna bolest

kod koje antitela (At) usmerena prema nikotinskom

acetilholinskom receptoru (nAChR) postsinaptičke

membrane mišića dovode do poremećaja

neuromišićne transmisije sa posledičnom pojavom

slabosti i patološke zamorljivosti skeletnih mišića.

U poslednjih nekoliko godina uočen je značajan

porast broja bolesnika sa MG sa početkom posle

pedesete godine života, a naročito porast broja

obolelih muškaraca.

Cilj: Ispitivanje sociodemografskih i

kliničkih karakteristika bolesnika sa MG starih

(MGS) u poređenju sa bolesnicima sa MG ranog

početka.

Materijal i metode: Ova retrospektivna

studija obuhvatila je 527 bolesnika koji boluju od

MG, medju kojima je 338 bolesnika imalo MGS,

sa nastankom bolesti posle pedesete godine

života. Kontrolnu grupu predstavljalo je 189

bolesnika sa početkom MG pre pedesete godine

života. Svi pacijenti su lečeni na Klinici za

neurologiju Kliničkog centra Srbije.

Rezultati: U grupi bolesnika sa MGS

uočena je tri puta veća učestalost muškog pola.

Provokativni faktori za nastanak bolesti bili su

značajno redji u ovoj grupi obolelih. Očni

simptomi su inicijalno bili češći u grupi MGS

pacijenata, gde je i inače bila značajno češća očna

forma bolesti. Teža klinička ispoljavanja bila su

nešto češća u grupi mladjih pacijenata, dok je tok

bolesti u MGS grupi bio signifikantno lošiji u

poredjenju sa MG mladih. Procenat bolesnika sa

pozitivnim AChR antitelima, kao i onih sa

ekstratimičnim malignitetom bio je veći u MGS

grupi pacijenata.

Zaključak: Rezultati naše studije ukazuju

da se MG kasnog životnog doba razlikuje od MG

mladjeg životnog doba u brojnim kliničkim, a

pretpostavlja se, i patogenetskim mehanizmima.

Ključne reči: Mijastenija gravis, staro

životno doba.

Abstract

Introduction: Acquired autoimmune

myasthenia gravis (MG) is an organ - specific

autoimmune disease where antibodies to the

nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) of the

postsynaptic muscle membrane lead to

neuromuscular transmission disorder, with

consequent appearance of weakness and abnormal

fatigue of the skeletal muscle. In the last few years

there has been a significant increase in the number

of patients with MG, with an onset after the age of

fifty, particularly among male patients.

The Aim: To investigate socio-

demographic and clinical characteristics of

patients with a late onset MG compared to the

patients with an early onset MG.

Material and Methods: This retrospective

study included 527 patients with MG, where 338

patients had a late onset MG, after the age of fifty,

hospitalized at the Clinic of Neurology, the

Clinical Centre of Serbia. The control group

consisted of 189 patients with an early onset of

MG, before the age of fifty.

Results: Among the late onset MG patients,

we registered a three times larger male

population. Provocative factors of the disease

appearance were rare in the late onset group of

MG. The initial ocular symptoms were more

common in patients with a late onset, as well as

the ocular form of the disease. Clinical

characteristics of MG were more severe in the

early onset MG patients, while the progress of the

disease was significantly worse in patients with a

late onset MG. The percentage of patients with

positive AChR antibodies was higher in the group

of patients with a late onset.

Conclusion: The results of our study

indicate that the late onset MG differs from an

early onset MG in numerous clinical and assumed

pathogenetic mechanisms.

Key words: Myasthenia gravis, late onset.

133Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Uvod

Stečena autoimuna mijastenija gravis (MG)

je organ-specifična autoimuna bolest kod koje

antitela (At) usmerena prema nikotinskom

acetilholinskom receptoru (nAChR) postsinaptičke

membrane mišića dovode do poremećaja

neuromišićne transmisije sa posledičnom pojavom

slabosti i patološke zamorljivosti skeletnih mišića.

Ova antitela se mogu naći kod oko 80% pacijenata

sa generalizovanom formom MG, dok se kod

preostalih, tzv. AChR negativnih bolesnika mogu

naći druga At usmerena ka različitim antigenima

postsinaptičke membrane mišića (1). Kod 30-40%

seronegativnih pacijenata nalaze se antitela na

mišić-specičnu tirozin kinazu (MuSK) i kod

manjeg broja preostalih seronegativnih pacijenata i

antitela na “low density lipoprotein receptor

related protein 4” (LRP4) (2). Centralno mesto u

patogenezi anti-AChR antitelo pozitivne MG ima

timus, gde se smatra da se nalazi i primarni

neoantigen i gde nastaje senzibilizacija na nAChR.

