木口日医誌　　6　（3／4），239～244　〔1954＞

Polarographyによる癌反応（第1g報）血清濾液反応とSH量に関する研究

　　　　佐藤矩康　吉原萬手札幌医科大学内科学教室　（指導滝本教授・和田教授〉

Cancer　Reqction　by　Means　of　Polarography　（XIX）

　　On　the　Determination　of　SH－Group　Related　to　　　　Polarographical　“Serum　Filtrate　Reaction”

　　　　　　　　　　　　　　By　．　　　Noi｛iyAf　u　SArroH　and　MAM？Ei　YosHiHARA

Depuartment　o！b　lnternal　Medicine，　Sappo7”o　Uni’versity　of　Med’icivee

　　　　（Direotθd伽Pγqプ．　S．　TA　ffr，vo　To＆Pγ（ゾ．　T．恥加）

　Polarography（以下P）による癌反応の造血成

績については先に柴田等1）によって報告されたが，

従来かかる癌反応に応用されているP濾液反応に

与るいわゆる濾液物質の本態に．関しては未だ不明

の点が多く，文献的にみるとBrdicka2）は癌1肛清

中に増加する病的蛋白質の分解産物で，Sulfosali－

cylic　Acid似下SSA）で沈澱しないSH化合物と

考え，またWaldschmidt－Leitz　IL　K．　Mayer、）は血

清Mucoidの関与を説いているが，最近Winzler

等4）は氏等の単離したMucoproteinがその本態

であろうと推測し，癌及びある種の炎症でP反応

の陽性化とともに該物質がliiit液中に増加すること

を指摘している。本来Brdicka及びWaldschmidt－

L．がP法を癌診断に応用した端緒は血液内SH活

性の低下に注口したものであり，いわゆるP第1

反応についてはSH活性を同時に測定して多くは

これを認めるに至っているが，濾液反応について

はなお実証に．乏しく，これを決定づける段階には

至っていない。私共は，人血清SSA除蛋白濾液中

のSH基を化学的に，定量し，　P蛋白波高似下PPW）

との間に如何なる相関関係があるかを追及せんと●

し，先ずSH基定量法としてこれまで報告されて

いるHopkins5）のNitroprusside反応を初め，

SH：反応剤の上から大別した，酸化によるフェリ

チアン法6）一一8），メルカプチッド形成によるアンベ

誠顔定法Ω）一’IL）〉，アルキル化によるヨードアセタミ

ド法等13）・1“1）の中，Barron，　Anson＆Mirsky6）一s）の

フェリチアン法が除蛋自剤として三塩化酷酸及び

タングステン酸を使用している点に着目して，

SSA除画面濾液においてもこの方法が可能ではな

いかとの推測の下に以下の実験法を考案し，さら

にこれを臨床的に応用して2，3知見を得たので一

括報告したい。

1）柴田・他：札幌医誌3，161（1952）．2）　Brdicka，　R．：　Klin．　Wschr．　17，　1411；　18，　305　（1939）．

3）　Waldschmidt－L．　u．　Mayer，　K．　：　Z．　physiol．　Chem．

　227，　16　（1942）．

4）　Winzler，　R．　J．　et　al．：　J．　Clin．　lnv．　27，　609；　617

　（1948）．

5）　Hopkins：　Bioehem．　J．　15，　286　（1921）．

6）　Barron：　Advanees　Emzymol．　11，　223　（1951）．

7）　Anson：　J．　Gen．　Physiol，　24，　399　（1941）．

8）Mirsky，　A．　E．：　工Gen．　PhysioL　24，709（1941）．

9）　Beneseh　＆　Beneseh　：　Arch．　Biochem．　19，　35　（1948）．

ユ0）Weissman，　Schoenbach＆Armis七ead：J．　Bio1．　Chem．　187，　153　（1950）．