U prilog ovoj pretpostavci ide i nalaz znatno češće

timusne patologije kod obolelih od MG u

poređenju sa zdravom populacijom, kao i jasno

pozitivan učinak timektomije u ovoj grupi

pacijenata (1).

Klinički, MG se karakteriše promenljivom

slabošću i prekomernom zamorljivošću pojedinih

ili svih skeletnih mišića (1). Simptomi mogu biti

predominantno očni, bulbarni, ekstremitetni ili

generalizovani. Bolest najčešće počinje znacima

zahvaćenosti očnih mišića, da bi kasnije zahvatila i

druge mišićne grupe i dobila generalizovani oblik.

Simptomi najčešće, posebno u početku, variraju,

najblaži su ili odsutni ujutru i nakon odmora, a

pogoršavaju se tokom dana, posebno nakon

obavljanja bilo kakvog rada sa ponavljanjim ili

produženim angažovanjem određene mišićne

grupe.

U poslednjih nekoliko godina uočen je

značajan porast broja bolesnika sa MG sa

početkom posle pedesete godine života, a

naročito, porast broja obolelih muškaraca poznog

životnog doba (3). Nema dovoljno podataka o

tome da li se grupa obolelih sa kasnim početkom

MG izdvaja po kliničkim, patogenetskim i

imunoserološkim karakteristikama u odnosu na

klasičnu MG ranog početka.

Cilj ovog istraživanja bilo je ispitivanje

sociodemografskih i kliničkih karakteristika

bolesnika sa MG starih (MGS) u poređenju sa

bolesnicima sa MG ranog početka.

Materijal i metode

Ova retrospektivna studija obuhvatila je

527 bolesnika koji boluju od MG. Uključeno je

338 bolesnika sa MGS, tj. sa početkom posle

pedesete godine života, koji su bili hospitalizovani

na Klinici za neurologiju Kliničkog centra Srbije u

periodu od 1.1.2002. do 31.12.2012. godine.

Podaci za ove bolesnike prikupljeni su iz istorija

bolesti pacijenata. Kontrolnu grupu je predstavljao

189 bolesnika sa MG ranog početka, tj. sa

početkom pre pedesete godine života, za koje su

podaci dobijeni iz registra bolesnika sa MG za

grad Beograd. Dijagnoza je postavljena na osnovu

tipične kliničke slike sa pozitivnim testovima

zamaranja, a potvrđena je prostigminskim testom

i/ili testom neuromišićne transmisije pri

niskofrekventnoj repetitivnoj stimulaciji i/ili

pozitivnim antitelima na AChR ili MuSK (4).

Težina kliničke slike MG određivana je

prema MGFA (Myasthenia Gravis Foundation of

America) kliničkoj klasifikaciji u piku bolesti (5).

U studiji su analizirani sledeći

sociodemografski i klinički podaci dobijeni iz

istorija bolesti ili registra za MG: pol bolesnika,

provokativni faktor za nastanak MG, godine na

početku bolesti, inicijalni simptomi, dijagnostičko

kašnjenje, prisustvo i tip antitela prema antigenima

neuromišićne spojnice, MGFA u piku bolesti,

trajanje bolesti, godine u trenutku ispitivanja,

predominantni simptomi, patologija timusa,

timektomija, prisustvo i tip autoimunih bolesti kod

samog bolesnika i u porodici, kao i prisustvo

maligniteta.

Rezultati istraživanja prikazani su

tabelarno. Poređenje ispitivanih grupa bolesnika

vršeno je pomoću hi kvadrat testa za nominalne i

ordinalne varijable, pomoću Mann Whitney U

testa za kontinuirane neparametarske varijable i

pomoću Studentovog t testa za kontinuirane

parametarske varijable. Razlika je označavana kao

statistički značajna ako je p<0,05, a visoko

statistički značajna ako je p<0,01.

134 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Rezultati

Osnovni sociodemografski i klinički podaci ispitivanih bolesnika prikazani su u Tabeli 1.

Tabela 1. Osnovni demografski i klinički podaci ispitivanih bolesnika na početku bolesti(N=527)

Varijabla MG sa ranim početkom

(N=189)

MG sa kasnim početkom

(N=338)

Pol (broj, % muškaraca) ** 50 (26,4%) 214 (63,3%)

Provokativni faktor (broj, %) **

odsutan

stres

infekcija

hirurška operacija

abortus ili porođaj

ostalo

nepoznato

80 (42,3%)

69 (36,5%)

14 (7,4%)

3 (1,6%)

9 (4,8%)

8 (4,2%)

6 (3,2%)

228 (67,4%)

70 (20,7%)

19 (5,6%)

2 (0,6%)

0 (0,0%)

7 (2,1%)

12 (3,5%)

Godine na početku bolesti **

(prosek ± SD) 30,1 ± 10,2 65,3 ± 7,6

Inicijalni simptomi (broj, %) **

očni

bulbarni

ekstremitetni

generalizovani

slabost mimike

nepoznato

85 (44,9%)

59 (37,2%)

34 (17,9%)

3 (1,6%)

2 (1,0%)

6 (3,2%)

233 (68,9%)

50 (14,8%)

24 (7,1 %)

22 (6,5 %)

3 (0,9 %)

6 (1,8%)

Dijagnostičko kašnjenje **

(prosek u mesecima ± SD) 13,9 ± 23,1 9,1 ± 14,0

Antitela *

AChR

MuSK

seronegativni

106 (79,7%)

5 (3,8 %)

22 (16,5 %)

139 (90,3%)

3 (1,9%)

12 (7,8%)

** p<0,01; * p<0,05

Uočena je tri puta veća učestalost muškog

pola kod bolesnika sa MGS u odnosu na bolesnike

ranog početka (26,4% u odnosu na 63,3%,

p<0,01). Provokativni faktor bio je prisutan kod

29,0% sa MGS, a kod čak 54,5% bolesnika sa

ranim početkom bolesti (p<0,01). Očni simptomi

su inicijalno bili češći kod bolesnika sa MGS

(68,9%), dok je kod pacijenata sa ranim početkom

bolest češće počinjala bulbarnim (37,2%) ili

ekstremitetnim slabostima (17,9%). Dijagnostičko

kašnjenje bilo je kraće kod bolesnika sa kasnim

početkom (9,1 ± 14,0 meseci prema 13,9 ± 23,1

meseci, p<0,01).

Prisustvo antitela u serumu analizirano je

kod 154 bolesnika sa kasnim početkom (45,5%) i

133 bolesnika sa ranim početkom MG (70,3%).

Procenat bolesnika sa pozitivnim AChR At bio je

veći u grupi obolelih sa kasnim početkom, dok je

procenat MuSK pozitivnih i seronegativnih

bolesnika bio dvostruko veći u grupi sa ranim

početkom (p<0,05) (Tabela 1).

Bolesnici sa kasnim početkom imali su

nešto blažu formu bolesti sa dvostruko većom

učestalošću čisto okularne forme (Tabela 2).

Posmatrajući predominantne simptome, očni

simptomi su bili prisutni kod 24,7% bolesnika

kasnog početka i 12,6% bolesnika ranog početka

MG (p<0,01). Sa druge strane, uočen je veći

procenat bolesnika u remisiji u grupi sa ranim

početkom bolesti (39,2% u odnosu na 15,2%,

p<0,01).

135Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Tabela 2. Tok i ishod bolesti kod ispitivanih bolesnika sa mijastenijom gravis (N=527)

Varijabla MG sa ranim početkom

(N=189)

MG sa kasnim početkom

(N=338)

MGFA u piku bolesti *

(prosek ± SD) 3,2 ± 1,7 2,9 ± 1,6

MGFA u piku bolesti (broj, %) **

I

IIA

IIB

IIIA

IIIB

IVA

IVB

V

nepoznato

20 (10,6%)

52 (27,5%)

62 (32,8%)

2 (1,0%)

40 (21,2%)

1 (0,5%)

7 (3,7%)

5 (2,6%)

0 (0,0%)

71 (21,0%)

58 (17,2%)

135 (39,9%)

2 (0,6%)

55 (16,3%)

0 (0,0%)

8 (2,4%)

7 (2,1%)

2 (0,5%)