11）　岩縛。五琵K：　　［i本生到匙学編志　13，356　（1951）．

12）　Schoenbaeh，　Armistead＆Weissman：　Proe．　Soc．

　Exp．　Biol．　＆　Med，　73，　44　（1950）．

13）Rosner：　工Bio］．　Chem。132，657（1940）．

14）　Mazur　et　al．：　J．　Biol．　Chem．　187，　485　（1950）．

239

240 佐藤・吉原一Polarographyによる癌反応XIX 木し幌二二　1954

　　　　　　　　　実験方法

A。試　　藥

　1）　0，1MPotassium　ferricyanide（PF）：　再結晶した

ものより調製し1”Cの暗所に保存する。保存により盲検値

の高くなることがある故，大体毎週新たに調製する必要が

ある。

　2）IM　Phosphate　buffer（PB）：　それぞれIMの

Potassium　biphosphoricum及びPotassium　Phosphate

を等量混和しpH　6．7の燐酸緩衝液を用意する。

　3）　20％　Sulfosalieylie　aeid　（SSA）　：

　4）Feでric　sulfate　gum　ghatti（FSG）：Folinls）の方

法に従ったが，私共はGum　Ghattiの代りにアラビヤゴ

ム末を使用した。即ち溜水1¢にアラビヤゴム末20gを溶

し，一夜室温放置後濾過する。別に85％Hp，PQ；　75　cc　ec

溜水100ccを加え，これにFe（SO4）：｝5gを溶解する。これ

をさらに上記アラビヤゴム溶液1¢中に加え，37℃卿卵器

中に2～3日放置する。その後1％KMnQi　15　ccを，振盈

しながら徐々に加えて調製を終る。

　5）　Standard　Cysteine　Solution：　1M塩酸Cys七eine

のS七〇ck－Solutionより1cc中に0．1，0．2，03及び0．4μM

塩酸Cysteineを含有する溶液を調製する。これ等はそれ

ぞれ3．3，6．6，99及び13．2γのCysteine－SHを含むこと

になり，これを用いて規準曲線を作製する。

B．窯施法

　1）血清1，0　ecを溜水20ccで稀釈し，さらに20％

SSA　3．O　ccを加えよく混和し，10分後東洋濾紙No．5で濾

過する。

（E）

e・yo

O，2S

e，2e

O．IS

e・Io

o，os

ズ

1・け・エ矧5’6岬”” 求h雛印押

　2）濾液2．Occを硝子栓附試験管にとり，1MPBO．2cc，

0．1MPF　O，5　ceを加え5分間室温放置する。弐いでFSG

O．3ccを加える（この段階のSSA濃度は6．7％にあたる）。

　3）』これを70℃の恒温槽中に10分聞おき’，直ちに涜永

中3分叩放冷し，全量を20．Occまで稀釈して比色に供し

た（なおこの際私共はエルマ型光電式比色計Filter　66を用

いた＞p得たる吸光係数より，血清中のSH量を次項の如く

して得た規準曲線についてCysteine－SHとして求める方

法をとった。

　4）規準曲線の作製：前記各濃度の塩酸Cysteine　1．O

cc及び20％SSA　1．O　ccを硝子栓附試験管にとり，前顎同

様に操作する。ここに得られた規準曲線は第1図の如く原

点をとおりBeerの法則に一致する。

o

実験成績A．各種及懸川下の楡討

　1）各試藥間の量的決定について：Barron及びAnson

＆Mirskyの方法について種々検討を行ったところ，これ

ら反応に与える各試葉は，そのメヂウムにおいて極めて不

安定てあり，わずかな試薬の量的変動に対しても澗濁を生

じたり或いは反応終末点の不鮮明な結果を招来することを

知った。検討の結果PB　02　cc　PF　O．5　cc　FSG　O．3　ccの時

が最も安鐸のように思われた。なお本法においては検体が

すでにSSA酸性であることからPBを除いて操作を行っ

て見たところPrussian　blueの形成が見られず，緩衝液の

必要なことを知った。ついで上記操作及び量酌関係におい

て安完に保たれているメデウム申に最後にFSGを加え，