MGFA u piku bolesti (broj, %) #

blaga forma (I-IIIA)

teška forma (IIIB-V)

nepoznato

135 (71,4%)

53 (28,9%)

0 (0,0%)

266 (78,7%)

70 (20,8%)

2 (0,5%)

Trajanje bolesti **

(prosek u godinama ± SD) 12,3 ± 9,6 7,1 ± 5,2

Godine u trenutku ispitivanja **

(prosek ± SD) 42,1 ± 12,3 69,6 ± 8,6

Predominantni simptomi (broj, %) **

očni

bulbarni

generalizovani

ekstremitetni

remisija

17 (12,6%)

10 (7,4%)

26 (19,3%)

29 (21,5%)

53 (39,2%)

65 (24,7%)

42 (16,0%)

77 (29,3%)

39 (14,8%)

40 (15,2%)

**p<0,01; *p<0,05; # p=0,059

U grupi sa kasnim početkom, najveći

procenat bolesnika imao je involutivni i/ili

perzistentni timus (81,2%), dok je u grupi sa ranim

početkom dominirala hiperplazija timusa (63,0%)

(p<0,01). Timom je bio podjednako zastupljen u

obe grupe. Timektomija je rađena češće kod

mlađih od 50 godina (73,5% u odnosu na 9,5%,

p<0,01).

Udruženost MG sa drugim bolestima

prikazana je u Tabeli 3. Udružene autoimune

bolesti su bile znatno ređe kod bolesnika sa kasnim

početkom bolesti (8,9% prema 22,2%, p<0,01).

Takođe, uočeno je da je prisustvo autoimunih

bolesti kod drugih članova porodice bilo ređe u

grupi bolesnika sa kasnim početkom (5,0% prema

23,3%, p<0,01). Pojava udruženog maligniteta bila

je češća kod bolesnika sa kasnim početkom MG,

ali bez dostizanja nivoa statističke značajnosti

(9,8% prema 5,3%, p>0,05).

136 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

Tabela 3. Udruženost mijastenije gravis sa drugim bolestima kod ispitivanih bolesnika (N=527)

Varijabla MG sa ranim početkom

(N=189)

MG sa kasnim početkom

(N=338)

Timus (broj, %) **

timom

hiperplazija

involutivni/perzistentni

20 (14,5%)

87 (63,0%)

31 (22,5%)

19 (13,2%)

8 (5,6%)

117 (81,2%)

Timektomija (broj, %) **

da

ne

nepoznato

139 (73,5%)

45 (23,8%)

5 (2,7%)

32 (9,5%)

297 (87,9%)

9 (2,6%)

Autoimune bolesti (broj, %) **

da

ne

nepoznato

42 (22,2%)

142 (75,1%)

5 (2,6%)

30 (8,9%)

295 (87,3%)

13 (3,8%)

Tip autoimune bolesti (broj, %)

tireoideja

tireoideja i lupus

lupus

reumatoidni artritis

multipla skleroza

ostalo

19 (45,2%)

1 (2,4%)

5 (11,9%)

3 (7,1%)

0 (0,0%)

14 (33,3 %)

15 (50,0%)

0

0

1 (3,3%)

0

14 (46,7%)

Autoimune bolesti u porodici (broj, %) **

da

ne

nepoznato

44 (23,3%)

140 (74,1%)

5 (2,6%)

17 (5,0%)

306 (90,5%)

15 (4,4%)

Malignitet (broj, %)

da

ne

nepoznato

10 (5,3%)

174 (92,1%)

5 (2,6%)

33 (9,8%)

292 (86,4%)

13 (3,8%)

Pojava maligniteta (broj, %)

pre MG

istovremeno sa MG

posle MG

6 (3,2%)

1 (0,5%)

3 (1,6%)

15 (4,4%)

4 (1,2%)

11 (3,3%)

**p<0,01

Diskusija

U našem istraživanju uočene su određene

specifičnosti u grupi bolesnika sa MG kasnog

početka, što može imati uticaja na razumevanje

patogeneze bolesti, kao i na terapijski pristup kod

ovih bolesnika.

Zapazili smo predominaciju muškaraca

među bolesnicima sa kasnim početkom MG.

Nasuprot tome, poznato je da kod MG sa

početkom izmedju 16. i 50. godine života postoji

predominacija ženskog pola (6,7) dok je u

prepubertetskom periodu ona nešto češća kod

dečaka (8,9), što sve sugeriše ulogu ženskih polnih

hormona u njenoj indukciji. U prilog ovoj činjenici

ide i nalaz povišene koncetracije receptora za

estrogen na perifernim limfocitima pacijenata

obolelih od MG, kao i veoma česta

predmenstrualna pogoršanja MG pacijentkinja

obolelih od ove bolesti (6). Ovo je u skladu sa

činjenicom da se skoro sve autoimune bolesti

češće javljaju kod žena.

Zapaženo dvostruko češće prisustvo

ekstratimičkih maligniteta kod bolesnika sa MG

poznog životnog doba može se objasniti

činjenicom da tokom vremena dolazi do

postepenog propadanja imunske regulacije kod oba

pola. Slični rezultati nalaze se i u drugim studijama

(10).

137Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

Na specifičnost patogeneze MG kasnog

početka, ukazuje i činjenica da je provokativni

faktor, koji je prethodio bolesti kao potencijalni

pokretač autoimunog mehanizma, bio znatno ređe

prisutan kod bolesnika sa MG kasnog početka. U

skladu sa tim je i znatno ređe prisustvo udruženih

autoimunih bolesti kod MG kasnog početka prema

našoj i ranijim studijama (11). Takođe, kod

bolesnika sa kasnim početkom MG češće je bilo

prisustvo At na AChR, a ređe prisustvo MuSK At i

kompletno seronegativnih bolesnika, što još

jednom ukazuje na specifičnost patogeneze ove

forme MG. Slične učestalosti antitela nalaze i

drugi autori (11,12).

Od ranije je poznato da je uloga timusne

hiperplazije u razvoju MG posle pedesete godine

od manjeg značaja (13), što je u skladu sa našim

rezultatom da je čak četiri petine bolesnika sa

kasnim početkom MG imalo involuciju timusa,

dok je kod bolesnika ranog početka dominirala

hiperplazija timusa. Na ovim činjenicama se i

zasniva preporuka da se timektomija obavezno vrši

kod generalizovane forme MG sa početkom pre

pedesete godine života, a kod onih sa kasnim

početkom samo ako postoji tumorski izmenjena

timusna žlezda - timom (14). U skladu sa ovom

preporukom, timektomija je učinjena samo kod

10% naših pacijenata sa kasnim početkom bolesti.

Naše istraživanje pokazuje da su inicijalni

simptomi kod bolesnika sa MG kasnog početka

najčešće bili očni, za razliku od bolesnika sa ranim

početkom, kod kojih su češći bili bulbarni ili

ekstremitetni. Ovaj nalaz odgovara literaturnim

podacima (15). Interesantno je da je u našoj studiji

dijagnostičko kašnjenje bilo kraće kod bolesnika

sa kasnim početkom MG. Ovo se može objasniti

češćim posetama lekaru kod starih ljudi. Pored

toga, rano javljanje očnih simptoma, poput

spuštenosti očnih kapaka i pojave dvoslika, kod

lekara budi sumnju na MG, za razliku od

generalizovanih i bulbarnih smetnji koje se javljaju

kod bolesnika sa ranim početkom, a koje mogu

dovesti do pogrešne dijagnoze cerebrovaskularne

bolesti ili depresije.

Prema MGFA klasifikaciji u piku bolesti, u

grupi pacijenata sa kasnim početkom generalno je

zapažena lakša klinička slika, sa predominantno

očnim simptomima kod čak četvrtine obolelih

(15). Sa druge strane, iako blagi, simptomi MG

kod bolesnika sa kasnim početkom bili su

rezistentniji na svu primenjenu terapiju, te su ovi

bolesnici dvostruko ređe ulazili u remisiju u

odnosu na bolesnike sa ranim početkom.

Rezultati naše studije ukazuju da se MG

kasnog životnog doba razlikuje od MG mladjeg

životnog doba u brojnim kliničkim, a pretpostavlja

se i patogenetskim mehanizmima. U prilog ovoj

pretpostavci govori činjenica da je u grupi MG

starog životnog doba prisutna jasna predominacija

muškog pola, ređe prisustvo provokativnog

faktora i udruženih autoiumunih bolesti i češće

prisustvo antitela na n AChR, dok je timusno tkivo

najčešće u involuciji.

Literatura

1. Meriggioli M, Sanders D. Autoimmune

myasthenia gravis: emerging clinical and

biological heterogeneity. Lancet Neurol 2009;

8(5):475-490.