これをBarronの法に従い25分問暗所室温放置を行って

見たところ，三寿液並びに検体共にPrussian　blueの形成

をみず比色値は零であったが，加温により呈色することを

知った。

　2）メヂウム中のSSA濃度と温度との関係：　P用血

清SSA濾液をそのまま本法に応用するとそのメヂウム中

のSSA濃度は5．3％となり，このものは加温により発色す

るが漏濁を生じ測定困難となるため，ここに温度と濃度と

の関係を検討したところ，第2図の如き結果が得られた。

即ちメヂウムが呈色可能な温度においてSSA濃度が高け

ればメヂウムは楓濁から免かれるが，一方またSSA濃度

が或程度以上高くなると急激にSSA特有の色調が加わり，

盲検値の上昇を来たす難点のあることを知った。それ故瀕

濁及び盲検値の上昇を考慮した場合70℃，SSA濃度6．7％

（盲検値E；O．085）下が最も適当であった。

Fig．　1．

15）　Folin，　O．　＆　Malmorus，　H．　：　」．　Biol．　Chem．　83，　115　（1929）．

6巻3！4号

（温度、’じ）

L四

eo

O．『0

雷77

s

佐藤・吉原：一Polarographyによる癌反応XIX

掴 玖

■

量色域（十1

〔一ナ－　　雪　　「　　鴇　　－　　

～亙 明

一一P■一@一。 ヨ　　ヰ　　　らヨ　ら　もア　　　ロ　　　　　　　　　　　　　てむ

　　　　　　　　　　　（5SAヌ農一度～！o）

Fig．　Z．

　3）温度とPrussian　Blue呈色との関係：　SSA濃度

を6．7％とし温度を種々変化させて塩酸Cysteine　31．52γ

の吸光係数を求めると第3図の如き結果が得られた。即ち

温度の上昇とともにPrussian　blueの形成は増強される

が，75℃においてすでに軽度ではあるが澗濁を生ずる。従

って吐きの場合同様温度条件は70℃が適当である。

　　CE｝　e，t6・

241

b．t＋

，b，1

レ

場合のPrussian　blue形成を検討するに第4図の如き結

果が得られた。即ち4～8分でほぼ最高度に発色し，その

後は10，15及び20分目まで何れも塁色度の変化が見られ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ロず，30分目にはPrussian　blueの沈澱が認められた。故

に本法における反応時間は10分が適当と考えた。

　5）Cysteine－SHとしての測定範囲について；規準液

作製にあたり塩酸Cysteine・SH　16．5　r以上の濃度では，架

状沈澱形成が認められ，これを防ぐためにアルギン酸ソー

ダ末使用等の工夫を試みたがこれまでのところ成功しなか

った。故に本法を用いてのSH基測定範囲は，　SHとして

3．3～13．2γの間が最適と考える。

　6）回牧試験：同一血清濾液に一定量の塩酸Gysteine

を添加してその揚合回収される塩酸Cys七eine中のSH基

量を本法により測定した。第1表の如く添加したCysteine－

SHは平均96％以内で回収された。

第1表

創世濾液SH実測値

o so

Fig．　3．

3．5　r

添加塩酸Cysteine量

濾液塩酸Cysteine　液実測値

回収率（％）

O．1　pt　M

（15．76　r）

7．0　r

106．0

3．5　r 3．9　r 3．9　r

O．2　xi　M　i　O．1　pt　M

（31．52　r）i（15．76　r）1

O．2　pt　M

（31．52　r）

9，6T

92．4

7．0　r

93．9

10．3　r

96．9

Lo　÷O　7’5　tO

　　　　　　｛温度。ω

B。本法による臨床庶用成績

　本法を用いて正常人及び各種疾患患者血清SSA濾液中

のSH含量を測定し，患者血清については同時にPPW及

びこの場合の血肥総蛋白量を硫酸銅法により測定した。

第2表

　4）70t℃恒温槽中における：反雁時間の影響：塩酸Cy－

steine　31．52γを検体とし70℃恒温槽中の加温時間とその

　　CE）e，t6

at午

。．10

Ptussianblve

；児澱

eJ

5’