2. Higuchi O, Hamuro J, Motomura M,

Yamanashi Y. Autoantibodies to low-density

lipoprotein receptor-related protein 4 in

myasthenia gravis. Ann Neurol 2011; 69(2):418-

22.

3. Lavrnic D, Basta I, Rakocevic-Stojanovic

V, Stevic Z, Peric S, Nikolic A, Marjanovic I,

Pekmezovic T. Epidemiological Study of Adult-

Onset Myasthenia Gravis in the Area of Belgrade

(Serbia) in the Period 1979-2008.

Neuroepidemiology 2013; 40(3):190-194.

4. Osserman KE, Genkins G. Studies in

myasthenia gravis: review of a twenty-year

experience in over 1200 patients. Mount Sinai J

Med 1971; 38:497-536.

5. Jeretzki A 3rd, Barohn RJ, Ernstoff RM,

Kaminski HJ, Keesey JC, Penn AS, et al.

Myasthenia gravis: recommendations for clinical

research standards. Task force of the Medical

Scientific Advisory Board of the Myasthenia

gravis Foundation of America. [Review].

Neurology 2000; 55:16-23.

6. Carbone A, Piantelli M, Musiani P, Larocca

LM, Aiello FB, Maggiano N, Scoppetta C, Crucitti

F, Ranelletti FO. J Clin Lab Immunol. 1986;

21(2):87-91.

7. Milichop JG, Dodge PR. Diagnosis and

treatment of myasthenia gravis in infancy,

childhood and adolescence: a study of 51 patients.

Neurology (Minneap), 1960, 10:1007-1014.

8. Oosterhuis HJG, Clinical aspects in

myasthenia gravis. Edinburgh: Churchill

Livingstone, 1984: 21-50.

9. Andrews PI, Massey JM, Howard JF,

Sanders DB. Race, sex, and puberty influence

onset, severity, and outcome in juvenile

138 Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladakStudentski radovi

myasthenia gravis. Neurology, 1994, 44: 1208-

1214.

10. Evoli A, Batocchi AP, Tonali P, Marciano

M. Risk of cancer in patients with myasthenia

gravis. Ann NY Acad Sci 1998; 841-742-5.

11. Maniaol AH, Elsais A, Lorentzen AR, Owe

JF, Viken MK, Saether H, Flam ST, Brathen G,

Kampman MT, Midgard R, Christensen M,

Rognerud A, Kerty E, Gilhus NE, Tallaksen CME,

Lie BA, Harbo HF. Late Onset Myasthenia Gravis

Is Associated with HLA DRB1 15:01 in the

Norwegian Population 1-8. PLoS One. 2012;

7(5):e36603.

12. K. H. Chan, R.T.F. Cheung, W. Mak, S.L.

Ho. Nonthymoma early-onset-and late-onset-

generalized myasthenia gravis – A retrospective

hospital-based study. Clin Neurol Neurosurg.

2007; 109(8):686-91.

13. Johan A. Aarli. Myasthenia Gravis in the

Elderly Is It Different? Ann N Y Acad Sci. 2008;

1132:238-43.

14. F. Romi, N. E. Gilhus, J. E. Varhaug, A.

Myking, G. O. Skeie and J. A. Aarli. Thymectomy

and anti-muscle autoantibodies in late-onset

myasthenia gravis. European Journal of Neurology

2002, 9: 55-61.

15. Donaldson DH, Ansher M, Horan S,

Rutherford RB, Ringel SP. The relationship of age

to outcome in myasthenia gravis. Neurology, 1990,

40: 786-790.

139Volume 64 | Broj 1-2 | Decembar 2013

Medicinski podmladak Studentski radovi

PARTNERSKI STUDENTSKI KONGRESI partner student conferences

Zagreb International Medical Summit (ZIMS) Novembar; Zagreb, Hrvatska

International Congress of Medical Sciences (ICMS) 8-11. maj 2014; Sofija, Bugarska

in Shams International Medical Student Conference (AIMSC) Februar; Kairo, Egipat

„Obrazovanje je najmoćnije oružje koje možete koristiti da biste promenili svet.“

Nelson Mandela (1918 – 2013)

UNIVERZITET U BEOGRADU

MEDICINSKI FAKULTET

UNIVERSITY OF BELGRADE

SCHOOL OF MEDICINE