　　　　　　　　　　ロ　ロリ　

・・’、・’2．’ `寺。

　Fig・4・

氏　　名 年令

横田川高承佐高梅伊波

○○○○○○OOOO

2885109901

4322221122

性

8δ6δQT6♀♀孚♀

」血清SH

（mg／dの

1．050

1，050

1．050

0．990

0．975

0．990

0．975

0．990

1．025

1．050

　1．0145土0．0317

血清蛋白（g／de）

7，0

7．1

6．9

7．0

7．1

7．5

7．4

7．0

6．9

7．85

242 佐藤・吉原、Polarographyによる癌反応XIX 木し幌医誌　1954

第　3　表

患　老　名

須

米

齊

続

oO

o五　十　〇

厚奥永落豊寺鈴

石

oooooo○

o

年令

62

33

59

53

74

32

20

57

54

17

20

20

性 臨床診断名 血清SH（mg／dの

6

6

6

9

9

6

9

6

9

9

6

6

9

腹部腫瘍胃

肝

胃

胆

瘍癌

潰臓

　　癌

嚢　癌

胸　膜　炎

同　　上

肝　硬　変

同　　上

悪、性高血圧

慢性腎炎ネフローゼ

同　　上

1．695

1．050

3．495

1．620

2．100

ユ．200

1．050

1．755

1．275

1．620

IA40

1．560

1．275

　　P？W　（mm）

W■W・■半1腱

25

23

19

30

28

20

30

・10

13

20

12．5

10

10

30

24

23

32

31

23

34

16

15

23

19

21

20

〈．T’）

（，＋）

「

（＋）

ci一）

（±）

（一り

（一）

〈一）

（±）

（・一）

（・．）

（，”）

血溝蛋白量

（9／dの

　．ew－w，）

3S

30

2S

2G

IS

IO

s

・

．

．

■●

一，

．

．

．

．

．

．

‘Pro七ei噂7シζ）

7，0

S・o

7，0

be

so

呼。

ヌ。，

ee　一

．

．

’

の

．

．

の

4．7

6．0

5．52

5．4

5．4

6．7

7．18

59

6．5

8．05

4．0

3．22

o

3．22

9　の

。．9　1．。1．Il．ユt．3陣1・s　l・らi．7　1・92」3・s

　　　　　　　　　　　　　　　（SH顎）

C　PPW一　IVi　）

　　　　一・クo

zs

20

Js

to

s

o

．．

Fig．　S．　（1）

．

，

．

．

．

・

の

．

．

．

ひ¶　1．σ1．ti，z　t．3　好　1、5　｛61．7t．82．けぢ

　　　　　　　　　　　　　　　（　SH　”’：’11iidi　）

Fig．　5．　（2）

リ　o・r’．。μ1、2’31．旧．∫1る1．71、8気ガ3．5’

　　　　　　　　　　　　　　　　　（SH　’”Y’　dl）

Fig．　6．

　その結果は第2表の如く正常人血清濾液では大体一一・iEHの

値を示し，平均1．0145±0．0317mg／dtであった。これに

対し悪性腫瘍及び炎症性疾患を主とする患者血清について

は第3表の如くかなりの動揺が認められるが全般的に高値

を示し，これをPPW及び血二二蛋白量との間についてみ

ると第5図（1），（2）及び第6図の如く必ずしも特定の平行関

係は認められなかった。またこの場合平均値の差を正常人

血清濾液のSH値との問に推計学的吟味を試みたが，分布

不均一のために不可能であった。

総括並びに考按

Barron及びAnSQn＆Mirskyのフェリチアン法により

6巻3／4号 佐藤・吉原・一P61arographyによる癌反応XIX 243

人血清SSA濾液についてSH測定を行うべく工夫考案した。

　原法の論拠はpH　6．8の常温で

　　2Protein－SH＋2Ferricyanide一．Protein　S－S＋

　　2Ferrocyanide

の如く遊離した全SH基と反応し，この場合還元された

Ferrocyanideが酸性メヂ砂ム申で，硫酸鉄と反応して

Prussian　blueを形成するところにあるが，ここに形成ざ

れたPrussian　blueは容易に沈澱する欠点を有している

ので，これを安定させるためにGqm　gha七ti等の保護膠質

作用を必要とするのである。私共の場合もこの沈澱形成を

避けるために最も困難を来した。即ち上述の如く規準曲線

作製にあたっては比色範囲に限界を設け，さらに反応条件

の1吟味を二二検討して，発色時間，温度条件，試薬配分等

に亘る考慮を重ねた次第である。かくして一応は臨床応用

上一定傾向を把握し得ることが出来，SSA濾液中のSH測

定が可能であると考えたのであるが，．なおここに2，3の問

題が残されていることを認めないわけにいかない。即ち本

法は血清SSA濾液内のSHについてCysteine－SHとして

測定したものであるが，これが如何なる分子状態にあるSH

基であるかに関しては遺感ながら明瞭には指摘することが

出来ない。しかし上述の論拠に立ってこれを健康者につい

て応用したところは大体一定の値を示し，悪性腫瘍及び炎

症疾患では一般に高値を示す傾向にあった。かかる病的血

清のSSA濾液内に増加する因子が何を意味するかについ

てはBrdickaiG）のProteDse説に始まり今日では電気泳動

的Vc　a－Globuline｝こ随伴するWinzleri7）のMucoprotein

が認められており，これがSSA濾液のPPWに支配的な役

割を演じているともいわれている。私共の成績も’SSAで

除蛋白操作を施しても沈澱しない部分に含まれる因子とし

て大体かかるMucoproteinようの物質が関与しているで

あろうことは，MucoproteinそのものがSに富む分解で

あり，また本法による以上の病的血清内に増量している成

績が諸家の報告1‘り曜ゆにも一致する点から，容易に推測さ

れるところである。また血清蛋白が直接関与しない点につ

いては事実同時に測定した総蛋白量の増減により影響され

ないことからも明かであるが，さらにかかるSH量の増加

が1血清蛋白質の如何なる分屑の変動と関係があるかについ

ては，その細部に亘って検討する必要があるが，今回は調

査し得なかったのでこれまでの範囲ではこれを明かにする

ことが出来ない。

　次ぎに本実験を意図した主要目的であるPPWとの関係

であるが，PPWの上昇を示す場合にはSHの増加が認め

られるが，他方PPWの正常範囲においても本法によるSH

増加が観察された。このことは本法によって測定された

SSA濾液中のSH：基のみがPPWの波高上昇を演ずるもの

ではなく，PPWについてはその間にさらに復雑な要約と

して従来もいわれるCyStine　S－Sは勿論．かかる方法に与

るSH基以外の条件が当然関与すると考えなけれぽならな

いからである。また本法の意味するこころが電流滴完法門

によるSH基と平行するか否かの吟昧についても問題が残

っていることは勿論である。

　何れにしても以上の方法の考案によって測定し

得たところはPPWの上から見たSH基量と全面

的に平行しないことだけは事実である。

結 論

　フェリチアン法の各種条件を検討し，人血清

SSA除蛋白濾液中のSH基をCysteine　SHとし

て測定する方法を考案した。

　正常入血清濾液につてはほぼ一定したSH含量

を得ることが出来，これを各種患者血清にも応用

してその成績より臨床的な応用価値を見出した。

また教室におけるP的研究と平行してその濾液反

応との関係をみたが全面的な平行関係を認めるこ

とは出来なかった。

　　　　　　　　　　　　　　　（同召禾029．9．20受f寸）

16）　Brdicka，　R．：　Acta　Union　lnternal．　Contra　Cancer

　　3，　13　（1938）．

17）Winzler，　R．」．　et　al．二J．　Clin．　Invest，27，609（1948）．

18）　Mayer，　K：　Z．　physiol．　Chem．　275，　116　（1942）．

19）　Albers：　Biochem．　Z．　306，　236　（1940）．

’

244　　　　　　燃・吉原一一P・1…9・・phyによる癌反応XIX　　　　札幌医誌1954

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Summary

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　Fg・the　e・tim・ti・n・f　SH　val・・i・h・m・n・e・a　th。・Ferri。yanid。　M。th，ri・’w。6

　　　examined，　using　sulfosalicylic　acid　as　deproteinzing　agent．

　　　　　　　SH・・1…in　n・・m・1・e・a・filt・at・w・…el・ti・・ly…h・ngeab1・，　whil・・n・th・・th・・

　　　h・・d・ig・i丘ca・t　i・crea・e・were・b・e・v・d　i・・ev・・al　di・ea・ed・・nditi・n・i．・。．・，　can，e，。f

　　　stomach，　hepatoma　and　exudative　Pleurisy・etc．　　　　　　　　　　・

　　　　　　　It　was・b・etv・d　th・t　th・v・・i・ti・n・f　SH　v・1ues　see皿・d　t・be　sca・cely，el。t。d　t。

　　　polarographic（丘1trate）wave　heights．

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Received　Sept．20，1954＞．